معلومة

كودون GUG للبداية في E. coli: هوية بدء الحمض الريبي النووي النقال وكفاءة الترجمة

كودون GUG للبداية في E. coli: هوية بدء الحمض الريبي النووي النقال وكفاءة الترجمة



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

الترجمة في بكتريا قولونية يبدأ عادةً في كودون AUG ، والذي يشفر الحمض الأميني ميثيونين. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، يكون كود البدء هو GUG ، والذي عادةً ما يشفر فالين. إذا تم استخدام GUG ككودون بدء ، فهل يكون الحمض الريبي النووي النقال مشحونًا بالميثيونين المستخدم أم أنه مشحون بالفالين ، وهل استخدام GUG ككودون بدء يؤثر على كفاءة الترجمة؟


يترجم جدول ترجمة NCBI جميع مواقع البدء البديلة إلى methionines. حسب فهمي ، فإن كل الترجمة تبدأ من خلال fMet-tRNA. لا أعرف ما إذا كان هناك أي استثناءات لهذه القاعدة.

فيما يتعلق بكفاءة الترجمة ، لم أجد سوى ورقة عام 1985 في PNAS (Reddy et al ، PNAS 82: 5656-60) ، حيث قارنوا بين كفاءة الترجمة الخاصة بـ adenilate cyclase الخاص بـ UUG start مقابل GUG أو AUG ، والحصول على نسبة ترجمة 1: 2 : 6 UUG: GUG: AUG ، مما يشير إلى أن AUG هو الأكثر كفاءة ، يليه GUG. أيضًا ، قارن روميرو وجارسيا ، رسائل علم الأحياء الدقيقة في FEMS 84: 325-330 (1991) كفاءة AUG مقابل AUC و AUA و AUU ، مما يدل على كفاءة أقل بكثير لتلك الكودونات ، لكنهم لم يقارنوها بـ GUG.


تحدد المنافسة بين عامل بدء الترجمة eIF5 وبروتينه المقلد 5MP معدل بدء غير AUG على مستوى الجينوم

ليمنج تانغ ، جاكوب موريس ، جي وان ، تشيلسي مور ، يوشيهيكو فوجيتا ، سارة جيلاسبي ، إريك أوبي ، جاغبريت ناندا ، مود ماركيز ، مايكا جانغال ، آبي أندرسون ، كريستيان كوكس ، هيرويوكي هيرايشي ، ليمنج دونج ، هيروهايد سايتو ، تشينغاخام رانجيت سينغ Witcher ، Ivan Topisirovic ، Shu-Bing Qian ، Katsura Asano ، المنافسة بين عامل بدء الترجمة eIF5 والبروتين المقلد 5MP يحدد معدل بدء غير AUG على مستوى الجينوم ، بحوث الأحماض النووية، المجلد 45 ، العدد 20 ، 16 نوفمبر 2017 ، الصفحات 11941-11953 ، https://doi.org/10.1093/nar/gkx808


الثلاثاء 27 فبراير 2018

المنشورات - كيف أحصل على مجموعة بيانات اقتباس تحتوي على نصوص كاملة للمقالات بتنسيق PDF؟

أنا أقوم ببحث في التنقيب عن النص. من أجل ذلك ، أحتاج إلى مجموعة بيانات تحتوي على ملفات PDF للنصوص الكاملة للمقالات الورقية البحثية ، ويجب أن تكون جميع المقالات مرتبطة ببعضها البعض من حيث الاستشهاد بها. هناك مجموعات بيانات لشبكة الاستشهادات متاحة والتي تحتوي فقط على بيانات وصفية للأوراق ، ولكن مع هذا أريد أيضًا أن تكون النصوص الكاملة للمقالات بتنسيق PDF.

ماذا علي أن أفعل للحصول على مجموعة البيانات هذه؟

الدرجات - لماذا تحتاج لجنة القبول إلى النظر في النص بأكمله؟

تنظر لجان القبول في النص الكامل للطالب لفهم قدراتهم الأكاديمية. لماذا لا يكفي الحكم على الأكاديميين للطالب على أساس المعدل التراكمي وحده؟


مقدمة

يتبع بدء الترجمة قواعد مختلفة في البكتيريا وفي حقيقيات النوى. يتم التعرف على أكواد البدء البكتيرية بشكل عام بواسطة الوحدة الفرعية 30S الريبوسوم بمساعدة نموذج ربط الريبوسوم ، تسلسل Shine-Dalgarno (SD) الغني بالبيورين المكمل للطرف 3 للوحدة الريبوزومية الصغيرة RNA (15 والمراجع فيها) . في حقيقيات النوى ، لا تحتوي mRNAs على تسلسلات SD ، ويُعتقد أن التعرف على أكواد البدء يتوافق مع نموذج `` مسح الريبوسوم '' (15 16) ، حيث ترتبط الوحدات الفرعية 40S ، بمساعدة العديد من عوامل البروتين ، بـ غطاء في نهاية 5 ′ من الرنا المرسال أو في جوارها المباشر وبعد ذلك "مسح" التسلسل نحو الطرف 3 "حتى تتم مصادفة كودون البدء. عادةً ما يكون الأخير هو أول AUG في أي إطار قراءة ممكن. علاوة على ذلك ، تحتوي البكتيريا وحقيقيات النوى على مجموعات مختلفة من عوامل بدء الترجمة ، بعضها فقط مشترك في كلا المجالين (17).

