معلومة

لماذا لا تضاعف تتابع سانجر (الفلوريسنت) الحمض النووي النيوكليوتيدات؟

لماذا لا تضاعف تتابع سانجر (الفلوريسنت) الحمض النووي النيوكليوتيدات؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما أفهمه هو أن PCR يتم تنفيذه حتى يوقف النيوكليوتيدات الفلورية التكرار. يتم تغذية أجزاء الدنا من خلال الأنبوب الشعري بناءً على الحجم ، ويتم غربلة الأجزاء من الأصغر إلى الأكبر ؛ بعد ذلك ، يتم قراءة التسلسل من طرف إلى آخر.

أنا في حيرة من أمري كيف نعرف أن كل نوكليوتيد في التسلسل قد تم حسابه ، أو إذا تم حساب النيوكليوتيد مرتين. إذا كانت شظيتان من نفس الحجم ، تنتهي بنفس ddNTP ، تمر عبر الأنبوب الشعري في أوقات مختلفة قليلاً ، كيف نعرف ما إذا كان هذا النوكليوتيد المحدد لم يتم احتسابه مرتين؟


في تسلسل إنهاء السلسلة ، يتم الكشف عن مجموعة من الجزيئات بدلاً من مجموعة واحدة. تبدو القراءة كما يلي:

[http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/dnaseq/trouble/badseq.html]

تمثل القمم شدة الفلوروفورات الأربعة المختلفة في الكاشف. كل جزء ينتهي في نفس المكان سيكون له نفس الفلوروفور ونفس الطول. نظرًا لأن الرحلان الكهربائي للهلام الشعري يفصل الجزيئات حسب الحجم ، فإن هذه الأجزاء ستمر في نفس الوقت تقريبًا. "في نفس الوقت تقريبًا" هو السبب في أنك ترى قممًا عريضة ومتداخلة في القراءة بدلاً من الخطوط الحادة والمتميزة.

من الناحية المثالية ، ستظهر القراءة مثل النصف الأيسر من الصورة ، حيث يوجد حد أدنى من التداخل بين القمم. ومع ذلك ، سترى غالبًا قممًا متداخلة ، كما هو الحال في النصف الأيمن من الصورة. يشرح الرابط أعلاه العديد من الأسباب لحدوث ذلك. يتم تحديد ما إذا كان يتم تعيين ذروة بشكل صحيح أم لا بواسطة درجات Phred ، وهو تحليل إحصائي لشكل ودقة كل قمة.


تسلسل الجينوم

قم بتنزيل الفيديو من iTunes U أو Internet Archive.

لا يمكن أن تستمر بدون بعض أبعاد الاعتراف على الأقل.

إذا وجدت نفسك في أي وقت من الأوقات في وضع يكون فيه لديك أو على وشك التخلي عن كل أمل ، فأنت تعتقد أن الأمور مستحيلة تمامًا ولا توجد طريقة ، ستتذكر هذا الأسبوع أنه لا يوجد شيء مستحيل.

من الممكن أن تعود ثلاث مباريات في الجزء السفلي من الشوط التاسع ، عليك أن تصدق أنه يمكنك القيام بذلك ، وتذكر أن تقوم بتشغيل قرص Dave Roberts.

مجرد نصيحة عامة جيدة. يا له من أسبوع رائع ، إنه أسبوع رائع للغاية. رائع. هناك دروس في الحياة تؤخذ منها. من فضلك خذهم.

كما تعلم ، هناك حقًا. أعني أنني فقدت الأمل في تلك المرحلة ، أعترف بذلك. كنت أتمنى أن أقول ، لقد علمت أنهم سوف يسحبونها ، لكنني لم أفعل.

ويا فتى ، قاموا بإخراجها لعبة تلو الأخرى.

لذا ، جميعكم يفكرون بأفكار جيدة هذا الأسبوع. قد يكون هذا أسبوعًا تاريخيًا ، كما تعلم ، لقد كنت هنا. على أي حال ، فصاعدا.

كنا نتحدث في المرة الماضية عن كيفية تحليل نسختك. فكرة استنساخ قطع عشوائية من الحمض النووي ، وتحديد نسختك داخل مكتبة ، وتنقية الحمض النووي من نسخة مستنسخة ، وإجراء بعض التحليلات الأولية عن طريق ربما القطع باستخدام إنزيم تقييد ، ثم تسلسله باستخدام هذه التقنيات التي وصفتها سيسمح لك خذ المستنسخ الذي كان ، على سبيل المثال ، قادرًا على إنقاذ الخميرة التي لا يمكن أن تنمو بدون أرجينين ومعرفة تسلسل الحمض النووي الخاص بها. يمكنك أخذ الاستنساخ الذي حصلت عليه عن طريق التهجين مع تسلسل الحمض النووي المقابل لتسلسل البروتين لبيتا غلوبين وتسلسله ورؤية تسلسل جين بيتا غلوبين ربما. هذا قوي جدا.

أريد أن أتوقف لحظة ، وسنعود إليها بمزيد من التفصيل في محاضرة لاحقة ، لكنني وصفت حقًا كيف يمكنك تسلسل استنساخ واحد. أريد فقط أن أكتب ملاحظة ، لأن أحدهم سأل عنها في المرة الأخيرة ، عن كيفية تسلسل الجينوم بأكمله. سأل شخص ما عن هذا.

تذكر قبل أن نسحب نسختنا ، قمنا بترتيبها ، حصلنا على تسلسل الحمض النووي الخاص بها. ماذا لو أردت ترتيب الجينوم بأكمله؟ نعم. افعل الكثير من هذا ، صحيح ، إذا كان لدي جينوم كامل. حسنًا ، سأل أحدهم هل يمكنني وضع كتاب تمهيدي هنا وتسلسل فقط؟

سوف يستغرق وقتا طويلا جدا. واتضح أنها لن تنجح لأن الفصل الذي يمكنك تحقيقه من خلال المواد الهلامية هو دالة ، والفصل بين N و N زائد 1 في الطول يشبه لوغاريتم النسبة. لذلك ، اتضح أنه عندما يعجب N و N زائد 1 بحوالي ألف ، يمكنك تحقيق القليل جدًا من الفصل المادي بينهما. وهكذا ، فإن تسلسل الحمض النووي لا يمكن أن يتجاوز بكثير القواعد الألف. لذا ، فإن مشكلة تسلسل الجينوم عن طريق وضع مادة أولية على قطعة طويلة للغاية من الحمض النووي ، مائة مليون قاعدة ، هي أنه لا يمكنك فصل الأجزاء الصغيرة من هذا القبيل. لذا ، ما تفعله هو تفكيك الجينوم الخاص بك إلى الكثير من القطع. إستراتيجية واحدة ، قسّمها إلى مكتبة من بعض القطع الكبيرة جدًا. اتضح أنه يمكنك صنع قطع عشوائية من مائة ألف زوج قاعدي.

استنساخها في كروموسومات بكتيرية اصطناعية كما تحدثنا من قبل. خذ مكتبة من الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية ثم ابدأ في ترتيبها.

وخذ أي كروموسوم بكتيري صناعي وقم بتقسيمه إلى مجموعة كبيرة من القطع التي قد يصل طولها إلى ألف قاعدة ، ويمكنك تسلسل كل هذه. كيف يمكنك الترتيب للحصول على مجموعة متداخلة مثالية من آلاف الأزواج المستنسخة التي تتناوب بشكل مثالي عبر التسلسل بدون تكرار؟

أنت لا تفعل. هذه هي الإجابة الصحيحة. هذا كيف تفعل ذلك ، أنت لا تفعل ذلك. بدلاً من ذلك ، تأخذ مجموعة من الأشياء بشكل عشوائي.

وفي الواقع ، عادة قد تأخذ نسخًا تعطيك ستة أو ثمانية أضعاف التكرار. أنت فقط تسلسل الكثير من النسخ ثم تطلب من الكمبيوتر إعادة تجميعها.

وفي الواقع ، كل هذا التداخل جيد جدًا للقدرة على لصق هذه القطع معًا. أحيانًا يقوم الناس بأشياء مثل أخذ قطع قد يصل طولها إلى أربعة آلاف قاعدة وتسلسل ألف قاعدة هنا وألف قاعدة هنا باستخدام برايمر يبدأ من هناك وأساس يبدأ من هناك. وبعد ذلك يمكنك الحصول على تسلسل الحمض النووي من طرفي استنساخ. وإذا كان لديك هذا الأمر لمئات من النسخ المستنسخة ، فقد يقوم برنامج الكمبيوتر الخاص بك بعمل أفضل في ربط الأشياء. إنها لعبة كلمات متقاطعة كبيرة جدًا تتمثل في تجميع كل هذه القطع معًا ، وهي عبارة عن أحجية تجميع كل هذه القطع معًا. لكن ، في الواقع ، هذه هي الطريقة التي تتسلسل بها قطعة كبيرة من الحمض النووي. تقوم بتقطيعها إلى قطع متوسطة الحجم من الحمض النووي ثم قطع صغيرة من الحمض النووي ، وتقوم بتسلسلها ، وتستخدم العلوم الحسابية لإعادة تجميعها.

بعض الناس ، بالنسبة لبعض الجينوم ، يأخذون الجينوم الكبير بأكمله ويذهبون على الفور إلى الكثير من القطع الصغيرة. هذا يمكن ان يعمل ايضا أنا أعتمد بالضبط على مدى تعقيد الجينوم الخاص بك.

في الجينوم البشري ، هناك بعض أجزاء الجينوم البشري المتطابقة تقريبًا والتي قد تكون متطابقة بنسبة 99.91٪ في جزأين مختلفين من الجينوم. وهكذا ، إذا قمت بذلك ، فقد تواجه صعوبة في تمييز تلك القطع عن بعضها. لذلك ، بالنسبة للجينومات المعقدة حقًا ، يحب الناس أحيانًا تقسيمها إلى قطع متوسطة الحجم. لكن في الأساس ، يُشار إلى فكرة تسلسل قطعة كبيرة من الحمض النووي بهذه العملية باسم تسلسل البندقية. في الواقع ، تم تطوير تسلسل البندقية في عام 1980 تقريبًا بواسطة فريد سانجر ، وهو نفس الشخص الذي طور تقنية تسلسل الحمض النووي التي أخبرتك بها عن استخدام البوليميراز والديديوكسينوكليوتيدات.

أراد سانجر بسرعة كبيرة الانتقال من تسلسل قطعة واحدة إلى قطع متتالية ، لذلك طور تقنية البندقية هناك. ويتم الآن تطبيقه في العديد من الأشكال المختلفة للبنادق الوسيطة ، وبنادق الجينوم الكاملة ، وما إلى ذلك. إذن ، هذا ردًا على السؤال الذي طرحه أحدهم في المرة السابقة ، حسنًا ، كيف يمكنك عمل جينوم كامل؟ وفي واقع الأمر ، هذا ليس نظريًا لأنه ، في الواقع ، يحمل الناس الجينوم بهذه الطريقة. ونقوم بذلك في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا.

يتم إجراء الكثير من الجينوم هنا بهذه الطريقة. سأل شخص آخر كيف يمكنك تحليل نسختك. ومرة أخرى ، سأدلي بملاحظة موجزة حول ذلك ردًا على السؤال. لذا ، تحليل بعض تسلسل الحمض النووي. لذا ، لنفترض أننا حصلنا على تسلسل الحمض النووي ، A-A-T-A ، لا تهتم بكتابة هذا.

أنا فقط أختلق الرسائل هنا. كيف يمكننا أن نفهم ذلك؟

لنفترض أنني أعطيتك الآحاد والأصفار من قرصك الصلب ، كيف يمكنك الاستفادة منها؟ هذا مثير للاهتمام مثل تلك الموجودة في محرك الأقراص الثابتة لديك ، أليس كذلك؟

إنه يحتوي على أربعة أحرف ، وليس حرفين ، ولكن هذا في الواقع ما تحصل عليه من أي مشروع. تريد تسلسل بيتا غلوبين؟

ستحصل على شيء مثل هذا. تريد تسلسل جين أرجينين؟ تريد تسلسل الجينوم البشري؟ تحصل على سلسلة طويلة جدًا من أربعة أحرف. ماذا تفعل به؟

أوه ، حسنًا ، يمكنك مقارنتها بنسخة طبيعية من الجين.

وإذا فعلت ذلك فقد أجد مجموعة من الاختلافات.

ولكن كيف لي أن أعرف حتى مكان وجود جين بيتا غلوبين ضمن هذا التسلسل؟ يحتوي هذا الاستنساخ على بيتا غلوبين. كيف يمكنني حتى العثور على exons؟ نعم؟ أو أيا كان؟ انظر إلى الكودونات.

لذا ، لنبدأ في النظر إلى الكودونات. هذا الكودون هنا؟

حسنًا ، أو هذا ، ربما يكون هذا الرمز هنا. آسف؟

ابحث عنه. هل ترى أي أكواد بداية هنا؟ أوه ، هناك ATG هناك. لذا ، ربما يكون هذا هو كود البداية أو ربما لا. كم مرة نتوقع أن نجد ATG في بعض إطارات القراءة؟ كما تعلم ، يمكن أن يحدث بسهولة إلى حد ما. أيضًا ، كيف نعرف أن الأمر يسير على هذا النحو؟

ربما يجب أن نبحث عن ATG ، سنضعه هناك ، ونذهب بهذه الطريقة. آسف؟ رسمت السهم هناك؟

حسنًا ، هذا لأنه حيث بدأ التسلسل على صفحتي.

لا تخبرني أن جيني يعمل بهذه الطريقة. نعم؟ من خمسة إلى ثلاثة أولياء. آه ، لكنها قطعة مزدوجة من الحمض النووي. كما ترون ، إذا كانت خمسة أو ثلاثة أعداد أولية على هذا الشريط ، فإن الجينوم لديه خيط آخر يقرأ بطريقة أخرى. ماذا حصلت؟ C-A-T-A ، يمين ، C-C-T ، وما إلى ذلك. ويمكن ترميز الجين على هذا الشريط.

قد يكون هذا هو خيط الترميز ، ويمكن أن يكون خيط الترميز ، وأبحث عن ATG فقط في واحد من ثلاثة إطارات قراءة محتملة على واحد من خيطين محتملين سأجد كل أنواع الأشياء.

اسف جدا؟ يخمن. يخمن. التخمين جيد.

إنهم لا يفعلون ، لا ، أليس كذلك ، أنت تتذكر أننا تحدثنا عن قبول الأوراق. إذا كنت ستكتب الورقة بهذه الطريقة ، فمن المحتمل أن يقرعها المراجع ويقول ، كما تعلم ، التخمين ليس كذلك ، ليس جيدًا بما فيه الكفاية. لذلك ، هذا في الواقع مثير جدًا للاهتمام. كيف تجد في الواقع تسلسل الجينات؟ حسنًا ، اتضح أنها مشكلة غير تافهة غالبًا ما يتم تجاهلها في الكتب المدرسية.

ما قد تفعله هو أنه إذا كان هناك شيء ما هو exonic حقًا ، إذا كان هذا أي exon ، فهل له أي خصائص يمكنك التفكير فيها؟ لا ينبغي أن يكون لها رمز إيقاف. لا توقف كودون.

كم مرة يحدث رمز الإيقاف بشكل عشوائي في إطار قراءة معين؟

كم عدد كودونات التوقف هناك؟ ثلاثة من أصل 64 كودون ممكن.

يوجد حوالي واحد من كل 20 كودونًا في أي إطار قراءة محدد هو كود الإيقاف. لذا ، هذا يعني أنني إذا قرأت لحوالي 20 كودونًا ، ولم أتوقف عن ذلك ، فقد بدأت تزداد احتمالية أن هذا ليس عشوائيًا. إذا قرأت ، على سبيل المثال ، 60 كودونًا ، و 180 قاعدة ، ولم أواجه أي كودون توقف في إطار القراءة هذا ، فإن احتمالات حدوث ذلك تكون إما عن ناقص ثلاثة أو نحو ذلك ، أليس كذلك؟ لأنني إذا مررت بثلاثة أطوال مميزة ، إما ناقص ثلاثة ، كما تعلمون ، ولا أعرف ، حوالي 5٪ أو شيء من هذا القبيل. إذا ذهبت لآلاف القواعد دون أي توقف للكودون ، فهل ستنبهر؟ هذا مثير للإعجاب. لذا ، كل ما علي فعله هو العثور على بضعة آلاف من القواعد بدون توقف كودون. المشكلة في ذلك أنه يوجد في البكتيريا بعض الجينات التي يبلغ طولها ألف قاعدة وأنت ، هناك ، يمكنك قراءتها وليس لديها كودون توقف. ما هي مشكلة الجينوم البشري؟ الإنترون. اتضح أنه نظرًا لتقسيم تسلسلات التشفير إلى exons الصغيرة ، إذا وجدت ألف قاعدة بدون أكواد توقف ، فمن المحتمل جدًا أن يكون تسلسل تشفير.

لكن exon البشري النموذجي يكون في حدود 150 إلى 200 قاعدة.

غير مريح للغاية لأنه ، كما تعلمون ، هو exon نموذجي يشفر 50 ، 60 ، 70 كودون. لذلك ، اتضح أنه حتى هذا ليس بالأمر السهل. حسنًا ، الإجابة هي أنها ليست مشكلة تافهة. يفعل الناس كل أنواع الأشياء لمعرفة كيفية فك تشفير تسلسل الجينوم. تقوم بتشغيل فلاتر الكمبيوتر هناك والتي تقول ، انظر ، هناك مجموعة من الأكواد المتتالية بدون أكواد التوقف.

تميل إلى أن يكون هناك القليل من التفضيلات ، كما هو الحال من بين الخيارات المترادفة لـ Stop codons ، يميل البشر إلى تفضيل كودون واحد وقفة واحدة ، كودون واحد لحمض أميني معين على الآخرين. لذلك ، هناك بعض التحيزات حول الكودونات المستخدمة.

ويمكن للكمبيوتر أن يأخذ القليل من ذلك في الاعتبار.

ثم يمكنك أيضًا إنشاء مكتبة من الحمض النووي للبذور وتسلسل الحمض النووي للبذور ، وهو الحمض النووي الريبي الذي سيساعدك كثيرًا ويبحث عن مكان تطابقها. ثم يمكنك أن تأخذ متواليات من الإنسان والفأر. واتضح أن التسلسلات الموجودة في الفأرة والتسلسلات في الإنسان ، إذا قمت بترتيبها ، تميل الإكسونات إلى التطابق بشكل أفضل من الإنترونات لأن التطور يهتم كثيرًا بالإكسونات. لكن اتضح أن هذه ليست مشكلة تافهة. وحتى اليوم ، إذا أعطيتك امتدادًا عشوائيًا للحمض النووي البشري ، فلن يكون كذلك ، فلا يوجد برنامج كمبيوتر بسيط يعمل به ، ولا حتى برنامج كمبيوتر معقد ، ولكنه سيكون قادرًا بمفرده ، بدون إبطي البيانات ، لانتقاء جميع الجينات بدقة.

حتى بالنسبة للبكتيريا البسيطة ، لا يمكننا تثبيت جميع الجينات بشكل مثالي. على الرغم من أن عدم وجود هذه الإنترونات يعني أن الإكسونات تميل إلى أن تكون كبيرة جدًا ، فهذا يعني أن الترميز كبير جدًا ويمكننا القيام بذلك نوعًا ما. لذا ، أردت فقط أن أشير إلى أنه لا يزال هناك الكثير الذي يتعين القيام به هناك. تمكنت الخلية ، شكرًا لك ، من قراءة هذا جيدًا ، لكننا لسنا أذكياء حتى الآن مثل الخلية ، وبالتالي لا يمكننا قراءة كل هذه الأشياء تمامًا.

