معلومة

ماذا تعني مواقع الربط الجديدة هذه؟

ماذا تعني مواقع الربط الجديدة هذه؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا متأكد من أن الإجابة واضحة بالنسبة للبعض منكم ، لكني أنهيت فترة تدريبي حيث وجدنا تقاطعات لصق جديدة (junctionseq ؛ بيانات RNAseq) (انظر الملف المرفق) ولدي بعض الصعوبات في تقاطعات الوصلات. أفهم أن القراءات يمكن تعيينها في تقاطع 2 exons (والتي يمكن ربطها بتقييم الجودة) وأنه بمقارنة شرطين ، يمكننا العثور على مجموعات exons أكثر "مرتبطة" ولكني لا أفهم:

  • كيف يمكن اكتشاف تقاطع جديد في تقاطع سابق (sub1) ، أو خلف آخر exon من الجين (sub2) ، وبالتالي ، ما يمكن أن تكون النتيجة (النتائج)

يتم تشكيل وصلة لصق من pre-mRNA (أو نسخة أولية) كلما تمت إزالة intron أو تقسمه. يتم الآن ربط جزأين من الحمض النووي الريبي (RNA) اللذان كان يتم فصلهما في مرحلة ما قبل الرنا المرسال مع بعضهما البعض ، مما يشكل تقاطعًا بين اثنين من exons.

تقرأ RNA-Seq أن امتداد موقع تقاطع هذا لن يتماشى جيدًا مع التسلسل الجيني ، ولكن إذا قمت بإنشاء ملف لجميع تقاطعات الوصلات المحاكاة المحتملة ، فقد يكون هناك بعض قراءات RNA-Seq التي تتوافق الآن بشكل مثالي.

التمييز بين ما يشكل intron وما يشكل exon هو تجريبي بحت. في حين أنه من الصحيح أن مجمع spliceosomal يتعرف بشكل تفضيلي ويرتبط بمواقع مانح لصق ومقبول لصق متجاورة بشكل صحيح ، يمكن أن تنتج مجموعة متنوعة من النصوص المختلفة المعالجة والناضجة من نسخة أولية واحدة. هذا التحليل التفاضلي للتسلسلات المؤثرة في رابطة الدول المستقلة عند حدود الإنترونات والإكسونات المحتملة يسمى التضفير البديل.


انفصال جيني

إحدى الوحدات البيولوجية للوراثة ، ذاتية التكاثر ، وتقع في موضع محدد (موضع) على كروموسوم معين. تشكل الجينات أجزاء من جزيء الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) المعقد الذي يتحكم في التكاثر الخلوي والوظيفة. هناك الآلاف من الجينات في كروموسومات كل نواة خلية تلعب دورًا مهمًا في الوراثة لأنها تتحكم في السمات الجسدية والكيميائية الحيوية والفسيولوجية الفردية التي يرثها الأبناء من والديهم. من خلال الشفرة الجينية للحمض النووي ، يتحكمون أيضًا في الوظائف اليومية وتكاثر جميع خلايا الجسم. على سبيل المثال ، تتحكم الجينات في تخليق البروتينات الهيكلية وكذلك الإنزيمات التي تنظم التفاعلات الكيميائية المختلفة التي تحدث في الخلية.

الجين قادر على التكاثر. عندما تتكاثر الخلية عن طريق الانقسام ، تحمل كل خلية ابنة مجموعة من الجينات التي هي نسخة طبق الأصل من الخلية الأم. تشرح خاصية النسخ المتماثل هذه كيف يمكن للجينات أن تحمل سمات وراثية عبر الأجيال المتعاقبة دون تغيير.


مقدمة

التضفير هو عملية بيولوجية أساسية يتم فيها قطع الإنترونات من سلائف RNAs و exons مرتبطة معًا. يشير التضفير البديل إلى الاستخدام البديل للإكسونات. تشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 95٪ من الجينات البشرية متعددة exon تخضع لعملية تضفير بديلة [1]. يعد تخطي Exon (لما يسمى بإكسونات الكاسيت) هو نمط التضفير البديل الأكثر شيوعًا [2]. عادةً ما يتم قياس مستوى تخطي exon مع النسبة المئوية للتقسيم (PSI أو Ψ) [3]. يمكن تقدير النسبة المئوية المقسمة من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) حيث أن عدد قراءات RNA-Seq المنقسمة تدعم إدراج exon مقسومًا على العدد الإجمالي لقراءات الانقسام التي تدعم تخطي أو تضمين exon. الربط هو عملية معقدة تتضمن التنظيم عن طريق عناصر التسلسل في exons وإنترونات المرافقة [4 ، 5]. علاوة على ذلك ، غالبًا ما يكون التضفير البديل خاصًا بالأنسجة [2 ، 3 ، 6 ، 7]. هذا يعني أن بعض الأشكال الإسوية للتضفير موجودة فقط في أنسجة معينة أو أن الوفرة النسبية للأشكال الإسوية لصق تختلف عبر الأنسجة. يلعب التضفير البديل دورًا مهمًا في نمو الأنسجة وتشكيل هوية الأنسجة [8 ، 9]. كشف تحليل أدوار ترميز البروتين للإكسونات الخاصة بالأنسجة عن دورها الحاسم في إعادة توصيل شبكات تفاعل البروتين في الأنسجة المختلفة [10]. ترتبط أنماط التضفير الخاصة بالأنسجة بزخارف قصيرة من الحمض النووي الريبي [2 ، 11-14]. تشفر أشكال الحمض النووي الريبي القصيرة هذه العناصر التنظيمية للربط الخاص بالأنسجة ، وعادة ما تكون مواقع الربط الداخلية أو الخارجية لعوامل الربط مع نشاط خاص بالأنسجة. تشمل عوامل الربط الخاصة بأنسجة الثدييات Nova1 و Nova2 و PTB / nPTB و RBFOX1 للأنسجة العصبية و MBNL1 للعضلات ، من بين أمور أخرى. للمراجعة ، انظر تشين ومانلي [15].

تمثل عيوب الربط جزءًا مهمًا من الأساس الجيني للأمراض البشرية [16-18]. بعض عيوب التضفير هذه خاصة بالأنسجة ذات الصلة بالأمراض. على سبيل المثال ، الأفراد المصابون باضطراب طيف التوحد (ASD) كثيرًا ما يعرضون تضفيرًا خاطئًا للإكسونات الخاصة بالدماغ [19-21] بالإضافة إلى إثراء طفرات دي نوفو في إكسونات محددة للدماغ [22]. ومن ثم ، فإن الأدوات الحسابية التي يمكن أن تتنبأ بالتأثيرات الخاصة بالأنسجة للمتغيرات الجينية على التضفير ستكون ذات صلة لفهم الأساس الجيني للأمراض الخاصة بالأنسجة مثل ASD.

تم تطوير العديد من الأدوات الحسابية للتنبؤ بمواقع لصق أو قوة الربط من التسلسل [23 - 33]. ومع ذلك ، هناك نقص في الأدوات اللازمة للتنبؤ بالتأثيرات الخاصة بالأنسجة للمتغيرات الجينية البشرية على التضفير. باراش وآخرون طور أول نموذج قائم على التسلسل يتنبأ بالتضفير الخاص بالأنسجة في خلايا الفأر [34]. يدمج النموذج عناصر التسلسل التنظيمي للتنبؤ نوعيًا بما إذا كان تضمين إكسون الكاسيت يزيد أو ينقص أو يظل عند مستوى مماثل من نسيج إلى نسيج آخر. تم تحسين هذا النموذج بشكل أكبر للتنبؤ بالتغيرات الاتجاهية بين الأنسجة جنبًا إلى جنب مع التقديرية Ψ الفئات (منخفضة ومتوسطة وعالية) داخل نسيج باستخدام شبكة بايزي العصبية ذات المتغيرات المخفية [35]. في دراسة لاحقة ، تم تدريب شبكة عصبية بايز مماثلة (SPANR) على البيانات البشرية [29]. ومع ذلك ، تم تقييم SPANR فقط للتنبؤ بالتأثير الأكبر عبر جميع الأنسجة التي تم فحصها. وبالتالي ، فإن أداء SPANR على أي نسيج معين غير واضح. علاوة على ذلك ، لا يسمح SPANR المتاح للجمهور بإجراء تنبؤات خاصة بالأنسجة.