لا يُعرف سوى القليل جدًا عن طريقة بدء الترجمة في الأركيا. تتشابه mRNAs الأثرية من الناحية الهيكلية مع تلك البكتيرية ، مع التكرار المتكرر للنصوص متعددة الأطوار ، والتي غالبًا ما تسبق رموز البدء (وإن لم يكن دائمًا) أشكالًا شبيهة بـ SD (11 3). ومع ذلك ، لم يتم اختبار ما إذا كانت أشكال SD مطلوبة حقًا لبدء الترجمة. علاوة على ذلك ، يبدو أن بعض الأركيا تحتوي على نسبة عالية من الرنا المرسال تفتقر تمامًا إلى منطقة غير مترجمة 5 (5′-UTR) (24) ، والتي من الواضح أن ترجمتها لا يمكن أن تعتمد على التعرف على تسلسل SD. أخيرًا ، تمتلك العتائق مجموعة أكثر تعقيدًا من عوامل البدء من البكتيريا بينما تستخدم الأخيرة ثلاثة عوامل بدء فقط (IF1 و IF2 و IF3) (13) ، و Archaea ، على الأقل على أساس التحليل الجيني ، استخدم أكثر من 10 ( 11 3) ، بما في ذلك متماثلات عوامل البدء حقيقية النواة eIF5A و eIF4A و eIF2 ، وهو بروتين ثلاثي له على ما يبدو نفس وظيفة IF2 البكتيرية ولكن لا علاقة له به تمامًا في كل من التسلسل والهيكل. بسبب هذه الملاحظات ، فقد تم التكهن بأن بدء الترجمة في الأركيا قد يكون له ميزات فريدة وقد يشبه عملية حقيقية النواة في بعض الجوانب (11 17 ، 18). حتى الآن ، ومع ذلك ، فإن الدراسات التجريبية حول هذا الموضوع قد تخلفت كثيرًا عن التخمينات النظرية والتكهنات التطورية.

في هذا العمل ، قمنا بتحليل طبيعة رابطة الدول المستقلة- عمل إشارات تتحكم في التعرف على مواقع بدء الترجمة في الأركون شديد الحرارة Sulfolobus solfataricus. لهذا الغرض ، درسنا ترجمة mRNA ثنائي الاتجاه في نظام خالٍ من الخلايا يسمح بفك تشفير مؤمن لـ سلفولوبس الرنا المرسال الطبيعي عند درجة حرارة قريبة من درجة الحرارة الفسيولوجية (23). وجدنا أن بدء الترجمة في S. solfataricus يتم التحكم بشكل صارم بواسطة أشكال SD ، التي كان وجودها ضروريًا للتعبير عن كلا السيسترون في mRNA قيد الدراسة. كان تأثير المحددات الأخرى ، مثل كودون البدء ، متغيرًا ويعتمد على الجين وموقعه في الرنا المرسال. أخيرًا ، يمكن إزالة الكتلة الترجمية الناتجة عن الطفرات في تسلسل SD عن طريق حذف 5′-UTR تمامًا. يشير هذا إلى أن البدء "بدون قيادة" يعمل عن طريق آلية فريدة ، تختلف عن تلك المستخدمة في البدء "الطبيعي" ، والتي قد تكون قديمة من الناحية التطورية ومشتركة في جميع المجالات الأساسية الثلاثة للحياة.


شكر وتقدير

نشكر J. Que على R26-Sox2-IRES-eGFP الفئران ، D. Xu ومرفق كورنيل للجينوم لدعم التسلسل ، ومرفق Rockefeller Proteomics لتحليل البروتين / الببتيد ، وأعضاء مختبر Fuchs للمناقشات ، و L. Polak و M. Sribour لدعمهم في دراسات تكوين الأورام. نشكر E. Heller لدعم المعلوماتية الحيوية ، و L. Calviello لدعمه مع RiboTaper ، و F. Garcia-Quiroz و M. Jovanovic لقراءتهما النقدية للمخطوطة. يقر مركز موارد البروتيوميات بجامعة روكفلر بالتمويل المقدم من Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust ومؤسسة Sohn Conferences لأجهزة قياس الطيف الكتلي. تستند النتائج المنشورة هنا جزئيًا إلى البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة شبكة أبحاث TCGA (http://cancergenome.nih.gov/). كما. كان مدعومًا من قبل منظمة برنامج Human Frontier Science Program (HFSP ، LT000639-2013) ويتم دعمه حاليًا من قبل برنامج الأشخاص (إجراءات ماري كوري) لبرنامج الإطار السابع للاتحاد الأوروبي FP7 بموجب اتفاقية منحة REA رقم. 629861. S.N. هو زميل ديمون رونيون (DRG-2183-14). ب. كان مدعومًا بمنحة برنامج تدريب العلماء الطبيين من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة T32GM007739 لبرنامج Weill Cornell / Rockefeller / Sloan-Kettering Tri-Institutional MD-PhD. إي إف وجي إس دبليو هم محققون في معهد هوارد هيوز الطبي. تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة إلى E.F. من المعاهد الوطنية للصحة (R37-AR27883) و NYSTEM CO29559.