سنعود إلى علم الجينوم في محاضرة أخرى. نعم؟ نعم ، لا - يا لها من فكرة رائعة.

نعم فعلا. هناك في الواقع بعض التجارب ، والتي ربما إذا ذكّرتني بإمكانية ذلك ، يمكنني العمل عليها في محاضرة لاحقة ، لكن لدى الناس بعض التجارب حيث يمكنهم بشكل عشوائي إحداث طفرات من البكتيريا وتحديد أي منها سينمو وأيها لن ينمو. ويمكنهم القيام بكل ذلك بالتوازي في أنبوب اختبار واحد. وبالتالي يمكنك معرفة أي نيوكليوتيدات في الجينوم مهمة وأيها غير مهم.

إنه نوع من الإجراء الرائع. نعم. على أي حال ، أردت فقط ربط ذلك الشيء هنا. الآن ، دعنا ننتقل إلى إعادة تسلسل الجين. لذا ، لنفترض أننا تمكنا من ترتيب ، لا أعرف ، الجينوم البشري ، مجمل الجينوم البشري الذي لدينا أمامنا ، حسنًا؟ في الواقع ، الأسبوع المقبل في مجلة Nature ستظهر ورقة تكتب ، في الواقع ، اليوم ، أمس ، لا ، بالأمس ، في الواقع ، بالأمس ، ظهرت بالأمس في مجلة نيتشر ورقة تتحدث عن التسلسل النهائي للجينوم البشري.

http: //www.nature. om / nature / journal / v431 / n7011 / pdf / nature03001.pdf وهكذا ، أي شخص يريد الاتصال بالإنترنت ، في الواقع ، يمكننا الحصول عليه ، سنحصل على نسخ للفصل. لماذا لا نحضر لك نسخ من الصحيفة؟ انها ليست طويلة مثل آخر واحد. لكن في الحقيقة ، لم أكن أدرك أنه كان بالأمس. اعتقدت أنه كان الأسبوع المقبل. صدر أمس التقرير النهائي حول التسلسل النهائي للجينوم البشري ، والذي كان عدد منا يعمل عليه لفترة طويلة.

وقد ظهر للتو. إذن ، لدينا ذلك الآن بالفعل.

في الواقع ، لقد كان على الويب لفترة من الوقت ، لكن الورقة التي تصف الأمر استغرق بعض الوقت للكتابة وصدرت بالأمس.

لذا ، سوف نحضر لك نسخة من ذلك. لكن الآن لديك هذا التسلسل الكامل للجينوم البشري هنا. لقد كنت ، كما تعلمون ، أعمل على هذه الورقة مع الناس لفترة طويلة ، كما تعلمون ، لم أكن أهتم بحقيقة أنها صدرت للتو. أنت لا تريد أن تعرف كم من الوقت استغرقت لكتابة هذا.

الورقة ، في الواقع ، غير عادية. إنها الورقة الوحيدة التي نشرتها Nature على الإطلاق حيث تكون قائمة المؤلفين طويلة بما فيه الكفاية بحيث لا توجد لدينا في المجلة. يوجد موقع ويب يحتوي على قائمة المؤلفين. هناك ، على ما أعتقد ، ليس لدي العدد النهائي ، ولكن يوجد شيء في الجوار حوالي 200 مؤلف في الصحيفة. قررنا أن كل من عمل عليها يجب أن يكون مؤلفًا مشاركًا للورقة ، وقمنا بوضعها كلها على موقع إلكتروني.

لذلك ، على أي حال ، أنا استطرادا. لذا ، افترض أن لدينا جين بيتا غلوبين هنا.

إذن ، لقد حصلت على ذلك - لدي الشكل الطبيعي لجين بيتا غلوبين ، أو لدي شكل شخص واحد ، على أي حال ، في تسلسل الجينوم البشري. الآن أريد أن آخذ مريضًا مصابًا بفقر الدم المنجلي وأريد إعادة تسلسل الجين الخاص به.

الآن ، تذكر ما قلناه ، سوف نصنع مكتبة من ذلك الشخص ، أليس كذلك؟ لذلك ، نحصل على دم هذا الشخص ، وننقي الحمض النووي ، ونقطعه ، ونستنسخه ، ونفحص المكتبة بمسبار مشع لجين بيتا غلوبين ، وسننسحب الجين وسنقوم بإعادة تسلسله.

لنفترض أننا أردنا فعل ذلك لمائة مريض.

مقابل كل مريض نحصل على دم ، نصنع الحمض النووي ، نستنسخ في البلازما ، وقد صنعنا مكتبة بلازما كاملة ، ونضعها على مرشح ، ونفحصها بمسبار مشع ، ونخرج المستنسخة و تسلسلها.

الآن ، بالنسبة لأي مكتبة من هذا القبيل ، ربما تحتاج إلى البحث في مئات الآلاف من الحيوانات المستنسخة للعثور على بيتا غلوبين.

لذا ، من أجل الحمض النووي الخاص بك والحمض النووي الخاص بك والحمض النووي الخاص بك والحمض النووي الخاص بك ، سنقوم بإنشاء مكتبات من مئات الآلاف من الحيوانات المستنسخة ، أي زوجان ، وهذا عدد كبير من اللوحات ، أليس كذلك؟

سنضعهم جميعًا ، على فلاتر النايلون في أكياس Seal-a-Meal هذه مع هذه المجسات المشعة ، وسنبحث عن نسخة بيتا غلوبين ، ونسخة بيتا غلوبين ، وبيتا غلوبين استنساخ ، استنساخ بيتا غلوبين الخاص بك ، وما إلى ذلك ، وما إلى ذلك ، وما إلى ذلك. هذا ممل حقا. هل تدرك مدى صعوبة دراسة فقر الدم المنجلي إذا كان علينا القيام بذلك لكل مريض متعاقب ، فقم بإنشاء مكتبة كاملة؟

لكن هذا ما كان عليك فعله في البيولوجيا الجزيئية لأن هذه هي الطريقة التي تحصل بها على الجين. أنت تبني مكتبة كاملة ، تسحبها من المكتبة. ومع ذلك ، إذا كنت ترغب في القيام بذلك ، فهل يمكنك الحصول على تسلسل بيتا غلوبين من الجينوم الخاص بك دون الحاجة إلى إنشاء المكتبة بأكملها؟

اتضح ، وأنا أعلم أنه تمت تغطيته على الأقل في بعض الأقسام ، هناك تقنية رائعة للقيام بذلك. وما هي هذه التقنية؟ PCR. لذلك ، اتضح أن التقدم الكبير التالي حقًا في البيولوجيا الجزيئية كان تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل.

وما كانت طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي طريقة للحصول على قطعة من الحمض النووي تتوافق مع جين معروف بالفعل ، عليك أن تعرف الجين بالفعل ، وما يسمح لك بفعله هو الحصول على قطعة الحمض النووي تلك بناءً على المعرفة على الأقل بعض من تسلسلها.

يسمح لك بتضخيم ذلك الحمض النووي من أ ، من أي فرد.

لذا ، مقارنة بالتجربة حيث أقوم بإنشاء مكتبة لك ومكتبة لك ومكتبة منك ومكتبة منك ، قد يستغرق كل منها شهرًا ، سيسمح لنا PCR بالقيام بذلك من حيث المبدأ في خمس دقائق . وفي الواقع ، هناك آلات تتيح لك القيام بذلك في غضون خمس دقائق.

لذا ، دعونا نناقش كيف يعمل هذا PCR. لا أحد يستخدم آلات الخمس دقائق لأنك عادة ستنتظر ساعة أو نحو ذلك ، ولكن على أي حال. لنفترض أنني أخذت تسلسل الحمض النووي الخاص بي هنا من الجينوم البشري. خمسة أولي إلى ثلاثة أعداد.

خمسة أولي إلى ثلاثة أعداد. هذا التسلسل هنا بيتا غلوبين.

أريد الحصول على هذا التسلسل. أول شيء أفعله هو أنني سأقوم بتسخين عينة الحمض النووي الخاصة بي إلى 97 درجة مئوية ربما لتفسد الطبيعة.

يعني تغيير الطبيعة ، بالطبع ، كسر الروابط الهيدروجينية التي تفصل بين الخيطين بحيث تنفصل الخيوط ، من خمسة إلى ثلاثة أعداد ، ومن خمسة إلى ثلاثة أعداد.

الآن ، ما أفعله بعد ذلك هو أن آخذ تمهيديًا محددًا للحمض النووي يطابق هذا الامتداد قبل أن يبدأ جين بيتا غلوبين.

أو قبل ذلك حيث أنا مهتم به. كيف أصنع كتابًا تمهيديًا يطابق هذا التسلسل فقط؟ أطلب ، حسنًا ، كيف أعرف ماذا أطلب؟ أنا أعرف التسلسل ، أليس كذلك؟

لقد حصلت على التسلسل بالفعل. أنا فقط أنظر إليها وأقول أنني أريد هذا التسلسل. ثم كيف أحصل عليه؟

أنا أطلب ذلك. أنا أكتبه في الويب وسيقوم الجهاز بتوليف هذا ، هذا التمهيدي. عادةً ما يكون التمدد المكون من 20 قاعدة كافياً. لذا ، سأحضر لي عشرين بلمر ، 20 قاعدة قليلة النوكليوتيد مكملة للتسلسل على هذا الجانب من الجين.

ما سأفعله أيضًا هو نفس الشيء هنا.

سأحصل على كتاب تمهيدي ثان. هذا هو التمهيدي رقم واحد. هذا هو التمهيدي رقم اثنين. نعم؟ الآن ، دعنا نرى.

خمسة اولي. هذا هو خمسة ، خمسة أعداد. الآن ما أود القيام به هو إضافة البوليميراز ، أود إضافة dNTPs.

لذلك ، بالإضافة إلى بوليميريز الحمض النووي بالإضافة إلى dNTPs.

وماذا سيحدث؟ سيأتي البوليميراز ويبدأ في نسخ الحمض النووي الخاص بي ، لكنه سينسخه فقط بدءًا من البادئات. الآن ، سيستمر هذا بالطبع ، لكن بوليميريز الحمض النووي لا يستمر إلى الأبد ، كما تعلمون ، تتوقف التفاعلات نوعًا ما عند نقطة ما.

وهكذا ستنطلق خصلة هنا وتنطلق خصلة هناك. الآن ، لاحظ ما قمت به.

لقد بدأت بجينوم بشري كامل ، وكان عدد نسخ بيتا غلوبين واحدًا لكل جينوم. عندما انتهيت من هذه العملية ، كم عدد النسخ ، كم عدد النسخ المزدوجة من بيتا غلوبين لدي؟ اثنين. لا يزال هذا قليلًا جدًا ، لكنه أكثر مما كان لدي من قبل. إذن ، ماذا أفعل بعد ذلك؟

يكرر. لذا ، دعونا نقوم بتسخين تلك العينة مرة أخرى. سوف نفسد الطبيعة عند 97 درجة ، والآن لدينا خيطنا الأولي هنا ، لدينا خصلة لدينا التي خرجت من هذا التمهيدي الذي يمتد إلى هنا وربما يمضي قدمًا ، لدينا هذه الخصلة هنا. لدينا هذا الخيط هنا.

وكان هذا خمسة أعداد أولية ، وخمسة شرطة ، وخمسة شرطة ، وخمسة شرطة.

الآن ماذا نفعل؟ نكرر. سنأخذ كتابنا التمهيدي ، هذا هو التمهيدي رقم واحد ، دعنا نرى. تتطابق هناك.

التمهيدي رقم اثنين هنا. رقم واحد هنا. الرقم اثنان.

هل حصلت على هذا الحق؟ نعم فعلا. حسن. ثم أين يتوقف هذا الرجل؟

في النهاية تمامًا حيث كان كتابي التمهيدي الآخر. هذا الرجل يجري هنا. هذا الرجل يتوقف في النهاية.

قد يذهب هذا الرجل أبعد من ذلك بقليل. كم عدد نسخ جين بيتا غلوبين لدي الآن؟ أربعة. اثنان منهم ، بالمناسبة ، يجلسان بشكل مثالي بين البادئات الوردية. ماذا سيحدث إذا فعلت هذا مرة أخرى؟ كم عدد النسخ التي سأحصل عليها؟

ثمانية ، ستة منها ستجلس بشكل مثالي واثنان قد يكونان خشن بعض الشيء فيما يتعلق بالمكان الذي يذهبون إليه. لذلك ، في البداية ، بعد الدورة رقم صفر ، هذه هي الشروط الأولية ، كان عدد النسخ بالنسبة للجينوم واحدًا.

بعد دورة واحدة تكون اثنتان. بعد دورتين تكون أربع.

بعد دورات N هي نسختان للنسخة N. هل هذا واضح كيف يعمل PCR؟ وهذا في كل جولة تضاعف. وباستثناء هذين الشيئين الأبيضين اللذان ينفجران على الجانب ، فإنهما يتأرجحان ذهابًا وإيابًا ذهابًا وإيابًا بين البادئين اللذين اخترتهما.

ما هو عندما N يساوي عشرة ، ماذا لديك؟ ألف نسخة.

ماذا يحدث عندما تساوي N 20؟ مليون نسخة.

ما هو رقم نسخة بيتا جلوبين؟ بيتا ، دعنا نفترض بيتا غلوبين ، من أجل الجدل ، من أجل الجدل حوالي ألف قاعدة.

ما هو جزء الجينوم البشري الذي يمثله بيتا غلوبين؟

أجل ، حوالي المليون في الجينوم. لا ، في الواقع ، واحد على ثلاثة ملايين ، لكننا سنسميها جزء من المليون.

لذا ، بعد أن قمت بتضخيم بيتا غلوبين مليون مرة ، يمثل بيتا غلوبين الآن نصف الأشياء الموجودة في الأنبوب.

ماذا سيحدث إذا ذهبت عشر جولات أخرى؟ كم عدد النسخ لدي؟ مليار نسخة. بعبارة أخرى ، بدأت بشيء لم يكن موجودًا إلا في حوالي واحد من المليون مما كان موجودًا في أنبوب الاختبار الخاص بي. إذا كان بإمكاني صنع مليار نسخة من هذا الجزيء المحدد ، فهو الآن يهيمن على الخليط بحيث يصبح أكثر وفرة بألف مرة من بقية الجينوم.

إنها تعمل. هذا هو الشيء الرائع ، هذا يعمل.

أي أسئلة حول هذه التقنية؟ الآن نعم؟ حسنًا ، أنا بحاجة إلى اثنين من البادئات في تسلسلهما. كم عدد النسخ التي أحتاجها من كل من هذه المواد الأولية؟ حسنًا ، من الواضح أنني بحاجة إلى الكثير من النسخ من تلك المواد الأولية. إذن ، التمهيدي رقم واحد ، إنه تسلسل واحد ، لكن عندما أطلبه من الشركة ، سأطلب لي حمولة قارب ، الكثير من هذا التمهيدي. لذا ، أضيف ، من الأفضل أن أضيف مليار جزيء من هذا التمهيدي لأنني سأقوم بعمل مليار نسخة بدءًا من هذه البادئات.

لكن إذا كان لدي مليار نسخة من العدد الأول ومليار نسخة من العدد الثاني ، كما تعلمون ، هذه الأيام ، المليارات ليست بهذه الضخامة ، كما تعلمون ، الجزيئات هي رقم أفوجادرو وكل ذلك. ليس من الصعب الحصول على الأشياء.

إذن ، ترمي فائضًا هائلاً ، فائضًا هائلاً من التمهيدي رقم واحد ، فائض هائل من التمهيدي رقم 2 ، وأنت تفعل هذا فقط.

الآن ، أعني ، ما هي تكلفة صنع مثل هذا الفائض الهائل من البرايمر؟ إنها حوالي عشرة سنتات للقاعدة ، لذا فهي دولاران ، اثنان دولارات لكل برايم ، يُعطي أو يأخذ. كما تعلم ، حتى أتمكن من الحصول على سعر أفضل لك إذا كنت تريد ، ولكن ، كما تعلم ، على أي حال.

إنه ليس سعرًا سيئًا لشراء التمهيدي. لذلك ، يمكنك فقط الخروج وطلب زوج من البادئات. يمكنك الحصول عليها غدا.

وبعد ذلك كل ما عليك فعله هو إضافة البادئات إلى ، لذلك آخذ الحمض النووي. هل أنا ، أنا ، أحتاج منك الحمض النووي.

اتضح أنه يمكنني سحب دمك وتنقية الحمض النووي وكل ذلك.

لكن اتضح أنه إذا كان كل ما أردت فعله هو تضخيم موضع واحد ، يمكنني في الواقع أن آخذ عصا المصاصة وأطلب منك كشط الجزء الداخلي من خدك. سيؤدي ذلك إلى إخراج عدد كافٍ من الخلايا من داخل خدك ، وإلصاقها في أنبوب اختبار ، وسيحتوي بالفعل على ما يكفي من الحمض النووي هناك. اتضح أن هذه تقنية حساسة وقوية للغاية ، ولكن قبل أن نصل إلى هذا الإشعار ، ما كان علينا القيام به. كان علينا تسخين حمضنا النووي إلى 97 درجة وإضافة البوليميراز. ثم نقوم بالتسخين مرة أخرى إلى 97 ، نضيف البوليميراز ، التسخين مرة أخرى إلى 97 ، نضيف البوليميراز. لماذا يجب علي الاستمرار في إضافة البوليميراز؟ لأن البوليميراز يتم تسويته عند 97 درجة لذلك يتم تغيير طبيعته. لذا ، فإن الإزعاج بشأن تفاعل البوليميراز المتسلسل هو أنني يجب أن أذهب إلى أنبوب إيبندورف البلاستيكي ، وأفتح الغطاء ، وألصق بعض بوليميريز الحمض النووي ، وأغلقه ، وألصقه مرة أخرى في حمام ساخن ، اتركه لفترة من الوقت ، أخرجه ، افتحها ، أضف المزيد من البوليميراز ، ضعها مرة أخرى في حمام التسخين ، أخرجها. وهذه في الواقع هي الطريقة التي استخدمها العلماء البدائيون في تفاعل البوليميراز المتسلسل منذ وقت ليس ببعيد ، حسنًا؟ ألن يكون رائعًا لو تمكنا من هندسة بوليميراز DNA لا يفسد عند 97 درجة؟ لأن ما يمكننا فعله بعد ذلك هو إضافة البوليميراز ، وإغلاق الأنبوب ، ووضعه في آلة تعمل بالحرارة ، والبرودة ، والحرارة ، والبرودة ، والحرارة ، والبرودة ، والحرارة ، والبرودة ، ولكنك ستفعل ، فكيف نفعل ، ما نوع الهندسة البيولوجية الساطور التي نستخدمها لتعديل البوليميراز بحيث لا يفسد الطبيعة عند 97 درجة؟

نعم؟ احصل عليه من البكتيريا. ما نوع البكتيريا التي تطلبها عن إنزيم يمكن أن يعمل في الماء المغلي بشكل أساسي؟

البكتيريا التي تعيش أساسًا في الماء المغلي. أين تبحث عن هذا؟ فتحات حرارية.

أنت ، السخانات ، أشياء من هذا القبيل. الحياة تعيش في كل مكان. ما تذهب إليه هو أنك تجد نفسك بكتيريا ، لذلك تجد البكتيريا التي تعيش في السخانات أو في الفتحات الحرارية وتنقي بوليميريز الحمض النووي الخاص بها. الأكثر شهرة يأتي من الكائن الحي ، وهي بكتيريا تسمى Thermos aquaticus ، aquaticus.