لقد طورنا سابقًا MMSplice ، وهي شبكة عصبية ذات تصميم معياري يتنبأ بتأثير المتغيرات على الربط [30 ، 31]. على عكس SPANR ، التي تم تدريبها على التسلسل الجيني الطبيعي الطبيعي ، تستفيد MMSplice من بيانات الاضطراب من اختبار مراسل متوازي تم نشره مؤخرًا على نطاق واسع [28]. تفوقت MMSplice على SPANR والعديد من تنبؤات الربط الأخرى في التنبؤ Ψ الاختلافات المرتبطة بالمتغيرات الجينية التي تحدث بشكل طبيعي بالإضافة إلى تأثيرات المتغيرات على النسبة المئوية المقسمة المقاسة في فحوصات المراسل [30 ، 36]. تقوم MMSplice بنمذجة نسبة الأرجحية لإكسون الكاسيت المراد ربطه عند مقارنة تسلسل بديل بتسلسل مرجعي. نسب الأرجحية المتوقعة هي نفسها لجميع الأنسجة لأن MMSplice قد تم تدريبه بطريقة لا تراعي الأنسجة وبالتالي لا تلتقط تأثيرات المتغيرات التي تؤثر على العناصر التنظيمية الخاصة بالأنسجة.

تم تطوير نماذج التعلم العميق للعناصر التنظيمية الخاصة بالأنسجة لعمليات بيولوجية أخرى. تتضمن هذه النماذج DeepSEA لملفات تعريف الكروماتين [37] ، وفرط الحساسية لـ Basset لـ DNase I [38] ، و ExPecto للتعبير الجيني الخاص بالأنسجة [39] ، و FactorNet لربط عامل النسخ [40] ، و ChromDragoNN لإمكانية الوصول إلى الكروماتين [41]. القاسم المشترك لهذه النماذج هو أنها مدربة من خلال التعلم متعدد المهام ، أي أن النماذج تقدم تنبؤات مشتركة لجميع الأنسجة أو أنواع الخلايا باستخدام مجموعة مشتركة من الميزات التنبؤية الأساسية. تسمح هذه الإستراتيجية للنماذج بجمع المعلومات بكفاءة حول العناصر التنظيمية التي يتم مشاركتها عبر أنواع الخلايا أو الأنسجة.

هنا ، قمنا بتطوير MTSplice (الربط متعدد الأنسجة) ، وهو نموذج يتنبأ بآثار الربط الخاصة بالأنسجة للمتغيرات الجينية البشرية. تقوم MTSplice بضبط تنبؤات MMSplice مع تنبؤات TSplice (الربط الخاص بالأنسجة) ، وهي شبكة عصبية عميقة جديدة تتنبأ بالاختلافات الخاصة بالأنسجة Ψ من التسلسل الذي قمنا بتدريبه على 56 من الأنسجة البشرية باستخدام التعلم متعدد المهام. يتم عرض أداء MTSplice من خلال التنبؤ بالاختلافات الخاصة بالأنسجة Ψ المرتبطة بالمتغيرات الجينية التي تحدث بشكل طبيعي لمجموعة بيانات GTEx وكذلك التحقيق في تنبؤات تأثير الربط الخاص بالدماغ للمتغيرات المرتبطة بالتوحد. MTSplice مفتوح المصدر ومتاح مجانًا في مستودع النماذج Kipoi [42].


المواد والأساليب

عينات البلازما البشرية

تم جمع ملفات تعريف بروتين البلازما بواسطة مجموعة Hoosier Oncology (HOG) (إنديانابوليس ، إنديانا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحليل كل عينة دفعة واحدة بواسطة مطياف الكتلة. في الدراسة ، تم جمع 80 عينة بلازما (40 عينة من نساء مصابات بسرطان الثدي و 40 عينة من امرأة متطوعة صحية عملت كمجموعة تحكم). تم جمع مجموعة بيانات تحقق مستقلة من 80 عينة تحتوي على 40 عينة تم جمعها من نساء مصابات بسرطان الثدي و 40 عينة من امرأة متطوعة صحية كانت بمثابة ضوابط بواسطة مجموعة هووسير للأورام (HOG) (إنديانابوليس ، إنديانا ، الولايات المتحدة الأمريكية) أيضًا ويمكن مقارنتها بـ الدراسة في التركيبة السكانية والتوزيع السريري لمراحل / أنواع سرطان الثدي. على سبيل المثال ، تم تشخيص معظم المرضى المشاركين في الدراستين بسرطان الثدي في مرحلة مبكرة (المرحلة الأولى أو الثانية) ، وانخفضوا في الفئة العمرية بين 40 و 65 ، وكان متوسط ​​حجم الورم 2.2.

تحديد البروتين وتقديره

لتحديد البروتين ، تم تحليل الببتيدات التربتية باستخدام مطياف الكتلة الخطي للأيونات الحرارية Thermo-Fisher Scientific (LTQ) إلى جانب نظام مساح HPLC. تمت إزالة الببتيدات بتدرج من 5 إلى 45٪ أسيتونتريل تم تطويره على مدى 120 دقيقة وتم جمع البيانات في لعبة ثلاثية الوضع (مسح MS ، مسح التكبير ، ومسح MS / MS). تم إنشاء بيانات قائمة الذروة الأولية المكتسبة بواسطة XCalibur (الإصدار 2.0) باستخدام المعلمات الافتراضية وتم تحليلها بشكل أكبر عن طريق التحديد الخالي من الملصقات والخوارزمية الكمية باستخدام المعلمات الافتراضية التي وصفها Higgs وآخرون [33]. تم إجراء عمليات بحث في قاعدة بيانات MS مقابل مجموعة بيانات البروتين المجمعة من مؤشر البروتين الدولي وقاعدة بيانات البروتين البشري NCBI-nr غير الزائدة ، والتي بلغ مجموعها 22،180 سجل بروتين. تم تطبيق مرشحات معالجة البيانات الحساسة لتحديد البروتين للحفاظ على الببتيدات فقط مع درجة XCorr أعلى من 1.5 للببتيدات المشحونة منفردة ، و 2.5 للببتيدات ذات الشحنة المزدوجة ، و 3.5 للببتيدات المشحونة ثلاثياً. تم تعيين درجات XCorr هذه وفقًا لتحليل تمييزي خطي مشابه لتلك الموصوفة في DTASelect (الإصدار 2.0) للتحكم في المعدل الإيجابي الكاذب عند مستويات أقل من 5٪.

لتقدير كمية البروتين ، أولاً ، تمت محاذاة جميع مخططات كروماتوجرام الأيونات المستخرجة (XICs) من خلال وقت الاستبقاء. تمت مطابقة كل ذروة محاذاة بواسطة أيون السلائف ، وحالة الشحن ، وأيونات الشظايا من بيانات MS / MS ، ووقت الاستبقاء خلال نافذة مدتها دقيقة واحدة. بعد ذلك ، بعد المحاذاة ، تم قياس المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) لكل قمة محاذاة بشكل فردي من كل عينة ، وتطبيعها ، ومقارنتها بالوفرة النسبية - كل ذلك كما هو موضح في [33]. هنا ، تم استخدام نموذج مختلط خطي معمم من ANOVA الفردي (تحليل التباين) لتحديد شدة البروتين. من حيث المبدأ ، يأخذ النموذج الخطي المختلط في الاعتبار ثلاثة أنواع من التأثيرات عند اشتقاق شدة البروتين بناءً على المتوسط ​​المرجح لشدة الببتيد الطبيعي الكمي: 1) تأثير المجموعة، والتي تشير إلى التأثيرات الثابتة غير العشوائية الناتجة عن الظروف التجريبية أو العلاجات التي تتم مقارنتها 2) تأثير العينة، والتي تشير إلى التأثيرات العشوائية (بما في ذلك تلك الناشئة عن تحضير العينات) من العينات البيولوجية الفردية داخل المجموعة 3) تكرار التأثير، وهو ما يشير إلى التأثيرات العشوائية من تكرار الحقن من نفس تحضير العينة.

نهج Peptidomics للبحث عن شكل إسوي بديل بديل جديد في بيانات البروتينات

يتضمن نهج peptidomics الخاص بنا لتحديد الشكل الإسوي البديل للربط البديل في بيانات البروتينات ثلاث خطوات (الشكل & # x200B (الشكل 1): 1): 1) بناء قاعدة بيانات تركيبية لأشكال الربط البديلة للتجارب البروتينية 2) تحديد وتوصيف الشكل الإسوي البديل للربط باستخدام البروتينات و 3) التحقق من صحة شكل التضفير البديل.


