معلومة

ما هو الموقع الخلوي لتركيب الأحماض الأمينية غير الأساسية؟

ما هو الموقع الخلوي لتركيب الأحماض الأمينية غير الأساسية؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هو موقع تخليق الأحماض الأمينية غير الأساسية في الخلية؟ هل هي عضية معينة؟ وما هو الدافع الجيني وراء هذا؟

اعتقدت أن الهدف الكامل للحمض النووي هو ترميز كيفية تصنيع البروتينات وأنه آلية التعبير الجيني. ثلاثة توائم من النيوكليوتيدات عبارة عن أكواد للأحماض الأمينية وهي الحبيبات التي تعمل بها الخلية.

الآن تبين أن الخلايا تعرف كيف تصنع أكثر من نصف الأحماض الأمينية العشرين لدى البشر ، وأنا لا أرى ، في الويب ، نصوصًا جيدة لكيفية عملها ، وأين ، وكيف يتم ترميزها.

شكرا لك للمساعدة في إلقاء بعض الضوء.


أعتقد أنك على حق تقريبًا. يتم نسخ الحمض النووي (في النواة) إلى mRNA ، ويحدث تخليق البروتين على الريبوسومات حيث يتم ترجمة تسلسل القواعد في mRNA إلى بروتين. توجد الريبوسومات في السيتوبلازم أو متصلة بالشبكة الإندوبلازمية. (تم سرد "قصة mRNA" جيدًا في من اكتشف mRNA؟)

ولكن هناك أيضًا نوع آخر من الحمض النووي الريبي (RNA) مهم لتخليق البروتين ، وهو نقل الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي): يرتبط كل حمض أميني بجزيء "محول" (tRNA) وهذا الشكل من الأحماض الأمينية المستخدمة بواسطة الريبوسوم. إنه جزيء المحول (الحمض الريبي النووي النقال المشحون بحمض أميني) الذي يحتوي على الكودون المضاد ، الذي يتزاوج مع الرنا المرسال أثناء التخليق الحيوي للبروتين.

من أجل إجراء عملية التخليق الحيوي للبروتين ، تحتاج الخلية إلى إمدادات من الأحماض الأمينية ، "اللبنات الأساسية" للبروتينات. ومن هنا تفكيرك (ربما) مرتبك بعض الشيء؟ قد تأتي اللبنات الأساسية لهضم البروتين في الطعام ، أو قد يتم تصنيعها بواسطة الكائن الحي. إذا كان من الممكن تصنيعها "de novo" ، ربما بدءًا من دورة حل الجلوكوز أو دورة كريبس الوسيطة ، فإنها (عادةً) تعتبر غير ضرورية. ما تعتبر الأحماض الأمينية ضرورية أو غير ضرورية يعتمد على الكائن الحي. لا يستطيع البشر ، على سبيل المثال ، تخليق "de novo" الأحماض الأمينية العطرية Phe أو Tyr أو Trp ، لكننا علبة تحويل Phe إلى Tyr. من ناحية أخرى ، يمكن للإشريكية القولونية أن تصنع كل هذه الأحماض الأمينية الثلاثة من كتل بناء بسيطة ، لكن لا يمكنها تحويل Phe إلى Tyr (انظر Miller & Simmonds). وبالتالي ، يعتبر Tyr غير ضروري للبشر (بشرط توفر إمدادات كافية من Phe).

عادة ما تكون المسارات الكيميائية الحيوية المؤدية إلى التخليق الحيوي للأحماض الأمينية معقدة للغاية ، مع إشراك العديد من المنتجات الجينية (الإنزيمات). تم سرد قصة التخليق الحيوي للأحماض الأمينية جيدًا في Umbarger (1978): التخليق الحيوي للأحماض الأمينية وتنظيمها.


هناك العديد من الإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي للأحماض الأمينية. يتم ترميز بعض هذه الإنزيمات في الجينوم البشري. يمكنك التحقق من KEGG للحصول على مسار مفصل في الكائنات الحية المختلفة.

تشير الأسهم الخضراء إلى التفاعلات (والإنزيمات) الموجودة في كائن حي معين (الانسان العاقل، في هذه الحالة). إذا قمت بالنقر فوق الأسهم ، يمكنك معرفة تفاصيل الإنزيم.

هذه الإنزيمات موجودة في السيتوبلازم وكذلك في الميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، يتم إنتاج المواد المتفاعلة لتخليق بعض الأحماض الأمينية في الميتوكوندريا (وسيطة دورة TCA). انظر هذا المقال عن دور الميتوكوندريا في استقلاب الأحماض الأمينية.

نظرة عامة على شبكة التمثيل الغذائي للأحماض الأمينية في الميتوكوندريا البشرية. تمثل المناطق المظللة الأجزاء السيتوبلازمية من المسارات.


امتحان 2 الكيمياء الحيوية الدور الاول

القمع - يبطئ النسخ من الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي.

بروتين كيناز - هم من خلال مجموعة فوسفاتية على إنزيم مستهدف.

بمجرد أن تحسب هذا ، ماذا تعني الأرقام؟

إذا كانت دلتا G أقل من الصفر ، فسيتم المضي قدمًا.

إذا كانت دلتا G أكبر من الصفر ، فهذا هو رد الفعل العكسي.

إذا كانت دلتا G تساوي صفرًا ، فهي في حالة توازن.

يتكون من كتلتين مسطحتين _______________ ، متصلتين بمفصلة ، بقضيب _______ ملحوم في الجزء الخلفي من كل كتلة.

تحتوي الكتل المعدنية على ___________ أكبر بكثير من الأنسجة المراد أخذ عينات منها.

يتم إحضار الملقط إلى _______C في سائل ___.

بدون مقاطعة تدفق الدم ، يكون العضو / الأنسجة ____________ بين الصفائح ، باستخدام تأثير كبير للقضبان الطويلة ، وضغطه حتى يصل سمكه إلى ______ مم.

تؤدي درجة الحرارة المنخفضة للغاية ، والمعدل العالي لانتقال الحرارة إلى الصفائح المعدنية ، والعينة الرقيقة إلى أوقات تجمد تصل إلى أقل من ثانية واحدة لمعدل الكبد أو القلب. ______________ توقف.

المنتجات لها _________ طاقة مختلفة للمنتجات.

يمكن أن يكون رد الفعل الأول ATP

تفاعل مع إنزيم أو ركيزة ، واستخدم نقل الفوسفات أو البيروفوسفات أو الأدينيل إلى أي منهما.

يمكن أن تصبح مجموعة نقل أو مجموعة مغادرة من هنا.

اجمع طاقات التفاعلين لتحديد دلتا G للتفاعل الكلي.

Tyrosine ضروري عندما لا يكون Phe موجودًا - Tyrosine مصنوع من Phe.

يحتوي على البيبسين ، الذي ينشق بعد Phe و Leu و Glu. يكون الرقم الهيدروجيني المنخفض أكثر تساويًا للكهرباء ، مما سيساعد في إنشاء مثل الشحنات للتنافر وفصل الجزيء - وهذا يساعد البيبسين على الوصول إلى هناك. لن يتمكن البروتين من الانثناء مرة أخرى لأنه لم يعد بروتينًا كاملاً.

هناك بروتياز محايد - يعمل عند درجة حموضة محايدة - كيموتريبسين (مركبات عطرية) - التربسين (ليسين وأرجينين) - كاربوكسي ببتيداز - يأخذ AA واحدًا في كل مرة على طرف الكربوكسيل. Elastase - يشق الإيلاستين وهو نسيج عالي المرونة يوجد في النسيج الضام.


مقدمة

تتمثل إحدى السمات العالمية لتكرار الحمض النووي حقيقية النواة في تكرار الجينوم مرة واحدة ومرة ​​واحدة فقط في كل مرة تنقسم فيها الخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعطيل مجمعات ما قبل النسخ المتماثل الحالية (pre-RCs) بعد بدء المرحلة S ، ولكن بشكل متزامن مع منع تجميع ما قبل RCs الجديدة حتى يكتمل الانقسام ويوجد غشاء نووي. يتم إبراز أهمية هذا المبدأ من خلال حقيقة أن التكرار الداخلي (جولات متعددة من تكرار الحمض النووي في غياب الانقسام المتداخل) هو حدث نادر. في الثدييات ، يحدث فقط في خلايا الأرومة الغاذية العملاقة المتمايزة نهائيًا وفي الخلايا العملاقة.

يبدأ تكرار الحمض النووي حقيقية النواة بربط مجمع التعرف على الأصل (ORC) بالحمض النووي ، وهو حدث يتم تنظيمه من خلال التغييرات المعتمدة على دورة الخلية في واحدة أو أكثر من الوحدات الفرعية الست ORC (DePamphilis ، 2005). في الثدييات ، يبدو أن هذه التغييرات خاصة بأكبر وحدة فرعية ORC ، Orc1. يتكون ORC للثدييات من مجمع أساسي مستقر من وحدات ORC الفرعية Orc2 و Orc3 و Orc4 و Orc5 [المشار إليها هنا باسم ORC (2-5)] التي ترتبط بشكل ضعيف مع Orc1 و Orc6 (دار وآخرون ، 2001 Giordano-Coltart et al. ، 2005 Kneissl et al. ، 2003 Vashee et al. ، 2001). يعتبر تفاعل Orc1 مع المركب الأساسي ORC في وجود ATP ضروريًا لربط ORC بالحمض النووي ولتجميع المواد الأولية في المختبر (Giordano-Coltart et al. ، 2005). يؤكد التثبيط الانتقائي لتخليق Orc1 في الخلايا المستنبتة أنه مطلوب أيضًا لتجميع ما قبل RCs في الجسم الحي (Ohta et al. ، 2003) ، والفقدان الانتقائي لـ Orc1 من الكروماتين أثناء الانقسام الفتيلي يفسر حقيقة أن كروماتين الثدييات الطور الطوري سوف لا تتكاثر في ORC المستنفدة Xenopus مستخلصات البيض (Li et al. ، 2000 Natale et al. ، 2000 Yu et al. ، 1998).

يبدو أن نشاط ORC في خلايا الثدييات ينظمه التغيرات المعتمدة على دورة الخلية في ارتباط Orc1 مع مواقع الكروماتين ORC (DePamphilis ، 2005). تتضمن ما يسمى بـ "دورة ORC" للثدييات ثلاثة تغييرات محددة في Orc1 (انظر الرسم البياني في الشكل 10). أولاً ، يتم تقليل تقارب Orc1 للكروماتين بشكل انتقائي مع دخول خلايا الثدييات المرحلة S (Kreitz et al. ، 2001 Li and DePamphilis ، 2002 Ohta et al. ، 2003) ، وهو تغيير ينعكس في حقيقة أن Orc1 لم يعد قادرًا على ذلك. أن تكون متشابكة مع الحمض النووي في خلايا الطور S (Abdurashidova et al. ، 2003 Ladenburger et al. ، 2002). على النقيض من ذلك ، يظل قلب ORC (2-5) مرتبطًا بشكل ثابت بالكروماتين خلال انقسام الخلية (تمت مناقشته في DePamphilis ، 2005). ثانيًا ، يخضع Orc1 للانتشار في كل مكان خلال المرحلة S (Fujita et al. ، 2002 Li and DePamphilis ، 2002 Mendez et al. ، 2002 Ritzi et al. ، 2003 Tatsumi et al. ، 2003). في الخلايا البشرية المحولة ، يتحلل 70-90 ٪ من HsOrc1 بشكل انتقائي خلال المرحلة S بواسطة آلية تعتمد على اليوبيكويتين (Fujita et al. ، 2002 Mendez et al. ، 2002 Ritzi et al. ، 2003 Tatsumi et al. ، 2003) (AV ، بيانات غير منشورة). يتم بعد ذلك إعادة تصنيع HsOrc1 وربطه بالكروماتين أثناء الانتقال من طور M إلى G1. أخيرًا ، يكون Orc1 مفرطًا في الفسفرة خلال مرحلة G2-M ، نتيجة لارتباطه بـ CcnA-Cdk1 (Li et al. ، 2004 Tatsumi et al. ، 2000 Thome et al. ، 2000). نظرًا لأن تثبيط نشاط CDK في الخلايا الطورية يتسبب في الارتباط السريع لـ Orc1 (Li et al. ، 2004) وبروتينات صيانة الكروموسوم (MCM) (Ballabeni et al. ، 2004) بالكروماتين ، والبدء المبكر لتكرار الحمض النووي (Itzhaki et al. ، 1997) ، يُفترض أن فرط فسفرة Orc1 أثناء مرحلة G2-M يمنع ارتباطها المستقر بمواقع الكروماتين ORC (2-5). هذا من شأنه أن يفسر عدم وجود مواقع كروماتين ORC وظيفية على الكروماتين الطوري (Li et al. ، 2000 Natale et al. ، 2000 Yu et al. ، 1998). يعيد Orc1 الارتباط بإحكام مع الكروماتين أثناء الانتقال من المرحلة M إلى G1 (Li and DePamphilis ، 2002 Mendez et al. ، 2002 Natale et al. ، 2000) متبوعًا بظهور ما قبل RCs في مواقع جينومية محددة (Li et al. ، 2000 Natale et al. ، 2000).

تسبب التعبير خارج الرحم لـ CHO (Cg) Orc1 في فقدان التصاق الخلية في ظل ظروف لم يحدث فيها التعبير خارج الرحم عن CgOrc2. (أ) تم نقل خلايا CHO بكمية إما pCgOrc1 (•) أو pCgOrc2 () المشار إليها ثم حضنت لمدة 36 ساعة قبل تحديد جزء الخلايا غير المرتبطة. (ب) تم نقل خلايا CHO باستخدام 1 ميكروغرام من pCgOrc1 (•) أو pCgOrc2 () ثم حضنت للأوقات المشار إليها قبل تحديد جزء الخلايا غير المرتبطة. تم طرح البيانات التي تحتوي على pCI وحده من بيانات pCgOrc1 و pCgOrc2. تشير المناطق المظللة إلى الظروف التي أعطى فيها pCgOrc2 و pCI نتائج لا يمكن تمييزها. (C) تم نقل خلايا CHO باستخدام 1 ميكروغرام من pFCgOrc1 (FOrc1) أو pFCgOrc2 (FOrc2) للأوقات المشار إليها في ساعات ما بعد تعداء (post-T). تم قياس كمية FOrc1 و FOrc2 في إجمالي عدد الخلايا (مرفقة وغير مرتبطة) عن طريق التكتل المناعي باستخدام الجسم المضاد لـ FLAG. تم اكتشاف نطاق واحد تم ترحيله كـ ∼100 كيلو دالتون لـ FOrc1 و 65 كيلو دالتون لـ FOrc2. (D) تم فصل خلايا CHO ، المنقولة كما في اللوحة A ، إلى تلك التي رفعت من الطبق (غير مرتبطة) وتلك التي ظلت متصلة. تم فحص نصف الخلايا غير المرتبطة و 10 4 خلايا متصلة إما لـ FOrc1 أو FOrc2. (E) تم فصل خلايا CHO ، المنقولة كما هو الحال في اللوحة B ، إلى خلايا متصلة وغير مرتبطة قبل اختبار FOrc1 و FOrc2 للأوقات المشار إليها. في كل تجربة ، تم تجزئة بروتينات الخلية المرفقة وغير المرتبطة في نفس الهلام ، ونقلها إلى نفس اللطخة المناعية ، واكتشافها بنفس الجسم المضاد لـ FLAG لضمان المقارنة الدقيقة.