مما يعني بالطبع الماء الساخن ، أليس كذلك؟ هذا ما تسمى البكتيريا ، الترمس المائي. و ، أو ، ويسمى إنزيمه تك ، تك. لذلك ، سوف نشير إليها كثيرًا ، Taq polymerase ، وهذا يعني من هذه البكتيريا الترمس المائي ، حسنًا؟ إذن ، هذا طق. لذلك ، اتضح أنه يمكنك القيام بذلك الآن دون الحاجة إلى فتح وإغلاق أنابيب الاختبار.

عفوًا ، قصدت وضع ذلك هنا. ما مدى حساسية PCR؟ إنها حساسة للغاية. يمكنك أن تفعل ذلك ، تطبيقات PCR. متعدد الاستخدامات. أولاً ، دعنا نعيد تسلسل الجين.

الجين من الخميرة أو من الإنسان. أنت فقط بحاجة ، كما تعلم ، أي عينة من الحمض النووي. احصل على الجين الخاص بي ، واحصل على البرايمر ، وكما كنت أشير باستخدام عصا المصاصة ، لست مضطرًا إلى الحصول عليها نقية جدًا ، على الرغم من أنك في المختبر تواجه مشكلة في جعلها نقية لأنك تريدها أن تكون نقية و كل ذلك. نعم؟

صيح. نعم. لذا ، تذكر أنني كنت أثير ضجة حول دقة النسخ ، أليس كذلك؟ وقلت إن البوليميراز بمفرده قد يكون لديه دقة تبلغ حوالي عشرة إلى خمسة ناقص.

الآن ، ما هي الآليتين ، لإصلاح الحمض النووي ، لمراجعة الحمض النووي؟

كان أحدهما نشاطًا داخليًا للتدقيق اللغوي يمتلكه الإنزيم.

كان الإنزيم سيضع قاعدة ، ويفحص القاعدة ، وهذا في الواقع يساعده من حيث الحجم أو اثنين.

وبعض هذه البوليمرات لها نشاط تدقيق.

ولكن بعد ذلك ناقشنا أيضًا نشاط إصلاح عدم التطابق الذي سيظهر لاحقًا ويكتشف عدم التطابق. أنت محق تمامًا ، إن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ليس دقيقًا مثل الخلايا لأنه لا يحتوي على نشاط إصلاح غير متطابق. لذلك ، عندما تأخذ منتج PCR ، إذا كنت سأستنسخ ، لذلك إذا كنت سأأخذ كل منتج PCR ، على سبيل المثال ، من جين بيتا غلوبين الخاص بي ، لذلك سأقوم بأخذ أنبوب الاختبار الخاص بي ، فأنا سأضيف البادئات وكل شيء ، سأذهب إلى PCR ، وسأذهب إلى PCR ، وبعد ذلك سأحصل على الكثير من نسخ بيتا غلوبين. إذا كنت سأأخذ بيتا غلوبين هذا وقمت فقط بتسلسل الحمض النووي مباشرة في أنبوب الاختبار. هذه هي قطعتي من بيتا غلوبين.

يمكنني الآن تسلسلها عن طريق إضافة جهاز تمهيدي وإجراء تسلسل الفلورسنت وتشغيله على جهاز التسلسل وكل ذلك.

آسف ، الذهاب في الاتجاه الآخر. سوف أجري رد فعل تسلسلي.

يمكنني فعل ذلك في الواقع ، وما أفعله هو مجموع السكان من مليون أو مليار جزيء. إذا كان أحدهم مخطئًا ، فسيغمره الآخرون ، حسنًا؟ لأنني أستطيع أن أفعل رد فعلي التسلسلي على منتج PCR بأكمله.

وستظل الأخطاء العشوائية في جزيء أو آخر أقلية صغيرة من الأصوات في أي قاعدة معينة ، أليس كذلك؟ لكن لنفترض أنني كنت سأأخذ منتج PCR الخاص بي ، كل هذه الجزيئات المضخمة هنا ، وافترض أنني كنت سأستنسخها بشكل فردي وكنت سأقوم بتسلسل كل من تلك الحيوانات المستنسخة بدلاً من تسلسل a ، خليط من جميع المنتجات. في الواقع ، سأرى معدل طفرة أعلى. وأنت على حق تمامًا.

عندما يقوم الناس باستنساخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عليهم التحقق منها بعد ذلك والتخلص من المنتجات الخاطئة ، حسنًا؟ صح تماما. جيد جيد جيد. إذن ، أنتم يا رفاق ، كما تعلمون ، على رأس القضايا المهمة المتعلقة بالحمض النووي. لذا ، يمكنني أخذ جين ويمكنني إعادة تسلسله. يمكنني أيضًا القيام بأشياء مثل أخذ الدم والبحث عن وجود فيروس.

لذا ، يمكنني إعادة تسلسل بيتا غلوبين ودراسة الناس ومعرفة من الذي أصيب بفقر الدم المنجلي وكل ذلك. يمكنني أخذ الدم وقد أريد أن أقول هل أرى فيروس نقص المناعة البشرية موجودًا في دم شخص ما؟

على سبيل المثال ، يمكن إجراء اختبار فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق صنع بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتسلسل فيروس نقص المناعة البشرية. لديها جينوم.

أخذ عينة من دم الإنسان و PCR- إدخالها. إذا حصلت على منتج PCR إيجابي ، وهو منتج PCR تم تصنيعه بواسطة هذين البادئين ، وإذا تحققت ، على سبيل المثال ، من أنه يعطيك تسلسل فيروس نقص المناعة البشرية ، فأنت تعلم أن عينة الدم هذه ، هذا الشخص مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية الفيروس.

هذه طريقة للقيام بذلك. تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل نفسه سريع.

عادة ما يستغرق ساعات. في الواقع ، يمكن إجبارها على السير بسرعة أكبر بواسطة الآلات التي تقوم بالدوران الحراري بسرعة.

ويمكنك في الواقع إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في خمس دقائق ، على الرغم من أن الناس لا يفعلون ذلك كثيرًا ، ولكن إذا وضعت أنبوبًا شعريًا زجاجيًا رقيقًا وذهبت للحرارة والبرودة والحرارة والبرودة بسرعة كبيرة جدًا ، فهناك آلة من شركة Idaho Technologies يمكنها القيام بذلك في غضون خمس دقائق ، لكنها في العادة ليست مشكلة. وقمت بوضعه للتو ، كما تعلمون ، في غضون بضع ساعات ستحصل على إجابة هناك حول ما إذا كان شخص ما مصابًا بفيروس نقص المناعة البشرية أم لا ، على سبيل المثال. لذلك ، يمكنك القيام بذلك لاكتشاف الكميات المنخفضة نسبيًا من الفيروسات. الى اي مستوي تستطيع النزول؟

حسنًا ، اتضح ، ما هو الحد؟ ما هو أصغر عدد من الجزيئات قد تتمكن من اكتشافه في عينة؟

نظريا. واحد. لا يمكنك أقل من جزيء واحد ، أليس كذلك؟ لذلك ، قد يكون المرء هو الحد الأقصى. إذن ، كيف يمكنني الترتيب للحصول على جزيء واحد في أنبوب اختبار؟ أود الحصول على أنبوب اختبار يحتوي على نسخة واحدة بالضبط من جين بيتا غلوبين.

ما هي أفضل طريقة للحصول على نسخة واحدة بالضبط من بيتا جلوبين ووضعها في أنبوب الاختبار؟

آسف؟ لا يمكنك. لماذا ا؟ جزيء واحد فقط.

أريد الحصول على نسخة واحدة بالضبط من بيتا غلوبين. يمكنني ، يمكنني فقط أخذ الحمض النووي الكلي وتخفيفه ، لذا ، في المتوسط ​​، هناك نسخة واحدة فقط. أو ، في الواقع ، هل هناك أي طريقة ، أعني هل يمكنني ذلك ، أود فقط شراء حزمة تحتوي على بيتا غلوبين واحد بالضبط. آسف؟ اربطها بشيء كبير.

دعونا نفكر بيولوجيا. هل تقوم البيولوجيا بتجميع نسخة واحدة من بيتا جلوبين؟ آسف؟ جاميتس. ماذا عن الحيوانات المنوية؟

لنلتقط حيوان منوي من ذيله هنا ، نضعه في أنبوب الاختبار.

إنها نسخة واحدة من بيتا جلوبين. لذلك ، يمكنك في الواقع أخذ أجهزة فرز الخلايا وجعلها تقوم بفرز الحيوانات المنوية في أنابيب اختبار فردية.

أنت تعرف الآن أن هناك نسخة واحدة من بيتا جلوبين.

قم بتسخينه ، وسوف يؤدي إلى فتح الحيوانات المنوية ، وإضافة المواد الأولية الخاصة بك ، يمكنك تضخيم بيتا غلوبين ، إنها نسخة واحدة. هذا يثبت حساسيته غير العادية. يمكنك فعل ذلك بحيوان منوي واحد.

يمكنك فعل ذلك مع بيضة واحدة أيضًا ، ولكن يصعب الحصول عليها.

لذلك ، بهذا المستوى من الحساسية ، يمكنك القيام بما يلي. لذلك ، كتابة الحيوانات المنوية الواحدة. الآن ، تعد كتابة الحيوانات المنوية الفردية أمرًا رائعًا ولكنها عديمة الفائدة نوعًا ما. ماذا ستفعل به ، صحيح؟ ولكن هناك شيء آخر يمكنك القيام به. كتابة الأجنة.

لنفترض أن أحدهم يعاني من مرض وراثي في ​​عائلته ، ربما يكون مرض هنتنغتون. وافترض أن الفرد المصاب بمرض هنتنغتون يريد إنجاب أطفال. أو الفرد ، آسف ، الشخص المعرض لخطر الإصابة بمرض هنتنغتون أو سرطان الثدي أو أي شيء يريد إنجاب الأطفال.

ما يمكنك القيام به هو الحصول على بويضات من عيادة التلقيح الصناعي ، وتخصيب البويضات في المختبر ، وتنميتها في طبق بتري إلى مرحلة 8 أو 16 خلية قبل إعادة زرع الأجنة في الأم. ألن يكون رائعًا أن نختار إعادة زراعة جنين لا يعاني من المرض الوراثي؟ كيف سنقوم بفعل ذلك؟ PCR. كيف حالك فماذا نفعل؟ نأخذ الجنين.

نصنع الحمض النووي من الجنين. نقوم بعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل ونقول ، آه ، هذا الجنين لم يكن مصابًا بالمرض الوراثي. المشكلة أنها قتلت الخلايا هناك ، صحيح أنها قتلت الجنين.

أيه أفكار؟ اسحب خلية واحدة. قم بإزالة خلية واحدة. اتضح أنه في المرحلة لا يتم تمييز الخلايا.

إذا قمت بإزالة خلية واحدة من الجنين في تلك المرحلة المبكرة جدًا ، فإن الخلايا الأخرى تصنع طفلًا سعيدًا وصحيًا تمامًا.

هذه الخلية ليست ضرورية. تعد حساسية الخلية المفردة هذه ذات قيمة كبيرة لأنني أستطيع فعلاً إجراء التنميط الجيني لخلية واحدة على الأجنة المخصبة في المختبر وأن أكون قادرًا على منح الآباء فرصة ، فرصة لإعادة زرع الأجنة التي ليس لديها عيب وراثي فقط. هذا بارد. هذا رائع حقا.

هناك أشياء أخرى قد تتمكن من القيام بها. إذا كنت تعالج مريضًا مصابًا بالسرطان ، أو مريضًا ، أو مريضًا بالسرطان ، وقد أعطيت علاجًا كيميائيًا تريد أن تعرفه ، فهل تمكنت من استئصال الخلايا السرطانية؟ وبعد ستة أشهر هل عادت أي من الخلايا السرطانية؟ يمكنني البحث عن كميات قليلة جدًا من الخلايا السرطانية. أستطيع ، يمكنني القيام بمراقبة الكميات المنخفضة من الخلايا السرطانية بعد العلاج الكيميائي.

وبالطبع يمكنني أيضًا إجراء الطب الشرعي.

يمكنني أخذ عينة صغيرة من الدم من مكان الجريمة أو اللعاب من ظهر مغلف قام شخص ما بلعقه ، ويمكنني إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل والبحث عن الاختلافات الجينية التي تميز الناس. ومن المفترض أنك ترى كل هذه الأشياء على التلفزيون طوال الوقت. لذلك ، هذا ما يعد PCR مفيدًا له.

إنه جيد. حسنا. الموضوع الأخير ، موضوع موجز للغاية ، لكني أريد أن أذكر. كان هذا هو القدرة على تحليل الطفرات الجينية الموجهة.

ولن أخوض في تفاصيل كل هذا ، لكني أريد فقط أن أصف المفهوم بشكل أساسي على الأقل.

يمكنني أخذ أي قطعة من الحمض النووي ، لنقل من دروفسيلا ، ويمكنني تغيير الحمض النووي في المختبر. يمكنني تغيير هذه القاعدة من G إلى C. هناك حق ، هناك بروتوكول مناسب وخدعة طبخ للقيام بذلك. إنه ينطوي على وضع القليل من القلة فوقه والتمديد ، ولا يهم بالضبط كيف.

يمكنني إدخال جين إضافي في ذلك. يمكنني استخدام إنزيم تقييد صغير لفتحه وحشو شيء فيه.

يمكنني حذف شيء من هذا. ربما سأستخدم إنزيم تقييد لفتحه ، وما إلى ذلك. في الأساس يمكنني ، يمكنني دمج الجينات معًا. يمكنني القيام بأي نوع من بناء قطع الحمض النووي وتعديلات قطع الحمض النووي التي أود القيام بها في المختبر. يمكنني بعد ذلك أخذ هذا الجين المتحور ، دعنا نقول أن الجين عبارة عن إنزيم ، يشفر الإنزيم ، ويكون للإنزيم موقع نشط. يمكنني تغيير رمز الحمض الأميني في الموقع النشط لمعرفة ما إذا كان هذا الحمض الأميني مهمًا حقًا أم لا.يمكنني فعل أي من هذه الأشياء.

ويمكنني إعادة هذا إلى كائن حي. تذكر أنك قلت أنه يمكنك تحويل الحمض النووي مرة أخرى إلى بكتيريا؟

حسنًا ، يمكنك أيضًا القيام بأشياء مثل حقن الحمض النووي في البويضة المخصبة. في الواقع ، في المرحلة التي يوجد فيها نواة ذكر وأنثى لم تلتحم بعد بعد الإخصاب مباشرة. يمكنك أن تأخذ ماصة صغيرة وإبرة ويمكنك حقن بعض الحمض النووي الذي تريده في نواة الذكر ، وبعد ذلك عندما يندمج نواة الذكر والنواة الأنثوية وينمو الجنين ، فإنه سيحصل على الحمض النووي الخاص بك.

يمكنك صنع فئران تحمل أي جين قمت بتعديله بهذا الشكل. لا يمكنك أيضًا ، أنت ، لا يمكنك فقط تعديل قطعة من الحمض النووي وإضافة ، هذه إضافة جينية ، يمكنك أيضًا إجراء طرح الجينات. يمكنك القيام بطرح الجينات ، ومرة ​​أخرى ، لن أقلق بشأن التفاصيل هنا ، عن طريق أخذ الخلايا الجذعية الجنينية. الكثير في الأخبار هذه الأيام ، وقد نعود إليهم. وفي المختبر ، والعمل مع الخلايا الجذعية الجنينية ، لتحويل قطعة من الحمض النووي التي تم ترتيبها لإعادة الاتحاد إلى الجين المعني ومعرفة ذلك.

لذلك ، إذا قمت بالبناء ، إذا قمت ببناء قطعة من الحمض النووي في المختبر وقمت بوضعها في مجموعة كاملة من الخلايا الجذعية الجنينية ، يمكنك اختيار ، من خلال تقنيات الساطور المختلفة ، لتلك الخلايا الجذعية الجنينية التي تناولت الجين الخاص بك. ولم يتم تناولها فحسب ، بل صدمتها في الموضع الطبيعي بدلاً من الموضع الطبيعي.

وبهذه الطريقة يمكنك التخلص من الجين. يمكنك القيام بالضربة القاضية للجينات.

لذا ، فإن النقطة الأساسية لهذا الآن ، لتلخيص هذه المحاضرات العديدة هي أننا الآن في النقطة التي رأيناها في هذه الصورة التي رأيناها في البداية ، الوظيفة ، الجين ، البروتين ، التي فهمناها الآن أولاً كمنهجية ، علم الوراثة والكيمياء الحيوية.

ومن ثم فهمنا كيف تقوم الجينات بتشفير البروتينات من خلال البيولوجيا الجزيئية. تسمح لنا أدوات الحمض النووي المؤتلف بالتحرك في أي اتجاه. تريد أن تجد الجين الكامن وراء وظيفة ما ، هل تريد العثور على الجين الخاص بمرض هنتنغتون؟

يمكننا أن نفعل ذلك. استنساخها بناءً على ارتباطها فقط.

تريد أن تجد الجين الذي يشفر البروتين؟ إذا كنت أعرف تسلسل الأحماض الأمينية ، يمكنني العثور على تسلسل الحمض النووي الذي يتوافق معه.

إذا أردت أن أجد ما يفعله بروتين معين ، وظيفته ، يمكنني الحصول على الجين الخاص بهذا البروتين. يمكنني أن أخرج الجين الخاص بهذا البروتين وأرى ما هي وظيفته.

فجأة ، بالنسبة لعلماء الرياضيات من بين المجموعة ، يصبح هذا مخططًا تبادليًا ، يمكنك ملاحقته في أي اتجاه. هذا ، بمعنى ما ، ما كان يدور حوله القرن العشرين ، كان فكريًا دمج هذين التخصصين من خلال البيولوجيا الجزيئية ثم الحمض النووي المؤتلف الذي يمنحك جميع الأدوات التي إذا كنت جالسًا في أي مكان في هذا المثلث ، يمكنك التحرك بهذه الطريقة و بهذه الطريقة ، من جين إلى بروتين ، ومن بروتين إلى جين ، ومن وظيفة إلى جين ، ومن وظيفة إلى بروتين. سنتحدث في الكثير من بقية الدورة عن كيفية استخدامك لهذه الأدوات ، ولكن هذا يختتم الجزء الأول من الدورة التدريبية حول مفاهيم ومنهجيات البيولوجيا الجزيئية. الآن ، إذا تمسكت بدقيقة أخرى ، فهذه هي آخر محاضرة لي لفترة من الوقت. لن أكون كذلك ، فنحن نجري اختبارًا ، ولدينا اختبارًا يوم الاثنين ، ثم يتولى بوب المهمة مرة أخرى.

لذا ، لن أراك الأسبوع المقبل أو نحو ذلك. إذن ، شيئان.

أولاً ، لن أراك قبل انتهاء بطولة العالم ، لذا يرجى من الجميع التفكير في أفكار جيدة حول Red Sox. ثانيًا ، لن أراك قبل الانتخابات. تصويت.