مناقشة

في هذه الدراسة ، قمنا بفحص هياكل النسخ كاملة الطول للأشكال الإسوية للربط الشاذ باستخدام بيانات التسلسل طويلة القراءة. قمنا ببناء كتالوج لهذه الأشكال الإسوية لـ NSCLCs. لمعالجة التسلسل غير الدقيق لـ MinION ، استخدمنا بيانات التسلسل قصيرة القراءة لتحديد تقاطعات الربط الدقيقة. كشف هذا النهج عن عدد كبير من النصوص الشاذة الجديدة وتم اكتشاف بعض هذه الأشكال الإسوية كببتيدات من خلال تحليل البروتين. علاوة على ذلك ، أظهر اختبار ELISpot أن بعض هذه الأشكال الإسوية على الأقل ، التي لها مستضد قوي ، لديها القدرة على أن تصبح مستضدات جديدة. تُظهر هذه النتائج بوضوح قدرة التسلسل طويل القراءة للبحث عن الأشكال الإسوية الجديدة والمستضدات الجديدة التي قد يتم تجاهلها من خلال مناهج تسلسل القراءة القصيرة الحالية.

في السياق السريري ، يعتبر TMB ، الذي يتم تحديده من خلال العدد الإجمالي للطفرات غير المترادفة ، مؤشرًا على فعالية العلاج المناعي للسرطان. ومع ذلك ، فإن دقة التنبؤ ليست كافية لأنواع كثيرة من السرطان. تظهر الدراسة الحالية أن طفرات التضفير الشاذة والانزياح للإطار لديها إمكانات كبيرة لإنتاج عدد أكبر من المستضدات الجديدة. تشير العديد من التقارير السابقة إلى أن هذه الإمكانية قد يكون لها تأثير على تشكيل المشهد المناعي للورم لدى المرضى بالإضافة إلى TMB الجينومي [28 ، 29 ، 30]. عندما يتعذر فحص النسخ النصية مباشرة في بيئة سريرية معينة ، فقد توفر حالة NMD وعوامل الربط الأخرى معلومات مهمة. في الواقع ، أشارت التقارير السابقة إلى أن عدد طفرات تغيير الإطارات التي يُتوقع ألا تؤدي إلى NMD أعلى في المستجيبين للعلاج المناعي وأن هذا العامل المقترن بـ TMB يحسن دقة التنبؤ للمستجيبين للعلاج المناعي [61].

ركزنا بشكل أساسي على NSCLC في هذه الدراسة. ومع ذلك ، تمكنا من تحديد الأشكال الإسوية الشاذة المحتملة لأنواع أخرى من السرطان من خلال النظر في كتالوجنا الكامل. من الواضح أنه عند إضافة المزيد من أنواع السرطان إلى الكتالوج ، ستزداد حساسية وانتقائية الاكتشاف بشكل أكبر. لاحظ أيضًا أنه نظرًا لأن GTEx يعتمد على مجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة القراءة ، فإن تمثيل التقاطعات في GTEx لا يشير بالضرورة إلى وجود الشكل الإسوي في أشكالها كاملة الطول في الأنسجة الطبيعية. لحساب أنماط الشكل الإسوي الخاصة بالسرطان واستخراجها ، يجب أن ننتج مجموعة بيانات أكبر من الأشكال الإسوية طويلة القراءة للأنسجة الطبيعية في الدراسة المستقبلية. من شأن المزيد من التحليلات المتعمقة أن توضح إمكانية أن توفر ميزات النسخ هذه مؤشرًا تكميليًا للتنبؤ بفعالية العلاج المناعي ، بالإضافة إلى السمات الجينية.


مناقشة

التضفير البديل للحمض النووي الريبي لمستقبلات 5-HT1A البشري يغير استقراره

على الرغم من دوره الأساسي في النقل العصبي واضطرابات المزاج السيروتونين ، إلا أن تسلسل 5-HT1A mRNA الكامل تم تمييزه بشكل غير كامل. على الرغم من اعتباره لفترة طويلة جينًا "لايترونًا" (Fargin et al. ، 1988 Charest et al. ، 1993) ، فقد أظهرنا أن الإنسان 5-HT1A 3′-UTR مقسم بدلاً من ذلك إلى ثلاثة أشكال إسوية من الرنا المرسال تختلف اختلافًا كبيرًا في ثباتها وترجمتها. انتاج. لتأكيد نتائجنا ، تم تحديد متغير LS في قواعد بيانات RNAseq (إصدار التعليق التوضيحي لـ Homo Sapiens التابع للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية 108) ، ولكن لم يتم تمييزه فعليًا. في القوارض HTR1A الجينات ، فإن مواقع متقبل اللصق / المتبرع يتم حفظها بشكل سيئ ولم يتم اكتشاف التضفير (الشكل 1د). في المقابل ، تُظهر مقارنة التسلسل بين مكاك الريسوس والإنسان 5-HT1A 3′-UTRs تماثلًا قويًا (هوية 93 ٪) والحفاظ على مواقع لصق (الشكل 1).ه) ، مما يشير إلى أن التضفير 5-HT1A قد يحدث في الرئيسيات الأخرى. هذا يتوافق مع الأدلة على مستوى الجينوم على أن حدوث التضفير يزداد مع التطور (Barbosa-Morais et al. ، 2012 Gueroussov et al. ، 2015) ، ووجود الإنترونات في 5-HT1A mRNA 3′-UTR يمنح آلية قوية للضبط المعتمد على لصق لتعبير مستقبلات 5-HT1A في الرئيسيات. قد يوفر توضيح الآليات الخاصة بالإنسان أو الخاصة بالرئيسيات [على سبيل المثال ، الآليات المعتمدة على ميرنا (لوبيز وآخرون ، 2014)] المتورطة في الاكتئاب أهدافًا ورؤى جديدة لا يمكن استخلاصها من نماذج القوارض.

يحدث وجود الإنترونات 3′-UTR في 6 ٪ فقط من الجينات (Bicknell et al. ، 2012) وينتج عادةً mRNAs غير مستقر للغاية يتحلل بواسطة NMD. ومع ذلك ، ليس هذا هو الحال بالنسبة للمتغيرات المقسمة 5-HT1A mRNA ، والتي تكون مستقرة للغاية مقارنة بالشكل غير المقسم. ومن ثم ، تناولنا دور miR135 في إحداث التضفير HTR1A الاستقرار ، نظرًا لأن miR135 يعمل في موقع محفوظ للغاية داخل HTR1A intron لتنظيم مستويات RNA مستقبلات 5-HT1A بشكل سلبي (Issler et al. ، 2014). في الخلايا العصبية للمورين 5-HT ، يتم تحفيز miR135 بسرعة عن طريق مضادات الاكتئاب إيميبرامين وفلوكستين ، ويؤدي الإفراط في التعبير عن miR135 في الخلايا العصبية 5-HT إلى تنظيم مستقبلات 5-HT1A RNA ويقلل من القلق والاكتئاب في نموذج الهزيمة الاجتماعية المزمنة (Issler et al. ، 2014). على النقيض من ذلك ، أدت ضربة قاضية لـ miR135 إلى زيادة القلق وكشفت عن مثبطات امتصاص السيروتونين الانتقائية التي يسببها الاكتئاب ، مع منع الإجراءات المضادة للقلق التي يسببها SSRI. تتوافق هذه النتائج مع الدور الرئيسي لـ miR135 في قمع تعبير مستقبلات 5-HT1A وعواقبه السلوكية. تظهر بياناتنا ذلك HTR1A يمنع الربط زعزعة الاستقرار بوساطة miR135 عن طريق إزالة موقع ربط ميرنا. هذا الاكتشاف في HTR1A يوفر 3′-UTR دليلًا إضافيًا على هذه الآلية الجديدة لتثبيت الحمض النووي الريبي (Mohr and Mott ، 2015).