تسبب التعبير خارج الرحم لـ CHO (Cg) Orc1 في فقدان التصاق الخلية في ظل ظروف لم يحدث فيها التعبير خارج الرحم عن CgOrc2. (أ) تم نقل خلايا CHO بكمية إما pCgOrc1 (•) أو pCgOrc2 () المشار إليها ثم حضنت لمدة 36 ساعة قبل تحديد جزء الخلايا غير المرتبطة. (ب) تم نقل خلايا CHO باستخدام 1 ميكروغرام من pCgOrc1 (•) أو pCgOrc2 () ثم حضنت للأوقات المشار إليها قبل تحديد جزء الخلايا غير المرتبطة. تم طرح البيانات التي تحتوي على pCI وحده من بيانات pCgOrc1 و pCgOrc2. تشير المناطق المظللة إلى الظروف التي أعطى فيها pCgOrc2 و pCI نتائج لا يمكن تمييزها. (C) تم نقل خلايا CHO باستخدام 1 ميكروغرام من pFCgOrc1 (FOrc1) أو pFCgOrc2 (FOrc2) للأوقات المشار إليها في ساعات ما بعد تعداء (post-T). تم قياس كمية FOrc1 و FOrc2 في إجمالي عدد الخلايا (مرفقة وغير مرتبطة) عن طريق التخمير المناعي باستخدام الجسم المضاد لـ FLAG. تم اكتشاف نطاق واحد تم ترحيله كـ ∼100 كيلو دالتون لـ FOrc1 و 65 كيلو دالتون لـ FOrc2. (D) تم فصل خلايا CHO ، المنقولة كما في اللوحة A ، إلى تلك التي رفعت من الطبق (غير مرتبطة) وتلك التي ظلت متصلة. تم فحص نصف الخلايا غير المرتبطة و 10 4 خلايا متصلة إما لـ FOrc1 أو FOrc2. (E) تم فصل خلايا CHO ، المنقولة كما هو الحال في اللوحة B ، إلى خلايا متصلة وغير مرتبطة قبل اختبار FOrc1 و FOrc2 للأوقات المشار إليها. في كل تجربة ، تم تجزئة بروتينات الخلية المرفقة وغير المرتبطة في نفس الهلام ، ونقلها إلى نفس اللطخة المناعية ، واكتشافها بنفس الجسم المضاد لـ FLAG لضمان المقارنة الدقيقة.

على الرغم من أن هذه الدراسات تشير إلى أن نشاط ORC في خلايا الثدييات يتم تنظيمه من خلال التغييرات المعتمدة على دورة الخلية في Orc1 ، فقد أشارت دراسات أخرى إلى أن هذا قد لا يكون هو الحال دائمًا. على عكس خلايا HeLa ، يظل المستوى داخل الخلايا لـ Orc1 في خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) ثابتًا طوال انقسام الخلية (Li and DePamphilis، 2002 Li et al.، 2004 Natale et al.، 2000 Okuno et al.، 2001) ، وقد تم تأكيد هذا الاختلاف في دراسات موازية تحت ظروف مماثلة (SG ، بيانات غير منشورة). علاوة على ذلك ، على الرغم من إمكانية وجود كل من الهامستر و Orc1 البشري في كل مكان في الجسم الحي وفي المختبر (Li and DePamphilis ، 2002 Mendez et al. ، 2002) (SG ، بيانات غير منشورة) ، تم اكتشاف شكل أحادي الانتشار من Orc1 فقط خلال المرحلة S في بعض الدراسات (Li and DePamphilis ، 2002) ، ولكن ليس في دراسات أخرى (Okuno et al. ، 2001). علاوة على ذلك ، لا يوجد دليل على أن الانتشار الأحادي في كل مكان لـ Orc1 يتداخل مع وظيفته. وبالمثل ، فإن تأثيرات فرط الفسفرة على قدرة Orc1 على المشاركة في تكرار الحمض النووي متضمنة من تثبيط أنشطة بروتين كينيز في الخلايا الطورية ، وعدم وجود دليل مباشر.

لتحديد ما إذا كان الانتشار الأحادي في كل مكان وفرط الفسفرة لـ Orc1 يمكن ، في الواقع ، قمع وظيفة Orc1 ، المعدلة وغير المعدلة ORC1 تم التعبير عن الجينات بشكل عابر في خلايا CHO و HeLa ، وتم مقارنتها بآثار Orc2 المعبر عنها بشكل عابر. أظهرت النتائج أن التغييرات المعتمدة على دورة الخلية في Orc1 الموصوفة أعلاه يمكن أن تؤثر في الواقع على نشاط ORC الذي ينشطه أثناء الانتقال من المرحلة M إلى المرحلة G1 ، وقمعه أثناء الانتقال من المرحلة S إلى المرحلة M. بشكل غير متوقع ، كشفت هذه التجارب أيضًا أن Orc1 غير المعدلة يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج الذي كان مشابهًا للخلايا الأبوطوزية التي نشأت تلقائيًا أثناء تكاثر الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن نفس التعديلات التي منعت Orc1 من المشاركة في تكرار الحمض النووي قد حيدت أيضًا قدرتها على إحداث موت الخلايا المبرمج ، مما يشير إلى أن الفشل في تنظيم نشاط ORC أثناء نمو الثدييات يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا.


النتائج

جيل من mESCs تفتقر إلى Y RNAs

استخدمنا نظام CRISPR-Cas9 لإنشاء خطوط mESC تحتوي على عمليات حذف لكل من جينات Y RNA الصادقين: Rny1 و Rny3. اخترنا خلايا الفأر بسبب العدد القليل من الحمض النووي الريبي المميز Y في هذه الخلايا وانخفاض عدد الجينات الكاذبة ، مقارنة بالخلايا البشرية. على وجه التحديد ، بينما تحتوي الخلايا البشرية على & gt1000 Y RNA pseudogenes ، تحتوي الفئران على أقل من 60 (16). على الرغم من أن معظم هذه التسلسلات تفتقر إلى محفزات RNA polymerase III وتحتوي على طفرات تمنع ارتباط Ro60 (16 ، 48) ، على الأقل يتم نسخ بعض التسلسلات ، ربما بسبب انتشار البوليميراز II أو كجزء من ما قبل الرنا المرسال الناشئ (36 ، 49) . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون استخدام mESCs بمثابة منصة للدراسات المستقبلية على الفئران.

أنشأنا سطرين خلويين مستقلين يفتقران إلى كل من RNAs Y للماوس. باستخدام النشاف الشمالي ، أكدنا أن الحمض النووي الريبي المتوقع لم يكن قابلاً للاكتشاف عند أي منهما آكانيوزذ1 أو Rny3 تم حذفه (الشكل 1 أ). كما لوحظ سابقًا (21) ، يتم تقليل الحمض النووي الريبي Y1 و Y3 بمقدار 9.5 و 4.5 ضعفًا ، على التوالي ، في Ro60 - / - مسك (الشكل 1 أ ، الممرات 1-2). علاوة على ذلك ، أظهرت الخلايا التي تفتقر إلى الحمض النووي الريبي Y1 أو Y3 مستويات متزايدة بشكل طفيف من الحمض النووي الريبي الآخر (الشكل 1 أ ، الممرات 5-8 و 1 ب) والتي قد تعكس زيادة الاستقرار بوساطة Ro60 للحمض النووي الريبي المتبقي. نظرًا لأن RNAs Y1 و Y3 يمكن أن يكون لها وظائف متداخلة أو زائدة عن الحاجة ، فقد أنشأنا أيضًا mESCs تفتقر إلى كل من RNAs (الشكل 1A ، الممرات 9-10).

mESCs التي تفتقر إلى Y RNAs قابلة للحياة وتنقسم بشكل طبيعي. (أ) RNA من اثنين Ro60 - / - خطوط mESC ، mESCs من النوع البري ، mESCs تحمل ناقل lentiCRISPR v2 الفارغ (WT *) واثنان مستقلان Rny1 −/− , Rny3 - / - و Rny1 −/− Rny3 - / - تعرضت خطوط mESC إلى النشاف الشمالي للكشف عن Y1 و Y3 RNAs. 5S rRNA ، والتحكم في التحميل. (ب) تقدير مستويات الحمض النووي الريبي Y1 و Y3 في كل خط خلوي بالنسبة إلى mESCs من النوع البري (الممر 3 في A). تمثل البيانات ثلاث مكررات بيولوجية وتظهر على أنها تعني ± SEM. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. * ، ص & lt 0.05 *** ، ص & lt 0.001. (ج) ملامح دورة الخلية من النوع البري ، Ro60 - / - واثنان مستقلان Rny1 - / - Rny3 - / - مسك. تم قياس دمج BrdU عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم عرض النسبة المئوية للخلايا في مراحل G1 و S و G2 / M من دورة الخلية. تمثل البيانات يعني ± SEM (ن = 6).

mESCs التي تفتقر إلى Y RNAs قابلة للحياة وتنقسم بشكل طبيعي. (أ) RNA من اثنين Ro60 - / - خطوط mESC ، mESCs من النوع البري ، mESCs تحمل ناقل lentiCRISPR v2 الفارغ (WT *) واثنان مستقلان Rny1 −/− , Rny3 - / - و Rny1 −/− Rny3 - / - تعرضت خطوط mESC للنشاف الشمالي للكشف عن Y1 و Y3 RNAs. 5S rRNA ، والتحكم في التحميل. (ب) تقدير مستويات الحمض النووي الريبي Y1 و Y3 في كل خط خلوي بالنسبة إلى mESCs من النوع البري (الممر 3 في A). تمثل البيانات ثلاث مكررات بيولوجية وتظهر على أنها تعني ± SEM. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. * ، ص & lt 0.05 *** ، ص & lt 0.001. (ج) ملامح دورة الخلية من النوع البري ، Ro60 - / - واثنان مستقلان Rny1 - / - Rny3 - / - مسك. تم قياس دمج BrdU عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم عرض النسبة المئوية للخلايا في مراحل G1 و S و G2 / M من دورة الخلية. تمثل البيانات يعني ± SEM (ن = 6).

Y RNAs ليست مطلوبة لتكرار الحمض النووي

على الرغم من الإبلاغ عن أن Y RNAs ضرورية لتكرار الحمض النووي في أنواع الفقاريات (38-40 ، 50-52) ، Rny1 −/− Rny3 - / - افتقرت mESCs إلى عيوب نمو واضحة. لذلك قمنا بمقارنة دورات الخلايا من النوع البري ، Ro60 - / - واثنان مستقلان Rny1 −/− Rny3 - / - خطوط الخلايا.كشف وضع العلامات باستخدام bromodeoxyuridine (BrdU) ، متبوعًا بقياس التدفق الخلوي ، عن دورات خلوية مماثلة لجميع خطوط الخلايا الأربعة (الشكل 1C). نستنتج أن Y RNAs ليست ضرورية لتكرار الحمض النووي في mESCs.

مطلوب RNAs لـ Ro60 للتراكم إلى مستويات من النوع البري

ومن المثير للاهتمام ، في mESCs التي تفتقر إلى كل من Y1 و Y3 RNAs ، انخفضت مستويات Ro60 و gt2 أضعاف (الشكل 2 أ). للتأكد من أن مستويات Ro60 المنخفضة كانت بسبب نقص Y RNAs ، قمنا بتوليد مستقرة Rny1 −/− Rny3 - / - الخلايا التي Rny1 و / أو Rny3 تم دمج الجينات المحورة في مواقع خارج الرحم (الشكل 2 ب). على الرغم من أن تعبير Y1 RNA من الجينات المحورة كان مشابهًا لتعبير الخلايا من النوع البري ، فإن تعبير Y3 RNA كان 45 ٪ فقط من الخلايا من النوع البري (الشكل 2B ، قارن الممر 1 بالممرات 5 و 6). الأهم من ذلك ، أن التعبير عن Y1 أعاد تعبير Ro60 بتنسيق Rny1 −/− Rny3 - / - أدت الخلايا القريبة من مستويات النوع البري والتعبير عن Y3 في هذه الخلايا إلى زيادة مستويات Ro60 على الخلايا التي تحمل المتجه الفارغ فقط (الشكل 2C). نستنتج أن Y RNAs مطلوبة لكي يتراكم Ro60 إلى مستويات من النوع البري.