معلومات الكاتب

العنوان الحالي: معهد أبحاث السرطان في المملكة المتحدة ، لندن ، مختبرات كلير هول ، ساوث ميمز ، هيرتفوردشاير ، EN6 3LD ، المملكة المتحدة

العنوان الحالي: وزارة الزراعة الأمريكية ، خدمة البحوث الزراعية ، SEPRL ، 934 College Station Road ، أثينا ، جورجيا ، 30605 ، الولايات المتحدة الأمريكية

العنوان الحالي: قسم التخدير ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا ، 94143 ، الولايات المتحدة الأمريكية

العنوان الحالي: مركز بيركلي للبيولوجيا التركيبية ، جامعة كاليفورنيا ، 717 شارع بوتر ، بيركلي ، كاليفورنيا ، 94720-3224 ، الولايات المتحدة الأمريكية

الانتماءات

أقسام البيولوجيا الجزيئية والخلوية والكيمياء ، جامعة كاليفورنيا ، بيركلي ، 94720 ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية

باربرا إس شويرث ، كاثي دبليو هاو ، جيمي إتش دودنا كيت وأمبير أنطون فيلا سانجورجو

قسم الأحياء الدقيقة ، جامعة ميامي ، أكسفورد ، 45056 ، أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكية

جي مايكل داي وأمبير جاري آر جانسن

قسم البيولوجيا الجزيئية ، بيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية ، جامعة براون ، بروفيدنس ، 02912 ، رود آيلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية

قسم العلوم البيولوجية الفيزيائية ، مختبر لورانس بيركلي الوطني ، بيركلي ، 94720 ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية


1. الكود القياسي (transl_table = 1)

بشكل افتراضي ، تساوي جميع ملفات transl_table في GenBank flatfiles معرّف 1 ، وهذا هو ليس مبين. عندما تكون transl_table غير مساوية للمعرف 1 ، يتم عرضها كمؤهل في ميزة CDS.

بدء كودون:

رموز البدء البديلة:

في حالات نادرة ، يمكن بدء الترجمة في حقيقيات النوى من أكواد أخرى غير AUG. حالة موثقة جيدًا (بما في ذلك التسلسل المباشر للبروتين) هي بداية GUG لبروتين P الريبوسوم للفطر

يمكن العثور على أمثلة أخرى في المراجع التالية: Peabody 1989 Prats et al. 1989 هان وآخرون. 1992 Sugihara et al. 1990. يسمح الكود القياسي حاليًا بالبدء من UUG و CUG بالإضافة إلى AUG.
عد إلى الأعلى


نقاش

يعد نظام HigBA TA ضروريًا لصيانة البلازميد للبلازميد Rts1 المقاوم للكاناميسين (19). على وجه الخصوص ، على الرغم من أن بكتريا قولونية يحتوي كروموسوم K12 على a higA متجانسة ، أقاربها المسببة للأمراض بكتريا قولونية CFT073 و بكتريا قولونية O157: H7 يبدو أنه يمتلك نسخة واحدة أو أكثر من الوحدة بأكملها (20). في الواقع ، تحتوي كروموسومات العديد من البكتيريا المسببة للأمراض على واحد أو أكثر higBA هذا ينطبق أيضًا على العديد من البكتيريا ذات معدلات النمو البطيئة أو فترات السكون الطويلة المميزة (20). من أجل فهم أفضل لكيفية نقل هذا السم إلى تدهور الرنا المرسال ، وهو كتلة مصاحبة في تخليق البروتين ، وتوقف النمو (21 ، 22) ، قررنا أن أهداف مجمع الريبوسوم-HigB تقوم بترجمة الرنا المرسال بفعالية للانقسام في التسلسلات الغنية بـ A. يقطع HigB 100٪ من متواليات AAA داخل الرتل وخارجه في مناطق تشفير mRNAs (بما في ذلك أول ثلاث AAA من امتدادات 4 أو أكثر As). يقطع HigB أيضًا متواليات AA ولكن بكفاءة أقل بكثير (20٪) ، ويقطع فقط في بعض الأحيان عند مفرد As.

تم الحصول على البلازميد المترافق Rts1 من عزلة إكلينيكية لـ بروتيوس فولغاريس (33). تحليل بيانات استخدام الكودون المتاحة لـ P. الشائع (323 منطقة ترميز ، تضم الغالبية جينات بلازميد Rts1) كشفت أن HigB يشق في تسلسل مستهدف يتوافق مع الكودون الأكثر شيوعًا ، AAA (ليسين 41.0 / 1000 كودون). ثاني أكثر الكودون شيوعًا ، GAA (كودون حمض الجلوتاميك 38.3 / 1000) ، يحتوي أيضًا على موقع انقسام AA HigB.