NSR100 و PTBP1 كمحددات للربط 5-HT1A mRNA

تعتبر بروتينات ربط الحمض النووي الريبي الخاصة بالأنسجة التي تعزز أو تمنع إدراج exons البديلة في نسخ الحمض النووي الريبي (RNA) منظمات مهمة للتضفير البديل (Lee and Rio ، 2015). من خلال التلاعب بالعديد من منظمات الربط المخصب بالدماغ وفحص التغييرات في 5-HT1A mRNA splicing ، وجدنا أن التضفير 5-HT1A RNA يتم كبته بواسطة PTBP1 ، ولكن تم تحسينه بواسطة nSR100. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن عامل لصق آخر في اتجاه المصب PTBP1 أو nSR100 يمكن أن يتوسط أو يساهم في تنظيم التضفير 5-HT1A mRNA. يتم تقليل تنظيم PTBP1 ، وهو مثبط في كل مكان للربط ، بواسطة miR124 أثناء التمايز العصبي ، مما يتيح التعبير عن PTBP2 وتنشيط برنامج الربط العصبي المحدد (Makeyev et al. ، 2007). يبدو أن المستويات القاعدية المنخفضة للربط 5-HT1A mRNA في خطوط الخلايا مدفوعة في الغالب بتعبير PTBP1 العالي ، حيث زادت ضربة قاضية لـ PTBP1 HTR1A التضفير على الرغم من زيادة PTBP2 ، وهو مثبط أضعف للربط (Markovtsov et al. ، 2000). في المقابل ، يعزز nSR100 إدراج عدد من exons الخاصة بالخلايا العصبية (Raj et al. ، 2014) ، وقد أدى زيادة التعبير عنه في خلايا SKN-SH إلى زيادة مستويات متغير SS ، وهو ما لم نكتشفه في أنسجة المخ. يشير هذا إلى أن منظمات لصق إضافية غير موجودة في خلايا SKN-SH قد تكون مطلوبة من أجل الربط المناسب 5-HT1A في الجسم الحي. تم الإبلاغ عن معارضة تنظيم التضفير بواسطة PTBP1 و nSR100 للجينات العصبية الأخرى ، بما في ذلك PTBP2 (كالاركو وآخرون ، 2009 راج وآخرون ، 2014). تشير بياناتنا إلى أنه في الخلايا العصبية ، تعمل المستويات المنخفضة من PTBP1 جنبًا إلى جنب مع وجود nSR100 على تعزيز تخليق الشكل الإسوي 5-HT1A RNA المستقر لتعزيز مستويات المستقبلات (الشكل 5).ح) ، بينما في الخلايا غير العصبية ، يثبط PTBP1 بشدة الربط والتعبير عن المستقبلات. الأهم من ذلك ، يبدو أن الاختلافات الإقليمية في مستويات nSR100 و PTBP1 تؤثر أيضًا على الربط 5-HT1A في الجسم الحي.

تنظيم 5-HT1A mRNA splicing في دماغ الإنسان

تمشيا مع انتشار التضفير البديل في الدماغ البشري (كانغ وآخرون ، 2011) ، وجدنا أن HTR1A كان التضفير في دماغ الإنسان بعد الوفاة أكبر منه في خطوط الخلايا وكان خاصًا بالمنطقة. منطقة محددة HTR1A يبدو أن التضفير مدفوع بشكل أساسي بتعبير nSR100: كان أدنى مستوى في الدماغ المتوسط ​​/ الحصين ، حيث ارتبط انخفاض nSR100 والتعبير العالي PTBP1 بزيادة غير مقسمة HTR1A RNA ، بينما ارتبطت المستويات الأعلى من nSR100 في PFC بانخفاض mRNA غير المقسم وارتفاع نسب التقسيم / غير المقسمة (الشكل 5).ح). بينما كان nSR100 متورطًا بقوة في الربط التنموي للدماغ (Calarco et al. ، 2009 Irimia et al. ، 2014 Raj et al. ، 2014) ، تشير نتائجنا إلى أنه قد يكون مهمًا في التنظيم الديناميكي لتعبير RNA الخاص بالمنطقة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يساهم تقليل الربط لزيادة التنظيم الناجم عن miR135 لـ 5-HT1A RNA (Issler et al. ، 2014) في التخفيض التفضيلي في مستقبلات 5-HT1A التي لوحظت في الدماغ المتوسط ​​والحصين بعد علاج SSRI المزمن في الاكتئاب البشري (جراي) وآخرون ، 2013) والقلق ، على التوالي (Spindelegger وآخرون ، 2009). خصوصية المنطقة HTR1A ينشئ الربط آلية جديدة للتنظيم التفاضلي لمستقبلات 5-HT1A بعد المشبكي وما قبل المشبكي ، مكملة لآليات النسخ (Czesak et al. ، 2006 ، 2012).

في PFC للأفراد المصابين بالاكتئاب ، كان هناك انخفاض كبير في نسبة الربط ، بما يتوافق مع انخفاض nSR100 ، على الرغم من أن الانخفاض في PTBP1 قد يبطل جزئيًا تأثير انخفاض مستويات nSR100. أبلغت كل من دراسات التصوير وبعد الوفاة عن انخفاض في مستقبلات 5-HT1A القشرية في الاكتئاب (López-Figueroa et al. ، 2004 Savitz et al. ، 2009 Szewczyk et al. ، 2009) ، يمكن أن يساهم النمط الظاهري الذي يقلل من التضفير 5-HT1A في . في المقابل ، يبدو أن المستقبلات الذاتية قبل المشبكية 5-HT1A يتم تنظيمها في حالة الاكتئاب (Stockmeier et al. ، 1998 Boldrini et al. ، 2008 Hesselgrave and Parsey ، 2013) ، وهو ما يتوافق مع دورها في تثبيط نشاط الخلايا العصبية 5-HT. بينما لم نشهد انخفاضًا كبيرًا في إجمالي 5-HT1A RNA في PFC ، تظهر معظم الدراسات تغيرات محلية للغاية في مستقبلات القشرة الأمامية 5-HT1A التي قد تكون مفقودة في الأنسجة التي درسناها.

عدة بشر HTR1A ترتبط تعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات (SNPs) بالاكتئاب (Kishi et al. ، 2013) ، بما في ذلك المروج الوظيفي SNP rs6295 C (-1019) G (Lemonde et al. ، 2003) ، والذي ارتبط بزيادة التعبير عن 5 - مستقبلات HT1A الذاتية (Hesselgrave and Parsey، 2013) وانخفاض في مستقبلات PFC 5-HT1A (Kautzky et al.، 2017). هناك العديد من تعدد الأشكال بالقرب من المنطقة المقسمة ، اثنان منها في حالة اختلال توازن قوي في الارتباط مع rs6295-C / G: rs6449693 T / C و rs878567 C / T (Donaldson et al. ، 2016). HTR1A RNA مع أليل rs878567-C هو الأليل المعبر عنه بقوة أكبر في PFC العادي ، ولكنه ينخفض ​​في PFC المكتئب (Donaldson et al. ، 2016). يشير هذا إلى وجود تأثير استقرار لـ rs878567-C ، ربما عن طريق زيادة التقسيم HTR1A RNA. لكن، HTR1A تتأثر مستويات الحمض النووي الريبي أيضًا بالنسخ الخاص بالأليل لمروج rs6295-C SNP (Lemonde et al. ، 2003). ومن المثير للاهتمام ، أن rs749099 A / G SNP يجلس على عدد قليل من النيوكليوتيدات من موقع متقبل لصق ويمكن أن يؤثر على الربط. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لمعالجة الارتباط بين المروج و 3′-UTR SNPs وتأثيرها على التضفير 5-HT1A ومستويات المستقبلات والاكتئاب الشديد.

باختصار ، توفر بياناتنا الدليل الأول على التغيير HTR1A التضفير في الاكتئاب. يتم تنظيم جينين آخرين من هرمون السيروتونين عن طريق التضفير البديل (HTR2C و TPH2) ، ويرتبط ضعف أنماط التضفير بالاضطرابات النفسية (Grohmann et al. ، 2010 Zhang et al. ، 2011 Martin et al. ، 2013). ومع ذلك ، فإن عوامل لصق المتورطة غير معروفة. نقترح أن التغييرات المرتبطة بالاكتئاب في تعبير أو نشاط عامل لصق يمكن أن تؤثر على العديد من الجينات العصبية الخاضعة للتنظيم عن طريق الربط (Calarco et al. ، 2009 Raj et al. ، 2014). هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات مثل هذه لتوضيح الآليات التي تنظم التضفير الخاص بمنطقة الدماغ وتأثيرها على وظائف الدماغ والمرض.


أساليب

توليف رواية resveralogues

ريسفيراترول (سيجما الدريتش ، المملكة المتحدة 1) لتخليق ديهيدروريسفيراترول 2 كما ورد سابقا [47]. (ه) -N- (4- (3،5-ديميثوكسيستريل) فينيل) ميثان سلفوناميد 3 تم تصنيعه من التناظرية المستبدلة بالنيترو التي تم الإبلاغ عنها سابقًا 7 عبر Fe / NH4تخفيض الكلور لإعطاء الأمين 8 [26] ، تليها السلفونيل مع كلوريد الميثان سلفونيل (الشكل 1 ب). الأميد المقابل 9 تم تحضيره أيضًا من 8، عن طريق أسيل مع أسيتيل كلوريد. المنتج 9 تعرض لنزع الميثيل (BBr3، CH2Cl2) لإعطاء المركب المستهدف (ه) -N- (4- (3،5-dihydroxystyryl) phenyl) acetamide.) 4. (ه) -5- (4- (3،5-ديميثوكسيستريل) فينيل] -1ح- تترازول 5 والأيزومري 2-1ح-تترازول التناظرية 6 تم تحضيرها مباشرة عن طريق cycloaddition المحفز بالحمض مع أيون أزيد من 4 و 2-cyanostilbenes [26] (10 و 11 على التوالى). (الشكل 1 ب) ترد تفاصيل توليف وتنقية وتوصيف الكائنات الحية في الملف الإضافي 8.