تعتبر Y RNAs مهمة لتراكم Ro60. (أ) مستويات Ro60 في قسمين Ro60 - / - خطوط mESC ، mESCs من النوع البري ، mESCs تحمل ناقل lentiCRISPR v2 الفارغ (WT *) واثنان مستقلان Rny1 −/− , Rny3 - / - و Rny1 −/− Rny3 - / - تم قياس خطوط مسك بواسطة النشاف الغربي (اللوحة اليسرى). ActB هو عنصر تحكم التحميل. اللوحة اليمنى ، تقدير مستويات بروتين Ro60 من ثلاث مكررات بيولوجية. البيانات تعني ± SEM تطبيعها إلى ActB. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. *** ، ص & lt 0.001. (بتم استخدام النشاف الشمالي لمقارنة مستويات Y RNAs في النوع البري ، Rny1 −/− Rny3 - / - مسك و Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs التي تعبر عن pUB6 / V5 / ناقله A الفارغ أو نفس المتجه المحتوي على Rny1, Rny3 أو كلا الجينات المعدلة. 5S rRNA هو عنصر تحكم في التحميل. (ج) ليساتس من النوع البري ، Rny1 - / - Rny3 - / - و Rny1 - / - Rny3 - / - mESCs معربا عن ناقل فارغ أو نفس المتجه الذي يحتوي على Rny1, Rny3 أو كلا الجينين المتحولين قد تعرضوا للتخثر المناعي للكشف عن Ro60 (اللوحة اليسرى). ActB ، التحكم في التحميل. اللوحة اليمنى ، تقدير مستويات Ro60 في كل خط خلية مقارنةً بـ mESCs من النوع البري. البيانات تعني ± SEM (ن = 3) تطبيع إلى ActB. ص تم حساب القيم باستخدام ثنائي الطرف غير مزدوج ر-اختبار **، ص & lt 0.01 *** ، ص & lt 0.001. (د) الهياكل الثانوية المحتملة لـ Y1 و Y3 و Y1 RNA و Y1-S ، حيث تم استبدال الحلقة الداخلية الكبيرة لـ Y1 بـ CUUG tetraloop. موقع التجليد Ro60 محاصر. (ه) لطخة شمالية تظهر تعبير Y1-S في قسمين مستقلين Rny1 −/− Rny3 - / - خطوط مسك. (F) تم استخدام النشاف الغربي لمقارنة مستويات Ro60 في mESCs من النوع البري ، Rny1 −/− Rny3 - / - مسك و Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs التي تعبر عن المتجه الفارغ أو نفس المتجه الذي يحتوي على التحوير Y1-S (اللوحة اليسرى). ActB هو عنصر تحكم التحميل. اللوحة اليمنى ، تقدير كمية بروتين Ro60 في كل خط خلية مقارنة بالخلايا من النوع البري. البيانات تعني ± SEM (ن = 3) تطبيع إلى ActB. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. ** ، ص & lt 0.01 *** ، ص & lt 0.001. (جي) تحليلات RT-qPCR لمستويات Ro60 mRNA في mESCs من النوع البري ، mESCs التي تحمل ناقل lentiCRISPR v2 الفارغ (WT *) ، Rny1 −/− , Rny3 - / - و Rny1 −/− Rny3 - / - مسك. البيانات تعني ± SEM (ن = 3) ، تم تطبيعها إلى β-actin و Gapdh mRNAs. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه للتحليلات الإحصائية.

تعتبر Y RNAs مهمة لتراكم Ro60. (أ) مستويات Ro60 في قسمين Ro60 - / - خطوط mESC ، mESCs من النوع البري ، mESCs تحمل ناقل lentiCRISPR v2 الفارغ (WT *) واثنان مستقلان Rny1 −/− , Rny3 - / - و Rny1 −/− Rny3 - / - تم قياس خطوط مسك بواسطة النشاف الغربي (اللوحة اليسرى). ActB هو عنصر تحكم التحميل. اللوحة اليمنى ، تقدير مستويات بروتين Ro60 من ثلاث مكررات بيولوجية. البيانات تعني ± SEM تطبيعها إلى ActB. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. *** ، ص & lt 0.001. (بتم استخدام النشاف الشمالي لمقارنة مستويات Y RNAs في النوع البري ، Rny1 −/− Rny3 - / - مسك و Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs التي تعبر عن pUB6 / V5 / ناقله A الفارغ أو نفس المتجه المحتوي على Rny1, Rny3 أو كلا الجينات المعدلة. 5S rRNA هو عنصر تحكم في التحميل. (ج) ليساتس من النوع البري ، Rny1 - / - Rny3 - / - و Rny1 - / - Rny3 - / - mESCs معربا عن ناقل فارغ أو نفس المتجه الذي يحتوي على Rny1, Rny3 أو كلا الجينين المحولين قد تعرضوا للتخثر المناعي للكشف عن Ro60 (اللوحة اليسرى). ActB ، التحكم في التحميل. اللوحة اليمنى ، تقدير مستويات Ro60 في كل خط خلية مقارنةً بـ mESCs من النوع البري. البيانات تعني ± SEM (ن = 3) تطبيع إلى ActB. ص تم حساب القيم باستخدام ثنائي الطرف غير مزدوج ر-اختبار **، ص & lt 0.01 *** ، ص & lt 0.001. (د) الهياكل الثانوية المحتملة لـ Y1 و Y3 و Y1 RNA و Y1-S ، حيث تم استبدال الحلقة الداخلية الكبيرة لـ Y1 بـ CUUG tetraloop. موقع التجليد Ro60 محاصر. (ه) لطخة شمالية تظهر تعبير Y1-S في قسمين مستقلين Rny1 −/− Rny3 - / - خطوط مسك. (F) تم استخدام النشاف الغربي لمقارنة مستويات Ro60 في mESCs من النوع البري ، Rny1 −/− Rny3 - / - مسك و Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs التي تعبر عن المتجه الفارغ أو نفس المتجه الذي يحتوي على التحوير Y1-S (اللوحة اليسرى). ActB هو عنصر تحكم التحميل. اللوحة اليمنى ، تقدير كمية بروتين Ro60 في كل خط خلية مقارنة بالخلايا من النوع البري. البيانات تعني ± SEM (ن = 3) تطبيع إلى ActB. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. ** ، ص & lt 0.01 *** ، ص & lt 0.001. (جي) تحليلات RT-qPCR لمستويات Ro60 mRNA في mESCs من النوع البري ، mESCs التي تحمل ناقل lentiCRISPR v2 الفارغ (WT *) ، Rny1 −/− , Rny3 - / - و Rny1 −/− Rny3 - / - مسك. البيانات تعني ± SEM (ن = 3) ، تم تطبيعها إلى β-actin و Gapdh mRNAs. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه للتحليلات الإحصائية.

نظرًا لأن موقع الارتباط العالي التقارب لـ Ro60 يقع داخل سيقان RNA Y1 و Y3 (محاصر في الشكل 2D) ، قمنا باختبار ما إذا كان التعبير عن هذا الجذع في Rny1 −/− Rny3 - / - كانت الخلايا كافية لاستعادة مستويات Ro60 إلى تلك الموجودة في الخلايا البرية. لقد أنشأنا سطرين مستقلين من mESC يعبران بثبات عن Y1 RNA المقطوع ، Y1-S ، حيث تم استبدال الحلقة الداخلية الكبيرة لـ Y1 بـ CUUG tetraloop (الشكل 2D). أكدنا أنه تم التعبير عن Y1-S بـ Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs باستخدام النشاف الشمالي (الشكل 2E). أعاد التعبير عن RNA Y1-S مستويات Ro60 إلى تلك الموجودة في الخلايا البرية (الشكل 2F). باستخدام RT-qPCR ، أظهرنا أن مستويات Ro60 mRNA لم تتغير في mESCs التي تفتقر إلى واحد أو كلاهما من Y RNAs (الشكل 2G). وبالتالي ، فإن Y RNAs تزيد من مستويات Ro60 من خلال آلية ما بعد النسخ.

تؤثر Y RNAs على التوزيع الخلوي لـ Ro60

كشفت الدراسات السابقة أن مجمعات RNA الخاصة بالفأر Ro60 / Y هي حشوية إلى حد كبير ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى أن ربط Y RNA يخفي تسلسل توطين نووي على سطح Ro60 (21 ، 41). لتحديد كيفية تأثير فقدان Y RNAs على التوزيع الخلوي لـ Ro60 ، أجرينا التألق المناعي على النوع البري و Y RNA المحذوفين. كما هو موضح (21) ، Ro60 هو إلى حد كبير السيتوبلازم في mESCs (الشكل 3). توزيع 60 Ro في Rny1 - / - و Rny3 - / - كانت mESCs مشابهة لتلك الموجودة في الخلايا البرية ، مما يشير إلى أن حذف أي من الحمض النووي الريبي Y لا يكفي لتغيير توزيع Ro60. ومع ذلك، في Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs ، تم اكتشاف أقل من Ro60 في السيتوبلازم (الشكل 3 أ). على الرغم من أن انخفاض Ro60 السيتوبلازمي يمكن أن يكون بسبب انخفاض بروتين Ro60 في هذه الخلايا (الشكل 2 أ) ، فإن بعض Ro60 المتراكمة في بؤر نووية مشتركة مع العلامة النووية الليفية (الشكل 3 أ و ب).

تنظم Y RNAs التوزيع الخلوي لـ Ro60. (أ) تم إجراء التألق المناعي للكشف عن Ro60 (أخضر) في Ro60 - / - ، النوع البري، Rny1 −/− , Rny3 - / - , Rny1 −/− Rny3 - / - و Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs التي تعبر بثبات عن Y1 و Y3 RNAs أو Y1-S. الفيبريلارين (أحمر) هو علامة نووية. تم اكتشاف النوى (الزرقاء) باستخدام شريط مقياس DAPI ، 20 ميكرومتر. يتم تضمين الصور المكبرة لـ Colocalizing Ro60 و fibrillarin في اللوحات السفلية. تمثل الإدخالات 2.5 × تكبير للمناطق المحددة مع تنسيق Ro60 و fibrillarin. (ب) التقدير الكمي لمتوسط ​​شدة التألق النووي لـ Ro60 من نوى gt35 في كل من خطوط الخلايا المشار إليها. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه *** ، ص & lt 0.001.

تنظم Y RNAs التوزيع الخلوي لـ Ro60. (أ) تم إجراء التألق المناعي للكشف عن Ro60 (أخضر) في Ro60 - / - ، النوع البري، Rny1 −/− , Rny3 - / - , Rny1 −/− Rny3 - / - و Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs التي تعبر بثبات عن Y1 و Y3 RNAs أو Y1-S. الفيبريلارين (أحمر) هو علامة نووية. تم اكتشاف النوى (الزرقاء) باستخدام شريط مقياس DAPI ، 20 ميكرومتر. يتم تضمين الصور المكبرة لـ Colocalizing Ro60 و fibrillarin في اللوحات السفلية. تمثل الإدخالات 2.5 × تكبير للمناطق المحددة مع تنسيق Ro60 و fibrillarin. (ب) التقدير الكمي لمتوسط ​​شدة التألق النووي لـ Ro60 من نوى gt35 في كل من خطوط الخلايا المشار إليها. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه *** ، ص & lt 0.001.

للتأكد من أن توزيع Ro60 المعدل في Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs كان بسبب فقدان Y RNAs ، قررنا ما إذا كان يمكن استكمال التغييرات في توزيع Ro60 من خلال التعبير عن Y RNAs في الخلايا. في Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs التي تعبر بثبات عن اثنين من الحمض النووي الريبي Y ، كان توزيع Ro60 مشابهًا لتوزيع الخلايا البرية (الشكل 3 أ). ومن المثير للاهتمام ، في Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs التي تعبر فقط عن جذع الحمض النووي الريبي Y1 (Y1-S) ، زاد مضان Ro60 السيتوبلازمي ، لكن تراكم Ro60 في النوى كان مشابهًا لذلك في Rny1 −/− Rny3 - / - مسك (الشكل 3 أ). وهكذا ، في حين أن جذع Y1 RNA كافٍ لاستعادة مستويات بروتين Ro60 (الشكل 2F) ويعيد جزئيًا على الأقل تراكم Ro60 في السيتوبلازم ، فإن وحدة Y RNA الأخرى ضرورية لمنع Ro60 من التراكم في النوى. نظرًا لأن البيانات البيوكيميائية والهيكلية تدعم نموذجًا تعمل فيه هذه الوحدة كبوابة لمنع RNAs الأخرى بشكل صارم من الوصول إلى تجويف Ro60 (25 ، 30) ، فإن أحد الاحتمالات هو أنه في حالة عدم وجود هذه الوحدة ، فإن بعض Ro60 يربط rRNA الناشئ أو غيره الحمض النووي الريبي.

تحديد البروتينات المرتبطة بـ Ro60 المعتمدة على Y RNA

لتحديد مدى دعم Y RNAs لتفاعل Ro60 مع البروتينات الأخرى ، حددنا مجموعة بروتينات mESC التي تتطلب ارتباط Ro60 Y RNA. لهذا الغرض ، أنشأنا Ro60 - / - mESCs التي تعبر بثبات عن Ro60 (كدنا) بثلاث نسخ من حاتمة FLAG مدمجة في الطرف N (Ro60 −/− , علم3-رو 60) (الشكل 4). من خلال إجراء النشاف الغربي ، قررنا أن مستوى علم3-رو 60 في هذه الخلايا ، التي تم تصنيعها تحت سيطرة مروج اليوبيكويتين C البشري ، كانت أعلى بمقدار 2.5 مرة تقريبًا من الخلايا البرية (الشكل 4 أ ، قارن الممرات 2 و 3). والجدير بالذكر أن مستويات الحمض النووي الريبي Y1 زادت أيضًا في هذه الخلايا (الشكل 4 ب ، الممر 3) ، بما يتوافق مع النموذج الذي يتم فيه إنتاج هذا الحمض النووي الريبي بشكل زائد واستقراره بربط Ro60. استخدمنا هذه mESCs كخط أصل لتوليد Rny1 −/− , Rny3 - / - و Rny1 −/− Rny3 - / - المشتقات. دعماً لآلية ما بعد النسخ لتنظيم مستويات Ro60 ، فإن Ro60 in Ro60 −/− , علم3-Ro60 Rny1 −/− Rny3 - / - انخفض عدد خلايا mESCs التي تفتقر إلى كل من Y1 و Y3 إلى 67٪ من الأبوين Ro60 −/− , علم3-رو 60 mESCs (الشكل 4 أ ، قارن الممرات 6 و 7 مع الممر 3). ما إذا كان الانخفاض الأصغر في مستويات Ro60 في هذه الخلايا ، مقارنةً بـ Rny1 −/− Rny3 - / - mESCs (الشكل 2 أ) يرجع إلى الإفراط في التعبير عن FLAG3-Ro60 أو وجود علامة N-terminal غير معروف. البروتينات التي يتم تنقيتها بالاشتراك مع FLAG3تم تحديد -Ro60 من الخلايا التي تحتوي على Y RNAs وتفتقر إليها باستخدام مقياس الطيف الكتلي (الشكل 4C والجدول التكميلي S2). كانت الوصلات المضادة لـ FLAG من mESCs من النوع البري غير الموسومة عناصر تحكم سلبية. لزيادة متانة بيانات قياس الطيف الكتلي لدينا ، أجرينا ثلاث عمليات تنقية مستقلة. حددنا المتفاعلات المحتملة على أنها تلك البروتينات التي تم تمثيلها ، في جميع التكرارات الثلاثة ، بواسطة اثنين على الأقل من الببتيدات وتم إثرائهما بأربعة أضعاف على الأقل. Ro60 −/− , علم3-رو 60 mESCs المتعلقة بالخلايا من النوع البري غير المميزة.