ومع ذلك ، يمكن أيضًا نسخ Rts1 بتنسيق المتقلبة الرائعة (34) ، مما تسبب في غالبية بروتيوس التهابات المسالك البولية. تحليل بيانات استخدام الكودون للجينوم الكامل لـ P. ميرابيليس كشف أن HigB يشق في تسلسل مستهدف يتوافق مع ثاني أكثر كودون شيوعًا ، AAA ، يشفر ليسين (46.5 / 1000 كودون) لـ P. ميرابيليس الجينوم (الليوسين هو الكودون الأكثر استخدامًا بمعدل 48.6 / 1000 كودون). على الرغم من أن الليوسين هو أيضًا الكودون الأكثر شيوعًا في بكتريا قولونية K12 (52.82 / 1000 كودون) ، يتم تمثيل AAA بتردد أقل (33.62 / 1000 كودون) مما هو عليه في P. ميرابيليس.

على الرغم من أن تسلسل الجينوم الكامل P. الشائع لم يتم الإبلاغ عنه ، فهو غني بال AT (61٪) (35) كما هو جينوم P. ميرابيليس (أيضًا 61٪ AT) (36). للمقارنة ، فإن بكتريا قولونية يحتوي جينوم K12 على محتوى AT أقل (49٪) (37). الغريب أن التسلسل P. ميرابيليس تحتوي السلالة على بلازميد متميز عن Rts1 المعين pHI4320. ليس فقط AAA ليسين هو الكودون الأكثر شيوعًا في هذا البلازميد ، بل هو تقريبًا ضعف وفرة الجينوم المضيف (76.3 / 1000 كودون). ربما تكيفت Rts1 للحصول على ميزة انتقائية عندما أ بروتيوس تحتوي السلالة على كلا البلازميدات Rts1 و pHI4320 بحيث يؤدي أي HigB حر إلى تحلل مرنا بشكل انتقائي من البلازميد المنافس. وبشكل أكثر تحديدًا ، إذا تم علاج Rts1 فقط ، فلن يؤدي توكسين HigB المستقر المتبقي إلى تحلل الحمض النووي الريبي المضيف فحسب ، بل يجب أيضًا أن يحط من البلازميد المنافس بشكل أكثر كفاءة ، مما يضمن ميزة الاحتفاظ بـ Rts1 على الرقم الهيدروجيني 4320. باختصار ، تشير هذه البيانات إلى أن موقع انشقاق HigB يستغل كعب أخيل لمضيفه (بمعنى آخر. تسلسل A-rich سواء داخل الإطار أو خارج الإطار) لزيادة فعاليته إلى أقصى حد عندما تؤدي الظروف إلى فقدان البلازميد وتضمن القتل بعد الفصل العنصري.

دراسات في بكتريا قولونية ربط K12 أيضًا وجود كودون AAA عند +2 بكفاءة عالية لبدء الترجمة (38 ، 39). AAA هي أيضًا الكودون الأكثر شيوعًا عند +2 ، ممثلة في & # x0223c10٪ من الكل بكتريا قولونية K12 mRNAs التي تحتوي على أكواد AUG أو GUG (39). ترتبط المتواليات الغنية بالبيورين ، وخاصة تلك الغنية بالأدينين ، بمناطق حبلا مفردة في 16 S rRNA (40). وبالتالي ، قد تكون الكفاءة التحويلية الأعلى عند العثور على متواليات غنية بـ A 3 & # x02032 لموقع بدء الترجمة بسبب عدم وجود بنية ثانوية لـ mRNA. محتوى AT العالي لـ P. الشائع و P. ميرابيليس تشير الجينوم إلى أن هذه السلالات قد تحتوي أيضًا على عدد أعلى من المتوسط ​​من أكواد AAA في وقت مبكر من الرنا المرسال. في الواقع ، قمنا بمسح 100 إطار قراءة مفتوح عشوائي من P. ميرابيليس الجينوم ووجدت نسبة أعلى (17٪) من AAA عند +2 من بكتريا قولونية ك 12. لذلك ، يعمل HigB على مستويات متعددة من الخلايا المضيفة الغنية بـ AT. أولاً ، يستهدف أحد أكثر الكودونات وفرة (AAA) من خليته المضيفة من أجل الانقسام. ثانيًا ، يشق أيضًا جميع المتواليات المحتوية على AAA بشكل مستقل عن الإطار. ثالثًا ، يشق AAs محددة (& # x0223c20 ٪ من الإجمالي) ويشق أحيانًا مفردة AS. رابعًا ، قد يؤدي استهداف mRNAs المعبر عنها بدرجة عالية والتي تحتوي على AAA عند +2 إلى تعزيز فاعلية HigB. بالتناغم ، تضمن هذه الآلية متعددة المستويات القتل السريع والفعال لما بعد الفصل العنصري للمضيفين الذين يفقدون بلازميد Rts1.

يكمل تحليل الآلية الجزيئية لـ HigB توصيف جميع الأعضاء التمثيليين الأربعة لعائلة RelE على النحو التالي: RelE و YafQ و YoeB من بكتريا قولونية K12 و HigB من البلازميد Rts1. يعمل جميع أفراد الأسرة الأربعة من خلال الارتباط بالوحدة الفرعية 50 S ريبوسوم من 70 S ريبوسوم. ومع ذلك ، يضفي كل منها سمية من خلال آليات متميزة. تمتلك YafQ نشاط ريبونوكلياز في المختبر و في الجسم الحي لكنه يكتسب نشاطه المعتمد على الإطار والمتسلسل فقط عند الارتباط بالريبوسوم في الجسم الحي (14). يكتسب HigB فقط نشاط الريبونوكلياز عند الارتباط بالريبوسوم ويشق تسلسل التعرف على ترجمة mRNAs داخل وخارج الإطار. في المقابل ، لا يُظهر RelE ولا YoeB وحدهما نشاط نوكلياز إندوريبون في المختبر (13 ، 15) ، وانقسام mRNA ثانوي فقط لتثبيط YoeB بوساطة بدء الترجمة في الجسم الحي (15). ال في الجسم الحي تم ربط نشاط انشقاق الرنا المرسال المرتبط بـ RelE بنشاط التحلل الداخلي للريبوسوم (32).