تحديد تنشيط إنزيم SIRT1

تم قياس نشاط إنزيم SIRT1 باستخدام مجموعة اكتشاف الأدوية الفلورية SIRT1 (كايمان للكيماويات ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. هذا الاختبار عبارة عن مقايسة فحص الفلورسنت المباشر المعياري لـ SIRT1 ex-vivo وهو أساسًا متغير لنظام "fluor de lys" المعروف. لتحديد السعة النسبية لكل Resveralogue لتنشيط الإنزيم ، محلول 25 ميكرومتر لكل مركب (ن = 3) تم تحضينه مسبقًا مع الإنزيم والعوامل المساعدة قبل قياس النشاط. تم تحقيق القياس الكمي عن طريق قياس الإخراج عند λالسابق = 360 نانومتر و λم = 460 نانومتر. تضمنت كل لوحة قياسات خلفية وعناصر تحكم إنزيمية فقط. يتم تقديم البيانات كتغيير أضعاف (يعني ± sd) في النشاط المقيس إلى إنزيم فقط وريسفيراترول 1، بحيث لا يمثل 0 أي تنشيط ، ويشير 1.0 إلى تنشيط مكافئ لتلك الملاحظة مع ريسفيراترول 1.

تحديد السمية الخلوية لمكتبة resveralogue

تم استخدام مقايسة إطلاق LDH التجارية (Pierce LDH Cytotoxicity Assay Assay Kit) لتحديد موت الخلية. باختصار ، تم زرع خلايا MRC5 (عند مضاعفة عدد السكان (PD) = 45) في 24 طبقًا جيدًا عند 1.3 × 10 5 خلايا / سم 2 وتم السماح لها بالتعافي من التربسين لمدة 24 ساعة ثم تعريضها لكل من الكائنات الحية (3 مكررات بيولوجية ×) 3 تركيزات 10 و 50 و 100 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة أخرى. تم بعد ذلك خلط 50 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر مع حجم متساوٍ من خليط تفاعل اختبار LDH وحضنت في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. تمت إضافة 50 ميكرولتر من محلول إيقاف اختبار LDH إلى كل بئر وتم قياس امتصاص المحلول بواسطة القياس الطيفي عند 490 نانومتر. تم تضمين التحلل الكامل والمركبة فقط الضوابط الإيجابية والسلبية. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​(+/− الانحراف المعياري)٪ من التحكم الكلي في التحلل.

ثقافة الخلايا الليفية الأولية البشرية (NHDF و MRC-5 و HF043)

تم استخدام سلالات الخلايا الليفية المكونة من ثلاث خلفيات وراثية وسلالتين في هذه الدراسة: الخلايا الليفية الجلدية البشرية الطبيعية (NHDF Heidelburg ، ألمانيا) ، والأرومات الليفية الرئوية الجنينية ثنائية الصبغيات البشرية (معهد MRC-5 Coriell للبحوث الطبية) والأرومات الليفية القلفة الوليدية (HF043 Dundee Cell) المنتجات ، المملكة المتحدة). كانت ظروف الاستزراع المعيارية عبارة عن كثافة بذر تبلغ 6 × 10 4 خلايا / سم 2 في وسط (C-23020 ، بروموسيل ، هايدلبورج ، ألمانيا) تحتوي على 1 ٪ بنسلين وستربتومايسين ، ومزيج مكمل خاص بالأرومة الليفية يتكون من مصل العجل الجنيني (3) ٪ الخامس/ v) ، وعامل نمو الخلايا الليفية المؤتلفة (1 نانوغرام / مل) والأنسولين البشري المؤتلف (5 ميكروغرام / مل) (بروموسيل ، هايدلبورغ ، ألمانيا). بالنسبة للمقايسات التي تتطلب ثقافات شيخوخة ، تم حساب الخلايا وأعداد متساوية من الخلايا المصنفة في كل مرور حتى تباطأ نمو الثقافة إلى أقل من 0.5 PD / أسبوع كما هو موضح سابقًا [2] (حدث هذا عند PD = 64 (NHDF) ، 65 (MRC-5) و 64 (HF043). تم تحديد أعداد الخلايا القابلة للحياة في كل ممر عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق. بالنسبة للثقافات التي نمت تحت ظروف تجويع المصل ، تم الحفاظ على الخلايا في DMEM (Sigma Aldrich ، Dorset ، المملكة المتحدة) مكمل بنسبة 0.1٪ من المصل و 1 ٪ من البنسلين والستربتومايسين في حالة عدم وجود مكمل خاص بالأرومة الليفية ، لمدة 24 ساعة قبل العلاج.

القياس الكمي لإفراز السيتوكينات الرئيسية

تم زرع خلايا NHDF من ثقافة شيخوخة عند 6 × 10 4 خلايا / سم 2 في صفيحة 6 آبار في وسط خالٍ من المصل ، وبعد 10 أيام تمت معالجتها بـ 5 ميكرومتر من كل من 1–6 لمدة 24 ساعة. ثم تم حصاد المواد الطافية للخلايا وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. تم تحديد مستويات 9 سيتوكينات (GMCSF ، IFNγ ، IL1β ، IL2 ، IL6 ، IL8 ، IL10 ، IL-12p70 ، و TNFα) في طاف الخلية من خلايا التحكم المعالجة والمركبة فقط باستخدام K15007B MesoScale Discovery متعدد ELISA المناعي (MSD ، Rockville ، الولايات المتحدة الأمريكية) في 11 مكررًا. تم قياس كمية البروتينات بالنسبة لمنحنى قياسي باستخدام Sector Imager SI-6000 وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​(+/− SEM).

التنميط التعبير عن تعبير عامل الربط في مزارع الخلايا الشائخة

تم زرع خلايا NHDF عند 6 × 10 4 خلايا / سم 2 في 6 أطباق جيدة ، ثم سمح لها بالنمو لمدة 10 أيام ثم عولجت بـ 5 ميكرومتر من كل مركب لمدة 24 ساعة في 3 مكررات بيولوجية ، مع عناصر تحكم السيارة فقط (DMSO). ريسفيراترول 1 كان العلاج الحاد بجرعة أولية 5 ميكرومتر ، متبوعًا بالثقافة دون مزيد من العلاج لمدة 4 أسابيع. بالنسبة لأنظمة العلاج المزمنة ، تمت إضافة ريسفيراترول (أو مركبة DMSO) مرة واحدة كل 48 ساعة خلال 4 أسابيع. تم اختيار 20 نسخة من عامل التضفير المرتبطة بالعمر والشيخوخة التكرارية في عملنا السابق [1 ، 2] مسبقًا للتقييم هنا. (تتوفر معرفات الفحص عند الطلب). تم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام 1 مل من TRI reagent ® (Life Technologies ، Foster City USA) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم نسخ إجمالي الحمض النووي الريبي (100 نانوغرام) في تفاعلات 20 ميكرولتر باستخدام مجموعة Superscript III VILO (تقنيات الحياة ، فوستر سيتي ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم بعد ذلك تحديد كمية التعبير النصي في ثلاث نسخ لكل تكرار بيولوجي باستخدام TaqMan Low Density Array (TLDA) على منصة ABI-Prism 7900HT. كانت ظروف ركوب الدراجات عبارة عن دورة واحدة لكل منها 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 94.5 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم 40 دورة من 97 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 57.9 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. تضمنت خلطات التفاعل 50 ميكرولتر TaqMan Fast Universal PCR Mastermix (Life Technologies ، Foster City ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 30 ميكرولتر dH2O و 20 ميكرولتر قالب (كدنا). تم توزيع 100 ميكرولتر من خليط التفاعل في حجرة بطاقة TLDA وطرده مرتين لمدة دقيقة واحدة عند 1000 دورة في الدقيقة لضمان التوزيع الصحيح للمحلول لكل بئر. تم تقييم تعبير النص من خلال نهج Ct المقارن ، بالنسبة إلى IDH3B, GUSB و PPIA جينات التحكم الذاتية ، المختارة على أساس الأدلة التجريبية للاستقرار مع تقدم العمر في بيانات المصفوفة الدقيقة السابقة الخاصة بنا [1] ومع الشيخوخة الخلوية في عملنا السابق [2]. تم التعبير عن تعبير النص بالنسبة إلى مستوى تعبير عامل الربط في خلايا التحكم المعالجة بالمركبة.