يتطلب ارتباط Ro60 بالبروتينات الشريكة Y RNA (أ) Ro60 و FLAG3-تم مقارنة مستويات 60R في خطوط الخلايا المشار إليها بالنشاف الغربي (اللوحة اليسرى). اللوحة اليمنى ، التحديد الكمي لثلاث مكررات بيولوجية. البيانات تعني ± SEM (ن = 3) تطبيع إلى ActB. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. ** ، ص & لتر 0.01. (ب) تمت مقارنة مستويات Y RNAs في خطوط الخلايا المشار إليها بواسطة النشاف الشمالي. (ج) البروتينات التي تم تحديدها بواسطة مطياف الكتلة في الوصلات المضادة لـ FLAG. تم إجراء ثلاث مكررات (R1 ، R2 ، R3). تلك البروتينات التي يتطابق معها طيف الببتيد كانت & gt 4 أضعاف في الرواسب المناعية من Ro60 −/− , علم3-رو 60 يتم عرض mESCs من الخلايا البرية غير المميزة في جميع التكرارات الثلاثة.

يتطلب ارتباط Ro60 بالبروتينات الشريكة Y RNA (أ) Ro60 و FLAG3-تم مقارنة مستويات 60R في خطوط الخلايا المشار إليها بالنشاف الغربي (اللوحة اليسرى). اللوحة اليمنى ، التحديد الكمي لثلاث مكررات بيولوجية. البيانات تعني ± SEM (ن = 3) تطبيع إلى ActB. ص تم حساب القيم باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. ** ، ص & لتر 0.01. (ب) تمت مقارنة مستويات Y RNAs في خطوط الخلايا المشار إليها بواسطة النشاف الشمالي. (ج) البروتينات التي تم تحديدها بواسطة مطياف الكتلة في الوصلات المضادة لـ FLAG. تم إجراء ثلاث مكررات (R1 ، R2 ، R3). تلك البروتينات التي يتطابق معها طيف الببتيد كانت & gt4 أضعاف في الرواسب المناعية من Ro60 −/− , علم3-رو 60 يتم عرض mESCs من الخلايا البرية غير المميزة في جميع التكرارات الثلاثة.

ومن المثير للاهتمام ، من بين البروتينات التسعة التي تم تحديدها على أنها مكونات محددة محتملة لمضادات FLAG ، كان Ro60 هو البروتين الوحيد الذي كان موجودًا في الراسبات المناعية من الخلايا التي تفتقر إلى كل من Y RNAs (الشكل 4C والجدول التكميلي S2). جميع المتفاعلات المحتملة الأخرى ، بما في ذلك Mov10 5 ′ إلى 3 RNA Helicase (53) ، بروتين ربط الميتوكوندريا والنووي RNA Lrpprc (54) ، Igf2bp1 / Zbp1 ، Ssb / La ، Ptbp1 ، LINE-1 المشفر بالترانسبسون Orf1 وبروتينات Y-box Ybx1 و Ybx3 ، كانت غائبة في الراسبات المناعية من Rny1 −/− Rny3 - / - مسك (الشكل 4 ج). على الرغم من وصف كل من هذه البروتينات مسبقًا للتنقية المشتركة مع الفئران أو الإنسان Ro60 (32 ، 34 ، 55) ، توضح بياناتنا أن ارتباط هذه البروتينات بـ Ro60 يتطلب واحدًا أو كلاهما من Y RNAs.

تربط RNAs Y1 و Y3 Ro60 بشركاء ربط متميزين

لتحديد أي الحمض النووي الريبي هو المسؤول عن ارتباط Ro60 بكل بروتين ، أجرينا التهابات مناعية باستخدام Ro60 −/− , علم3-رو 60 تفتقر mESCs إلى واحد أو كلاهما من Y RNA واكتشفت البروتينات المشتركة في التنقية عن طريق النشاف الغربي. كما هو متوقع ، كانت جميع البروتينات التي تم فحصها ، بما في ذلك Lrpprc و Mov10 و Igf2bp1 / Zbp1 و Orf1 موجودة في الوصلات المضادة لـ FLAG من الوالدين. Ro60 −/− , علم3-رو 60 mESCs (الشكل 5A ، الممر 7) وتغيب في الواتس من نفس الخلايا المحذوفة لكل من Y1 و Y3 (الممر 10). ولا سيما فحص Ro60 −/− , علم3-رو 60 كشفت mESCs التي تفتقر إلى Y1 أو Y3 أن هذه ncRNAs تربط مجموعات مميزة من البروتينات بـ Ro60. التنقية المشتركة لـ Mov10 و Lrpprc و Orf1 مع Ro60 مطلوب Y1 ، بينما يعتمد ارتباط Ro60 مع Igf2bp1 / Zbp1 على Y3 RNA (الشكل 5A و B). نظرًا لانخفاض مستويات Ybx1 و Ybx3 التي تمت تنقيتها مع Ro60 في mESCs ، لم نتمكن من تحديد ما إذا كان ارتباطهم بـ Ro60 يتطلب Y RNAs محددًا.

يربط Y1 و Y3 بروتينات مميزة بـ Ro60. (أ و ب) Lysates من النوع البري غير المميز (الممرات 1 و 6) و Ro60 −/− , علم3-رو 60 تعرضت mESCs (الممران 2 و 7) إلى الترسيب المناعي مع الأجسام المضادة لـ FLAG جنبًا إلى جنب مع Ro60 −/− , علم3-رو 60 تم حذف mESCs لـ Y1 أو Y3 أو كلاهما من Y RNAs (الممرات 3-5 و8-10). تم تحليل اللايسات (الممرات 1-5) والبروتينات في الراسبات المناعية (الممرات 6-10) بواسطة النشاف الغربي للكشف عن البروتينات المشار إليها. ActB هو عنصر تحكم سلبي. (ج و د) ليساتس من Ro60 - / - (الممران 1 و 6) ، و mESCs من النوع البري غير الموسوم (الممران 2 و 7) ، و mESCs من النوع البري المحذوف لواحد أو كلاهما من Y RNAs (الممرات 3-5 و8-10) تعرضت للترسيب المناعي مع مضادات -جسم مضاد لـRo60. تعرضت Lysates (الممرات 1 إلى 5) والبروتينات المناعية (الممرات من 6 إلى 10) إلى النشاف الغربي للكشف عن Lrpprc (C) و La (D). ActB هو عنصر تحكم سلبي. (هح) ليساتس من Ro60 - / - (الممران 1 و 6) ، و mESCs من النوع البري (الممران 2 و 7) ، و mESCs من النوع البري المحذوف لواحد أو كلاهما من Y RNAs (الممرات 3-5 و8-10) تعرضوا للترسيب المناعي مع الأجسام المضادة ضد Ptbp1 (E) و LINE-1 Orf1 (F) و Mov10 (G) و Igf2bp1 / Zbp1 (H). تعرضت اللايسات (الممرات 1-5) والبروتينات في الراسبات المناعية (الممرات 6-10) إلى النشاف الغربي للكشف عن البروتينات المشار إليها. في كل لطخة ، تم اكتشاف Ro60 كعنصر تحكم إيجابي وكان ActB (E) أو Gapdh (F - H) عنصر تحكم سلبي. * ، فرقة غير محددة.

يربط Y1 و Y3 بروتينات مميزة بـ Ro60. (أ و ب) Lysates من النوع البري غير المميز (الممرات 1 و 6) و Ro60 −/− , علم3-رو 60 تعرضت mESCs (الممران 2 و 7) إلى الترسيب المناعي مع الأجسام المضادة لـ FLAG جنبًا إلى جنب مع Ro60 −/− , علم3-رو 60 تم حذف mESCs لـ Y1 أو Y3 أو كلاهما من Y RNAs (الممرات 3-5 و8-10). تم تحليل اللايسات (الممرات 1-5) والبروتينات في الراسبات المناعية (الممرات 6-10) بواسطة النشاف الغربي للكشف عن البروتينات المشار إليها. ActB هو عنصر تحكم سلبي. (ج و د) ليساتس من Ro60 - / - (الممران 1 و 6) ، و mESCs من النوع البري غير الموسوم (الممران 2 و 7) ، و mESCs من النوع البري المحذوف لواحد أو كلاهما من Y RNAs (الممرات 3-5 و8-10) تعرضت للترسيب المناعي مع مضادات -جسم مضاد لـRo60. تعرضت Lysates (الممرات 1 إلى 5) والبروتينات المناعية (الممرات من 6 إلى 10) إلى النشاف الغربي للكشف عن Lrpprc (C) و La (D). ActB هو عنصر تحكم سلبي. (هح) ليساتس من Ro60 - / - (الممران 1 و 6) ، و mESCs من النوع البري (الممران 2 و 7) ، و mESCs من النوع البري المحذوف لواحد أو كلاهما من Y RNAs (الممرات 3-5 و8-10) تعرضوا للترسيب المناعي مع الأجسام المضادة ضد Ptbp1 (E) و LINE-1 Orf1 (F) و Mov10 (G) و Igf2bp1 / Zbp1 (H). تعرضت اللايسات (الممرات 1-5) والبروتينات في الراسبات المناعية (الممرات 6-10) إلى النشاف الغربي للكشف عن البروتينات المشار إليها. في كل لطخة ، تم اكتشاف Ro60 كعنصر تحكم إيجابي وكان ActB (E) أو Gapdh (F - H) عنصر تحكم سلبي. * ، فرقة غير محددة.

نظرًا لأن كلا من Ro60 و Y1 RNA تم التعبير عنه بشكل مفرط في Ro60 −/− , علم3-رو 60 mESCs (الشكل 4) ، أكدنا تفاعلات Ro60 مع كل من البروتينات المحددة باستخدام mESCs من النوع البري. باستخدام الأجسام المضادة لـ Ro60 ، أكدنا أن تفاعل Lrpprc مع Ro60 يتطلب Y1 RNA ، بينما يتفاعل Ssb / La مع Ro60 من خلال كل من Y1 و Y3 RNAs (الشكل 5C و D) ، كما هو متوقع من الدراسات السابقة (23). وبالمثل ، أكدت حالات التسرع المناعي مع الأجسام المضادة ضد Ptbp1 و Orf1 و Mov10 و Igf2bp1 / Zbp1 و Orf1 أن ارتباطها مع Ro60 يعتمد على واحد أو كليهما من Y RNAs (الشكل 5E-H). على وجه التحديد ، كان ارتباط Orf1 و Mov10 يعتمد إلى حد كبير على Y1 ، وتطلب ارتباط Igf2bp1 / Zbp1 Y3 ، بينما تفاعل Ptbp1 مع مجمعات Ro60 / Y RNA (الشكل 5E-H). مجتمعة ، نستنتج أن أحد أدوار Y RNAs هو دعم تفاعلات Ro60 مع بروتينات محددة مرتبطة بـ RNA لإنشاء RNPs متخصصة.


الأحماض الأمينية كمواد اصطناعية

تعد أنشطة التخليق الحيوي المحسّنة ميزة أساسية لإعادة البرمجة الأيضية في السرطان: فهي تدعم الخلايا لإنتاج الجزيئات الكبيرة اللازمة لتكرار الحمض النووي وانقسام الخلايا ونمو الورم اللاحق. تقوم مسارات التخليق الحيوي أو المسارات الابتنائية بتحويل المستقلبات البسيطة (مثل السكريات والأحماض الأمينية) إلى جزيئات معقدة من خلال عمليات تعتمد على ATP. تشارك الأحماض الأمينية في تصنيع ثلاثة جزيئات أولية كبيرة: البروتينات ، والدهون ، والأحماض النووية (الشكل 1). جميع الأحماض الأمينية العشرون هي بروتينية ، ولكن مجموعة فرعية فقط من الأحماض الأمينية تشارك في تخليق الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) (على سبيل المثال ، الجلوتامين ، الجلوتامات ، الميثيونين ، والفينيل ألانين). من بين الأحماض الأمينية المشاركة في تخليق NEAA ، يوفر الجلوتامين النيتروجين لتخليق مجموعة الأميد من الأسباراجين. كما أنه يساهم في تخليق العديد من الأحماض الأمينية من خلال تقويضها للجلوتامات. يتم تحويل الجلوتامين إلى جلوتامات ، بشكل رئيسي عن طريق نشاط الجلوتاميناز (GLS) (الأشكال 1 ، 4 ب) 42. يمكن بعد ذلك تحويل الغلوتامات إلى α-KG والأحماض الأمينية الأخرى ، مثل الألانين ، والأسبارتات ، والفوسفوسرين ، عن طريق تفاعلات ناقلة الأمين (الأشكال 1 ، 4 ب).

على عكس الأحماض الأمينية المشتقة من الجلوتامين المذكورة أعلاه ، والتي تحتاج إلى الغلوتامات كمانح للنيتروجين ، يتطلب الأسباراجين الجلوتامين لتخليق دي نوفو (الأشكال 1 ، 2 هـ ، 4 ب). الجلوتامين عبارة عن ركيزة لتركيب الأسباراجين (ASNS) ، مما يوفر نيتروجين الأميد للأسبارتات لإنتاج الأسباراجين. الأرجينين هو حمض أميني آخر يستخدم في تصنيع الأحماض الأمينية غير الأساسية. يمكن أن يكون بمثابة مقدمة للبرولين أو كمصدر إضافي للجلوتامات ، سواء عن طريق وسيطة 1-بيرولين-5-كربوكسيلات (P5C) (الشكل 1) 56. 1-بيرولين-5-كربوكسيلات مختزل (PYCR) يحول P5C إلى برولين ، و 1-بيرولين-5-كربوكسيلات ديهيدروجينيز (P5CDH مشفر بواسطة ALDH4A1) يحفز تحويل P5C إلى جلوتامات 57. يرتبط السيرين والجليسين ارتباطًا وثيقًا ويمكن تحويلهما عن طريق سيرين هيدروكسي ميثيل ترانسفيراز (SHMT1 و 2) (الشكل 1). SHMT هو أحد الإنزيمات الرئيسية في عملية التمثيل الغذائي للكربون الواحد بوساطة حمض الفوليك. يشمل التمثيل الغذائي للكربون الواحد كلاً من دورة حمض الفوليك والميثيونين ويوفر مجموعات الميثيل لمجمعات الكربون الواحد المطلوبة للتخليق الحيوي للنيوكليوتيدات de novo و مثيلة الحمض النووي 59. تيتراهيدروفولات (THF) بمثابة متقبل عالمي واحد للكربون ويمكن أن يقبل كربون واحد من تحويل السيرين إلى الجليسين (دورة الفولات) ، وأكسدة الجلايسين إلى ثاني أكسيد الكربون2 و نيو هامبشاير3 بواسطة نظام انشقاق الجلايسين (GCS) 6 أو الميثيونين لتحويل الحمض الاميني (دورة المثيونين). يوجد THF أحادي الكربون في حالات أكسدة مختلفة (5،10-ميثيلين رباعي هيدروفولات (5،10-meTHF) ، 5-ميثيل- THF ، فورمات (10-فورميل THF)) ، ويدعم وظائف التخليق الحيوي المتميزة ، على سبيل المثال ، 5 ، 10-meTHF للتخليق الحيوي للبيريميدين و 5-ميثيل- THF للتخليق الحيوي البيورين 59.