نقترح النموذج التالي للقتل ما بعد الفصل بوساطة HigB (الشكل 7). لأننا وثقنا الانقسام بوساطة HigB على طول طول mRNAs (انظر الشكل 4 ح) ، يبدو أن HigB يرتبط بالترجمة الفعالة لـ 70 ريبوسومًا من خلال الوحدة الفرعية الريبوسومية 50 S. قد يرتبط HigB أيضًا بالوحدة الفرعية الريبوسومية 50 S حيث يتجمع في 70 S أحادي بناءً على ما يلي. 1) يمكنها أن تشق الرنا المرسال في وقت مبكر جدا ، في الكودون الثاني من ليرة لبنانية (الشكل 4 جي) و 2) تم اكتشافه أيضًا في جزء 50 S في ملفات تعريف 10 m m Mg 2+ (الشكل 3 ج). يبدو أن تفاعل HigB مع الريبوسومات يسبب تغيرًا خيفيًا في HigB ينشط نشاط نوكلياز إندوريبون خاص بالموقع. يسافر HigB بعد ذلك مع الريبوسوم المترجم ويشق الرنا المرسال عندما يصل إلى أول تسلسل إجماع رئيسي أو ثانوي من A-rich ، ومع ذلك ، فإن بياناتنا لا تمكننا من التمييز إذا كان HigB ينشق في أول موقع إجماع يصل إليه أو ما يليه. ينتج عن هذا الانقسام الواسع تحلل الرنا المرسال السريع وتثبيط استطالة الترجمة. نتيجة لذلك ، فإن نظام tmRNA لإنقاذ الريبوسومات المتوقفة غارقة ، مما يؤدي إلى إعادة تدوير أبطأ للريبوسوم يتضح من ذروة 70 S الأعلى استنساخًا (التي نقترحها تمثل الريبوسومات المتوقفة) بالإضافة إلى وجود HigB في جزء disome في الشكل 3. ج (لأن الريبوسومات بدون HigB المقيد لن تكون قادرة على الاستمرار في ترجمة الريبوسوم المتوقف في موقع قطع HigB). محتوى AT العالي لـ بروتيوس تعد جينومات المضيف مكملة بشكل ملحوظ للآلية الشاملة لعمل HigB وقد تنذر بوجود تكيف مماثل لنظرائه من الكروموسومات HigB.

ميزات وظيفة HigB-HigA بتنسيق بكتريا قولونية. يتم تصنيع السموم ومضادات الرنا المرسال للسموم من أوبرا منظم ذاتيًا ، ويتداخل إطار القراءة المفتوح للسم مع جين مضاد السموم بمقدار 1 نقطة أساس (19). يتميز HigBA عن أنظمة TA الأخرى لأن جين السم يسبق الترياق المضاد. يقوم كل من HigB / HigA و HigA بتنظيم المعامل تلقائيًا من خلال الارتباط بالمشغل المكون من موقعين فرعيين (يتضمن الموقع الفرعي 1 palindrome 5 & # x02032-TATTGCACATCGTGTAATA-3 & # x02032 ، ويتضمن الموقع الفرعي الآخر المتوافق 5 & # x02032-GTATTACACCAT-3GTAAT0 (18). يكون القمع بوساطة HigA / HigB أعلى بأربعة أضعاف من القمع بواسطة HigB وحده (18). يرتبط HigB بالترجمة الفعالة لـ 70 S ريبوسوم من خلال الوحدة الفرعية 50 S ريبوسوم. يبدو أن تفاعل HigB مع الريبوسومات يسبب تغيرًا خيفيًا في HigB ينشط نشاط نوكلياز endoribonuclease الخاص بالموقع (يمثله تغيير في شكل HigB). ثم يسافر HigB مع الريبوسوم المترجم ويشق الرنا المرسال عندما يصل إلى أول تسلسل إجماع رئيسي أو ثانوي من A-rich. لا يمكن لنظام tmRNA أن يستوعب تدهور mRNA الواسع ، مما يؤدي إلى إعادة تدوير أبطأ للريبوسوم (كما هو موضح في HigB disomes). تؤدي هذه الكتلة غير المقيدة في استطالة الترجمة إلى موت الخلايا البكتيرية (بمعنى آخر. القتل بعد الفصل العنصري للخلايا التي فقدت بلازميد Rts1).