Assessment of total gene expression and alternative splicing for senescence-related genes

To assess gene expression and splicing, NHDF cells were seeded at 6 × 10 4 cells/cm 2 in 6 well plates and after 10 days were treated with 5 μM of each compound for 24 h in 3 biological replicates. Target transcripts included the known age-related genes CDKN2A, CDKN1A, TP53, MTOR, CHK1 و CHK2. Probes specific to particular isoforms or groups of isoforms were designed to unique regions of the transcripts in question. Assays were validated by standard curve analysis of 7 serial 1:2 dilutions of pooled cDNA and proved robust and sensitive with an average efficiency of −3.4 and an average r 2 for reproducibility between replicates of 0.87. PCR reactions contained 2.5 μl TaqMan Universal Mastermix (no AMPerase) (Applied Biosystems, Foster City, USA), 0.9 μM each primer, 0.25 μM probe and 0.5 μl cDNA reverse transcribed as above in a total volume of 5 μl in a 384 well plate. PCR conditions were a single cycle of 95 °C for 10 min followed by 40 cycles of 95 °C for 15 s and 60 °C for 1 min. We also measured the total expression of the ATR, ATM. RB1, SIRT1 و SIRT2 الجينات. Probe and primer details are available on request. Each biological replicate was tested in triplicate. Isoform-specific and total expression changes were examined for statistical significance by two way ANOVA analysis using SPSS v.22 (IBM, USA).

Catalytic histochemical determination of SA β-gal positive fraction

Senescence marker SA β-Gal was assayed in triplicate using a commercial kit (Sigma Aldrich, UK) according to manufacturer’s instructions, with a minimum of 400 cells assessed per replicate.

QRTPCR measurement of transcripts of senescence associated genes

Molecular markers of senescence (CDKN2A و CD248 transcript levels) were measured by qRTPCR relative to the GUSB و PPIA endogenous control genes, on the ABI Prism 7900HT platform. PCR conditions and analysis were as previously described [2].

Live cell capture microscopy

For live capture microscopy, cells were seeded at a density of 5 × 10 4 cells per 35 mm glass bottomed dish (World Precision Instruments, USA) in 2 ml of media. They were then imaged on a Leica Axiovert inverted environmental microscope with heated chamber (37 °C) and CO2 قدرات. An image was taken every 10 min over the course of 92 h. A 20× objective was used with a 30 mS shutter speed and 10% light intensity from a widefield white light source for each image giving optimal contrast and minimal light exposure. Images were analysed using Leica LAS X software.

Determination of cell proliferation

Senescent cultures of each strain were seeded at 6 × 10 4 cells/cm 2 into 6-well plates and cultured for 10 days then treated with 5 μM of each compound for 24 h. Cell counts in three replicates of treated and vehicle-only cultures were carried out manually following trypsinisation and suspension of cells and are presented as mean (+/−SEM).

Immunocytochemical determination of Ki67 positive fraction

Proliferation index was assessed by using Ki67 staining on NHDF cells. Cells were seeded at 1 × 10 4 cells/coverslip and after 10 days were treated with 5 μM of each compound for 24 h in 3 biological replicates. Cells were fixed for 10 min with 4% PFA and permeabilized with 0.025% Triton and 10% serum in PBS for 1 h. Cells were then incubated with a rabbit monoclonal anti-Ki67 antibody (ab16667, Abcam, UK) at 1:200 overnight at 4 °C followed by FITC-conjugated secondary goat anti-rabbit (1:400) for 1 h, and nuclei were counterstained with DAPI. Coverslips were mounted on slides in DAKO fluorescence mounting medium (S3023 Dako). The proliferation index was determined by counting the percentage of Ki67 positive cells from at least 400 nuclei from each biological replicate at 400× magnification under a Leica D4000 fluorescence microscope.

Assessment of apoptosis using TUNEL assay

Terminal DNA breakpoints in situ 3 - hydroxy end labeling (TUNEL) was to quantify levels of apoptosis in NHDF cells. Cells were seeded at 1 × 10 4 cells/cm 2 in 6 well plates and after 10 days were treated with 5 μM of each compound for 24 h in 3 biological replicates. The TUNEL assay was performed with Click-iT® TUNEL Alexa Fluor® 488 Imaging Assay kit (Thermofisher, UK) following the manufacturer’s instructions. Negative and positive (DNase1) controls were also performed. The apoptotic index was determined by counting the percentage of positive cells from at least 400 nuclei from each biological replicate at 400× magnification.

Assessment of apoptosis by assessment of Caspase 3 and 7 activity

Caspase-3 and-7 activities were assessed as secondary measures of apoptosis. Cells were seeded (1000 cells per well) in a white-walled 96-well plate and then treated with 5 μM of each compound for 24 h in 11 biological replicates alongside vehicle-only controls. Caspase-3 and -7 activities in the supernatants were then measured by Caspase-Glo 3/7 assay (Promega, Madison, WI, USA) following the manufacturer’s instructions. Luminescence was measured by using a BMG Pherastar FSX.

Moderation of ERK signalling pathway with inhibitors and agonists

The role of ERK signalling in reversal of senescence was investigated using agonists (ceramide) and inhibitors (trametinib) of the ERK pathway. Cells from a senescent culture were seeded at 6 × 10 4 cells/cm 2 in a 6 well plate in serum free media, and after 10 days were treated with 1-20 μM of the ERK inhibitor trametinib (LC laboratories, Woburn, USA for 24 h hours, or with the ERK agonist N-Acetyl-D-sphingosine (C2-ceramide Sigma Aldrich, UK) at 20 μM for 24 or 120 h. To examine the role of ERK signalling in resveralogue-induced rescue of senescence, HNDF cells were treated with 20 μM of the ERK agonist C2-ceramide as above, but with the addition of 5 μM resveralogue for 24 h.

Assessment of telomere length in resveratrol treated cells

DNA was extracted from 2 × 10 5 NHDF cells treated with 5 μM resveralogue for 24 h, using the PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen™/Thermo Fisher, MA, USA) according to the manufacturer’s instructions. DNA quality and concentration was checked by Nanodrop spectrophotometry (NanoDrop/Thermo Fisher, MA, USA). Relative telomere length was assessed by a modified qPCR protocol [48]. PCR reactions contained 1 μl EvaGreen (Solis Biodyne, Tartu, Estonia), 2 μM each primer and 25 ng DNA in a total volume of 5 μl in a 384 well plate. PCR conditions were a single cycle of 95 °C for 15 min followed by 45 cycles of 95 °C for 10 s, 60 °C for 30 s and 72 °C for 1 min. Telomere length was calculated using the comparative Ct approach relative to the 36B4 housekeeping gene and normalised to the quantification from untreated cells. Three biological replicates were tested and each was assessed in triplicate.

تحليل احصائي

Unless otherwise indicated, differences between treated and vehicle-only control cultures were assessed for statistical significance by two way ANOVA analysis using SPSS v.22 (IBM, USA).


مناقشة

Global splicing changes in cancer have been studied using microarray or RNA-seq techniques in the past [14,15,16]. Compared to microarray (eg. Affymatrix Exon Array), RNA-seq can more precisely measure the splicing changes because the reads covering the exon-exon junction directly represent the splicing choice. Usually, a PSI value can be calculated based on the read counts of the upstream junction, downstream junction and the junction skipping the exon (eg. Fig. 1a). In this study, we used two additional approaches (PSI_junc5’ and PSI_junc3’) to calculate the PSI values (Fig. 2a-b). The two approaches have the advantage to deal with more complex splicing events like in CD44, nine consecutive alternative exons can be partially included, or all excluded. Using regular PSI exon method, only exon v10 was found to be significantly included in CRC. However, combining with the two additional PSI analysis, we concluded that the isoform CD44v8–10 is upregulated in CRC. The PSI_junc5’ and PSI_junc3’ approaches can also be used to study alternative last exons and alternative first exons, respectively. In this study, we identified 5 alternative first exon events in CRC or metastasis tissues. Except for HNF4A, none of the other four events was reported previously. The results indicated that the new approaches could identify novel splicing events. Interestingly, using the same approach, we did not identify any significant alternative last exon events. This may indicate that the transcription-coupled alternative first exon choices play a more important role in CRC compared to alternative polyadenylation-coupled last exon choices.