أ مسار تحويل الكبريت العكسي: يمكن إنتاج السيستين من الميثيونين من خلال مسار التحويل العكسي للكبريت. هذا المسار هو مزيج من دورة الميثيونين ومسار تحويل الكبريت. يتم إنشاء الهوموسيستين ، الوسيط للخطوة الأولى في مسار تحويل الكبريت ، من دورة الميثيونين. يتكثف السيرين مع الهوموسيستين ، وينتج السيستاثيونين. ثم يتم تحويل السيستاثيونين إلى السيستين وألفا كيتوبوتيرات بواسطة CGL. الإنزيمات الرئيسية في دائرة حمراء. THF tetrahydrofolate ، CBS cystathionine β-synthase ، SAM S-adenosylmethionine ، CGL cystathionine γ-lyase. ب تخليق البوليامين: البولي أمينات (بوتريسين ، سبيرمين ، وسبيرميدين) يتم تصنيعها من حمض الأرجينين الأميني ، ويتم تحويلها من واحد إلى آخر (بترتيب بوتريسين إلى سبيرميدين إلى سبيرمين). SAM ، بصفتها مقدمة لـ dcSAM ، هي الجهة المانحة الرئيسية لبناء هياكل البولي أمين. الإنزيمات الرئيسية في دائرة حمراء. ODC ornithine decarboxylase ، AMD S-adenosylmethionine decarboxylase ، SAM S-adenosylmethionine ، dcSAM decarboxylated S-adenosylmethionine. ج مصدر النيتروجين والكربون للأحماض النووية: يوفر الأسبارتات والجليسين والجلوتامين النيتروجين ووحدات الجلايسين والكربون الواحد من دورة الفولات (كشكل من أشكال فورمات) توفر الكربون للبيورينات. الجليسين هو المادة الأولية غير المباشرة للفورمات من خلال التمثيل الغذائي للكربون الواحد ، مما يوفر فورمات للتفاعلات الكيميائية الحيوية في التخليق الحيوي للبيورين. الأسبارتات والجلوتامين هما الأحماض الأمينية الرئيسية المشاركة في تخليق البيريميدين. الكربون (C) باللون الأصفر ، والنيتروجين (N) باللون الأخضر. د GSH و NADPH كمضادات للأكسدة: ترتبط أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بالجزيئات الكبيرة الخلوية وتتلفها. تسمح أكسدة NADPH و GSH بتقليل ROS إلى حالة غير نشطة. يقلل GSH بيروكسيد الهيدروجين إلى الماء ويصبح مؤكسدًا لـ GSSG بواسطة GPX. ثم يتم تقليل الجلوتاثيون المؤكسد (GSSG) مرة أخرى إلى GSH بواسطة GR في وجود NADPH. تظهر الإنزيمات في دوائر حمراء. GPX الجلوتاثيون بيروكسيديز ، اختزال الجلوتاثيون GR ، الجلوتاثيون المختزل GSH ، الجلوتاثيون المؤكسد GSSG ، NADPH النيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات ، NADP + النيكوتيناميد المؤكسد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات. ه تفاعل أميد لتخليق الأسباراجين: يتم تصنيع الأسباراجين عن طريق تفاعل إنزيم الوسط ، محفز بواسطة مركب الأسباراجين (ASNS). يوجد نيتروجين مجموعة الأميد المحفوظة في صندوق أحمر ، بينما يكون الإنزيم في دائرة حمراء.

يمكن أن يوفر الكبريت المحتوي على الأحماض الأمينية الميثيونين السيستين عن طريق مسار تحويل الكبريت العكسي (الشكل 2 أ). يتم تكثيف الهوموسيستين المتولد من دورة الميثيونين مع السيرين ليصبح السيستاثيونين بواسطة السيستاثيونين سينسيز (CBS) ، ثم يتحول إلى السيستين بواسطة السيستاثيونين γ- لياز (CGL) (الشكل 2 أ). يرتبط تحويل الميثيونين إلى السيستين بالتحويل البيني للسيرين والجليسين لأن دورة الميثيونين هي جزء من التمثيل الغذائي للكربون الواحد مقترنًا بدورة الفولات ، حيث يحفز SHMT تخليق السيرين والجليسين (الشكل 1) 6. في حين أن الأسباراجين لا يشارك بشكل مباشر في التخليق الحيوي لـ NEAA ، فإنه يعمل كعامل تبادل الأحماض الأمينية ويعزز امتصاص الأحماض الأمينية ، ويفضل من الأحماض الأمينية السرين / ثريونين والأحماض الأمينية غير القطبية 60 ، ويمكن أن يدعم تخليق اللبنات الأساسية.

توفر الأحماض الأمينية كلاً من الكربون والنيتروجين لتخليق الحمض النووي (الشكل 2 ج). يتطلب تخليق البيورين الحيوي فورمات وبيكربونات وثلاثة أحماض أمينية: الأسبارتات والجليسين والجلوتامين. بينما يعمل الجلوتامين والأسبارتات كمصدر للنيتروجين لكل من القواعد النووية (N1 من الأسبارتات و N3 و N9 من الجلوتامين) والمجموعة الأمينية من البيورينات (الجلوتامين للأدينين والأسبارتات للغوانين) ، يمكن للجليسين أن يساهم في التخليق الحيوي للبورين بطريقتين: الدمج المباشر في العمود الفقري البيورين (C4 و C5 و N7) أو عن طريق إنتاج وحدات أحادية الكربون للتفاعلات الكيميائية الحيوية المشاركة في التخليق الحيوي البيورين (C2 و C8) (الشكل 2 ج) 5. الحامل الحرج لوحدات الكربون الواحد في العملية الأخيرة هو 5،10-meTHF. يتم تحويل 5،10-meTHF أيضًا إلى فورمات (10-فورميل THF) ، مما يساهم في كربونات C2 و C8 في القاعدة النووية 4،7،61. يعتبر التخليق الحيوي للبيريميدين أبسط من البيورين. على النقيض من البيورينات التي يتم تصنيعها على شكل ريبونوكليوتيدات بدلاً من كونها قواعد نووية ، يتم تصنيع البيريميدينات أولاً كقواعد نووية ثم يتم دمجها مع بيروفوسفات الفوسفوريبوزيل (PRPP) لإنتاج الريبونوكليوتيد المقابل. حلقة البيريميدين مشتقة من الجلوتامين والأسبارتات والبيكربونات. بالنسبة لتخليق البيريميدين ، يعمل الأسبارتات كمانحين للكربون والنيتروجين (N1 و C4 و C5 و C6) ، بينما يساهم الجلوتامين في N3 من مجموعة نوكليوباز والأمينية من السيتوزين (الشكل 2 ج). وحدة الكربون الواحد المشتقة من تحويل السيرين إلى الجلايسين مطلوبة لتخليق الثيميديلات. يعمل 5،10-meTHF كمانح أحادي الكربون لنقل مجموعة الميثيل إلى أحادي الفوسفات deoxyuridine (dUMP) وإنتاج أحادي فوسفات deoxythymidine (dTMP) ، وهو تفاعل محفز بواسطة thymidylate synthase (TS).

بالإضافة إلى دورها الأساسي في التخليق الحيوي للمستقلبات النيتروجينية ، يمكن للأحماض الأمينية توفير ذرات الكربون للتخليق الحيوي للدهون. في ظل نقص الأكسجة ، يساهم الجلوتامين في تجمعات أسيتيل CoA اللازمة لتكوين الدهون من خلال تحويله إلى بيروفات الذي يعيد دخول دورة TCA 46،62. يمكن أن تساهم الأحماض الأمينية متفرعة السلسلة أيضًا في تكون الدهون. في الخلايا الشحمية المتباينة ، يزداد التدفق التقويضي BCAA ، ويمثل الأسيتيل CoA المشتق من BCAA ما يقرب من 30 ٪ من مجمعات أسيتيل CoA الشحمية 3،63. تعمل الأحماض الأمينية الأساسية (EAAs) ليس فقط كمانحين للكربون ، ولكن نسبتها يمكن أيضًا أن تنظم تكوين الدهون من خلال التأثير على التعبير الجيني المكون للدهون. في الخلايا الظهارية للثدي البقري ، نسبة الأحماض الأمينية "المثلى" (AA) (OPAA = Lys: Met 2.9: 1 Thr: Phe 1.05: 1 Lys: Thr 1.8: 1 Lys: His 2.38: 1 Lys: Val 1.23: 1) ينظم التعبير الجيني المولد للدهون ويغير التعبير عن الجينات الدقيقة الرئيسية المشاركة في التحكم في التوازن الشحمي ، مما يشير إلى دور مهم محتمل لنسب EAA في تخليق الدهون. سيكون من المثير للاهتمام معرفة ما إذا كان هذا محفوظًا في الأنواع الأخرى وكذلك في السرطان.


مناقشة

في هذه الورقة ، نقدم أول إعادة بناء نموذج قائم على القيود وتحليل التمثيل الغذائي للطاقة في الليشمانية الطفولية، وهو الكائن المسبب لمرض استوائي مهمل ، وهو داء الليشمانيات الحشوي. من دراستنا البسيطة القائمة على النموذج ، نستكشف الجوانب المختلفة لـ الليشمانية الطفولية استقلاب الطاقة ويكشف عن ميزات جديدة لعملية التمثيل الغذائي للطفيلي في ظل ظروف بيئية مختلفة. يراعي النموذج عمليات التمثيل الغذائي المركزية التي تشمل تخليق ATP وإنتاج الوسطاء الأساسيين الضروريين لإنتاج / نمو الكتلة الحيوية. علاوة على ذلك ، يتكون النموذج من تفاعلات تتميز بخمسة أقسام مختلفة & # x02014 أربعة أقسام خلوية & # x02014 الجليكوزوم (مقصورة مميزة من المثقبيات) ، والميتوكوندريا ، والفضاء بين الغشاء في الميتوكوندريا والعصارة الخلوية وخارطة الخلية لتبادل ونقل المستقلبات من الخلية إلى الخلية. بيئة. النقطة الرئيسية التي يجب ملاحظتها هنا هي أنه لم يتم النظر في أي من النماذج السابقة القائمة على القيد في الحيز الفضائي بين الغشاء الميتوكوندريا [15 ، 17 ، 51]. كان إدراج هذه المقصورة أمرًا ضروريًا ، نظرًا لأن التدرج البروتوني الذي تم إنشاؤه بواسطة الفسفرة المؤكسدة مقترن بتخليق ATP بين الميتوكوندريا والفضاء بين الغشاء ، وليس مع العصارة الخلوية. بناءً على الدليل ذي الصلة من الأدبيات وتحليل التسلسل المناسب ، تم تعيين ردود الفعل إلى مواقع خلوية محددة في النموذج (مما يعطي ثقة عالية لتلك التفاعلات التي لها دليل قوي على الأدبيات). نتيجة لذلك ، يمكن تعيين حوالي 54 من ردود الفعل إلى مواقعها المناسبة بثقة عالية.

تم تحليل شبكة التمثيل الغذائي iAS142 باستخدام تحليل توازن التدفق فيما يتعلق بطلب التمثيل الغذائي الجديد / تفاعل الكتلة الحيوية الذي تم تطويره باستخدام بيانات تخصيب نظائر 13C تم الحصول عليها من إل.مكسيكانا بروماستيجوتز نمت في وسط يحتوي على 13C المسمى الجلوكوز [19]. لم تستخدم أي من النماذج السابقة القائمة على قيود FBA [15 & # x0201317] بيانات نظيرية 13C لتطوير تفاعل الكتلة الحيوية. من تحليل النموذج وعمليات التحقق من الصحة ، فإن قوة الكتلة الحيوية iAS142 في التنبؤ الدقيق بالتفاصيل المعقدة إل. الرضع يمكن إثبات التمثيل الغذائي إلى حد ما. علاوة على ذلك ، تمت مقارنة الكتلة الحيوية iAS142 مع هدف الكتلة الحيوية الذي تم الحصول عليه من منشور تم نشره مسبقًا المثقبية الكروزية نموذج iSR215 لتنوير تأثير هدف الكتلة الحيوية على توزيع تدفق التفاعل [15]. كان الهدف من هذا التحليل هو تسليط الضوء على أهمية تفاعل الكتلة الحيوية والاختلاف في تدفقات التفاعل عند النظر في وظيفة الكتلة الحيوية المختلفة. يؤدي هذا أيضًا إلى تقديم مقدار التدقيق الذي يجب الحفاظ عليه أثناء إجراء دراسات النمذجة باستخدام FBA.

تم إجراء التحقق من صحة النموذج من مستويين لتقييم أهميته في التنبؤ بالجوانب الأيضية الفعلية كما تم إدراكها من الدراسات التجريبية المختلفة. تم إجراء المرحلة الأولى من التحقق من صحة النموذج من خلال التنبؤ باستخدام أنماط النمو الظاهرية في السيليكو تحليل خروج المغلوب للتفاعل والمقارنة مع الأنماط الظاهرية المعروفة تجريبياً. فيما يتعلق بمعلومات النمط الظاهري بالضربة القاضية المتاحة في الليشمانيا، يمكن للنموذج أن يتنبأ بالأنماط الظاهرية للنمو المعروفة المرتبطة بـ 7 ضربات قاضية للتفاعل بدقة مطلقة تبلغ 100٪. بصرف النظر عن أغراض التحقق من الصحة ، أعطت دراسة خروج المغلوب للتفاعل نظرة بيولوجية مميزة للدور الحاسم الذي يلعبه كل تفاعل في إل. الرضع استقلاب الطاقة. على الرغم من أنه من غير المناسب مقارنة تنبؤات النموذج مع المثقبيات الأنواع التي تظهر اختلافات المرحلة المحددة في التمثيل الغذائي وتعيش في بيئات مختلفة من الليشمانيا، تم مقارنة تنبؤات النموذج مع المتاحة غير الخاصة بالمرحلة المثقبيات بيانات النمط الظاهري بالضربة القاضية فقط لمزيد من التأكيد على حقيقة أن النموذج كان بالفعل الليشمانيا إعطاء تفكير بيولوجي محدد وراء كل نمط ظاهري لحذف الجينات تم توقعه من النموذج. تم تحديد ما مجموعه 61 تفاعلًا مميتًا من خلال حذف التفاعل الفردي في الشبكة وتم اقتراح 55 زوجًا من التفاعلات القاتلة غير التافهة لتكون ضرورية من خلال حذف التفاعل المزدوج. تشكل كل واحدة من عمليات الحذف هذه هدفًا دوائيًا واعدًا وفرضية قابلة للاختبار تجريبيًا ، والتي اعتبرناها كذلك لإظهار سيناريوهات تدخل العلاج الكيميائي لـ 9 تفاعلات يُتوقع أن تكون ضرورية لنمو الطفيلي من تحليل خروج المغلوب لتفاعل النموذج.