امتحان BIO-211 رقم 3

يستخدم النسخ العكسي لـ RNA إلى DNA متبوعًا بـ PCR
يسمى الحمض النووي العكسي المنسوخ من الحمض النووي الريبي DNA التكميلي (cDNA)
- يسمح بالحفاظ على تسلسل الحمض النووي الريبي (DNA) باعتباره أكثر استقرارًا

- في السرطان ، غالبًا ما يتم تعطيل الجينات الكابتة للورم (تلك التي تشفر البروتينات بوظائف مضادة للسرطان)
تتضمن أمثلة & gt Rb و P53 و PTEN ، وستكون بقعها خضراء على ميكروأري

كيف نفهم الكثير من البيانات؟
- قم بتجميع مجموعة البيانات - & gt يطلب هذا من برنامج الكمبيوتر العثور على عينات لها ملفات تعريف جينية متشابهة وجينات تتصرف بشكل مشابه عبر التجارب

فحص الأدوية - يمكن اختبار هذه الخلايا ضد الأدوية المصممة لعلاج حالة معينة لتحديد تأثيرها على أنواع الخلايا ذات الصلة

تخليق الأعضاء - يمكن إقناع خلائط gt من iPSCs لتشكيل خليط من أنواع الخلايا
- صنع الباحثون براعم & quotliver & quot؛ باستخدام iPSCs المتصلة بجهاز الدورة الدموية وأداء وظائف الكبد الطبيعية

إصلاح الأنسجة - تم استخدام iPSCs & gt لإصلاح تلف الشبكية في الفئران
- تم استخدام الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من iPSCs لتحسين الوظيفة الحركية في الفئران المصابة بتلف في الدماغ


المواد والأساليب

مواقع بدء الترجمة

في هذه الدراسة ، استخدمنا بيانات QTI-seq لتحديد TIS في الإنسان والفأر. على عكس ribo-seq الذي يلتقط جميع أجزاء mRNA المحمية بالريبوسوم ، فإن QTI-seq يلتقط ويتسلسل فقط أجزاء mRNA المحمية عن طريق بدء الريبوسومات QTI-seq التي تتفوق على الطرق الأخرى التي تحدد TISs (Gao et & # x000a0al. 2015).

قمنا بتحليل تسع عينات من تسلسل QTI ، بما في ذلك خمس عينات بشرية وأربع عينات من الفئران (الجدول التكميلي S1 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). تم تنزيل قراءات QTI-seq من قاعدة بيانات SRA أو قدمها المؤلفون الأصليون. استخدمنا FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ تم الوصول إليه آخر مرة في 13 مارس 2020) للتحكم في جودة البيانات واستخدمنا Trimmomatic (Bolger et & # x000a0al. 2014) للتصفية منخفضة- يقرأ الجودة عند الضرورة. تم تعيين القراءات التي تمت تصفيتها بأطوال تتراوح بين 25 و 35 نيوكليوتيدًا إلى الجينوم البشري (hg19) أو جينوم الماوس (mm9) مع إصدار التعليق التوضيحي للجين Ensembl 75 باستخدام TopHat2 (Kim et & # x000a0al. 2013) مع المعلمات الافتراضية. تم تجاهل القراءات المعينة بشكل غير فريد. تم استخدام Ribo-TISH ، الذي يتفوق على العديد من الأساليب المعمول بها في كل من الكفاءة والدقة (Zhang et & # x000a0al. 2017) ، لتحديد TISs. باختصار ، يقوم Ribo-TISH أولاً بتقييم جودة البيانات وتقدير موضع P-site في القراءة ، ثم يستخدم الأساليب المعتمدة على البيانات لنمذجة التوزيع الخلفي لبيانات QTI-seq ، وأخيراً يحدد TIS وفقًا لـ ص أو س القيمة (الأهمية الإحصائية قبل وبعد التحكم للاختبار المتعدد) محسوبة لكل TIS من التوزيع (Zhang et & # x000a0al. 2017).

يمكن أن تبدأ الترجمة من AUG أو الكودونات شبه المشابهة التي تختلف عن AUG بواسطة نوكليوتيد واحد (Peabody 1989 Kearse and Wilusz 2017). وبالتالي ، فإن AUG وكودوناتها القريبة تعتبر فقط أكواد بدء ترجمة حقيقية في تنبؤ TIS بواسطة Ribo-TISH. تم استخدام إحداثيات 5 & # x02032 معظم النيوكليوتيدات في كودون بدء الترجمة لتمثيل TIS. في المجموع ، تم تحديد 114،655 و 69،517 TIS في عينة واحدة على الأقل للإنسان والفأر ، على التوالي.

كمية متعدية من الجين

يتناسب عدد قراءات QTI-seq للجين مع عدد أحداث بدء الترجمة لكل وحدة زمنية. نظرًا لأن عدد أحداث البدء يجب أن يكون متناسبًا مع عدد جزيئات البروتين التي تم تصنيعها في ظل افتراض الاحتمالات المتساوية لتخليق البروتين الكامل بين الجينات ، فإن عدد قراءات QTI-seq للجين يتناسب مع عدد جزيئات البروتين التي تم تصنيعها لكل وحدة الوقت (أي كمية متعدية) للجين. لجعل عدد قراءات QTI-seq للجين قابلاً للمقارنة بين العينات ، نقوم بالإبلاغ عن عدد صeads صإيه مإجمالي المليون قراءة في العينة (RPM).