The exon4-skipping isoform of CLK1, predominantly expressed in NC samples, matches the isoform 3 transcript from Refseq annotation. Interestingly, isoform 3 is annotated as a non-coding transcript because skipping the 91 nt exon 4 is predicted to cause out-of-frame translation and the nonsense mediated decay (NMD) of the transcript (Fig. 1c). The increase of exon4-inclusion isoform (isoform 1) at the expense of isoform 3 in CRC and MC may thus increase the productive transcript level of CLK1 and potentially produce more proteins. CLK1 encodes a member of the CDC2-like family of protein kinases (CLKs). In the cell nucleus, CLKs phosphorylate serine/arginine-rich proteins, release them into the nucleoplasm and then regulate AS of genes. Small molecule inhibitors against these CLKs were developed and exhibited growth suppression, apoptosis induction and anti-tumor effect [40, 41]. Here, we found that CLK1 itself can be alternatively spliced. CRC cells may increase the CLK1 expression by regulating the inclusion of exon 4. Other CLKs (CLK2, CLK3 and CLK4) are also expressed in CRC and normal tissues from the RNA-seq data we analyzed. It’s unclear whether the CLK1 splicing change in CRC have a major functional impact of CLKs or not. If the function of this splicing event can be validated by further evidences, exon 4 skipping could be a new target for cancer therapy.

The splicing change of the exon 6 of COL6A3 has been reported previously in colon, bladder, prostate and pancreatic cancers tissues compared to normal tissues [14, 42], indicating that the splicing change may play a role in multiple cancer types. High expression of COL6A3 in stroma were associated with poor prognosis in CRC [43]. The percent of stromal cells does not correlate with the junction usage of COL6A3 (Supplementary Table 2, 8), excluding the possibility that the splicing events is caused by the variability of stroma content in tumor tissues. COL6A3 was also found to be a key hub gene in the cell migration/extracellular matrix module that was associated with poor prognosis in CRC [44]. COL6A3 knockout decreases cell proliferation and invasion, increases cell apoptosis in cancer cell lines [44]. Taken together, the relevance and importance of COL6A3 to CRC tumorigenesis were highlighted. Our finding of exon 6 splicing change added more complexity of the role of COL6A3 in CRC and this may serve as an additional biomarker in the diagnosis of CRC.

The expression of alternatively spliced CD44 adhesion molecules has been implicated in the pathogenesis and metastasis of colorectal cancer. mRNA expression, different splice isoform expression or protein isoform expression have been used in different studies. However, the results are usually conflicting. Either positive correlation [27, 45,46,47,48] or no correlation [49] to CRC or metastasis has been reported. Our study suggests that isoform CD44v8–10 is upregulated in CRC and liver metastasis tissue with relative downregulation of CD44s. However, metastasis did not show further increase of CD44v8–10 compared to CRC. Therefore, CD44v8–10 or maybe the ratio of CD44v8–10/CD44s could be used as a CRC biomarker.

We identified four genes (ARHGEF9, CHEK1, HKDC1 and HNF4A) with alternative first exon regulation in CRC. Although some studies indicated that many of these genes are linked to tumorigenesis or metastasis, the detailed functions of these splicing events in CRC have not been reported. ARHGEF9 has been shown to play a role in tumor cell migration, invasion and metastasis by linking oncogene CHD1L and Cdc42 pathway in hepatocellular carcinoma (HCC) [50]. HKDC1 encodes the hexokinase domain containing 1, which catalyzes the phosphorylation of glucose. Its high expression in hepatocarcinoma (HCC) is related to poor overall survival (OS) [51]. And it is also predicted to be a novel therapeutic target in lung cancer [52]. CHEK1 contributes to CDC25C-mediated Docetaxel resistance and can also be a therapeutic target in prostate cancer [53]. In HNF4A gene, the promoter P1 driven isoforms (expressing exon 1A) were decreased in CRCs and MCs compared to the promoter P2-driven isoforms (expressing exon 1D) (Fig. 3d, supplementary Figure 7). It was reported that P1-HNF4a is expressed primarily in the differentiated compartment of the mouse colonic crypt and P2-HNF4a in the proliferative compartment. The mice that could only produce P2-HNF4a experienced more colitis and developed more tumors than normal mice [54]. Taken together, the splicing changes of these genes identified in this study may contribute to tumorigenesis and can be better biomarkers than gene expression in CRC.

In this study, AS of two genes (SERPINA1 and CALD1) were found to be associated with metastasis. For SERPINA1, although the two splice isoforms have the same start codon in exon 4, their different 5’UTR sequences may contribute to different RNA decay or protein translation of the gene. Elevated expression of SERPINA1 has been associated with the advanced stage, lymph node metastasis, poor prognosis and shorter overall survival in CRC [55] and gastric cancer [56]. For CALD1 exon 6 skipping, the same splicing event was reported to be present in colon, bladder and prostate tumors compared to normal tissues [14]. The isoform expressed in metastatic CRC samples matches the low-molecular-weight isoforms (L-CAD), specifically encoded by WI-38 L-CAD II (transcript variant 2). The same isoform was significantly associated with poorer prognosis in urothelial bladder carcinoma (BC) [57]. L-CaD was also linked to lymph node metastasis and poorer prognosis in oral cavity squamous cell carcinoma (OSCC) [58].

The logistic regression analysis generated 17 models using 2 or 3 junctions as predictors with an average AUC above 0.99. This indicated that the splicing events identified here can be used as potential diagnosis biomarkers in CRC. It remains unclear whether the splicing events can be detected in circulating tumor cells. Although doing RNA-seq using patient samples is not feasible in the clinical setting, easier experimental approaches, such as RT-qPCR, NanoString, or AmpliSeq can be designed using as few as two or three genes of the 8 genes identified in this study.

We have identified two genes (COL6A3 and HKDC1) with AS associated with overall survival. The high gene expression of COL6A3 in stroma has been linked to poor overall survival in CRC [43], while high expression of gene HKDC1 is related to poor overall survival in hepatocarcinoma [51]. However, it’s still unclear whether the splicing isoforms of these two genes have the same functions. It might suggest that the splice isoforms have variable functions in different cancer types. More data is required to illustrate the functional link between the isoforms and patient survival.

Zong et al. have developed a prognostic predictors model using AS pattern of 13 genes identified from TCGA data [59]. However, normal tissue controls had not been used in that study. It’s not clear whether those splicing events are different in normal tissues.


مناقشة

The first evidence of the in vivo importance of FN was demonstrated by R. Hynes's group who showed that FN-null mice die during embryonic development (George et al., 1993). The early embryo lethality makes it difficult to study the biological functions of FN in the in vivo models. Therefore, one of the best methodologies to study the function of FN is by selective modification of the gene. Along with this line, Sakai et al. (2001) described a mouse model lacking pFN which showed increased neuronal apoptosis and larger infarction areas after transient focal cerebral ischemia. In an attempt to elucidate the role of the EDB exon, mice lacking this exon were also produced, but showed no obvious abnormalities in vivo (Fukuda et al., 2002).

We have investigated the in vivo role of the EDA exon by constructing mouse strains unable to carry out EDA exon alternative splicing. The EDA +/+ strain showing constitutive expression of the EDA exon in all tissues was obtained without any modification of the coding sequences and gene structure. This novel approach avoided the difficulties found in a previous attempt to produce animals devoid of alternative splicing of the EDB exon in the FN gene where the modification of the gene structure through the introduction of a selection cassette within the introns produced an FN-null allele (Georges-Labouesse et al., 1996). A similar phenomenon has recently been observed in other genes (Lewandoski, 2001). None of these negative effects was observed in our mutant mice, indicating that the insertion of loxP sites within the flanking introns did not modify the normal pre-mRNA transcription and processing.

Moreover, we observed no obvious embryonic mortality nor malformation in any of the homozygous mutant mice analyzed (EDA +/+ and EDA −/− animals), suggesting that the alternative splicing regulation of the EDA exon is not essential for the developmental processes or that it could be compensated by other gene products. The absence of any obvious developmental abnormality in EDA +/+ and EDA −/− mice suggests that the information and postulated roles for the EDA exon obtained by using recombinant FN fragments (Introduction) cannot be extended automatically to the in vivo functions where more complex mechanisms are acting.

EDA +/+ mice have decreased levels of FN in all tissues

The observation of decreased levels of FN in adult EDA +/+ mice, but not in embryos and very young mice (<1 mo old) suggests that different control mechanisms of FN levels are acting before and after puberty. This decrease could be due to one of the following explanations or a combination of them: (1) a decrease in FN mRNA levels (2) a decrease in the secretion rate of FN or (3) an increase in extracellular degradation of FN.