المفاهيم الأساسية والملخص

  • يتطلب العثور على جين مثير للاهتمام داخل عينة استخدام الجين الذي تقطعت به السبل مسبار الحمض النووي مُصنَّف بمنارة جزيئية (نشاط إشعاعي أو مضان عادةً) يمكنه التهجين بحمض نووي أحادي السلسلة مكمل في العينة.
  • الاغاروز الكهربائي للهلام يسمح بفصل جزيئات الحمض النووي على أساس الحجم.
  • تقييد طول القطعة تعدد الأشكال(RFLP) يسمح التحليل بالتخيل بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز لمتغيرات متميزة لتسلسل الحمض النووي الناجم عن الاختلافات في مواقع التقييد.
  • لطخة جنوبية يسمح التحليل للباحثين بالعثور على تسلسل DNA معين داخل عينة بينما لطخة الشمالية يسمح التحليل للباحثين باكتشاف تسلسل mRNA معين معبرًا عنه في عينة.
  • تقنية ميكروأري هي تقنية تهجين الحمض النووي التي تسمح بفحص عدة آلاف من الجينات في وقت واحد للعثور على الاختلافات في الجينات أو أنماط التعبير الجيني بين عينتين من الحمض النووي الجيني أو cDNA ،
  • بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (PAGE) يسمح بفصل البروتينات حسب الحجم ، خاصةً إذا تم إخفاء شحنات البروتين الأصلي من خلال المعالجة المسبقة بـ SDS.
  • تفاعل البلمرة المتسلسل يسمح بالتضخيم السريع لتسلسل DNA معين. يمكن استخدام الاختلافات في PCR للكشف عن تعبير mRNA (النسخ العكسي PCR) أو لتحديد تسلسل معين في العينة الأصلية (في الوقت الحقيقي PCR).
  • على الرغم من أن تطوير تسلسل سانجر الحمض النووي كان ثوريًا ، والتقدم في تسلسل الجيل القادم تسمح بالتسلسل السريع وغير المكلف لجينومات العديد من الكائنات الحية ، مما يؤدي إلى تسريع حجم بيانات التسلسل الجديد.

مراجع

Sanger ، F. المتتاليات ، المتتاليات ، والمتتاليات. Annu. القس Biochem. 57, 1–28 (1988)

Edman، P. طريقة تحديد تسلسل الأحماض الأمينية في الببتيدات. اكتا تشيم. سكاند. 4, 283–293 (1950)

هولي ، آر دبليو وآخرون. هيكل الحمض النووي الريبي. علم 147, 1462–1465 (1965)

سانجر ، إف ، براونلي ، جي جي وأمبير باريل ، بي جي إجراء تجزئة ثنائي الأبعاد للنيوكليوتيدات المشعة. جيه مول. بيول. 13, 373–398 (1965)

Wu، R. & amp Kaiser، A. D. التركيب والتسلسل الأساسي في النهايات المتماسكة للحمض النووي للعاثيات لامبدا. جيه مول. بيول. 35, 523–537 (1968)

Gilbert، W. & amp Maxam، A. تسلسل النيوكليوتيدات لمشغل lac. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 70, 3581–3584 (1973)

Sanger، F.، Nicklen، S. & amp Coulson، A.R. تسلسل الحمض النووي مع مثبطات إنهاء السلسلة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 74, 5463–5467 (1977). الحكام 8, 9 : الأوراق الأساسية التي أعدها سانجر ونيكلين وأمبير كولسون وماكسام وأمبير جيلبرت تصف الأساليب الأولى المعتمدة على نطاق واسع لتسلسل الحمض النووي.

Maxam، A. M. & amp Gilbert، W. طريقة جديدة لتسلسل الحمض النووي. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 74, 560–564 (1977)

Maniatis ، T. ، Jeffrey ، A. & amp van deSande ، H. الكيمياء الحيوية 14, 3787–3794 (1975)

Staden، R. استراتيجية لتسلسل الحمض النووي باستخدام برامج الكمبيوتر. الدقة الأحماض النووية. 6, 2601–2610 (1979)

Messing ، J. ، Crea ، R. & amp Seeburg ، P. H. نظام لتسلسل DNA البندقية. الدقة الأحماض النووية. 9, 309–321 (1981)

سانجر ، إف ، كولسون ، إيه آر ، هونج ، جي إف ، هيل ، دي إف آند بيترسن ، جي بي تسلسل النوكليوتيدات من دنا البكتيريا لامدا. جيه مول. بيول. 162, 729–773 (1982)

سميث ، لام وآخرون. الكشف عن الإسفار في تحليل تسلسل الحمض النووي الآلي. طبيعة سجية 321, 674–679 (1986)

كونيل ، سي وآخرون. تحليل تسلسل الحمض النووي الآلي. التقنيات الحيوية 5, 342–348 (1987)

Altschul، S. F.، Gish، W.، Miller، W.، Myers، E. W. & amp Lipman، D. J. Basic أداة بحث المحاذاة المحلية الأساسية. جيه مول. بيول. 215, 403–410 (1990)

Prober ، J.M et al. نظام لتسلسل الحمض النووي السريع باستخدام ديديوكسينوكليوتيدات متألقة تنتهي بالسلسلة. علم 238, 336–341 (1987)

Tabor ، S. & amp Richardson ، C.C. تحليل تسلسل الحمض النووي باستخدام بوليميريز الحمض النووي T7 للعاثية المعدلة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 84, 4767–4771 (1987)

كراكستون ، م. تسلسل التضخيم الخطي ، طريقة قوية لتسلسل الحمض النووي. أساليب 3, 20–26 (1991)

DeAngelis، M. M.، Wang، D.G & amp Hawkins، T.L. الصلبة الشلل العكسي لعزل منتجات PCR. الدقة الأحماض النووية. 23, 4742–4743 (1995)

تشانغ ، ج. وآخرون. استخدام بولي أكريلاميد غير متصالب لتسلسل الحمض النووي بأربعة ألوان عن طريق فصل الكهربي الشعري لشظايا تصل إلى 640 قاعدة بطول ساعتين. شرجي. تشيم. 67, 4589–4593 (1995)

جرين ، فريد ، فراب ، كونسيد. http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html (2017). قدم Phred مقاييس كمية وموثوقة للجودة الأساسية ، واستبدل الحكم البشري بأجهزة الكمبيوتر ، وهي عملية حدثت مرارًا وتكرارًا على مدار HGP.

إدواردز ، إيه وآخرون. التسلسل الآلي للحمض النووي لموضع HPRT البشري. علم الجينوم 6, 593–608 (1990)

Sutton، G.G، White، O.، Adams، M.D & amp Kerlavage، A. R. TIGR المجمع: أداة جديدة لتجميع مشاريع تسلسل البنادق الكبيرة. علوم الجينوم. تكنول. 1, 9–19 (1995)

مايرز ، إي دبليو وآخرون. تجميع الجينوم الكامل لـ ذبابة الفاكهة. علم 287, 2196–2204 (2000). قدم مُجمِّع Celera نهجًا متداخلًا - تخطيط - إجماع للتعامل مع المشكلات التي تطرحها عمليات التكرار وملايين القراءات اللازمة لإنتاج تجميع موثوق.

فليشمان ، آر دي وآخرون. التسلسل العشوائي للجينوم الكامل وتجميع طريق المستدمية النزلية. علم 269, 496–512 (1995)

جوفو ، إيه وآخرون. الحياة مع 6000 جين. علم 274, 546–567 (1996)

ال C. ايليجانس اتحاد التسلسل. تسلسل الجينوم للديدان الخيطية C. ايليجانس: منصة للتحقيق في علم الأحياء. علم 282, 2012–2018 (1998)

الاتحاد الدولي لتسلسل الجينوم البشري. التسلسل الأولي وتحليل الجينوم البشري. طبيعة سجية 409, 860–921 (2001). الحكام 29 : أنتج HGP و Celera مسودة تسلسلات للجينوم البشري مع نشر HGP لاحقًا مرجعًا أكثر اكتمالًا وخاليًا من الأخطاء نسبيًا.

الاتحاد الدولي لتسلسل الجينوم البشري. إنهاء التسلسل اللوني للجينوم البشري. طبيعة سجية 431, 931–945 (2004)

فينتر ، جيه سي وآخرون. تسلسل الجينوم البشري. علم 291, 1304–1351 (2001)

آدامز ، إم دي وآخرون. تسلسل الجينوم ذبابة الفاكهة سوداء البطن. علم 287, 2185–2195 (2000)

Balasubramanian ، S. ، Klenerman ، D. & amp Barnes ، C. متعدد النيوكليوتيدات المصفوفة واستخدامها في تحليل الجينوم. براءة الاختراع US20030022207 (2003)

Braslavsky، I.، Hebert، B.، Kartalov، E. & amp Quake، S.R. يمكن الحصول على معلومات التسلسل من جزيئات DNA مفردة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 100, 3960–3964 (2003)

هاريس ، تي دي وآخرون. تسلسل الحمض النووي أحادي الجزيء للجينوم الفيروسي. علم 320, 106–109 (2008)

Adams، C.P & amp Kron، S.J. طريقة إجراء تضخيم للحمض النووي باستخدام بادئين مرتبطين بدعامة صلبة واحدة. براءة الاختراع US5641658 (1997)

Chetverina ، H. V. & amp Chetverin ، A. B. استنساخ جزيئات الحمض النووي الريبي في المختبر. الدقة الأحماض النووية. 21, 2349–2353 (1993)

ميترا ، آر دي وأمبير تشيرش ، جي إم. فى الموقع تضخيم موضعي وتكرار الاتصال للعديد من جزيئات الحمض النووي الفردية. الدقة الأحماض النووية. 27، e34-e39 (1999)

Adessi ، C. et al. تضخيم الحمض النووي للطور الصلب: توصيف آليات التعلق والتضخيم التمهيدي. الدقة الأحماض النووية. 28، e87 (2000)

مارغوليس ، إم وآخرون. تسلسل الجينوم في مفاعلات بيكوليتر عالية الكثافة عالية الكثافة. طبيعة سجية 437, 376–380 (2005). الحكام 40, 41 : وصفت هذه الأوراق الأنظمة المتكاملة الأولى لتسلسل الجيل التالي من الحمض النووي.

شندور ، جيه وآخرون. تسلسل دقيق متعدد المستقطعات لجينوم بكتيري متطور. علم 309, 1728–1732 (2005)

دريسمان ، د. ، يان ، هـ. ، ترافيرسو ، ج. ، كينزلر ، ك. دبليو & فوغلشتاين ، ب. تحويل جزيئات الحمض النووي المفردة إلى جزيئات مغناطيسية فلورية لاكتشاف وتعداد الاختلافات الجينية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 100, 8817–8822 (2003)

درماناك ، ر. وآخرون. يقرأ تسلسل الجينوم البشري باستخدام قاعدة غير مقيدة على مصفوفات الحمض النووي النانوية ذاتية التجميع. علم 327, 78–81 (2010)

Ronaghi، M.، Karamohamed، S.، Pettersson، B.، Uhlén، M. & amp Nyrén، P. تسلسل الحمض النووي في الوقت الحقيقي باستخدام الكشف عن إطلاق البيروفوسفات. شرجي. بيوتشيم. 242, 84–89 (1996)

Toumazou، C. & amp Purushothaman، S. جهاز وطريقة الاستشعار. براءة الاختراع US7686929 (2004)

Rothberg، J.M، Hinz، W.، Johnson، K.L & amp Bustillo، J. جهاز لقياس التحليلات باستخدام مصفوفات FET واسعة النطاق. براءة الاختراع EP2639579 (2016)

برينر ، إس وآخرون. تحليل التعبير الجيني عن طريق تسلسل التوقيع المتوازي بشكل كبير (MPSS) على صفائف microbead. نات. التكنولوجيا الحيوية. 18, 630–634 (2000)

مكيرنان ، ك.جيه وآخرون. تم الكشف عن التسلسل والتباين الهيكلي في جينوم بشري عن طريق قراءة قصيرة وتسلسل ربط متوازي على نطاق واسع باستخدام تشفير ثنائي القاعدة. الدقة الجينوم. 19, 1527–1541 (2009)

Mitra ، R. D. ، Shendure ، J. ، Olejnik ، J. ، Edyta-Krzymanska-Olejnik ، & amp Church ، G.M Fluorescent فى الموقع التسلسل في مستعمرات البوليميراز. شرجي. بيوتشيم. 320, 55–65 (2003)

Ost ، T. B. وآخرون. البوليميرات المحسنة. براءة الاختراع WO2006120433 (2006)

روباريل وآخرون. تصميم وتوليف 3′-ا-النيوكليوتيدات الفلورية القابلة للفك ضوئيًا كنهاية عكسية لتسلسل الحمض النووي عن طريق التوليف. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 5932–5937 (2005)

سيو ، تي إس وآخرون. تسلسل الحمض النووي رباعي الألوان عن طريق التوليف على شريحة باستخدام نيوكليوتيدات فلورية قابلة للكسر ضوئيًا. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 5926–5931 (2005)

بارنز ، سي ، بالاسوبرامانيان ، إس ، ليو ، إكس ، سويردلو ، إتش آند ميلتون ، جي. براءة الاختراع US7057026 (2006)

سميث ، تي جيه ، تسلسل جزيء واحد مستنسخ باستخدام كيمياء فاصل عكسية ، مؤتمر تسلسل وتحليل الجينوم (2015).

بنتلي ، دي آر وآخرون. دقيقة كاملة تسلسل الجينوم البشري باستخدام الكيمياء فاصل عكسها. طبيعة سجية 456, 53–59 (2008). بلغ التقدم في التسلسل بالتوليف ذروته في منصة Solexa ، لاحقًا Illumina ، والتي سرعان ما أصبحت ، ولا تزال حتى اليوم ، أداة التسلسل الأكثر استخدامًا على نطاق واسع.

Wetterstrand، K. تكاليف تسلسل الحمض النووي: بيانات من برنامج تسلسل الجينوم NHGRI (GSP). http://www.genome.gov/sequencingcostsdata (2017)

ليفين ، م. وآخرون. أدلة الموجة ذات الوضع الصفري لتحليل جزيء واحد بتركيزات عالية. علم 299, 682–686 (2003). واحدة من أوائل الملاحظات في الوقت الحقيقي لتخليق الحمض النووي في جزيئات مفردة ، باستخدام النيوكليوتيدات المسمى الفلورسنت وبوليميراز الحمض النووي الراسخ في أدلة الموجة ذات الوضع الصفري ، والتي أدت مع مزيد من التطوير إلى منصة PacBio.

عيد ، ج وآخرون. تسلسل الحمض النووي في الوقت الحقيقي من جزيئات البوليميراز المفردة. علم 323, 133–138 (2009)

Deamer، D.، Akeson، M. & amp Branton، D. ثلاثة عقود من التسلسل النانوي. نات. التكنولوجيا الحيوية. 34, 518–524 (2016)

Bayley، H. Nanopore التسلسل: من الخيال إلى الواقع. كلين. تشيم. 61, 25–31 (2015)

Church ، G. ، Deamer ، D.W ، Branton ، D. ، Baldarelli ، R. & amp Kasianowicz ، J. توصيف جزيئات البوليمر الفردية بناءً على تفاعلات واجهة المونومر. براءة الاختراع US5795782 (1998). أدى مفهوم ssDNA الذي يعدل إشارة إلكترونية أثناء التحرك عبر مسام الغشاء في النهاية إلى تسلسل النانو العملي.

برانتون ، د. وآخرون. إمكانات وتحديات تسلسل الثقوب النانوية. نات. التكنولوجيا الحيوية. 26, 1146–1153 (2008)

لازلو ، إيه إتش وآخرون. يقرأ فك تسلسل النانو الطويل للحمض النووي الطبيعي. نات. التكنولوجيا الحيوية. 32, 829–833 (2014)

جاين ، م وآخرون. تسلسل نانوبوري وتجميع الجينوم البشري بقراءات طويلة جدًا. الطباعة المسبقة على https://www.biorxiv.org/content/early/2017/04/20/128835 (2017)

Flusberg ، B. A. وآخرون. الكشف المباشر عن مثيلة الحمض النووي أثناء تسلسل جزيء واحد في الوقت الحقيقي. نات. أساليب 7, 461–465 (2010)

سميث ، إيه إم ، جين ، إم ، مولروني ، إل ، جارالدي ، دي آر أند أكيسون ، إم. قراءة النيوكليوتيدات الكنسية والمعدلة في الحمض النووي الريبوزي 16S باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي النانوي المباشر. الطباعة المسبقة على https://www.biorxiv.org/content/early/2017/04/29/132274 (2017)

Garalde، D.R et al. تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر الموازي للغاية على مجموعة من المسام النانوية. الطباعة المسبقة على https://www.biorxiv.org/content/early/2016/08/12/068809 (2016)

Nivala ، J. ، Marks ، D.B & amp Akeson ، M. نقل البروتين بوساطة Unfoldase من خلال nanopore α-hemolysin. نات. التكنولوجيا الحيوية. 31, 247–250 (2013)

تشاو ، واي وآخرون. التحليل الطيفي أحادي الجزيء للأحماض الأمينية والببتيدات عن طريق نفق التعرف. نات. النانو. 9, 466–473 (2014)

ويلسون ، جيه ، سلومان ، إل ، هي ، زي ، وأمبير أكسيمينتيف ، أ. الجرافين النانوية لتسلسل البروتين. حال. Funct. ماتر. 26, 4830–4838 (2016)

Di Ventra، M. & amp Taniguchi، M. فك شفرة DNA و RNA والببتيدات باستخدام نفق الكم. نات. النانو. 11, 117–126 (2016)

سانجر ، إف وآخرون. تسلسل النوكليوتيدات للعاثيات phi X174 DNA. طبيعة سجية 265, 687–695 (1977)

شنايدر ، في.أيه وآخرون. تقييم GRCh38 و من جديد توضح مجموعات الجينوم أحادية الصيغة الصبغية الجودة الدائمة للتجميع المرجعي. الدقة الجينوم. 27, 849–864 (2017)

Pevzner ، P. A. ، Tang ، H. & amp Waterman ، M. S. نهج مسار أويلريان لتجميع أجزاء الحمض النووي. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 98, 9748–9753 (2001)

Zerbino ، D. R. & amp Birney ، E. Velvet: خوارزميات لـ من جديد تجميع قراءة قصيرة باستخدام الرسوم البيانية لـ Bruijn. الدقة الجينوم. 18, 821–829 (2008)

آدي ، إيه وآخرون. في المختبر، معلومات تسلسل بعيد المدى لـ من جديد تجميع الجينوم عبر اتصال ترانسبوزيز. الدقة الجينوم. 24, 2041–2049 (2014)

موستوفوي ، واي وآخرون. نهج هجين ل من جديد تجميع تسلسل الجينوم البشري والمراحل. نات. أساليب 13, 587–590 (2016)

بيرتون ، ج.ن. وآخرون. السقالات على نطاق الكروموسوم من جديد تجميعات الجينوم على أساس تفاعلات الكروماتين. نات. التكنولوجيا الحيوية. 31, 1119–1125 (2013)

Kaplan، N. & amp Dekker، J. سقالات الجينوم عالية الإنتاجية من في الجسم الحي تردد تفاعل الحمض النووي. نات. التكنولوجيا الحيوية. 31, 1143–1147 (2013)

بيكهارت ، دي إم وآخرون. يتيح تسلسل الجزيء الفردي والتقاط التشكل الكروماتين من جديد التجمع المرجعي لجينوم الماعز المحلي. نات. جينيه. 49, 643–650 (2017)

كورين ، إس وآخرون. Canu: تجميع قابل للتطوير ودقيق طويل القراءة عبر التكيف ك- ترجيح مرهف وتكرار الفصل. الدقة الجينوم. 27, 722–736 (2017)

Li، H. & amp Durbin، R. محاذاة قراءة قصيرة سريعة ودقيقة مع تحويل Burrows – Wheeler. المعلوماتية الحيوية 25, 1754–1760 (2009)

Langmead ، B. ، Trapnell ، C. ، Pop ، M. & amp Salzberg ، S. L. محاذاة فائقة السرعة وفعالة للذاكرة لتسلسلات الحمض النووي القصيرة للجينوم البشري. جينوم بيول. 10، R25 (2009)

لي ، هـ وآخرون. تنسيق تسلسل المحاذاة / الخريطة و SAMtools. المعلوماتية الحيوية 25, 2078–2079 (2009)

ماكينا ، إيه وآخرون. مجموعة أدوات تحليل الجينوم: إطار عمل MapReduce لتحليل بيانات تسلسل الجيل التالي من الحمض النووي. الدقة الجينوم. 20, 1297–1303 (2010)

تشيسون ، إم جيه وآخرون. حل تعقيد الجينوم البشري باستخدام تسلسل جزيء واحد. طبيعة سجية 517, 608–611 (2015)

Snyder ، M.W ، Adey ، A. ، Kitzman ، J.O. & amp Shendure ، J. نات. القس جينيه. 16, 344–358 (2015)

جرين ، آر إي وآخرون. مسودة تسلسل جينوم إنسان نياندرتال. علم 328, 710–722 (2010)

ليفي ، إس وآخرون. تسلسل الجينوم ثنائي الصيغة الصبغية للإنسان الفردي. بلوس بيول. 5، e254 (2007)

ويلر ، دي إيه وآخرون. الجينوم الكامل للفرد عن طريق تسلسل الحمض النووي المتوازي بشكل كبير. طبيعة سجية 452, 872–876 (2008)

وانج ، جيه وآخرون. تسلسل الجينوم ثنائي الصبغة لفرد آسيوي. طبيعة سجية 456, 60–65 (2008)

Ley ، T. J. et al. تسلسل الحمض النووي لجينوم اللوكيميا النخاعي الحاد الطبيعي خلويًا. طبيعة سجية 456, 66–72 (2008)

ألبرت ، ت.جيه وآخرون. الاختيار المباشر لمواقع الجينوم البشري عن طريق تهجين ميكروأري. نات. أساليب 4, 903–905 (2007)

Okou ، D. T. وآخرون. اختيار الجينوم القائم على ميكروأري لإعادة التسلسل عالي الإنتاجية. نات. أساليب 4, 907–909 (2007)

بوريكا ، جي جي وآخرون. تضخيم متعدد لمجموعات كبيرة من exons البشري. نات. أساليب 4, 931–936 (2007)

هودجز ، إي وآخرون. على مستوى الجينوم فى الموقع التقاط exon لإعادة التسلسل الانتقائي. نات. جينيه. 39, 1522–1527 (2007)

نج ، س.ب. وآخرون. الالتقاط المستهدف والتسلسل المتوازي على نطاق واسع لـ 12 إكسومًا بشريًا. طبيعة سجية 461, 272–276 (2009). الحكام 97, 103, 106 : سهّل استهداف جميع متواليات الترميز أو الإكسوم ، عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ولاحقًا عن طريق التقاط الإكسوم ، الاكتشاف المباشر للجينات المسببة للسرطان وجينات مرض مندل.