نظرًا لأن عدد أحداث بدء الترجمة لكل وحدة زمنية للجين يساوي تركيز mRNA مضروبًا في معدل بدء الترجمة لكل جزيء mRNA ، فإن تركيز mRNA يرتبط ارتباطًا إيجابيًا قويًا بعدد أحداث بدء الترجمة لكل وحدة زمنية. استخدمنا RNA-seq لقياس تركيزات mRNA وقمنا بتنزيل بيانات RNA-seq من SRA (الجدول التكميلي S1 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). عند مراقبة الجودة ، تم تعيين القراءات على الجينوم البشري (hg19) أو الماوس (mm9) باستخدام TopHat2 (Kim et & # x000a0al. 2013). Fخرقة صإيه كilobase من النصوص لكل متم حساب المليون قراءة المعينة (FPKM) للجين أولاً بواسطة أزرار الكم (Trapnell et & # x000a0al. 2012) ثم تم تحويلها إلى TPM باستخدام صيغة TPM = (FPKM & # x000d7 10 6) / (مجموع FPKM) (Li and ديوي 2011).

الطرق الإحصائية لتصحيح المسوحات غير المتكافئة لـ TIS بين الجينات

نظرًا لاختلاف كميات الترجمة بين الجينات ، لا يتم مسح TISs الخاصة بهم بنفس العمق بواسطة QTI-seq. لإزالة التأثير المحتمل لهذا المسح غير المتكافئ ، استخدمنا طريقتين مختلفتين. الأول هو نهج الجينات الفائقة. باختصار ، صنفنا جميع الجينات أولاً بمقاديرها الترجمية. قمنا بعد ذلك بتجميع الجينات في 25 حاوية تمثل 25 جينًا فائقًا ، مما يتطلب أن يكون إجمالي المبلغ المترجم لكل حاوية هو نفسه لجميع الصناديق. داخل حاوية ، تم دمج القراءات من TIS الأكثر استخدامًا لكل جين لتمثيل قراءات TIS الأكثر استخدامًا للجين الفائق. وبالمثل ، تم دمج القراءات من TIS الثاني الأكثر استخدامًا لكل جين لتمثيل قراءات TIS الثاني الأكثر استخدامًا للجين الفائق ، وهكذا. قد لا يكون نهج الجينات الفائقة قابلاً للاستخدام في ظل ظروف معينة (على سبيل المثال ، للمقارنة بين جينين متماثلين). في ظل هذه الظروف ، استخدمنا الطريقة الثانية & # x02014downsampling. باختصار ، اخترنا عشوائيًا عشر قراءات QTI-seq لكل جين من جميع الجينات بعشر قراءات على الأقل ما لم يُذكر خلاف ذلك لحساب تنوع TIS والاستخدامات الجزئية. يُفضل نهج الجينات الفائقة على الاختزال عندما يكون كلاهما قابلاً للاستخدام ، لأن الأول يستخدم جميع البيانات ، بينما يستخدم الأخير جزءًا فقط من البيانات.

مقاييس تنوع TIS

بعد دراساتنا الحديثة حول تعدد الأدينيل البديل وبدء النسخ البديلة (Xu and Zhang 2018 Xu et & # x000a0al. 2019) ، استخدمنا مؤشر Simpson (Simpson 1949) ومؤشر Shannon (Shannon 1948) لتحديد تنوع TIS لكل جين في عينة. . يتم استخدام كلا المؤشرين بشكل شائع في أبحاث التنوع البيولوجي ويميلان إلى الارتفاع مع عدد TISs بالإضافة إلى تكافؤ الاستخدامات النسبية لهذه TISs ، لكن مؤشر Simpson يعطي أوزانًا أكثر لنظم TIS المستخدمة بشكل متكرر مقارنة بمؤشر Shannon. بالنسبة لجين واحد ، يتم تحديد مؤشرات Simpson و Shannon لتنوع TIS على التوالي بواسطة 1 & # x02212 & # x02211 i & # x000a0 = & # x000a0 1 S pi 2 و & # x02212 & # x02211 i & # x000a0 = & # x000a0 1 S pi & # x000a0 ln & # x000a0 pi ، أين س هو عدد TISs في الجين و صأنا هو الاستخدام الجزئي لـ أناعشر TIS. عند استخدام الصيغ أعلاه لحساب تنوع TIS لجين فائق ، س هو الحد الأقصى لعدد TISs لأي جين ينتمي إلى الجين الفائق ، بينما صأنا هو مجموع عدد القراءات المعينة إلى TIS للرتبة #أنا من كل جين ينتمي إلى الجين الفائق مقسومًا على العدد الإجمالي للقراءات المعينة لجميع TISs لجميع الجينات التي تنتمي إلى الجين الفائق.