على الرغم من أن تنبؤات النموذج عادة ما يتم التحقق منها من خلال الضربات القاضية للتفاعل ، إلا أن هناك ثلاثة أوجه قصور مهمة في التحقق من صحة النموذج القائم على القيد من خلال دراسات خروج المغلوب للتفاعل [15]. أولاً ، بسبب عدم توفر بيانات خروج المغلوب الكاملة الخاصة بـ إل. الرضع، لم يتم إجراء العديد من عمليات التحقق من خروج المغلوب من إل. الرضع البيانات وحدها ، ولكن أيضًا النظر في البيانات التي تم الحصول عليها من أنواع المثقبيات الأخرى. ثانيًا ، نظرًا لأن النموذج المدروس هنا ليس نموذجًا لمقياس الجينوم ، فقد تكون هناك مسارات أساسية أخرى قد تكون مرتبطة بعملية التمثيل الغذائي للطاقة الأساسية ولكن لم يتم أخذها في الاعتبار في النموذج. ومن ثم ، فمن الممكن أن يتنبأ النموذج بأن رد الفعل غير قاتل ، على الرغم من أنه في سياق مقياس الجينوم بأكمله قد يكون مميتًا أو العكس. ثالثًا ، تم جمع بيانات الضربة القاضية التجريبية لأغراض التحقق من الدراسات غير المتجانسة التي ربما نظرت في ظروف أو وسائط تجريبية مختلفة لتوليد الضربة القاضية ، والتي لم يتم تنفيذها بشكل صريح في نموذجنا. ومن ثم ، فإننا نفضل استخدام تحليل خروج المغلوب للتفاعل النموذجي كمؤشر للجينات الأساسية المطلوبة لنمو الطفيلي بدلاً من أساس للتحقق من صحة نموذجنا.

من أجل التغلب على قيود التحقق من الصحة من خلال دراسات خروج المغلوب للتفاعل ، من خلال إجراء تحليل القوة فيما يتعلق بالتغيرات في امتصاص الأكسجين في نموذجنا ، حاولنا التحقق من صحة النموذج من خلال تحديد ظروف النموذج لتمييز إفراز مستقلبات الفائض. الليشمانيا من المعروف أنه يُظهر عملية التمثيل الغذائي الفائض التي تفرز خلالها كمية كبيرة من السكسينات والأسيتات والبيروفات وثاني أكسيد الكربون.2 وكميات قليلة من اللاكتات [57 ، 58]. يتم التحكم في هذا الإفراز إلى حد كبير من خلال الاختلافات في تركيزات الأكسجين والجلوكوز في الوسط. مع الاختلاف في كل من امتصاص الجلوكوز والأكسجين ، تمكنا من ملاحظة إفراز جميع مستقلبات الفائض المذكورة أعلاه. وبشكل أكثر تحديدًا ، اكتشف تحليل قوة النموذج إفراز اللاكتات عبر تفاعل نازعة الهيدروجين D-lactate والذي كان أحد أهم الجوانب التي تثبت صحة النموذج بالفعل. الليشمانيا محدد. يشير تحليل التسلسل والتجارب إلى عدم وجود نازعة هيدروجين D-lactate وظيفي في المثقبيات الأنواع [6 ، 72 ، 74]. بالرغم ان، المثقبيات وقد ثبت أن الأنواع تُظهر إفراز L-lactate بدلاً من D-lactate ، ولا يزال مسار هذه الآلية غير معروف [6]. وهكذا ، فيما يتعلق بإنتاج وإفراز الليشمانيا مستقلبات الفائض المحددة ، يمكن التحقق من صحة النموذج بشكل مناسب.

Promastigote و amastigote تم إنشاء سيناريوهات التمثيل الغذائي المحددة من النموذج وذلك لمراقبة الفروق المحددة للمرحلة في استقلاب الطاقة في إل. الرضع. 13C نظير حل الأيض في إل. مكسيكانا كشفت المراحل التنموية عن انخفاض في امتصاص الجلوكوز ، وامتصاص الغلوتامات وإفراز نواتج الفائض في الماستيغوتات الممحوضة مقارنة بالبروماستيجوتات [19]. وبالمثل ، بعد دمج سيناريو amastigote في نموذجنا ، يمكننا التقاط المعدل المنخفض لامتصاص الجلوكوز والجلوتامات وتقليل تبادل نواتج الفائض مع البيئة التي تمت ملاحظتها تجريبياً في amastigotes. فيما يتعلق بمصادر الكربون الأخرى ، انخفض أيضًا امتصاص الأحماض الأمينية غير الأساسية الأخرى مثل الأسبارتات والبرولين والألانين. نتيجة لذلك ، يمكن ملاحظة انخفاض كبير في تحلل السكر ، ودورة TCA ، وتوليف ATP ، وتدفق تفاعل استقلاب الأحماض الأمينية في سيناريو amastigote. أيضًا ، لوحظ انخفاض مميز في تناول الأكسجين خارج الخلية وإطلاق أيون الهيدروجين على الأرجح مما يدل على تكيف الطفيلي مع البيئة الحمضية ونقص الأكسجة للبلاعم البشرية. على الرغم من الانخفاض الكبير في تدفقات التفاعل ، كان التدفق من خلال تفاعلات transketolase في سيناريو amastigote مرتفعًا عند مقارنته بسيناريو promastigote الذي يشير إلى فرط تنشيط تحويلة فوسفات البنتوز في تلبية الطلب على الجلوكوز 6 فوسفات تحت ظروف نقص الجلوكوز. أيضًا ، في كل من سيناريوهات استقلاب البروماستيغوت والأماستيغوت ، أدى إغلاق امتصاص الجلوكوز حتى في وفرة الأحماض الأمينية الأخرى إلى القضاء على نمو الطفيلي مما يدل على أن الجلوكوز هو أهم مصدر للكربون المفضل ومفضل من قبل كل من مراحل نمو الطفيلي على الرغم من أنها موجودة في بيئات مختلفة تمامًا.

يمكن أن تتنبأ دراسات خروج المغلوب بالتفاعل بإنزيمات تخمير السكسينات كأمر ضروري لنمو الكائن الحي ونمو # x02019 مما يشير إلى دور مسار تخمير السكسينات في الحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال داخل الجليكوزوم عن طريق تجديد جزيئات NAD التي تستهلكها إنزيمات مسار التحلل العلوي [6 ، 18]. علاوة على ذلك ، بالنسبة لمحاكاة النماذج مع كل من الجلوكوز والجلوكوز فقط المكملين بالأحماض الأمينية ، أظهرت النتائج تجديد دورة TCA من خلال وسيطة C4 حمض الكربوكسيليك مثل مالات وفومارات وسكسينات التي يتم إنتاجها عبر مسار تخمير السكسينات ، مما يثبت أهمية تخمير السكسينات الجليكوزومي في تصلب TCA. من خلال تتبع توزيع التدفق من خلال تفاعلات النموذج ، يمكننا أن نفترض أن السبب الرئيسي لتنشيط تخمير السكسينات كان الطلب على تخليق الغلوتامات من خلال تفاعلات نازعة هيدروجين الجلوتامات والأسبارتات. وقد لوحظ نفس الشيء من خلال 13C استقلاب الطاقة في حل إل. مكسيكانا promastigotes [18]. من المهم أن نلاحظ هنا أنه هيكل شبكة إل. الرضع استقلاب الطاقة كما هو مطبق في نموذج iAS142 الذي يحكم هذا السلوك الأيضي. أيضًا ، من خلال نفس المسار الأيضي يتم تحقيق الحفاظ على الطاقة الخلوية للطفيلي. كان هذا المسار الخاص مفضلًا أيضًا في كل من سيناريوهات البروماستيجوت والأماستيجوت لاستقلاب الطاقة التي تم إعادة إنشائها في النموذج. بشكل مثير للدهشة ، توقعت دراسات خروج المغلوب في رد الفعل النموذجي أيضًا أن يكون NADPH والخلوي NADPH & # x02013 المعتمد على نازعة هيدروجين الغلوتامات حاسمًا لـ الليشمانية الطفولية. تشير كل هذه المعلومات إلى الدور الذي يلعبه تخمير السكسينات والتخليق الحيوي للجلوتامات في تحفيز استقلاب الطاقة بشكل أكبر لإثبات حقيقة أن إنزيمات تخمير السكسينات والتخليق الحيوي للجلوتامات يمكن أن تكون أهدافًا علاجية جديدة لـ إل. الرضع طفيلي.

كجزء من تصميم الأدوية العقلاني في الليشمانيا على سبيل المثال ، أصبح تحديد أهداف الأدوية الجديدة في مرحلة الاكتشاف المبكر مهمًا بشكل متزايد لتصميم مثبطات جزيئات صغيرة جديدة يمكن أن تكون بمثابة أدوية مرشحة محتملة ضد الطفيلي [22 ، 24]. تعتبر المرحلة التنموية من الماستيغوت هي الأكثر طلبًا لاكتشاف الأدوية لأنها المرحلة التي تسبب العدوى لدى البشر. تحدد دراسات الجينات الأساسية في شبكات التمثيل الغذائي أهداف العلاج الكيميائي المحتملة ، من خلال التقييم النوعي لدور بروتين معين يلعب في نمو الكائن الحي [17، 75 & # x0201377]. لإثبات إمكانية تطبيق تحليل النموذج القائم على FBA في التنبؤ الكمي وتصنيف التفاعلات الأساسية لتكون أهدافًا جيدة للأدوية ، قمنا بدمج في السيليكو سيناريوهات تدخل العلاج الكيميائي ضمن مرحلة amastigote المفترض في نموذجنا لـ 9 تفاعلات أساسية تنبأ بها في السيليكو تم إجراء تحليل خروج المغلوب للتفاعل في نموذج iAS142. من خلال التقليل الجزئي لقيمة التدفق الأمثل لكل من هذه التفاعلات الفردية في سيناريو amastigote ، تم تحديد الحد الأدنى للتثبيط الذي يحتاجه العلاج الكيميائي إلى كل تفاعل لتحقيق نمو صفري للطفيلي من خلال هذه المحاكاة. وفقًا لذلك ، أشارت التنبؤات إلى أنه بالنسبة لتفاعلات نازعة هيدروجين الجلوتامات والفوسفوجلوكوموتاز مقارنةً بالتفاعلات السبعة الأخرى ، أدى الحد الأدنى من نشاط الإنزيم / تدفق التفاعل إلى انخفاض فوري في نمو الطفيل مما يشير إلى اختيارهم كهدف دوائي مهم.


ملاحظة الناشر: تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

الشكل التكميلي 1 يتم إثراء الكسور الخلوية لعلامات البروتين والحمض النووي الريبي المتميز.

أ، تصوير Widefield لخلايا mES السليمة (يسار) ، نوى mES بعد استخراج العصارة الخلوية ، ولكن باستثناء منظف nonidet P-40 (NP-40) في المخزن المؤقت (وسط ، تحكم) ، ونواة mES بعد استخراج العصارة الخلوية وإزالة ER (يمين). بقعة نووية (DAPI) تظهر باللون الأزرق ، وصبغة تعقب ER باللون الأحمر. ب، بقع غربية من علامات البروتين لمقصورات خلوية مختلفة لخلايا HEK293. إنزيم نازعة الهيدروجين Glyceraldehyde 3-phosphate (GAPDH) للجزء السيتوبلازمي (cy) ، الوحدة الفرعية U1 البروتين النووي الصغيرة U1 70 (SNRP70) للكسر nucleoplasmic (np) ، والهيستون H3 لكسر الكروماتين (ch). يتم عرض البروتين من الخلية بأكملها (wc) للمقارنة. ج، RT-qPCR لعلامات RNA للمقصورات الخلوية المختلفة. بالنسبة لـ GAPDH و U1 ، تستهدف الاشعال RT (النسخ العكسي) mRNAs المقسمة (الناضجة) ، بينما بالنسبة لـ ACTIN mRNA ، يتم استهداف intron. د-ه، بقع غربية من واسمات البروتين لخلايا mES مع (د) علاج DMSO و (هـ) علاج NAI-N3. ACTIN للكسور السيتوبلازمية والنووية (cy و np) ، الوحدة الفرعية U1 الصغيرة للبروتين النووي الريبي النووي U1 70 (SNRP70) للكسر النووي (np) ، والهيستون H3 لكسر الكروماتين (الفصل).

الشكل التكميلي 2 توقف النسخ العكسي في تجارب icSHAPE شديدة الارتباط في التكرارات.

قطع التوزيع التراكمي لمعامل ارتباط بيرسون للنسخ العكسي تتوقف في مكررات كسور الحمض النووي الريبي في الكروماتين (الفصل) والنيوكليوبلازم (np) والسيتوبلازم (cy). تظهر البيانات من مكررات DMSO باللون الأحمر ، في المختبر يتم تكرار NAI-N3 باللون الأخضر ، و في الجسم الحي يتكرر NAI-N3 باللون الأزرق.

الشكل التكميلي 3 مراقبة جودة تفاعل icSHAPE عبر التكرارات والكسور والوفرة المختلفة من الحمض النووي الريبي.

أ,بومخطط التبعثر ومعاملات ارتباط بيرسون لنشاطات icSHAPE بين كل زوج من التكرارات والكسور في الماوس (أ) والبشر (ب). ج، مخطط الكثافة التراكمية لمعامل ارتباط بيرسون لعدد توقفات RT بين التكرارات عند عتبات مستوى تعبير RNA مختلفة. د، المخططات المبعثرة لـ NAI تقرأ الرقم مقابل RNA-seq RPKM * الطول (nt).

يتم إثراء كسور الكروماتين التكميلية الشكل 4 للحصول على معلومات هيكلية lncRNA و pre-mRNA (intron).