اتحاد مشروع 1000 جينوم. خريطة لتباين الجينوم البشري من التسلسل على نطاق السكان. طبيعة سجية 467, 1061–1073 (2010)

اتحاد مشروع 1000 جينوم. مرجع عالمي للتنوع الجيني البشري. طبيعة سجية 526, 68–74 (2015)

فو ، دبليو وآخرون. يكشف تحليل 6515 إكسومات عن الأصل الحديث لمعظم متغيرات ترميز البروتين البشري. طبيعة سجية 493, 216–220 (2013)

تشيو ، آر دبليو وآخرون. التشخيص غير الجراحي قبل الولادة لاختلال الصيغة الصبغية للجنين عن طريق التسلسل الجيني المتوازي على نطاق واسع للحمض النووي في بلازما الأم. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 105, 20458–20463 (2008)

Fan، H.C، Blumenfeld، Y. J.، Chitkara، U.، Hudgins، L. & amp Quake، S.R. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 105, 16266–16271 (2008)

تشوي ، م وآخرون. التشخيص الجيني عن طريق الالتقاط الكامل للإكسوم وتسلسل الحمض النووي الموازي بشكل كبير. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 106, 19096–19101 (2009)

Vissers، L. E. L.M، Gilissen، C. & amp Veltman، J. A. الدراسات الجينية في الإعاقة الذهنية والاضطرابات ذات الصلة. نات. القس جينيه. 17, 9–18 (2016)

يانج ، واي وآخرون. النتائج الجزيئية بين المرضى المُحالين لتسلسل الإكسوم الكامل السريري. جيه. ميد. مساعد. 312, 1870–1879 (2014)

وود ، إل دي وآخرون. المناظر الطبيعية الجينومية لسرطان الثدي والقولون والمستقيم. علم 318, 1108–1113 (2007)

آدامز ، إم دي وآخرون. تسلسل الحمض النووي التكميلي: علامات التسلسل المعبر عنها ومشروع الجينوم البشري. علم 252, 1651–1656 (1991)

بوتني ، إس دي ، هيرليهي ، دبليو سي ، وأمبير شيميل ، بي ، استنساخ تروبونين T و cDNA جديد لـ13 بروتين عضلي مختلف ، تم العثور عليه من خلال تسلسل البندقية. طبيعة سجية 302, 718–721 (1983)

Velculescu، V. E.، Zhang، L.، Vogelstein، B. & amp Kinzler، K.W، Serial analysis of gene expression. علم 270, 484–487 (1995). تلتقط طريقة SAGE علامات 3 من mRNAs ، وبالتالي تقديم فكرة استخدام مُسلسِل الحمض النووي لعد الجزيئات ، وهي فكرة انفجرت مع الإدخال الأخير لـ RNA-seq ، الترسيب المناعي للكروماتين متبوعًا بالتسلسل (ChIP – seq) وما إلى ذلك. .

كلونان ، ن. وآخرون. التنميط النسخي للخلايا الجذعية عبر تسلسل mRNA على نطاق واسع. نات. أساليب 5, 613–619 (2008)

ليستر ، ر. وآخرون. خرائط دقة أحادية القاعدة متكاملة للغاية للإبيجينوم في أرابيدوبسيس. زنزانة 133, 523–536 (2008)

Mortazavi ، A. ، Williams ، B. A. ، McCue ، K. ، Schaeffer ، L. & amp Wold ، B. رسم الخرائط وقياس نسخ الثدييات بواسطة RNA-seq. نات. أساليب 5, 621–628 (2008)

ناغالاكشمي ، يو وآخرون. المشهد النسخي لجينوم الخميرة المحدد بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي. علم 320, 1344–1349 (2008)

فيلهلم ، ب ت وآخرون. ذخيرة ديناميكية لنسخة حقيقية النواة تم مسحها بدقة أحادية النوكليوتيدات. طبيعة سجية 453, 1239–1243 (2008)

Trapnell، C.، Pachter، L. & amp Salzberg، S.L TopHat: اكتشاف تقاطعات لصق مع RNA-seq. المعلوماتية الحيوية 25, 1105–1111 (2009)

ترابنيل ، سي وآخرون. يكشف تجميع النسخ والقياس الكمي بواسطة RNA-Seq عن النصوص غير المشروحة والتبديل الإسوي أثناء تمايز الخلايا. نات. التكنولوجيا الحيوية. 28, 511–515 (2010)

Johnson، D. S.، Mortazavi، A.، Myers، R.M & amp Wold، B. رسم خرائط على مستوى الجينوم لـ في الجسم الحي تفاعلات البروتين والحمض النووي. علم 316, 1497–1502 (2007)

بويل ، أ.ب. وآخرون. رسم خرائط عالي الدقة وتوصيف الكروماتين المفتوح عبر الجينوم. زنزانة 132, 311–322 (2008)

Ingolia، N. T.، Ghaemmaghami، S.، Newman، J.R & amp Weissman، J. S. Genome-wide analysis في الجسم الحي للترجمة بدقة النيوكليوتيدات باستخدام التنميط الريبوسوم. علم 324, 218–223 (2009)

Shendure ، J. & amp Lieberman Aiden ، E. النطاق الموسع لتسلسل الحمض النووي. نات. التكنولوجيا الحيوية. 30, 1084–1094 (2012)

اتحاد مشروع الميكروبيوم البشري. هيكل ووظيفة وتنوع الميكروبيوم البشري السليم. طبيعة سجية 486, 207–214 (2012)

تايسون ، جي دبليو وآخرون. بنية المجتمع والتمثيل الغذائي من خلال إعادة بناء الجينوم الميكروبي من البيئة. طبيعة سجية 428, 37–43 (2004)

فينتر ، جيه سي وآخرون. تسلسل الجينوم البيئي لبحر سارجاسو. علم 304, 66–74 (2004)

Blaser، M.، Bork، P.، Fraser، C.، Knight، R. & amp Wang، J. استكشف الميكروبيوم: الرؤى الأخيرة والتحديات المستقبلية. نات. القس ميكروبيول. 11, 213–217 (2013)

Shokralla، S.، Spall، J.L، Gibson، J.F & amp Hajibabaei، M. تقنيات تسلسل الجيل التالي لأبحاث الحمض النووي البيئي. مول. ايكول. 21, 1794–1805 (2012)

نوزاكي ، هـ وآخرون. يكشف التسلسل الكامل بنسبة 100٪ عن سمات جينومية بسيطة بشكل غير عادي في الطحالب الحمراء ذات الينابيع الساخنة سيانيديوشيزون ميرولاي. BMC بيول. 5, 28 (2007)

Ovchinnikov، S. et al. تحديد بنية البروتين باستخدام بيانات تسلسل الميتاجينوم علم 355, 294–298 (2017)

Gymrek، M.، McGuire، A. L.، Golan، D.، Halperin، E. & amp Erlich، Y. تحديد الجينومات الشخصية عن طريق استدلال اللقب. علم 339, 321–324 (2013)

لارسون ، سي وآخرون. فى الموقع التنميط الجيني لجزيئات الحمض النووي الفردية عن طريق تضخيم الدائرة الدائرية المستهدفة لتحقيقات القفل. نات. أساليب 1, 227–232 (2004)

لي ، جيه إتش وآخرون. تسلسل الحمض النووي الريبي تحت الخلوية شديد التعدد فى الموقع. علم 343, 1360–1363 (2014)

ماكينا ، إيه وآخرون. تتبع سلالة الكائن الحي بالكامل عن طريق تحرير الجينوم التوافقي والتراكمي. علم 353، aaf7907 (2016)

بيكون ، آي دي وآخرون. استخدام تسلسل الباركود عالي الإنتاجية لتعيين الشبكات العصبية بكفاءة. الدقة الأحماض النووية. 45، e115 (2017)

Shipman ، S.L ، Nivala ، J. ، Macklis ، J.D & amp Church ، G.M Molecular التسجيلات عن طريق الحصول على مباعد CRISPR الموجه. علم 353، aaf1175 (2016)

زامفت ، ب.م وآخرون. قياس المناظر الطبيعية التي تعتمد على الكاتيونات بوليميريز الحمض النووي عن طريق التسلسل العميق. بلوس واحد 7، e43876 (2012)

Organick ، ​​L. et al. زيادة تخزين بيانات الحمض النووي واسترجاع الوصول العشوائي. الطباعة المسبقة على https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/07/114553 (2017)

Harrington، L.، Alexander، L. T.، Knapp، S. & amp Bayley، H. Pim kinase inhibitors التي تم تقييمها باستخدام مستشعر نانوبوري أحادي الجزيء. انجيو. تشيم. كثافة العمليات إيدن إنجل. 54, 8154–8159 (2015)

Pulcu ، G. S. ، Mikhailova ، E. ، Choi ، L.S & amp Bayley ، H. المراقبة المستمرة للحركة العشوائية لجهاز المشي الفردي الجزيئي الصغير. نات. النانو. 10, 76–83 (2015)

Rodriguez-Larrea، D. & amp Bayley، H. البروتين المشترك يتكشف يعتمد على اتجاه السحب. نات. كومون. 5, 4841 (2014)

Hyman، E.D. طريقة جديدة لتسلسل الحمض النووي. شرجي. بيوتشيم. 174, 423–436 (1988)

لي ، إل جي وآخرون. تسلسل الحمض النووي باستخدام مواد إنهاء موصوفة بصبغة و T7 DNA polymerase: تأثير الأصباغ و dNTPs على دمج مواد إنهاء الصبغة وتحليل احتمالية شظايا الإنهاء. الدقة الأحماض النووية. 20, 2471–2483 (1992)

هوانغ ، إس وآخرون. تحديد القواعد الفردية في أوليغومر الحمض النووي باستخدام نفق الإلكترون. نات. النانو. 5, 868–873 (2010)

روثبرج ، جيه إم وآخرون. جهاز أشباه موصلات متكامل يتيح تسلسل الجينوم غير البصري. طبيعة سجية 475, 348–352 (2011)

مانراو ، إي إيه وآخرون. قراءة الحمض النووي بدقة النوكليوتيدات المفردة مع MspA متحولة nanopore و phi29 DNA polymerase. نات. التكنولوجيا الحيوية. 30, 349–353 (2012)

شيرف ، جي إم وآخرون. تصعيد آلي للأمام والعكس للحمض النووي في ثقب نانوي بدقة 5-Å. نات. التكنولوجيا الحيوية. 30, 344–348 (2012)

ماير ، إم وآخرون. تسلسل جينوم عالي التغطية من فرد دينيسوفان قديم. علم 338, 222–226 (2012)

أرابيدوبسيس مبادرة الجينوم. تحليل تسلسل الجينوم للنبات المزهر نبات الأرابيدوبسيس thaliana. طبيعة سجية 408, 796–815 (2000)

اتحاد تسلسل جينوم الماوس. التسلسل الأولي وتحليل مقارن للجينوم الفأر. طبيعة سجية 420, 520–562 (2002)

جيبس ، آر إيه وآخرون. تسلسل الجينوم لجرذ براون النرويجي يعطي نظرة ثاقبة لتطور الثدييات. طبيعة سجية 428, 493–521 (2004)

اتحاد التسلسل والتحليل الشمبانزي. التسلسل الأولي لجينوم الشمبانزي والمقارنة مع الجينوم البشري. طبيعة سجية 437, 69–87 (2005)

مشروع تسلسل جينوم الأرز الدولي. التسلسل المستند إلى الخريطة لجينوم الأرز. طبيعة سجية 436, 793–800 (2005)

Schnable ، P. S. et al. جينوم الذرة B73: التعقيد والتنوع والديناميكيات. علم 326, 1112–1115 (2009)

آدي ، إيه وآخرون. الجينوم الذي تم حله بواسطة النمط الفرداني والإبيجينوم لخط خلية سرطان هيلا مختل الصيغة الصبغية. طبيعة سجية 500, 207–211 (2013)

لاندري ، جيه جيه وآخرون. المشهد الجينومي والنسخي لخط خلية هيلا. G3 (بيثيسدا) 3, 1213–1224 (2013)

Howe ، K. et al. تسلسل الجينوم المرجعي لأسماك الزرد وعلاقته بالجينوم البشري. طبيعة سجية 496, 498–503 (2013)

الجلسة ، أ.م وآخرون. تطور الجينوم في الضفدع المتآصل Xenopus laevis. طبيعة سجية 538, 336–343 (2016)

Smith، T.F & amp Waterman، M. S. تحديد التكرارات الجزيئية الشائعة اللاحقة. جيه مول. بيول. 147, 195–197 (1981)

Burge، C. & amp Karlin، S. توقع الهياكل الجينية الكاملة في الحمض النووي الجيني البشري. جيه مول. بيول. 268, 78–94 (1997)

كينت ، دبليو جيه بلات — أداة المحاذاة المشابهة للانفجار. الدقة الجينوم. 12, 656–664 (2002)

كينت ، دبليو جيه وآخرون. متصفح الجينوم البشري في جامعة كاليفورنيا. الدقة الجينوم. 12, 996–1006 (2002)

هوبارد ، تي وآخرون. مشروع قاعدة بيانات الجينوم Ensembl. الدقة الأحماض النووية. 30, 38–41 (2002)

جياردين ، ب. وآخرون. جالاكسي: منصة لتحليل الجينوم التفاعلي واسع النطاق. الدقة الجينوم. 15, 1451–1455 (2005)

بتلر ، جيه وآخرون. ALLPATHS: من جديد تجميع الجينوم الكامل للبندقية. الدقة الجينوم. 18, 810–820 (2008)

تشين ، ك وآخرون. BreakDancer: خوارزمية لرسم خرائط عالية الدقة للتنوع الهيكلي الجيني. نات. أساليب 6, 677–681 (2009)

Ye، K.، Schulz، M.H، Long، Q.، Apweiler، R. & amp Ning، Z. Pindel: نهج نمو النمط لاكتشاف نقاط الفاصل لعمليات الحذف الكبيرة والإدخالات متوسطة الحجم من القراءات القصيرة ذات النهاية المزدوجة. المعلوماتية الحيوية 25, 2865–2871 (2009)

لي ، آر وآخرون. من جديد تجميع الجينوم البشري مع تسلسل قراءة قصير متوازي بشكل كبير. الدقة الجينوم. 20, 265–272 (2010)

روبنسون ، جي تي وآخرون. عارض الجينوم التكاملي. نات. التكنولوجيا الحيوية. 29, 24–26 (2011)

تشين ، سي إس وآخرون. مجموعات جينوم ميكروبية غير هجينة منتهية من بيانات تسلسل SMRT طويلة القراءة. نات. أساليب 10, 563–569 (2013)

وانج دي جي وآخرون. تحديد واسع النطاق ورسم خرائط وتنميط جيني لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في الجينوم البشري. علم 280, 1077–1082 (1998)

لي ، آر وآخرون. تسلسل و من جديد تجميع جينوم الباندا العملاق. طبيعة سجية 463, 311–317 (2010)

Kitzman ، J. O. et al. تسلسل الجينوم المفرد للنمط الفرداني للفرد الهندي الغوجاراتي. نات. التكنولوجيا الحيوية. 29, 59–63 (2011)

Fan ، H. C. ، Wang ، J. ، Potanina ، A. & amp Quake ، S.R. نات. التكنولوجيا الحيوية. 29, 51–57 (2011)

سيو ، ج. إس وآخرون. من جديد تجميع ومراحل الجينوم البشري الكوري. طبيعة سجية 538, 243–247 (2016). BLAST و GenBank (GenBank و WGS Statisticshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/statistics/) كانت أدوات أساسية لمشاركة بيانات التسلسل والبحث عنها ، مما أدى إلى تضخيم قيمة كل تسلسل في الحقل.