A series of experiments have been performed to test which of these mechanisms, if any, was acting in the EDA +/+ mice. Northern blot experiments showed that the mRNA levels were not directly related to FN protein levels (Figs. 3 and 4 and Fig. S3). Protease levels were similar to those of EDA wt/wt , no additional FN degradation products were seen in EDA +/+ tissue extracts, and we were unable to see a decrease of FN levels in in vitro cultured cells derived from adult organs of EDA +/+ mice. The failure to identify the precise cause of the low FN-EDA + levels suggests that an atypical mechanism might be acting. One possibility is that a specific intracellular trafficking mechanism is able to modulate the levels of EDA + FN forms in adult animals. This mechanism was suggested for polarized secretion of FN forms in airway epithelial cells (Wang et al., 1991). It is interesting to note that Schwarzbauer et al (1989) have shown that the IIICS-0/IIICS-0 dimers were not secreted. It is possible that a similar control in the secretion mechanism could also be present for the EDA + subunits.

However, none of these effects was obvious in cultured fibroblasts from embryos and adult animals, and in the early stages of development of mice. In fact, the decrease in the amount of FN was evident only after 2–3 mo of age, which is after sexual development. Alternatively, a down-regulation of specific tissue inhibitors of MMPs in adult animals would have as its consequence an increase in activity of specific MMPs, a subtle change that direct gelatin zymography analysis will not detect.

Cutaneous wound healing is abnormal in EDA −/− mice

Initially, up to 3 d after wounding, there were no differences in the healing process between the three genotypes (EDA wt/wt , EDA −/− , and EDA +/+ ). This seems to be consistent with the fact that in the first days after wounding, deposited FN is mainly derived from plasma (Clark et al., 1983 ffrench-Constant et al., 1989). It was shown that normal wound healing could be helped by the presence of cFN (ffrench-Constant et al., 1989 Sakai et al., 2001). In fact, in mice devoid of pFN, normal wound healing was reported (Sakai et al., 2001). cFN is produced in situ 3 d after wounding (Clark et al., 1983 ffrench-Constant et al., 1989 Sakai et al., 2001) and a thin layer of cFN deposited on the surface of the wound immediately after injury in pFN-null mice (Sakai et al., 2001). Expression of cFN by the cells found at the base and edges of the wound just beneath the epidermis was observed, and the presence of cFN preceded the migration of epithelial cells that eventually covered the wound (ffrench-Constant et al., 1989). Previous studies have also shown that FN appears in the provisional matrix beneath the migrating epidermis coordinating with the FN-receptor expression on migrating epidermal cells (Clark et al., 1982, 1983 Grinnell, 1984). These data correlate perfectly with our results showing that after that period, despite the formation of granulation tissue and neovascularization, we observed abnormal reepithelization in EDA −/− mice. The granulation tissue of the EDA −/− wounds displayed edematous regions that occur before the ulcerative process. The subsequent epidermal ulceration was accompanied by a proliferative stimulus with the influx of polymorphonuclear leukocytes and macrophages, and a delay in the healing of the wounds. Possible reasons for these phenomena could be related to defects in the basal lamina, a change in integrin receptor levels, and/or a defect in the skin keratinocytes, fibroblasts, or immune system. The basal lamina looked similar in EDA −/− mice compared with EDA wt/wt mice by both Azan-Mallory coloration and the specific immunostaining of laminin. However, we cannot rule out minor differences in one of the other specific proteins that are present in the basal lamina. Moreover, similar levels of α9β1 integrin, one of the EDA receptors (Liao et al., 2002), were observed in skin of the three genotypes. Preliminary attempts to define differences between the EDA wt/wt and EDA −/− genotypes in immune system cells (T/B lymphocytes ratio and delayed hypersensitivity) and in the characteristics of fibroblasts (in vitro cell migration, cell adhesion, and duplication time) failed to show significant differences. However, it remains to be seen if the localization pattern of the integrin receptors or their signaling have been affected in the mutant mice.

The increase in ulceration in the EDA −/− wounds could be the result of a higher rate of cell death in the skin of the mice during wound closure. This does not seem to be the case as the number of positive cells between the EDA wt/wt , EDA −/− , and EDA +/+ wounds in the granulation tissue were similar in the area devoid of ulceration by both TUNEL and caspase-3 assay.

On the basis of these considerations and the data described in Results, we conclude that FN containing the EDA segment plays an essential role in the organization of the granulation tissue and probably in epidermal cell migration, either directly or by interaction with other ECM components.

EDA +/+ and EDA −/− mouse strains have a shorter lifespan

It has been shown that deficiency of SH2-containing inositol-5-phosphatase, lysosomal acid lipase, and DNA topoisomerase IIIβ had no consequences in embryonic development, but shortens the lifespan of the animals (Helgason et al., 1998 Du et al., 2001 Kwan and Wang, 2001). The shortened lifespan could be due to the changes in biological processes, which require the presence of the investigated protein during aging.

In the case of the FN mice, we showed that the absence of regulation of the EDA exon affects the lifespan of mutant animals. In normal animals, a dramatic change in the EDA + /EDA ratio is observed after birth and a gradual decrease of EDA inclusion is observed in the tissues that increases with the age of the animal (Magnuson et al., 1991 Pagani et al., 1991). Alternative splicing of FN is regulated at both the extracellular (ffrench-Constant, 1995 Kornblihtt et al., 1996 Boyle et al., 2000) and the molecular levels (Mardon et al., 1987 Lavigueur et al., 1993 Caputi et al., 1994 Muro et al., 1999). The mutant EDA +/+ and EDA −/− mice have no regulation of splicing of the EDA exon. It was possible that some biological processes that required specific EDA + /EDA − ratios of FN were altered because of the absence of regulation of EDA splicing. In fact, this was shown in this paper for the specific case of cutaneous wound healing in the EDA −/− mice. Furthermore, the low healing efficiency was exacerbated in older mice. In a similar fashion, other maintenance and tissue repair mechanisms could be affected, and the cumulative lower efficiency may result in a decrease in the lifespan of mutant animals. In the specific case of the EDA +/+ mice, due to the dramatic reduction in FN levels in most organs, it remains unclear whether the shortened lifespan seen in EDA +/+ mice was due to a change in FN quantity and/or quality. Although no significant differences have been reported on the lifespan of c129 and C57BL/6 (Smith et al., 1973 Goodrick, 1975 Kunstyr and Leuenberger, 1975), we cannot formally rule out that the differences in chromosome background at the FN EDA locus (C57BL/6 for the EDA wt/wt and c129 with one or two loxP sites for EDA −/− and EDA +/+ , respectively) could be responsible for the observed differences in lifespan.

In summary, we generated mice devoid of regulated splicing at the EDA exon of the FN gene. Surprisingly, both mouse strains showed that the alternative splicing at the EDA exon was dispensable during embryonic development, but it was necessary for a normal lifespan. Moreover, mice unable to incorporate the EDA exon in the FN protein displayed abnormal skin wound healing. On the other hand, mice having constitutive inclusion of the EDA exon showed an important decrease in the FN levels in all tissues.

The results presented here are important for three reasons: first, we presented a novel method to study the function of protein isoforms second, we added valuable information regarding the function of the FN isoforms and third, we showed that changes in the regulation of splicing are responsible for subtle changes in the phenotype that may be present, but undetected, in human pathologies.


Nonsynonymous Mutations

Nonsynonymous mutations have a much greater effect on an individual than a synonymous mutation. In a nonsynonymous mutation, there is usually an insertion or deletion of a single nucleotide in the sequence during transcription when the messenger RNA is copying the DNA. This single missing or added nucleotide causes a frameshift mutation which throws off the entire reading frame of the amino acid sequence and mixes up the codons. This usually does affect the amino acids that are coded for and change the resulting protein that is expressed. The severity of this kind of mutation depends on how early in the amino acid sequence it happens. If it happens near the beginning and the entire protein is changed, this could become a lethal mutation.

Another way a nonsynonymous mutation can occur is if the point mutation changes the single nucleotide into a codon that does not translate into the same amino acid. A lot of times, the single amino acid change does not affect the protein very much and is still viable. If it happens early in the sequence and the codon is changed to translate into a stop signal, then the protein will not be made and it could cause serious consequences.

Sometimes nonsynonymous mutations are actually positive changes. Natural selection may favor this new expression of the gene and the individual may have developed a favorable adaptation from the mutation. If that mutation occurs in the gametes, this adaptation will be passed down to the next generation of offspring. Nonsynonymous mutations increase the diversity in the gene pool for natural selection to work on and drive evolution on a microevolutionary level.