أ-بالنماذج الإنشائية لـ (أ) Ribonuclease P RNA و (بجسيم التعرف على الإشارة (SRP) RNA. يتم إنشاء النماذج من خدمة الويب ViennaRNA بناءً على بيانات من قاعدة بيانات RNASTRAND. يتم تلوين النيوكليوتيدات بدرجات icSHAPE من جزء البلازما النووية. ج، رسوم بيانية لنسب lncRNAs مقابل جميع النصوص في مقصورات خلوية مختلفة للإنسان والفأر. د، الرسوم البيانية لنسب التسلسل يقرأ المعينة للإنترونات مقابل جميع النصوص في الأجزاء الخلوية المختلفة للإنسان والفأر. البريد ز، مؤامرة الكمان لمؤشر Gini لبيانات icSHAPE في exon مقابل intron في (ه) mRNAs من خلايا mES ، (F) mRNAs من خلايا HEK293 المستنفدة من مواقع ربط RBP (20nt) و (ز) mRNAs من خلايا HEK293 المستنفدة من مواقع ربط RBP (100nt).

يلعب الشكل التكميلي 5 RNA دورًا مركزيًا في ربط النسخ والترجمة وتدهور الحمض النووي الريبي.

أ- ط، مخططات تقدير كثافة النواة (كيدي) (أ ، ج ، ه ، ز) ، المخططات المبعثرة (ب ، د ، و ، ح) ، ومخططات التشتت بقطع عمق قراءة أعلى (عمق القراءة = 200) (أنا) من معدل النسخ مقابل بنية RNA 5’UTR في الكروماتين ، كفاءة الترجمة مقابل بنية RNA 5’UTR في السيتوبلازم ، نصف عمر RNA مقابل بنية RNA كاملة الطول في nucleoplasm ، و RNA نصف عمر مقابل بنية RNA في السيتوبلازم. تم حساب القيمة p ثنائية الذيل بواسطة دالة حزمة python scipy.stats.pearsonr. ي-ل، مخططات مبعثرة لمعدل النسخ مقابل بنية RNA 5’UTR في الكروماتين. معدلات النسخ مأخوذة من مجموعات البيانات المنشورة: Min ، I.M et al. تطوير الجينات والأمبير. 25, 742–754, 2011 (ي) و Tastemel، M. et al. الدقة الخلايا الجذعية. 25, 250–255, 2017 (ك). الكفاءة متعدية مقابل هيكل 5’UTR RNA في السيتوبلازم (ل). بيانات الكفاءة التحويلية مأخوذة من تقرير منشور (Yoshikawa، H. et al. eLife. 7, 2018).

الشكل 6 التكميلي الارتباطات العكسية لنصف عمر الحمض النووي الريبي مع هياكل الحمض النووي الريبي في مناطق النسخ المختلفة والارتباطات الإيجابية لكفاءة ترجمة الحمض النووي الريبي مع معدل النسخ.

أ، مخطط الكثافة لمؤشر جيني بنصف عمر في مناطق 5’UTR و CDS و 3’UTR في السيتوبلازم والنيوكليوبلازم. ب، مخطط الكثافة لكفاءة الترجمة مقابل معدل النسخ في خلايا mES. تم إنشاء الشكل باستخدام البيانات المنشورة (Ingolia، N. T. et al. زنزانة 147، 789–802، 2011، and Jonkers، I. et al. eLife. 3، 2014). تم حساب قيمة p على الوجهين بواسطة دالة حزمة python scipy.stats.pearsonr.

الشكل 7 التكميلي RNA أقل تنظيماً في الكروماتين منه في السيتوبلازم.

خرائط الحرارة لمتوسط ​​درجات icSHAPE لأنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي في أجزاء مختلفة من الحمض النووي الريبي في الإنسان (بما في ذلك واستبعاد جميع مواقع ربط بروتين ربط الحمض النووي الريبي المعروفة (RBP)) والفأر. تمثل الخطوط المتقطعة بيانات غير كافية.

الشكل التكميلي 8 M 6 A ، ومواقع ربط pseudouridy () و HNRNPC أكثر تقطعت بهم السبل.

أ-ج، ملامح Metagene من درجات icSHAPE في (أ) م 6 مواقع أ مقابل مواقع تحكم (غير معدلة) مع عزر m 6 A ، (ب) مواقع الارتباط الكاذب (Ψ) مقابل مواقع U العشوائية ، و (ج) مواقع ربط HNRNPC مقابل مواقع التحكم مع شكل polyU. تم حساب قيم P بواسطة اختبار Mann-Whitney U أحادي الجانب ، وتعني النجوم الحمراء أن قيم p أقل من 0.01.

الشكل التكميلي 9 يتم إثراء العديد من مواقع ربط RBP في مناطق التغييرات الهيكلية للحمض النووي الريبي.

عدد مواقع ربط RBP في مناطق التغييرات المحددة (المثلث الأحمر) مقابل مناطق التغييرات العشوائية (النقاط الزرقاء).

الشكل التكميلي 10 يتأثر ارتباط LIN28A و IGF2BP3 بالـ RNAs المستهدفة بتعديل m 6 A.

أ,ب، فحوصات RNA المنسدلة و RBP Western blots باستخدام تحقيقات RNA التي تحتوي على طفرة غير معدلة A و m 6 A و U على التوالي من (أ) النصوص التي تربط IGF2BP3 ، و (ب) روابط LIN28A إلى مواقع m 6 A تم تمييزها باللون الأحمر "م". تظهر الرسوم البيانية أن الحمض النووي الريبي يتراجع مع ثلاث مكررات. يتم إجراء البقع الغربية باستخدام (أ) الجسم المضاد لـ IGF2BP3 أو الجسم المضاد لـ LIN28A ، بعد سحب الحمض النووي الريبي لأسفل. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للتكرارات. ج، تداخل مواقع ربط Lin28a (بما في ذلك مواقع Mettl3 الضربة القاضية (KO) وفي خلايا mES من النوع البري (WT)) ومواقع m 6 A. بالنسبة لتلك المواقع المتداخلة ، يرتبط Lin28a بقوة أكبر في 45 من أصل 68 موقعًا في Mettl3 KO ، مقابل 23 من أصل 68 موقعًا في خلايا WT mES.


& ltp> يوفر هذا القسم أي معلومات مفيدة حول البروتين ، ومعظمها معلومات بيولوجية. & ltp> & lta href = '/ help / function_section' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> الوظيفة i

ناقل محايد كهربائيًا لغشاء البلازما يتوسط الامتصاص الخلوي للكاتيونات المعدنية ثنائية التكافؤ الزنك والمنغنيز والحديد والتي تعتبر مهمة لاستتباب الأنسجة والتمثيل الغذائي والتطور والمناعة (PubMed: 15642354، PubMed: 27231142، PubMed: 29621230).

يعمل كمتوافق يعتمد على الطاقة ، وينقل عبر الأغشية مركبًا محايدًا إلكترونيًا يتكون من كاتيون معدني ثنائي التكافؤ واثنين من أنيونات البيكربونات (بالتشابه).

بجانب هذه الركائز الخلوية الداخلية ، يمكن أيضًا استيراد الكادميوم وهو معدن غير أساسي وهو سام للخلايا ومسرطن (عن طريق التشابه).

يتحكم في الامتصاص الخلوي للزنك الجهازي من خلال ظهارة الأمعاء ، والذي بدوره ضروري للحفاظ على الوصلات الضيقة ونفاذية الأمعاء (بالتشابه).

يعدل نشاط phosphodiesterases المعتمد على الزنك ، وبالتالي ينظم بشكل غير مباشر مسارات إشارات مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين G المهمة لتكوين السكر وتمايز الخلايا الغضروفية (عن طريق التشابه).

ينظم إشارات مستقبلات الأنسولين وامتصاص الجلوكوز وتخليق الجليكوجين وتكوين السكر في خلايا الكبد من خلال هدم الأنسولين داخل الخلايا المعتمد على الزنك (PubMed: 27703010).

من خلال امتصاص الخلايا للزنك يلعب أيضًا دورًا في تكيف الخلايا مع إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (عن طريق التشابه).

المنغنيز الناقل الرئيسي للغشاء الجانبي للخلايا الظهارية المعوية ، يلعب دورًا مركزيًا في التوازن الجهازي للمنغنيز من خلال امتصاص المنغنيز المعوي (PubMed: 31028174).

تشارك أيضًا في امتصاص المنغنيز خارج الخلية بواسطة خلايا الحاجز الدموي الدماغي (PubMed: 31699897).

قد يلعب أيضًا دورًا في استتباب المنغنيز والزنك المشاركة في التخلص من الدم من خلال إفراز الكبد الصفراوي (عن طريق التشابه).

يعمل أيضًا في الامتصاص خارج الخلية للحديد الحر. قد يعمل أيضًا داخل الخلايا ويتوسط في الانتقال من الجسيمات الداخلية إلى العصارة الخلوية للحديد الموطن بواسطة الترانسفيرين (PubMed: 20682781).

يلعب دورًا في المناعة الفطرية من خلال تنظيم التعبير عن السيتوكينات بواسطة الضامة المنشطة (PubMed: 23052185).

& # xd & ltp> المعلومات المنسقة يدويًا والتي تم نشرها من بروتين ذي صلة تجريبيًا. & lt / p> & # xd & # xd & ltp> & lta href = "/ manual / Evidences # ECO: 0000250"> المزيد. & lt / a> & lt / p> & # xd التأكيد اليدوي المستنتج من تشابه التسلسل بـ i

& # xd & ltp> معلومات منظمة يدويًا والتي يوجد لها أدلة تجريبية منشورة. & lt / p> & # xd & # xd & ltp> & lta href = "/ manual / Evidences # ECO: 0000269"> المزيد. & lt / a> & lt / p> & # xd تأكيد يدوي استنادًا إلى التجربة في i


استراتيجيات هندسة التمثيل الغذائي للنظام لبناء مصانع الخلايا

Maofang Teng و. Guoqiang Zhang ، النظم وهندسة الأيض الاصطناعية ، 2020

6.3 تصميم وبناء أجزاء / أنظمة بيولوجية جديدة

تعد البيولوجيا التركيبية مجالًا ناشئًا للبحث يمكن وصفه بأنه تصميم وبناء مسارات بيولوجية اصطناعية جديدة ، والتي تشمل (1) تصميم وبناء أجزاء وأجهزة وأنظمة بيولوجية جديدة ، و (2) إعادة تصميم الطبيعية الموجودة. أنظمة بيولوجية لأغراض مفيدة. تعد البيولوجيا التركيبية ، المدمجة مع الفكر الهندسي ، مجالًا بحثيًا متعدد التخصصات تم تطويره على أساس علم الأحياء الحديث وعلم الأنظمة. وهو يشمل البيولوجيا الجزيئية ، وبيولوجيا الخلية ، والنظاميات التطورية ، والكيمياء الحيوية ، والمعلوماتية ، والرياضيات ، وتكنولوجيا الكمبيوتر والهندسة ، وغيرها من التخصصات متعددة التخصصات. بعبارة أخرى ، البيولوجيا التركيبية هي هندسة علم الأحياء: تخليق أنظمة معقدة ، قائمة على أساس بيولوجي (أو مستوحاة) ، والتي تعرض وظائف غير موجودة في الطبيعة. يمكن تطبيق هذا المنظور الهندسي على جميع مستويات التسلسل الهرمي للبنى البيولوجية - من الجزيئات الفردية إلى الخلايا والأنسجة والكائنات الحية بأكملها. في الأساس ، سوف تقوم البيولوجيا التركيبية بتنفيذ تصميم النظم البيولوجية بطريقة منطقية ومنهجية. تعد النظم البيولوجية العلمية معقدة ولا يمكن التنبؤ بها ، ويتم تحسين المكونات الجزيئية الأساسية وتصميمها وتجميعها باستمرار من خلال تقنيات واستراتيجيات البيولوجيا التركيبية لتعزيز الوظائف البيولوجية للأنظمة الحالية ، ومحاكاة وبناء التراكيب البيولوجية ، والتي تساهم في إنشاء وظائف بيولوجية جديدة و أنظمة [13]. من خلال تصميم وبناء أنظمة بيولوجية بشكل مصطنع ، يتم تزويد الناس بنظريات وأدوات أكثر قوة وتوسيع الآفاق الفكرية في حل قضايا الطاقة والمواد وحماية البيئة والقضايا الصحية [14].

في عام 1978 ، تم اقتراح أيديولوجية البيولوجيا التركيبية لأول مرة من قبل عالم بولندي مشيرًا إلى أن اكتشاف نوكلياز التقييد لا يوفر فقط للأشخاص أدوات لإعادة تركيب الحمض النووي ، ولكن أيضًا يمكنه الاستفادة من الجينات الموجودة للبحث وإنشاء جينات جديدة. وبذلك يتم توجيه الناس إلى مجال جديد ، ألا وهو البيولوجيا التركيبية [15]. في العشرات من السنين الماضية ، تطورت البيولوجيا التركيبية بسرعة. كوليسنيشينكو وآخرون تقليل حجم الجينوم عن طريق حذف بعض جينات الإشريكية القولونية دون التأثير على وظيفة الحياة الأساسية ، مما مهد الطريق لتعديل جينوم السلالات الميكروبية [16]. كيسلينج وآخرون. [17] تم الحصول على حمض الأرتيميسينيك بالطرق البيولوجية الاصطناعية في خميرة الخميرة، وهو مقدمة الدواء المضاد للملاريا. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تخليق الحمض النووي أحد التقنيات التي تعزز تطوير البيولوجيا التركيبية. في وقت لاحق ، جيبسون وآخرون. تصنيع وتجميع جينوم بكتيري صغير تم نقله إلى خلية بكتيرية أخرى بدون DNA ، مما أدى إلى تكوين خلية جرثومية جديدة مستقلة وقابلة للتكرار [18]. في الوقت الحاضر ، استنادًا إلى التكنولوجيا الجينية ، فإن أبحاث البيولوجيا التركيبية التي تستخدم استراتيجيات هندسية ، ومكونات بيولوجية موحدة ، وبناء وحدات بيولوجية عالمية ، تسهل تصميم وتجميع أنظمة بيولوجية اصطناعية بوظائف جديدة محددة.

في السنوات الأخيرة ، تم توسيع وتحسين أدوات واستراتيجيات البيولوجيا التركيبية بشكل مستمر. من خلال بناء وتعديل الأجزاء البيولوجية ، وتصميم وبناء مسارات أيضية جديدة ، من المفيد تطوير سلالات تعرض أداءً أفضل وتحسين إنتاجية المنتجات البيولوجية المفيدة للبشر.هنا ، سيتم تقديم التقدم البحثي الرئيسي وتطبيق وإنجازات أدوات واستراتيجيات البيولوجيا التركيبية في السنوات الأخيرة من جوانب هندسة البروتين والأجزاء البيولوجية المستخدمة للتعبير الجيني الدقيق (الشكل 6.1).