الجزء 4: فحص الأحماض النووية باستخدام محلل بيولوجي Agilent

00: 00: 07.05 مرحبًا.
00: 00: 07.23 اسمي إريك تشاو ،
00: 00: 09.14 وأدير مركز UCSF للتكنولوجيا المتقدمة.
00: 00: 11.26 اليوم ، سأقدم لكم فيديو تدريبي
00: 00: 13.24 حول كيفية تشغيل Agilent Bioanalyzer.
00: 00: 16.22 هذا هو النظام المستخدم في مراقبة الأحماض النووية
00: 00: 19.11 للذهاب إلى الجيل التالي من تجهيزات مكتبة التسلسل ،
00: 00: 22.05 وكذلك تحقق من جودة مكتباتك النهائية قبل التسلسل.
00: 00: 26.25 هذا هو جهاز التحليل البيولوجي.
00: 00: 28.26 ويعمل النظام بشكل أساسي عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري.
00: 00: 32.10 ولكن بدلاً من تمرير العينات عبر أنبوب شعري طويل ورفيع ،
00: 00: 35.03 يحدث الفصل كله على رقائق ميكروفلويديك ، هنا.
00: 00: 41.12 لذا ، سأفتح هذه الشريحة
00: 00: 43.25 ونوضح لك المزيد من التفاصيل حول هذه الشريحة.
00: 00: 46.03 الشريحة مصنوعة بالفعل من الزجاج ،
00: 00: 47.27 وهناك عدة آبار على الرقاقة.
00: 00: 50.26 وهذه الرقاقة الزجاجية مدمجة في إطار بلاستيكي.
00: 00: 53.26 وعلى ظهر هذه الشريحة ،
00: 00: 55.19 ستتمكن من مشاهدة مجموعة كاملة من القنوات المختلفة ،
00: 00: 58.00 وهذا هو المكان الذي سيتم فيه تشغيل جميع العينات المختلفة
00: 01: 00.10 ويتم فصلها ثم يتم اكتشافها.
00: 01: 03.11 هذه الشريحة ، بمجرد تحضيرها ،
00: 01: 05.29 ستدخل في أداة التحليل البيولوجي هذه.
00: 01: 10.08 وهذه الأداة لها موقع يمسك بها الشريحة ،
00: 01: 13.02 بالإضافة إلى كاشف ضوئي في الأسفل لكشف الأحماض النووية المارة ،
00: 01: 18.11 ومجموعة إلكترود في الأعلى.
00: 01: 20.09 ومجموعة الأقطاب الكهربائية هذه في الأعلى
00: 01: 22.29 هو سبب مرور العينات المختلفة عبر الشريحة
00: 01: 25.11 والهجرة نحو ذلك de. كاشف.
00: 01: 29.02 إذن ، لم نقم بأي شيء لتحضير الرقاقة بعد ،
00: 01: 32.12 وسنستعرض ذلك بعد ذلك.
00: 01: 34.04 لذلك ، مع كل المجموعات المختلفة للمحلل الحيوي ،
00: 01: 36.20 يمكنك تحليل كل من RNA و DNA.
00: 01: 38.24 أنها تأتي مع دليل مستخدم سهل الاستخدام
00: 01: 41.12 الذي سنتابعه اليوم بشكل أساسي.
00: 01: 43.19 وفي دليل المستخدم هذا ،
00: 01: 45.15 توجد أقسام يخبرك فيها بتحضير خليط صبغة هلامية.
00: 01: 49.22 هذا شيء عليك القيام به في وقت مبكر ،
00: 01: 52.06 ويستغرق حوالي 30 دقيقة ،
00: 01: 54.01 لذلك هذا شيء قمنا به من قبل.
00: 01: 56.14 قبل أن نلتقط هذا الفيديو.
00: 01: 58.05 لكن جميع الكواشف الخاصة بالمجموعات تأتي في صندوق صغير مثل هذا
00: 02: 01.18 المحفوظة في الغرفة الباردة ،
00: 02: 03.12 وجميعهم يأتون مع علبة من الرقائق
00: 02: 05.24 في درجة حرارة الغرفة.
00: 02: 07.11 وهكذا ، بمجرد فتح هذا الصندوق
00: 02: 10.01 - واليوم سنستعرض مجموعات الحمض النووي عالية الحساسية -
00: 02: 13.13 سترى مجموعة من الكواشف هنا.
00: 02: 16.12 والكواشف التي ستحتاجها لتحضير خليط الصبغة الهلامية مسبقًا
00: 02: 20.17 عبارة عن صبغة وهلام ومرشح دوران.
00: 02: 28.07 وما ستفعله مسبقًا هو أخذ كمية معينة من الصبغة ،
00: 02: 31.21 قم بإضافته إلى الجل ودوامة ،
00: 02: 34.01 وبعد ذلك ستضع خليط الصبغة الهلامية
00: 02: 37.19 في أنبوب إيبندورف الذي يحتوي على مرشح دوران هناك ،
00: 02: 39.16 وستقوم بالطرد المركزي لمدة 30 دقيقة تقريبًا.
00: 02: 41.22 سيؤدي ذلك إلى تكوين جل صبغة لتعليق لطيف ومتساوي.
00: 02: 45.16 وعندما تنتهي ، سوف تتخلص من الفلتر ،
00: 02: 48.07 واحتفظ بصبغة الجل في أنبوب إيبندورف عند 4 درجات.
00: 02: 52.06 وستتمكن من استخدام خليط الصبغة الهلامية عدة مرات ،
00: 02: 55.07 لعدة عمليات تشغيل عبر العديد من الرقائق.
00: 03: 03.19 إذن ، ما لدي هنا هو أنبوب من صبغة الهلام التي أعددناها بالفعل.
00: 03: 07.09 وهذا ما سنستخدمه اليوم.
00: 03: 09.06 لكن قبل أن نبدأ في تحضير الرقاقة ،
00: 03: 11.13 سأشرح لك
00: 03: 13.16 كيفية تشغيل البرنامج.
00: 03: 15.09 البرنامج الذي يقوم بتشغيل Bioanalyzer
00: 03: 18.00 هو برنامج 2100 Expert.
00: 03: 19.24 عند فتح البرنامج ،
00: 03: 21.25 سيتم توصيله تلقائيًا بأداة Bioanalyzer.
00: 03: 24.12 وعلى اليسار توجد مجموعة من علامات التبويب.
00: 03: 27.27 الرموز التي يمكنك استخدامها للتنقل إلى مناطق مختلفة من البرنامج.
00: 03: 30.14 لإعداد التشغيل ،
00: 03: 32.10 تريد التأكد من النقر فوق رمز الأداة.
00: 03: 34.26 وعلى أيقونة الآلة الموسيقية ،
00: 03: 37.13 مرة أخرى سترى صورة للمحلل الحيوي.
00: 03: 39.21 وأول شيء تريد القيام به هو تحديد الاختبار الذي تقوم بتشغيله.
00: 03: 42.06 مرة أخرى ، يمكن للمحلل الحيوي تحليل كل من DNA و RNA.
00: 03: 45.18 وإذا كنت تختار DNA ، فأنت تريد تحديد الشريحة المناسبة.
00: 03: 48.25 واليوم نقوم بتشغيل الشريحة عالية الحساسية.
00: 03: 51.26 بالنسبة لـ RNA ، هناك نوعان مختلفان من الأطقم.
00: 03: 54.24 توجد أطقم Nano و Pico هذه ،
00: 03: 58.01 بالإضافة إلى عدة RNA صغيرة إذا كنت تريد إجراء فحوصات RNA صغيرة.
00: 04: 02.21 ولكن ما هو مهم في أطقم Nano و Pico
00: 04: 04.29 إذا كنت تقوم بتحليل RNA وترغب في الحصول على رقم RIN
00: 04: 07.24 - هذا رقم تكامل RNA -
00: 04: 10.00 عليك التأكد من تحديد خيارات RNA الإجمالية.
00: 04: 12.25 وسيؤدي ذلك إلى احتساب البرنامج لرقم RIN.
00: 04: 16.01 إذا قمت بتحديد خيارات mRNA ،
00: 04: 18.13 لن تحصل على رقم RIN لـ RNA الخاص بك.
00: 04: 20.27 لذا ، مرة أخرى ، بما أننا نجري حساسية عالية للحمض النووي ،
00: 04: 23.02 سنذهب إلى الحمض النووي مزدوج الشريطة ونختار الحساسية العالية.
00: 04: 27.08 بعد ذلك ، لديك خيار لتحديد مكان حفظ بياناتك فيه.
00: 04: 30.26 يمكنه الحفظ في مجلد افتراضي أو مجلد مخصص تحدده.
00: 04: 35.25 بعد ذلك ، دع النظام يعرف عدد العينات التي ستقوم بتشغيلها.
00: 04: 38.06 على شريحة DNA عالية الحساسية ،
00: 04: 40.12 يمكنك تشغيل ما يصل إلى 11 عينة.
00: 04: 42.03 اليوم ، سنقوم بتشغيل عينتين فقط.
00: 04: 44.07 وفي الأسفل ، يمكنك إعطاء أسماء لعيناتك المختلفة ،
00: 04: 47.25 ويمكنك تسميتها هنا.
00: 04: 50.25 وهكذا ، سنستخدم النموذج "أ" والعينة "ب" فقط.
00: 04: 56.13 إذن ، سنقوم الآن بإعداد الآلة والرقائق لتشغيل عيناتك.
00: 05: 00.13 مرة أخرى ، هذا هو Bioanalyzer ،
00: 05: 02.23 وهذا الرأس ينفتح لأعلى ولأسفل للحصول على الأقطاب الكهربائية في شريحة.
00: 05: 06.24 إذا كنت بحاجة إلى إزالة القطب الكهربائي ، فما عليك سوى قلب علامة التبويب لأسفل
00: 05: 10.26 - إنها هنا على طول الطريق إلى الأسفل.
00: 05: 13.03 سيؤدي ذلك إلى دفع مجموعة الإلكترود قليلاً ،
00: 05: 15.15 وبمجرد خروجها يمكنك إرجاعها مرة أخرى.
00: 05: 17.16 وإذا كنت بحاجة إلى تخزين مجموعة الأقطاب الكهربائية هذه ،
00: 05: 19.11 قم بتخزينه رأسًا على عقب بحيث تكون هذه الأقطاب الكهربائية
00: 05: 21.26 لا تتضرر من الاصطدام بالأسطح.
00: 05: 25.27 لإعادة القطب الكهربائي إلى النظام ،
00: 05: 28.00 ببساطة حركه لأسفل مرة أخرى
00: 05: 30.15 واتركها تنزل من تلقاء نفسها.
00: 05: 32.10 لا تجبرها.
00: 05: 33.15 بمجرد هبوطه إلى أدنى موضع ،
00: 05: 35.19 ارفع الرافعة لأعلى ، وهذا سوف يسحب مجموعة الأقطاب الكهربائية للداخل.
00: 05: 38.14 الشيء التالي الذي سنفعله هو غسل النظام.
00: 05: 40.26 لغسل النظام ،
00: 05: 42.21 تريد استخدام 350 ميكرولتر من المياه الخالية من نوكلياز
00: 05: 45.18 وضعها في رقاقة غسيل.
00: 05: 54.05 يمكنك استخدام أي بئر من رقاقة الغسيل ،
00: 05: 56.06 لأن جميع الآبار متصلة بواسطة خزان.
00: 06: 03.11 للغسيل ، ما عليك سوى وضع رقاقة الغسيل على حامل الرقائق
00: 06: 06.14 وأغلق النظام ،
00: 06: 08.28 واتركه لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة.
00: 06: 11.16 كل ما يفعله هذا هو غسل الأملاح والأوساخ
00: 06: 14.11 التي قد تكون على سطح تلك الأقطاب الكهربائية.
00: 06: 16.12 بمجرد الانتهاء من الغسيل ،
00: 06: 18.09 المضي قدمًا وإزالة الشريحة ،
00: 06: 20.03 ويمكنك فقط تفريغ الماء في سلة المهملات ،
00: 06: 22.07 وحفظ الشريحة للتشغيلات المستقبلية.
00: 06: 29.09 الآن ، سنجهز شريحتنا.
00: 06: 31.03 لقد فتحت هذا بالفعل من العبوة البلاستيكية ،
00: 06: 34.05 وسنضع هذا في محطة التحضير.
00: 06: 38.17 تجلس الرقاقة هنا ولا تتحرك حقًا.
00: 06: 41.24 وفي محطة التحضير ،
00: 06: 43.15 من المهم ملاحظة أن هذا مكون.
00: 06: 45.24 مكبس ، ويوجد حامل لتثبيت المكبس في أوضاع مختلفة.
00: 06: 48.28 واعتمادًا على الشريحة والمقايسة التي تستخدمها ،
00: 06: 51.22 ستحتاج إلى التأكد من ضبط المكبس على الإعداد الصحيح.
00: 06: 55.12 إذن ، هناك إعداد علوي ومتوسط ​​وأسفل.
00: 06: 58.14 لرقائق الحمض النووي عالية الحساسية ،
00: 07: 00.02 سيتعين علينا استخدام هذا الإعداد المنخفض.
00: 07: 02.00 وهكذا ، ما عليك سوى تحريك المقبض الفضي لأسفل
00: 07: 05.02 حتى تصل إلى هذا الموقع السفلي.
00: 07: 07.18 وتأكد من أنها تعلق في التعليق.
00: 07: 11.12 إذن ، هذا الآن مضبوط على الموضع المنخفض ،
00: 07: 13.19 ونحن جاهزون لبدء إضافة الكواشف الخاصة بنا.
00: 07: 15.24 أول كاشف سنستخدمه هو خليط الصبغة الهلامية
00: 07: 18.24 الذي أعددناه مسبقًا.
00: 07: 20.10 تمت إضافة الصبغة إلى الجل
00: 07: 23.00 ونسجها من خلال مرشح بالفعل.
00: 07: 25.07 ما سنفعله أولاً هو إضافة 9 ميكرولتر من خليط صبغة الهلام
00: 07: 30.18 إلى موضع الجل الذي تم وضع علامة عليه بدائرة داكنة على الشريحة الخاصة بك.
00: 07: 34.15 وسيكون هذا هو الثاني من الأسفل.
00: 07: 39.05 عند إضافة الكواشف إلى هذه الرقائق ،
00: 07: 40.23 تريد التأكد من أنك تلمس الجزء السفلي من الشريحة.
00: 07: 43.12 لا داعي للقلق بشأن زواجهم ،
00: 07: 45.08 لأنها مصنوعة من الزجاج ،
00: 07: 46.26 لذا فهي أصعب بكثير من أطراف الماصة.
00: 07: 53.11 الشيء الآخر الذي تريد التأكد من أنك لا تفعله
00: 07: 56.01 يطرد فقاعة في أسفل الرقاقة ،
00: 07: 58.08 لأن هذا هو المكان الذي توجد فيه تلك الشعيرات الدموية والقنوات.
00: 08: 01.01 إذا كان لديك فقاعة هواء هناك ،
00: 08: 03.13 سيعطل تدفق التيار.
00: 08: 07.13 الخطوة التالية هي رفع المحقنة حتى علامة 1 مل
00: 08: 13.03 ثم أغلق الغطاء حتى تسمع صوت طقطقة.
00: 08: 17.29 بعد ذلك ، ادفع المكبس برفق وثبات حتى النهاية
00: 08: 21.27 حتى يمسك التعليق.
00: 08: 25.28 وتريد ضبط عداد الوقت لمدة دقيقة واحدة.
00: 08: 28.21 ما يحدث الآن هو الضغط في المحقنة
00: 08: 31.24 يجبر خليط الصبغة الهلامية هذا من خلال أنبوب شعري داخل الرقاقة ،
00: 08: 35.16 وهذا يشكل قناة الفصل تلك
00: 08: 38.23 أن كل العينات سوف تمر.
00: 08: 40.13 لذلك ، كل من الضغط والتوقيت مهمان للرقائق المختلفة ،
00: 08: 43.11 لذا تأكد من الرجوع إلى دليل المستخدم الخاص بك
00: 08: 45.15 إذا كنت تقوم بتشغيل شيء آخر إلى جانب شريحة DNA عالية الحساسية.
00: 08: 51.25 لذا ، أثناء تشغيل هذا
00: 08: 53.20 - لدينا حوالي 30 ثانية أخرى -
00: 08: 55.13 أحد الأشياء التي يمكنك استخدامها للتحقق من رقائقك بعد ذلك هو
00: 08: 59.12 تريد التأكد من عدم رؤية أي من القنوات بعد الضغط ،
00: 09: 02.12 لأنهم الآن قد امتلأوا جميعًا بالسوائل.
00: 09: 04.23 قبل أن نقوم بهذه الخطوة ، إذا ألقيت نظرة على شريحتك ،
00: 09: 07.18 على الظهر ،
00: 09: 09.14 يمكنك بالفعل رؤية جميع القنوات إذا رفعتها أمام الضوء
00: 09: 11.14 بسبب الواجهات بين الزجاج والهواء الموجودة.
00: 09: 14.03 ولكن بعد التحضير ، يجب ألا ترى هؤلاء بعد الآن ،
00: 09: 17.15 لأنها يجب أن تكون مملوءة بالسوائل.
00: 09: 22.01 انتهت دقيقة وسنطلق الكباس.
00: 09: 26.04 ما تريد رؤيته هو المكبس
00: 09: 29.07 تجاوز علامة نصف ميل في غضون ثانيتين ،
00: 09: 32.16 وهذا يشير إلى عدم تسرب أي ضغط خارج النظام.
00: 09: 35.21 وهكذا ، يمكنك الآن إعادة المكبس ببطء إلى علامة 1 مل ،
00: 09: 44.07 ثم حرر المكبس من الشريحة.
00: 09: 48.21 بعد ذلك ، سنضيف 9 ميكرولتر أخرى من خليط صبغة الهلام
00: 09: 51.05 لمواضع الجل الثلاثة الأخرى على الرقاقة.
00: 09: 54.03 هذه هي الآبار الثلاثة الأخرى على الجانب الأيمن من الشريحة.
00: 09: 59.22 يمكنك استخدام نفس طرف الماصة لكل هذه ،
00: 10: 01.20 ومرة ​​أخرى ، فقط تذكر عدم طرد أي فقاعات هواء
00: 10: 04.26 باتجاه الجزء السفلي من. قاع الآبار.
00: 10: 21.22 بعد ذلك ، سنضيف 5 ميكرولتر من محلول المحدد
00: 10: 25.25 لكل من آبار العينة وآبار السلم.
00: 10: 30.07 هذه هي الآبار الـ 12 الموجودة على يسار الشريحة.
00: 10: 33.26 لذلك ، نحن لا نضيف هذه الآبار إلى آبار الهلام التي أضفنا إليها المواد بالفعل.
00: 10: 38.17 ويمكنك استخدام نفس الماصة لجميع هذه أيضًا.
00: 10: 42.26 وهذا يحتوي فقط على علامة علوية وسفلية
00: 10: 45.09 يمكن استخدامها كمعايير مرجعية
00: 10: 47.10 لمقارنة عينتك بالسلم.
00: 10: 56.11 لذلك ، حتى لو كنت تقوم بتشغيل عينة واحدة أو عينتين فقط ،
00: 10: 59.15 أو لا 11 عينة كاملة ،
00: 11: 01.07 لا يزال يتعين عليك إضافة علامة إلى جميع الممرات ،
00: 11: 03.17 أو لكل الآبار.
00: 11: 18.29 في الخطوة التالية ، سنضيف ميكروليترًا واحدًا للسلم
00: 11: 22.08 إلى بئر السلم ، وهذا موضح على الرقاقة.
00: 11: 41.11 الآن يمكننا إضافة عيناتك.
00: 11: 43.00 ومرة ​​أخرى ، هناك إشارات إلى رقم البئر
00: 11: 46.18 التي تتوافق مع أرقام العينات على الشريحة.
00: 12: 12.03 لدي عينتان فقط ، لذلك انتهيت الآن ،
00: 12: 14.28 ولكن يمكنك متابعة ما يصل إلى 11 عينة على هذه الشريحة.
00: 12: 18.14 الخطوة التالية هي خلط محتويات ملف.
00: 12: 21.10 للعلامة والعينات مع السلم في الشريحة ،
00: 12: 24.21 وللقيام بذلك نستخدم دوامة خاصة تأتي مع كل محلل حيوي.
00: 12: 29.01 لذا ، فقط تأكد من ضبطه على نقطة الضبط المناسبة ،
00: 12: 31.23 ثم اتركه يمتزج.
00: 12: 34.01 وتأكد من ضبط عداد الوقت بحيث يكون لديك.
00: 12: 38.16 حتى تعرف متى تتوقف.
00: 12: 39.29 ومرة ​​أخرى ، للحصول على الوقت للمقايسات المختلفة ،
00: 12: 41.26 فقط استشر دليل المستخدم الخاص بك.
00: 12: 46.01 حسنًا ، لأعلى.
00: 12: 48.26 الآن الشريحة جاهزة وجاهزة للتشغيل.
00: 12: 50.29 ما نريد فعله هو المضي قدمًا ووضع هذا في نظام Bioanalyzer ،
00: 12: 54.28 أغلق الغطاء ،
00: 12: 57.28 وبعد ذلك بمجرد أن يكتشف النظام الشريحة
00: 13: 01.10 ستتمكن من النقر فوق زر البدء لبدء التشغيل.
00: 13: 04.04 عادةً ما يستغرق تشغيل شريحة كاملة حوالي 45 دقيقة.
00: 13: 07.21 وهي فكرة جيدة أن تستمر في العمل لبضع دقائق ،
00: 13: 10.06 حتى ترى السلم يجري ،
00: 13: 12.13 فقط للتأكد من أن الجري قد بدأ جيدًا قبل الإقلاع.
00: 13: 16.16 الآن ، العينة الثانية والأخيرة قيد التشغيل.
00: 13: 18.20 ما تراه هنا هو أثر أولي لـ Bioanalyzer ،
00: 13: 21.06 وهذا هو تحليل التألق الذي يتم اكتشافه
00: 13: 24.03 حيث تمر العينة عبر الشعيرات الدموية.
00: 13: 26.29 في النهاية المنخفضة لدينا العلامة السفلية ،
00: 13: 29.29 وهنا لدينا العلامة العلوية.
00: 13: 32.13 تُستخدم كمراجع داخلية لمقارنة العينة بالسلم الذي تم تشغيله أولاً.
00: 13: 37.29 وفي المنتصف هنا مكتبتنا.
00: 13: 39.22 هذه عينة عالية التركيز
00: 13: 41.26 أي تقريبًا حوالي 25 نانومولار.
00: 13: 44.12 ولذا ، هذا هو سبب كون هذه اللطاخة كبيرة جدًا.
00: 13: 47.28 ستلاحظ أن قمم العلامة حادة جدًا ،
00: 13: 50.14 لأنها حجم محدد ،
00: 13: 52.26 وتميل المكتبات إلى الانتشار لهم ،
00: 13: 54.16 لأنها تأتي بأحجام مختلفة.
00: 13: 57.18 إنهما ليسا طول زوج أساسي واحد.
00: 14: 00.23 وهكذا ، انتهى السباق الآن ،
00: 14: 03.24 وسأوضح لك كيفية تحليل البيانات وتصديرها.
00: 14: 06.29 والآن بعد أن اختفت هذه الشاشة ،
00: 14: 09.04 انتهى التشغيل.
00: 14: 10.22 للوصول إلى بياناتنا ، نعود إلى الجانب الأيسر
00:14: 13.15 وانقر على أيقونة البيانات.
00: 14: 16.26 إذا كان لديك عدة جولات من البداية ،
00: 14: 18.25 سترى الرقائق الأخرى هنا.
00: 14: 20.24 الأحدث سيكون في الأسفل ،
00:14: 22.15 وهي عينتنا.
00: 14: 24.07 وإذا نقرنا على تلك الشريحة ،
00: 14: 26.19 سنحصل على بعض التفاصيل حول الشريحة ،
00: 14: 29.28 خصائص الفحص ، وبعد ذلك ،
00: 14: 31.22 إذا كنت تريد إلقاء نظرة على الآثار الأولية ،
00: 14: 33.09 تنقر على المخطط الكهربائي.
00: 14: 35.19 وهذا سيُظهر لك أثر. إما في عينة واحدة في كل مرة
00: 14: 39.16 - إذن ، هذه هي عينتنا الأولى ، وكانت هذه هي عينتنا الثانية -
00: 14: 44.26 أو يمكنك إلقاء نظرة على جميع العينات مرة واحدة.
00: 14: 47.13 وإليك العينة A والعينة B ، وهنا يوجد السلم.
00: 14: 51.22 وهكذا ، إذا نقرنا على السلم ، فسيكون لديه سلسلة من القمم
00: 14: 57.12 الموجودة في عينة السلم تلك ،
00: 14: 59.09 والسلم يحتوي أيضًا على العلامة التي أضفناها ،
00: 15: 01.27 5 ميكرولتر من الكواشف ،
00: 15: 04.02 وهذه هي 35 زوجًا أساسيًا وشظايا زوج أساسي 10 كيلو بايت تقريبًا
00: 15: 08.07 الموجودة في جميع العينات.
00: 15: 10.28 وهكذا ، يتم استخدام السلم كمرجع ، لأننا نعرف الأحجام ،
00: 15: 15.11 ونربطها بالوقت الذي تستغرقه هذه العينات
00: 15: 17.18 ليخرج من خلال الرقاقة ،
00: 15: 19.17 ولدينا هذه المراجع الداخلية
00: 15: 21.19 التي سنستخدمها لمقارنة كل عينة.
00: 15: 24.06 الآن ، إذا نقرت على العينة أ ، فستحتوي أيضًا على علامات 35 و 10 كيلوبايت
00: 15: 27.22 تُستخدم لإنشاء تحجيم هذه العينات.
00: 15: 33.25 لذلك ، هنا في الأسفل على المخطط الكهربائي
00: 15: 36.19 هناك شيئين يمكنك القيام بهما.
00: 15: 38.00 يمكنك تعيين شيء يسمى جدول المنطقة ،
00: 15: 39.21 ومكتبات التسلسل من الجيل التالي
00: 15: 41.27 تقوم عادةً بتعيين هذه حوالي 200 زوج أساسي
00: 15: 44.00 حتى 1 كيلوبايت.
00: 15: 45.21 وهذا معروض هنا.
00: 15: 47.10 وما سيفعله هذا هو أنه سيحلل فقط المادة التي تظهر ضمن هذا النطاق.
00: 15: 50.27 وهذا سوف يعطيك تركيزًا تقريبيًا ، في بيكومولات.
00: 15: 53.24 إذن ، هذا تركيز يزيد قليلاً عن 4000 بيكومولار ،
00: 15: 57.22 أو ما يقرب من 4 نانومولار.
00: 16: 01.02 ستمنحك أيضًا متوسط ​​الحجم ،
00: 16: 03.06 وهو مفيد لبعض خطوات ضبط الجودة النهائية.
00: 16: 05.06 وهكذا ، يبلغ متوسط ​​حجم هذه المكتبة 320 زوجًا أساسيًا.
00: 16: 08.29 عينة أخرى عالية التركيز ، مرة أخرى ،
00: 16: 13.02 يتم تحليلها أيضًا في منطقة اللطاخة هذه.
00: 16: 15.22 وما يمكنك رؤيته هو أن هذه مكتبة ذات تركيز أعلى بكثير.
00: 16: 19.17 هذا يقيسه عند 17 نانومولار تقريبًا ،
00:16: 23.17 ومتوسط ​​الحجم 491 زوجًا أساسيًا.
00: 16: 29.05 في بعض الأحيان لا يكتشف Bioanalyzer قمم العلامة الخاصة بك بشكل صحيح ،
00: 16: 32.18 وسترى علامة حمراء أو علامة حمراء هنا
00: 16: 35.18 في صورة الهلام المحاكاة.
00: 16: 37.10 هذا شيء يسهل تصحيحه
00: 16: 39.19 بالذهاب إلى علامة تبويب جدول الذروة ، هنا.
00: 16: 42.26 لذلك ، على سبيل المثال ، في هذه العينة B ،
00: 16: 45.24 لدينا هذه الذروة الثانوية التي ظهرت.
00: 16: 48.03 في بعض الأحيان قد يتم التعرف على هذه القمة الصغيرة بشكل خاطئ كعلامة.
00: 16: 52.00 وعلى طاولة الذروة هذه ،
00: 16: 54.10 ما يمكنك فعله هو إبراز هذه القمم ،
00: 16: 57.11 وبمجرد أن ترى نقطة الهدف تظهر ،
00: 16: 59.12 يمكنك النقر بزر الماوس الأيمن وتعيينها يدويًا كعلامة سفلية أو علوية.
00: 17: 03.20 وهكذا ، على سبيل المثال ،
00: 17: 05.28 إذا كنت أرغب في تسمية هذا الزوج الأساسي البالغ 29 ذروة
00: 17: 08.08 معياري 35 زوجًا أساسيًا ، أو مرجعًا داخليًا ،
00: 17: 12.11 يمكنني النقر بزر الماوس الأيمن فوقه وتعيين العلامة السفلية يدويًا.
00: 17: 15.02 وهذا سيعيد حساب حجم كل شيء.
00: 17: 17.27 لذا ، الآن يمكنك أن ترى أن البرنامج قد أطلق على هذا الآن ذروة 35 زوجًا أساسيًا ،
00: 17: 22.03 وتطلق على هذه العلامة ذروة 46 زوج أساسي.
00: 17: 25.13 إذن ، هذا ليس ما أريده حقًا ، لذلك سأستمر في تغييره مرة أخرى.
00: 17: 29.25 وتحوم فوق محدّدتي السفلية الفعلية ،
00: 17: 32.02 انظر نقطة الهدف ، انقر بزر الماوس الأيمن ، وقم بتعيين العلامة السفلية.
00: 17: 38.05 لذلك ، بمجرد أن تبدو بياناتك وكأنها قد تم إعدادها بالكامل.
00: 17: 42.20 تم استدعاء جميع القمم بشكل صحيح ،
00: 17: 44.22 يمكنك تصدير هذا كملف PDF
00: 17: 47.13 بالنقر فوق زر الطابعة على شريط الأدوات.
00: 17: 52.04 وهكذا ، سيسألك أحيانًا عما إذا كنت تريد حفظ أي تغييرات.
00: 17: 54.14 وهكذا ، قلت ، نعم ، أريد حفظ تغييرات الذروة التي قمت بها.
00: 17: 58.19 ستظهر نافذة ،
00: 18: 01.09 وسيمنحك خيارات لنوع العناصر التي تريد تحديدها.
00: 18: 03.15 نترك هذا كإعداد افتراضي.
00: 18: 05.20 يمكنك إخبارها بطباعة جميع الآبار
00: 18: 07.28 أو فقط الآبار التي لديك عينات.
00: 18: 09.20 وبالنسبة لنا ، لديك عينتان فقط.
00: 18: 12.06 وبعد ذلك لديك خيارات لتصدير هذا كملف PDF أو HTML. ملف HTML ،
00: 18: 17.10 ولتحديد الدليل الذي تريد تصدير هذا إليه.
00: 18: 19.23 لذا ، سأحفظه على سطح المكتب
00: 18: 21.29 لتسهيل العثور عليه.
00: 18: 23.13 ولديك خيارات لوضع أربع أوراق في كل صفحة أو ورقة واحدة في كل صفحة.
00: 18: 27.05 لذا ، سأستمر وأحفظ هذا.
00: 18: 34.00 وإذا انتقلنا إلى سطح المكتب ،
00: 18: 36.09 يجب أن نكون قادرين على رؤية ملف PDF الخاص بنا ،
00: 18: 40.27 وهذا يجب أن يكون هنا.
00: 18: 43.27 لذلك ، إذا نقرت نقرًا مزدوجًا فوق هذا ،
00: 18: 45.19 سترى تقريرًا موجزًا ​​في الصفحة الأولى.
00: 18: 47.18 وأثناء التمرير لأسفل ،
00: 18: 49.17 سترى السلم هنا ،
00: 18: 53.05 وتريد أن ترى شرائط أو قممًا لطيفة وضيقة وحادة على السلم.
00: 18: 57.01 وبعد ذلك سترى العينات.
00: 19: 00.04 وستتضمن هذه بعض المعلومات الإضافية بالأسفل.
00: 19: 05.05 وهكذا ، سيرغب معظم الناس في حفظ ملف PDF ،
00: 19: 07.10 لأن هذا هو الملف الذي يمكنهم فتحه على أجهزة الكمبيوتر الخاصة بهم.
00: 19: 10.00 لا يمكنك فتح ملفات خام Bioanalyzer الفعلية ،
00: 19: 12.19 ملفات XAD هذه ، لأنها تتطلب برامج احتكارية ،
00: 19: 15.27 لذلك أنت بالتأكيد تريد تصدير ملف PDF هذا وحفظه.
00: 19: 18.17 وعمومًا فإن ملف PDF هذا هو ما ترسله إلى مرفق التسلسل الخاص بك ،
00: 19: 22.11 إذا كنت تحصل على عينة متسلسلة.
00: 19: 26.19 إذن ، الآن بعد اكتمال التشغيل ،
00: 19: 28.27 آخر شيء يتعين علينا القيام به هو غسل النظام.
00: 19: 31.10 لذا ، فإن أول شيء تريد القيام به هو سحب الشريحة القديمة ،
00: 19: 33.11 ضعه جانبًا - يمكنك التخلص منه ، فهو غير صالح للاستخدام الآن -
00: 19: 40.06 ثم خذ شريحة غسيل أخرى واملأها مرة أخرى بـ 350 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز.
00: 19: 48.28 ثم ضع شريحة في النظام
00: 19: 50.21 وأغلق الغطاء ، واتركه لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة.
00: 19: 53.06 ومن المهم حقًا أن تفعل ذلك بعد ذلك ،
00: 19: 55.11 لأننا نريد تنظيف الأقطاب الكهربائية من أي هلام وأملاح
00: 19: 58.06 التي ستوضع على الأقطاب الكهربائية من تشغيل الشريحة.
00: 20: 01.03 ليس من الجيد ترك شريحة هناك لفترة طويلة ،
00: 20: 03.05 لأن هذه الأشياء يمكن أن تجف على تلك الأقطاب الكهربائية
00: 20: 05.06 ويسبب مشاكل للمستخدم التالي.
00: 20: 08.11 النقطة الأخرى هي أنه من المهم حقًا إزالة رقاقة الغسيل.
00: 20: 11.08 إذا تركتها هناك ،
00: 20: 13.04 سيبدأ الماء في التبخر
00: 20: 16.03 ويسبب تكاثفًا داخل مجموعة الإلكترود ،
00: 20: 17.24 لذلك هناك الكثير من الأجهزة الإلكترونية أعلاه
00: 20: 20.15 أننا لا نريد الحصول على الرطوبة.
00: 20: 23.12 إذن ، بعد أن انتهت 30 ثانية ،
00: 20: 25.11 نزيل شريحة الغسيل ،
00: 20: 26.25 يمكننا التخلص من الماء ،
00: 20: 29.14 ضعه جانبًا ، ثم أغلق النظام فقط ، وتكون قد انتهيت.
00: 20: 32.14 شكرًا على المشاهدة.