محاكاة الكمبيوتر

للتأكد من أن الأنماط التي لوحظت في الشكل & # x000a01A & # x02013ج ليست تحفًا إحصائية ، لقد أجرينا عمليات محاكاة حاسوبية على النحو التالي. قمنا بشكل عشوائي بإنشاء كل جين يكون مقدار الترجمة (يقاس بالعدد الإجمالي للقراءات المعينة لجميع TISs للجين) واستخدامات TIS النسبية (مقاسة بأعداد القراءات المعينة إلى TISs المختلفة للجين) ، على التوالي ، تتبع الجينات متعدية توزيع المقدار وتوزيع استخدام TIS النسبي للبيانات من HEK293. على وجه التحديد ، تم أخذ عينات عشوائية من إجمالي عدد القراءة لجين محاكى من مجموعة أرقام القراءة الفعلية لجميع الجينات مع الاستبدال ، في حين أن عدد القراءات المعينة إلى TISs للجين كانت متغيرات عشوائية متعددة الحدود تم رسمها وفقًا لاستخدامات TIS لـ اختار عشوائيا الجين الحقيقي. ثم قمنا بتحليل البيانات المقروءة من الجينات المحاكاة كما لو كانت البيانات الفعلية.

المسافة في استخدام TIS بين خطوط الخلايا

لقياس الفرق في استخدام TIS للجين بين العينات A و B ، استخدمنا مسافة ارتباط صافية محددة بواسطة دAB & # x02212 0.5دأ & # x02212 0.5دب. هنا، دAB يساوي 1 ناقص معامل الارتباط Pearson & # x02019s بين العينات A و B في الاستخدامات الجزئية لجميع TISs للجين ، دأ بالضبط مثل دAB فيما عدا أن العيّنتين المستخدمتين هما عينتان من طراز QTI-seq bootstrap مشتق من العينة A ، و دب بالضبط مثل دAB فيما عدا أن العيّنتين المستخدمتين هما عينتان من طراز QTI-seq bootstrap مشتق من العينة B (Xu and Zhang 2018 Xu et & # x000a0al. 2019). حددنا الاستخدام الصفري في العينة A لـ TISs الموجودة في العينة B فقط ، والعكس صحيح. تم تأكيد ملاءمة مقياس المسافة المستخدم هنا مسبقًا (Xu and Zhang 2018).

Paralogs

تم تنزيل الجينات البشرية المماثلة من Ensembl (الإصدار 89 مايو 2017). حصلنا على 3678 عائلة جينية بشرية ، بما في ذلك 51657 زوجًا من جينات ترميز البروتين البشري. لقد اخترنا عشوائيًا من كل عائلة جينية زوجًا واحدًا متماثلًا يظهر فرقًا مضاعفًا أو أكبر في مقدار الترجمة للسماح بقوة إحصائية كافية.

قوة كوزاك

كانت نقاط قوة Kozak المستخدمة من الدراسات التي أبلغت عن كفاءات بدء الترجمة لجميع متواليات Kozak المحتملة (Noderer et & # x000a0al. 2014 Diaz de Arce et & # x000a0al. 2018). جمعت هذه الدراسات بين فرز الخلايا التي يتم تنشيطها بالفلور وتسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية لقياس كفاءة بدء الترجمة المرتبطة بكل كودون بدء (AUG وجيرانه التسعة) جنبًا إلى جنب مع كل تسلسل نيوكليوتيد محتمل في & # x022124 المجاور & # x022121 و # x022121 و +3 وظائف. كانت قيمة كفاءة بدء الترجمة متناسبة مع قيمة CACCAUGG ، ثم مضروبة في 100. تم تعيين قيمة قوة Kozak وفقًا لتسلسل Kozak المكون من ثمانية نيوكليوتيدات لكل TIS تم تحديده بواسطة QTI-seq. هنا ، أخذنا في الاعتبار ثمانية نيوكليوتيدات بدلاً من منطقة كوزاك النموذجية المكونة من عشرة نيوكليوتيدات ، لأن الفحص أعلاه اعتبر & # x022124 إلى +3 مواقع فقط.

نقاط الحفظ وتعدد الأشكال

لتقييم تنقية الاختيار الذي يعمل على مناطق TIS و Kozak ، قمنا بالتنزيل من UCSC (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenpath/hg19/phastCons46way/placentalMammals/ تم الوصول إليه مؤخرًا في 13 مارس 2020) نتائج PhastCons (Siepel et & # x000a0al 2005) محسوبة من محاذاة جينوم 46 من الثدييات المشيمية بما في ذلك الإنسان (hg19). تم تنزيل بيانات تعدد الأشكال البشرية ، بما في ذلك ترددات الأليل ، من المرحلة المؤقتة 3 من مشروع 1000 جينوم (Sudmant et & # x000a0al. 2015) ، من ftp: //ftp.1000genomes.ebi.ac.ukVol03707ftp/release/20130502/ في 29 يونيو ، 2018. تشتمل مجموعة البيانات هذه على الأنماط الجينية لـ 2،504 أفراد من 26 مجموعة وتشمل ما مجموعه 78136341 من النيوكلوتايد الجسدي. تم تضمين SNPs فقط في التحليل. تم تصنيف النيوكليوتيد الذي لوحظ في SNP على أنه أسلاف إذا كان هو نفسه نيوكليوتيد الحقل & # x0201cAA & # x0201d في ملف VCF متعدد الأشكال ، يتم اشتقاق نيوكليوتيدات أخرى في SNP. DAF في SNP هو تردد الأليل المشتق في SNP.


شاهد الفيديو: بناء تصنيع البروتين في الخلية: النسخ والترجمةافضل شرح (أغسطس 2022).