الشكل 6.1. الاستراتيجيات التمثيلية للبيولوجيا التركيبية والهندسة الأيضية لبناء مصانع الخلايا.

تشمل أدوات واستراتيجيات البيولوجيا التركيبية مكتبة المروج / RBS ، وتقليل التنظيم الجيني القائم على الحمض النووي الريبي / زيادة التعبير الجيني ، وتحرير / تقليل التنظيم الجيني المستند إلى CRISPR ، والسقالة الاصطناعية ، وما إلى ذلك.

6.3.1 هندسة البروتينات تحسن خصائص العناصر

تتطلب البيولوجيا التركيبية عمومًا هندسة مسارات التمثيل الغذائي الخلوي. تتمثل الطريقة الشائعة لتصميم وتعديل المسارات الأيضية في إدخال مكونات بروتينية غير متجانسة في المسارات الخلوية الموجودة ، وحتى التخلص من البروتينات الموجودة [19]. حتى الآن ، جاءت معظم المكونات المستخدمة في البيولوجيا التركيبية من كائنات طبيعية. نظرًا لأن البيولوجيا التركيبية تهدف إلى بناء أنظمة بيولوجية جديدة ، فإن وحدات البروتين المستقلة نسبيًا والتجميع مطلوبة. ومع ذلك ، فإن الإنزيمات المستخرجة من الطبيعة مقيدة بالركيزة والبيئة ، ولا يمكنها تلبية الخصائص والأنشطة المرغوبة بشكل كامل. لذلك ، من الضروري تطوير وحدات بروتين معيارية وموحدة مثل تحسين خصائص الإنزيم عن طريق إدخال وظائف تحفيزية بروتينية جديدة لبناء مسارات اصطناعية جديدة وتحسين كفاءة المسار الأيضي ، وتغيير البروتينات التنظيمية لمعالجة المسارات الأيضية وإنشاء سقالات بروتينية لتوجيه المستقلبات [20 ].

تمتلك هندسة البروتين القدرة على إنشاء بروتينات وظيفية جديدة. تصميم البروتين الحسابي هو نهج قائم على الهيكل لتعديل البروتين. وفقًا لدراسات محددة مثل خصائص التفاعل وهيكل الركيزة ، فإن تصميم تسلسل البروتين الجديد والهياكل والوظائف التي تعتمد على الهياكل والمحاكاة الحسابية الذرية يتم إجراؤها لتحقيق التطور الموجه للمكونات الحفازة وإنشاء مكتبات ذكية [21]. يمكن استغلال أدوات تصميم البروتين الحسابي لتحديد المجال الأساسي لبنية البروتين ، وتوفير المواقع المستهدفة للهندسة وحتى المسموح بها من جديد تصميم الانزيمات. هذا يمكن أن يقلل بشكل كبير من تكلفة المواد والوقت والعمالة. على سبيل المثال ، من أجل تحقيق خصوصية ركيزة جديدة ، Liu et al. [22] إعادة تصميم التفاعلات القائمة بين البروتين والرابطات القائمة على آليات التحفيز لتغيير خصوصية الركيزة. لقد صمموا ligase حمض الليبويك (lpal) عن طريق زيادة حجم الجيب المرتبط بالإنزيم ، وحصلوا أخيرًا على ليجاز فلوروفور مع نشاط على ريزوروفين. سيجل وآخرون. [6] حصل على إنزيم بواسطة من جديد التصميم الذي حفز تفاعل Diels-Alder مع الانتقائية الفراغية العالية وخصوصية الركيزة.

يمكن أيضًا استخدام بناء وتعديل وحدات البروتين لزيادة التدفق في مسارات التمثيل الغذائي الحيوي. من المعروف أن سقالات البروتين الاصطناعية أو بروتينات الاندماج يمكن أن تشترك مكانيًا في توطين الإنزيمات ذات الصلة لزيادة تركيز الإنزيم المحلي وتحسين كفاءة تخليق المنتج. دوبر وآخرون [23،24] معبرًا عن السقالات بنطاق معياري للتفاعل بين البروتين والبروتين لتحسين تدفق المسارات الأيضية المهندسة في الجسم الحي. تزيد السقالات في المسارات من الكفاءة وتنتج عيارات أعلى للمنتج حتى في تركيزات الإنزيم المنخفضة نسبيًا ، والتي يمكن أن تقلل بشكل فعال من انتشار المواد الوسيطة ، مما قد يزيد من معدل التفاعل عن طريق تغيير تفاعل بروتينات السقالة. تم تطبيق هذه الإستراتيجية أيضًا بنجاح لزيادة كفاءة مسار التخليق الحيوي للميفالونات. لويكا وآخرون. [25] أعرب عن اندماج بيرلات ديكاربوكسيلاز (Pdc) ونزعة هيدروجين الكحول (AdhB) في بكتريا قولونية، التي كانت إنتاجيتها من الإيثانول أعلى من إنتاج الخلايا المتوافقة مع Pdc و AdhB.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للتنظيم المكاني للبروتينات من المكونات الخلوية أن يحد بشكل فعال من المواد الوسيطة السامة ، ويزيد من التركيزات المحلية للإنزيمات والوسائط ، ويمنع التفاعلات الجانبية غير الضرورية. يمكن تحقيق التقسيم من خلال استخدام العضيات الطبيعية في الخلايا حقيقية النواة. يمكن للخلايا بدائية النواة بناء أجزاء ميكروية بكتيرية (BMC) مماثلة للعضيات في الخلايا حقيقية النواة. يتكون BMC من غلاف بروتيني ويغلف الإنزيمات المتعلقة بمسار التخليق الحيوي [26]. على سبيل المثال ، إدخال مسار الأسيتوين غير المتجانسة في الميتوكوندريا المبيضات glabrata زيادة تركيز الإنزيمات والوسائط. بعد الاقتران بحامل بيروفات الميتوكوندريا (MPC) ، زاد إنتاج الأسيتوين بنسبة 59.8٪ مقارنة بالمسار السيتوبلازمي [27]. تم تغليف بروتين تحلل البكتيريا E في BMCs المؤتلف ، والذي يمكن أن يحمي الخلايا من السمية [28].

6.3.2 تصميم وهندسة الأجزاء البيولوجية

مع تطور البيولوجيا الجزيئية ، يتم تصنيف تسلسل الجينات أيضًا على أنها وحدات وظيفية مختلفة لفهم عملية النسخ والترجمة بشكل أفضل ، مثل المروجين والمثبطات والمنشطات ووحدات النسخ ومناطق ترميز البروتين ومواقع ربط الريبوسوم والمُنهي. ومع ذلك ، لم يتم توحيد عدد كبير من الأجزاء البيولوجية الوظيفية المعروفة وأظهرت عدم توافقها ، مما أدى إلى عمل غير متسق بين المكونات ، وانخفاض الكفاءة بشكل كبير ، أو عدم القدرة على ممارسة الوظائف. يجب تصميم الأجزاء البيولوجية الجديدة وتصنيعها عن طريق تعديل المكونات البيولوجية الموجودة أو إنشاء مكونات بيولوجية جديدة تمامًا لبناء نظام بيولوجي مرغوب.

مع تقدم تسلسل الحمض النووي وتكنولوجيا تخليق الحمض النووي ، انخفضت تكلفة تخليق الجينات وتجميعها ، مما يجعل الحمض النووي الاصطناعي ممكنًا. يتضمن تخليق الحمض النووي إعادة تصميم تسلسلات الجينات المستهدفة والتسلسلات التنظيمية. يمكن تصنيع تسلسل الحمض النووي مع الوظائف المرغوبة في مسارات مختلفة بشكل انتقائي لتجنب آثار تنظيم التمثيل الغذائي في الجسم الحي.

لتحقيق البناء السريع للأجزاء والمسارات البيولوجية ، طور الباحثون سلسلة من تقنيات تجميع الحمض النووي الجديدة ، مما يضع الأساس لبناء أنظمة بيولوجيا تركيبية عالية الكفاءة. يستخدم تجميع Golden Gate نوع خاص من إنزيم تقييد IIS لتقسيم موقع التعرف على الحمض النووي لإنشاء نهاية لزجة متغيرة ، ثم يستخدم DNA ligase لتحقيق تجميع سلس لشظايا الحمض النووي المتعددة [29]. جيبسون وآخرون. [30] طورت مجموعة جيبسون للربط المتعدد الأجزاء ، وهي طريقة متساوية الحرارة ، لا تترك أثرًا ، من خطوة واحدة. يتم شق ناقلات مع منطقة تداخل شظايا الحمض النووي والعديد من شظايا الحمض النووي عند التفاعل مع نوكلياز خارجي ، وتعريضها لتجميع سلس تحت الإجراء التآزري لـ DNA ligase و DNA polymerase. Ligase Cycling Assembly (LCA) هو نهج لتجميع قليل النوكليوتيدات الأقصر أو شظايا DNA مزدوجة الشريطة في هياكل DNA أكبر [31]. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تقنيات أخرى لتجميع الجينات مثل Polymerase Cycling Assembly (PCA) [32] وتجميع BioBrick [33] ومستحلب PCA [34]. في السنوات الأخيرة ، قام Wang et al. [35] طور تقنية هندسة الجينوم المؤتمتة المتعددة (MAGE) ، حيث يتم تحقيق تنوع تركيبة الجينات عن طريق الطفرة المتزامنة لمواقع متعددة في بكتريا قولونية الكروموسوم على أساس الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). تم تطبيق هذه الطريقة في S. cerevisiae وتطور هندسة الجينوم بوساطة الخميرة (YOGE) [36]. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لتقنيات الهندسة الجينومية القائمة على نوكليازات المستجيب الشبيهة بالمنشط النسخي (TALENs) وتسلسلات التكرار القصيرة المتناظرة القصيرة المنتظمة (CRISPR) المُصممة هندسيًا أن تُحدث شقوقًا أو تكسر الحمض النووي المزدوج في مواقع محددة وتكون قادرة على تحرير الجينات [37] ، والتي تم استخدامها على نطاق واسع في البيولوجيا التركيبية. يسمح تطوير تجميع الجينات وتكنولوجيا تحرير الجينات بالتحكم النسخي للجينومات الطبيعية والاصطناعية بالإضافة إلى التطور الموجه للمجموعات الجينية في الجسم الحي أو في المختبر، وتسهيل إعادة تشكيل مسارات التخليق الحيوي وبالتالي تسريع تحسين الخلايا الميكروبية المهندسة.

نظرًا للتكتلات الجينية الحيوية الكبيرة (BGC) للمنتجات الطبيعية والتنظيم المعقد ، فمن الصعب التحكم بدقة في الجين المقابل بناءً على التلاعب الجيني. يمكن أن تتكون BGCs من جينات متعددة ، والتي يتم ترتيبها في واحد أو أكثر من العوامل تحت التنظيم المعقد والمتكرر من خارج الجين أو داخله ، مثل المحفزات ، ودورة التغذية الأمامية والتغذية المرتدة المضمنة [38 ، 39]. لذلك ، من الصعب تغيير مستوى التعبير عن جين واحد في BGCs للمنتج الطبيعي. وبالمثل ، فإن المكونات والأنظمة البيولوجية المصممة والمبنية بشكل مصطنع يتم نقلها حتمًا إلى الكائنات الحية للزراعة والعمل. ومع ذلك ، قد يكون لمسارات تحويل الإشارة والشبكات الأيضية من الكائنات الحية بعض التأثيرات على المكونات والأنظمة البيولوجية التركيبية. دفعت هذه العوامل الباحثين إلى تبسيط وإعادة بناء الجينات وحتى الجينومات بناءً على تقنيات بناء الحمض النووي بما في ذلك تخليق الحمض النووي وتكنولوجيا تجميع الحمض النووي. يمكن أن يجعل الأنظمة البيولوجية الاصطناعية أكثر قابلية للجهود الهندسية. أثناء إعادة هيكلة الجينات ، تتم إزالة كل المنطقة غير المترجمة وجينات البروتين المنظمة والجينات غير الأساسية. ثم يتم تعديل رموز الجينات الأساسية ومسحها ضوئيًا بواسطة الكمبيوتر لإزالة التنظيم الداخلي [39]. من خلال حذف الجينات غير الأساسية والاحتفاظ بالجينات الأساسية المرتبطة بأنشطة الحياة الفردية ، يمكن تبسيط الجينوم ويمكن بسهولة تحديد خلفية الخلايا الهيكلية وتحليلها. على سبيل المثال ، أعاد الباحثون تشكيل جينوم العاثية T7 [40]. تسهل مخططات تجميع الحمض النووي المعيارية ظهور استراتيجيات تنظيمية مركبة لمسار التلاعب. تتمثل الخطوة الأولى في تصميم المسار الأمثل عند إعادة تكوين المسارات الأيضية للمواد الكيميائية الطبيعية وغير الطبيعية. بعد ذلك ، يمكن إدخال الإنزيمات المرشحة المشتقة من الكائنات الحية بشكل غير متجانس أو مجتمعة لإنشاء مسارات أيضية جديدة. ينظم التجميع التوافقي وإعادة تكوين الشبكات الأيضية التعبير عن الإنزيمات ذات الصلة لتحسين تخليق المنتجات الطبيعية ، مثل مادة الأرتيميسين [41] والكاتشين [42].


معلومات الكاتب

الانتماءات

جامعة فرجينيا كومنولث ، ريتشموند ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

جواو إم بي ألفيس ، ميرنا جي سيرانو وأمبير جريجوري إيه باك

فريق BAMBOO ، INRIA Grenoble-Rhône-Alpes ، فيلوربان ، فرنسا

سيسيليا سي كلاين وأمبير ماري فرانس ساجوت

Laboratoire Biométrie et Biologie Evolutive، CNRS، UMR5558، Université de Lyon، Université Lyon 1، Villeurbanne، France

سيسيليا سي كلاين وأمبير ماري فرانس ساجوت

Laboratório Nacional de Computação Científica، Petrópolis، Rio de Janeiro، Brazil

سيسيليا سي كلاين وآنا تيريزا آر فاسكونسيلوس

قسم علم الطفيليات ، معهد العلوم الطبية الحيوية ، جامعة ساو باولو ، ساو باولو ، البرازيل

جواو إم بي ألفيس ، وفلافيا مايا دا سيلفا ، وأندريه جي كوستا مارتينز ، ومارتا إم جي تيكسيرا ، وأمبير إرني بي كامارجو

Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho، Universidade Federal do Rio de Janeiro، Rio de Janeiro، Brazil