  • الجزء 1: تسلسل الجيل التالي

فريدريك سانجر ، OM

فريدريك سانجر ، عالم الكيمياء الحيوية ، الذي توفي عن عمر يناهز 95 عامًا ، كان البريطاني الوحيد - وواحدًا من أربعة أشخاص فقط في التاريخ - فاز بجائزة نوبل مرتين.

كشف عمله عن الأسرار الكيميائية التي تكمن وراء الجينات - اللبنات الأساسية للحياة - ووضع الأساس للهندسة الوراثية ومشروع الجينوم البشري ، وهو جهد فريد لتوضيح التركيب الكيميائي لكل جين في جسم الإنسان.

حصل سانجر على أول جائزة نوبل له في عام 1958 عن العمل الذي قام به مع زملائه في أوائل الخمسينيات من القرن الماضي. يكدح في مختبر صغير يشبه الكوخ مدفون في قسم التكنولوجيا الحيوية بجامعة كامبريدج ، استنتج سانجر تسلسل الأحماض الأمينية (لبنات البناء الكيميائية) في هرمون الأنسولين ، وهو أول تسلسل بروتين كامل يتم تحديده على الإطلاق.

مقدمة لتسلسل البروتين

حصل على جائزة نوبل الثانية عام 1980 ، عن الأعمال ذات الصلة التي تم إجراؤها في مختبر البيولوجيا الجزيئية في كامبريدج ، حيث طور طريقة بارعة لاكتشاف "القواعد" الكيميائية الأساسية للحمض النووي التي مكنت العلماء من "قراءة" المادة الكيميائية. التسلسل - السلاسل الطويلة لجزيئات الحمض النووي - التي تشكل جيناتنا. التقنية التي طورها ، والمعروفة باسم تسلسل "سانجر" ، لا تزال مستخدمة بعد عقود.

تتضمن طريقة تسلسل الحمض النووي التي ابتكرها سانجر ، مع آلان كولسون ، تصنيع نسخة طبق الأصل من الجين قيد الدراسة.تتمثل الخطوة التالية في إضافة "مادة كيميائية قاتلة" ذات لون خاص تنهي التكاثر بمجرد اصطدامها بوصلة كيميائية معينة ، أو نوكليوتيد ، في الجين (تحتوي سلاسل الحمض النووي على أربعة أنواع من الروابط الكيميائية ، ويحدد ترتيب هذه الجينات فعل).

يتم تكرار العملية باستخدام مواد كيميائية قاتلة مختلفة والتي توقف النسخ المتماثل في مجموعات مختلفة من الروابط. يعطي هذا مزيجًا من شظايا الحمض النووي بأطوال مختلفة ، كل منها ينتهي بواحد من أربعة جزيئات صبغية فلورية مختلفة تتوافق مع النيوكليوتيدات الأربعة للحمض النووي. يتم بعد ذلك دفع الشظايا بواسطة مجال كهربائي عبر لوح من الهلام أو أنابيب شعرية رقيقة الشعر مملوءة بالبوليمر. هذا يفرزهم حسب الطول. يتم مسح ترتيب الألوان التي تظهر - المقابلة لتسلسل النيوكليوتيدات في القطعة الأصلية من الحمض النووي - بواسطة الليزر وعرضها على شاشة الكمبيوتر.

فيديو ممتاز وبسيط يشرح رسم خرائط الحمض النووي بواسطة "تسلسل سانجر"

أتاحت هذه الطريقة إمكانية تسلسل عدة مئات من قواعد الحمض النووي في يوم واحد ، وهي عملية استغرقت سابقًا عدة سنوات. لقد مكن سانجر وزملائه من رسم خريطة لتسلسل روابط الهياكل البسيطة مثل البروتينات والفيروسات ، مما أدى إلى فهم علمي أكبر بكثير للأساس الكيميائي للعيوب الجينية والعمليات التي تؤدي إلى المرض - وهو العمل الذي أدى إلى انفجار في تطوير الأدوية واللقاحات.

ولد فريدريك سانجر في 13 أغسطس 1918 لعائلة كويكر في قرية رندكومب في جلوسيسترشاير ، حيث كان والده الطبيب المحلي. تحت تأثير والده وتأثير شقيقه الأكبر ثيودور ، أصبح فريد مهتمًا بالبيولوجيا ووضع قلبه على متابعة والده في الطب.

من بريانستون حصل على مكان في كلية سانت جون بكامبريدج ، ولكن حتى قبل الذهاب إلى الجامعة قرر أنه سيكون الأنسب للعمل في مجال العلوم - وإن كان يأمل أن يكون لها تطبيقات إكلينيكية. في كامبريدج ، أصبح مهتمًا بمجال الكيمياء الحيوية الناشئ ، مقتنعًا أنه يوفر طريقة لتطوير أساس أكثر علمية لفهم العديد من المشكلات الطبية. لكنه لم يكن طالبًا واعدًا بشكل خاص ، واستغرق الأمر ثلاث سنوات لإكمال الجزء الأول من شهادته بينما كان يستغرق عامين فقط.

كان سانجر معترضًا على الخدمة العسكرية بدافع الضمير ، وبعد حصوله على شهادته في عام 1939 بقي في الجامعة لمدة عام آخر بعد اندلاع الحرب لأخذ دورة متقدمة في الكيمياء الحيوية ، فاجأ الجميع بالحصول على الدرجة الأولى. من عام 1940 إلى عام 1943 ، عمل مع ألبرت نويبرجر في عملية التمثيل الغذائي للحمض الأميني ليسين ، وفي الوقت نفسه شارك في مشروع بحثي ترعاه الحكومة يبحث في محتوى البروتين في البطاطس.

عندما تم تعيين AC Chibnall أستاذًا للكيمياء الحيوية في عام 1943 ، انضم سانجر إلى مجموعته البحثية التي تعمل على البروتينات. كان هذا وقتًا مثيرًا بشكل خاص في كيمياء البروتين: تم تطوير تقنيات كروماتوغرافيا جديدة بواسطة آرتشر مارتن وريتشارد سينج وشيبنال وسانجر اعتقدوا أنه قد تكون هناك إمكانية حقيقية لتحديد التركيب الكيميائي الدقيق للبروتينات.

كانت هذه الفكرة مثيرة للجدل في ذلك الوقت ، على الرغم من أن الأحماض الأمينية العشرين أو نحو ذلك التي يمكن أن تشكل البروتينات كانت معروفة ، اعتقد معظم العلماء أن ترتيب الأحماض الأمينية المختلفة في البروتين عشوائي. حتى أن أحد الأساتذة أنتج معادلة رياضية معقدة من شأنها أن تعبر عن هذه الوظيفة العشوائية. وهكذا ، عندما حاول شيبنال الحصول على منحة سانجر من مجلس البحوث الطبية للعمل على بنية البروتين ، تم رفض المنحة لأن "الجميع يعرف" أن نمط الأحماض الأمينية في البروتين كان عشوائيًا.

ومع ذلك ، جمع سانجر ما يكفي من المال من مصادر مختلفة لبدء العمل. من عام 1944 إلى عام 1951 حصل على زمالة بيت التذكارية للأبحاث الطبية وفي عام 1951 ، وهو الوقت الذي جاء فيه مجلس البحوث الطبية لإدراك أهمية عمله ، أصبح عضوًا في فريق MRC الخارجي.

كان البروتين الذي اختاره سانجر لأبحاثه هو الأنسولين ، بالإضافة إلى كونه صغير الحجم نسبيًا ومتوفر بكميات كبيرة ، كان له آثار سريرية قوية في فهم الأمراض مثل مرض السكري. طور طريقة لتمييز نهاية الحمض الأميني وفصله عن الأنسولين. ثم تم تحديد نهاية الحمض الأميني وتكررت العملية. بهذه الطريقة المضنية ، أظهر سانجر أن جزيء الأنسولين يحتوي على سلسلتين من الببتيد مكونين من اثنين أو أكثر من الأحماض الأمينية المرتبطة ببعضها البعض عن طريق روابط ثنائية الكبريتيد. استغرق الأمر ثماني سنوات أخرى لتحديد 51 من الأحماض الأمينية التي تتكون منها الأنسولين.

كان لجائزة نوبل في عام 1958 تأثير مهم ومحفز على حياة سانجر المهنية اللاحقة ، مما مكنه من الحصول على مرافق بحثية أفضل وجذب ألمع العلماء الشباب للعمل معه. في عام 1962 - مع وحدة ماكس بيروتز من مختبر كافنديش ، والتي تضمنت فرانسيس كريك وجون كيندرو وآرون كلوج - انتقل سانجر إلى مختبر البيولوجيا الجزيئية الذي تم تشييده حديثًا في مركز البحوث الطبية في كامبريدج.

محاطًا بالباحثين المهتمين بالحمض النووي والجينات ، صُدم سانجر بالتحدي المتمثل في تحديد ترتيب القواعد في الحمض النووي - المعروف باسم تسلسل الحمض النووي. بحلول هذا الوقت كان واضحًا أن الحمض النووي كان رمزًا خطيًا ، وعلى الرغم من أنه تم تفكيك الشفرة ، لم تكن هناك طرق لقراءة الشفرة حتى في أبسط الجينوم. لكن بالنسبة لسانجر ، كانت المشكلة مجرد امتداد طبيعي لعمله في تسلسل البروتين.

على مدار الخمسة عشر عامًا التالية ، طور هو وفريقه عدة طرق لتسلسل الأحماض النووية (DNA و RNA) ، وفي النهاية طوروا الطريقة التي فاز بها بجائزة نوبل الثانية. إن طريقة سانجر قادرة على "قراءة" الجينوم بمقدار 3،000،000،000 زوج من القواعد طويلة - 500 قاعدة في المرة الواحدة.

تقاسم سانجر جائزة نوبل الثانية له مع والتر جيلبرت ، الذي أجرى بحثًا مستقلًا في تحديد تسلسل القواعد في الأحماض النووية ، وبول بيرج ، لعمله على الحمض النووي المؤتلف.

كان رجل مهذب وجاد التفكير ذو آراء اشتراكية قوية ، شخصية سانجر النحيلة التي ترتدي نظارة طبية ، والتي عادة ما ترتدي سترة أكاديمية غير رسمية برقبة على شكل حرف V وقميص برقبة مفتوحة وحذاء بنعل مطاطي ، كان مشهدًا مألوفًا في كامبريدج لسنوات عديدة.

على الرغم من أنه كان واحدًا من أربعة أشخاص فقط فازوا بجائزتي نوبل (الآخرون هم ماري كوري وجون باردين ولينوس بولينج) ، إلا أنه ظل متواضعًا بشأن إنجازاته ، واضعًا إياها في العمل الجاد وروح الفريق بدلاً من العبقرية.

كانت جدران منزله المفروش ببساطة في Swaffham Bulbeck ، وهي قرية بالقرب من مدينة كامبريدج ، خالية من اللوحات أو الشهادات أو الاستشهادات: "تحصل على ميدالية ذهبية رائعة ، موجودة في البنك" ، أوضح. "وتحصل على شهادة ، وهي في الدور العلوي. يمكن أن أضعه على الحائط ، على ما أعتقد. كنت محظوظًا وسعيدًا للحصول عليه ، لكنني أكثر فخرًا بالبحث الذي أجريته. هناك بعض الأشخاص ، كما تعلم ، يعملون في مجال العلوم فقط للحصول على جوائز. لكن هذا ليس ما يحفزني ".

بعد تقاعده عام 1985 ، كرس سانجر معظم وقته للعمل في حديقته. في عام 1992 ، أنشأ صندوق ويلكوم ترست ومجلس البحوث الطبية مركز سانجر لتعزيز معرفة الجينوم. يقع على بعد 10 أميال خارج كامبريدج ، وأصبح أحد مراكز التسلسل الرئيسية لمشروع تسلسل الجينوم البشري.

دليل مشروع الجينوم البشري

من بين العديد من الأوسمة والجوائز ، حصل سانجر على ميدالية كورداي مورغان وجائزة الجمعية الكيميائية في عام 1951 والميدالية الملكية للجمعية الملكية في عام 1969 وميدالية كوبلي من الجمعية الملكية في عام 1977 وجائزة ألبرت لاسكر للبحوث الطبية الأساسية في عام 1979. وفاز الميدالية الذهبية للجمعية الملكية للطب عام 1983.

في عام 1954 أصبح زميلًا في الجمعية الملكية وزميلًا في كلية كينجز في كامبريدج. كان عضوًا فخريًا في العديد من الأكاديميات العلمية الأجنبية ، بما في ذلك الأكاديمية الأمريكية للفنون والعلوم.

تم تعيين سانجر بالبنك المركزي في عام 1963 وحصل على رفيق الشرف في عام 1981 - لكنه رفض وسام الفروسية ، ولم يرغب في أن يُدعى "سيدي": "الفروسية تجعلك مختلفًا ، أليس كذلك ، وأنا لا أريد كن مختلفا." ومع ذلك ، فقد قبل وسام الاستحقاق الأكثر تميزًا في عام 1986.

تزوج فريدريك سانجر عام 1940 مارجريت جوان هاو. لم تكن عالمة ، لكنه وصفها بأنها ساهمت في عمله أكثر من أي شخص آخر من خلال توفير منزل هادئ وسعيد. كان لديهم ولدان وبنت.


محتويات

استغرق تسلسل Nanopore 25 عامًا حتى يتحقق بالكامل. أنها تنطوي على تعاون وثيق بين الأوساط الأكاديمية والصناعة. كان البروفيسور ديفيد ديمر من أوائل الأشخاص الذين طرحوا فكرة التسلسل النانوي. في عام 1989 رسم مخططًا لقيادة خيط واحد من الحمض النووي من خلال ثقب بروتين نانوي مدمج في غشاء رقيق كجزء من عمله لتخليق الحمض النووي الريبي من الصفر. وإدراكًا منهم أن نفس النهج قد يحمل إمكانية تحسين تسلسل الحمض النووي ، أمضى Deamer وفريقه العقد التالي في اختباره. في عام 1999 ، نشر ديمر وزملاؤه أول ورقة بحثية باستخدام مصطلح "تسلسل الثقوب النانوية" وبعد ذلك بعامين أنتجوا صورة تلتقط دبوس شعر من الحمض النووي يمر عبر ثقب نانوي في الوقت الفعلي. تم وضع أساس آخر لتسلسل الثقوب النانوية من خلال عمل فريق بقيادة البروفيسور هاجان بايلي الذي بدأ منذ التسعينيات في تطوير الاستشعار العشوائي بشكل مستقل ، وهي تقنية تقيس التغيير في التيار الأيوني الذي يمر عبر ثقب نانوي لتحديد تركيز وهوية مادة. بحلول عام 2005 ، كان Bayley قد أحرز تقدمًا كبيرًا في طريقة تسلسل الحمض النووي وشارك في تأسيس Oxford Nanopore للمساعدة في دفع التكنولوجيا إلى أبعد من ذلك. منذ البداية ، اعتقدت الشركة أن التسلسل النانوي يوفر وسيلة لجعل تسلسل الحمض النووي أرخص وأسرع بكثير ولم يعد يعتمد على الكواشف والمعدات باهظة الثمن التي جعلت العملية حكراً على المختبرات شديدة المركزية الموجودة في البلدان ذات الدخل المرتفع. في عام 2014 ، أصدرت الشركة أول جهاز محمول لتسلسل الثقوب النانوية. كان هذا بمثابة إنجاز كبير لأنه جعل من الممكن إجراء تسلسل الحمض النووي في أي مكان تقريبًا ، حتى في المناطق النائية ذات الموارد المحدودة. وقد فتح هذا فصلًا جديدًا لاكتشاف وتتبع ورسم خرائط تطور مسببات الأمراض الناشئة حديثًا وراء تفشي الأوبئة في الوقت الفعلي على الأرض. لقد لعبت دورًا محوريًا على سبيل المثال في جائحة COVID-19. تم الآن تسلسل ربع جميع جينومات فيروس SARS-Cov2 في العالم بأجهزة ذات ثقوب نانوية. توفر التكنولوجيا أيضًا أداة مهمة لمكافحة مقاومة مضادات الميكروبات ، التي تشكل تهديدًا متزايدًا للصحة العامة. هذه مجرد بداية للعديد من التطبيقات التي يوفرها تسلسل الثقوب النانوية الآن. [9]

الغشاء البيولوجي أو الحالة الصلبة ، حيث يوجد ثقب النانو ، محاط بمحلول إلكتروليت. [10] يقسم الغشاء المحلول إلى حجرتين. [11] يتم تطبيق جهد متحيز عبر الغشاء محفزًا مجالًا كهربائيًا يدفع الجسيمات المشحونة ، في هذه الحالة الأيونات ، إلى الحركة. يُعرف هذا التأثير بالرحلان الكهربي. لتركيزات عالية بما فيه الكفاية ، يتم توزيع محلول الإلكتروليت جيدًا ويتركز كل انخفاض الجهد بالقرب من ثقب النانو وداخله. هذا يعني أن الجسيمات المشحونة في المحلول تشعر فقط بقوة من المجال الكهربائي عندما تكون بالقرب من منطقة المسام. [12] غالبًا ما يشار إلى هذه المنطقة باسم منطقة الالتقاط. داخل منطقة الالتقاط ، تتمتع الأيونات بحركة موجهة يمكن تسجيلها كتيار أيوني ثابت عن طريق وضع أقطاب كهربائية بالقرب من الغشاء. تخيل الآن أن بوليمر بحجم النانو مثل الحمض النووي أو البروتين يوضع في إحدى الغرف. يحتوي هذا الجزيء أيضًا على شحنة صافية تشعر بقوة من المجال الكهربائي عندما يتم العثور عليها في منطقة الالتقاط. [12] يقترب الجزيء من منطقة الالتقاط هذه بمساعدة الحركة البراونية وأي انجذاب قد يكون له على سطح الغشاء. [12] وبمجرد دخوله داخل ثقب النانو ، ينتقل الجزيء عبر مجموعة من القوى الكهروضوئية ، والتناضحية الكهربية ، وأحيانًا القوى الحرارية. [10] داخل المسام ، يحتل الجزيء حجمًا يحد جزئيًا من تدفق الأيونات ، ويُلاحظ على أنه انخفاض في التيار الأيوني. بناءً على عوامل مختلفة مثل الهندسة والحجم والتركيب الكيميائي ، سيختلف التغيير في حجم التيار الأيوني ومدة النقل. يمكن بعد ذلك استشعار جزيئات مختلفة ومن المحتمل تحديدها بناءً على هذا التعديل في التيار الأيوني. [13]

تعديل تعريف القاعدة

يعتمد حجم كثافة التيار الكهربائي عبر سطح النانو على أبعاد النانو وتكوين الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الذي يشغل ثقب النانو. أصبح التسلسل ممكنًا لأن العينات ، التي تمر عبر قناة ثقب النانو ، تسبب تغيرات مميزة في كثافة التيار الكهربائي المتدفق عبر ثقب النانو. إجمالي الشحنة التي تتدفق عبر قناة نانوبور يساوي السطح المتكامل لتدفق كثافة التيار الكهربائي عبر الأسطح العادية لوحدة المسام النانوية بين الأوقات t1 و ت2.

التحرير البيولوجي

يعتمد تسلسل الثقوب النانوية البيولوجية على استخدام بروتينات الغشاء ، المسماة بورينز ، المضمنة في الأغشية الدهنية لتكوين أسطح مسامية تعتمد على الحجم- مع "ثقوب" بمقياس نانومتر موزعة عبر الأغشية. يمكن تحقيق سرعة انتقال منخفضة بما فيه الكفاية من خلال دمج البروتينات المختلفة التي تسهل حركة الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي عبر مسام الأغشية الدهنية. [14]

ألفا الهيموليسين تحرير

تمت دراسة هيموليسين ألفا (αHL) ، وهو ثقب نانوي من البكتيريا التي تسبب تحلل خلايا الدم الحمراء ، لأكثر من 15 عامًا. [15] إلى هذه النقطة ، أظهرت الدراسات أنه يمكن تحديد القواعد الأربع باستخدام التيار الأيوني المقاس عبر مسام αHL. [16] [17] بنية αHL مفيدة لتحديد قواعد معينة تتحرك عبر المسام. مسام αHL هو

10 نانومتر ، مع قسمين متميزين 5 نانومتر. يتكون القسم العلوي من هيكل أكبر يشبه الدهليز ويتكون القسم السفلي من ثلاثة مواقع تمييز محتملة (R1 ، R2 ، R3) ، وهو قادر على التمييز بين كل قاعدة. [16] [17]

تم تطوير التسلسل باستخدام αHL من خلال الدراسة الأساسية والطفرات الهيكلية ، والانتقال نحو تسلسل القراءات الطويلة جدًا. لقد حسنت طفرة بروتين αHL من قدرات الكشف عن المسام. [18] الخطوة التالية المقترحة هي ربط نوكلياز خارجي بمسام αHL. سيقوم الإنزيم بشق القواعد المفردة بشكل دوري ، مما يمكّن المسام من تحديد القواعد المتتالية. إن اقتران نوكلياز خارجي بالمسام البيولوجية من شأنه أن يبطئ انتقال الحمض النووي عبر المسام ، ويزيد من دقة الحصول على البيانات.

والجدير بالذكر أن المنظرين أظهروا أن التسلسل عبر إنزيمات نوكلياز خارجية كما هو موضح هنا غير ممكن. [19] ويرجع ذلك أساسًا إلى التأثيرات المرتبطة بالانتشار والتي تفرض حدًا على احتمالية التقاط كل نيوكليوتيد أثناء انشقاقه. ينتج عن هذا احتمال كبير ألا يتم التقاط النيوكليوتيد قبل أن ينتشر في الكتلة أو يتم التقاطه خارج الترتيب ، وبالتالي لا يتم تسلسله بشكل صحيح بواسطة ثقب النانو ، مما يؤدي إلى أخطاء الإدراج والحذف. لذلك ، يلزم إجراء تغييرات كبيرة على هذه الطريقة قبل اعتبارها استراتيجية قابلة للتطبيق.

أشارت دراسة حديثة إلى قدرة αHL على اكتشاف النيوكليوتيدات في موقعين منفصلين في النصف السفلي من المسام. [20] تتيح مواقع R1 و R2 مراقبة كل قاعدة مرتين أثناء تحركها عبر المسام ، مما يؤدي إلى إنشاء 16 قيمة تيار أيوني مختلفة قابلة للقياس بدلاً من 4. تتحسن هذه الطريقة عند القراءة الفردية عبر ثقب النانو بمضاعفة المواقع التي يتسلسلها يقرأ لكل نانوبور.

تحرير MspA

Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) هي ثاني ثقوب نانوية بيولوجية يتم التحقيق فيها حاليًا لتسلسل الحمض النووي. تم تحديد مسام MspA كتحسين محتمل على αHL بسبب هيكل أكثر ملاءمة. [21] توصف المسام بأنها كأس بحافة سميكة وقطرها 1.2 نانومتر في أسفل المسام. [22] MspA الطبيعي ، في حين أنه مناسب لتسلسل الحمض النووي بسبب الشكل والقطر ، إلا أنه يحتوي على نواة سلبية تمنع انتقال الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل (ssDNA). تم تعديل النانو الطبيعي لتحسين الإزاحة عن طريق استبدال ثلاثة أحماض أسبارتيك سالبة الشحنة بهليون محايد. [23]

تبين أن الكشف عن التيار الكهربائي للنيوكليوتيدات عبر الغشاء أكثر تحديدًا بعشرة أضعاف من αHL لتحديد القواعد. [21] من خلال الاستفادة من هذه الخصوصية المحسنة ، اقترحت مجموعة في جامعة واشنطن استخدام الحمض النووي المزدوج (dsDNA) بين كل جزيء تقطعت به السبل لتثبيت القاعدة في قسم القراءة في المسام. [21] [23] ستوقف dsDNA القاعدة في القسم الصحيح من المسام وتمكن من التعرف على النيوكليوتيدات. تم منح منحة حديثة لتعاون من جامعة كاليفورنيا سانتا كروز وجامعة واشنطن وجامعة نورث إيسترن لتحسين التعرف الأساسي على MspA باستخدام بوليميراز phi29 بالتزامن مع المسام. [24]

تحرير الحالة الصلبة

لا تدمج مناهج تسلسل الثقوب النانوية في الحالة الصلبة ، على عكس تسلسل الثقوب النانوية البيولوجية ، البروتينات في أنظمتها. بدلاً من ذلك ، تستخدم تقنية المسام النانوية الصلبة العديد من الركائز المعدنية أو السبائك المعدنية ذات المسام النانومترية التي تسمح للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بالمرور. غالبًا ما تخدم هذه الركائز أدوارًا متكاملة في التعرف على تسلسل الأحماض النووية أثناء انتقالها عبر القنوات على طول الركائز. [25]

تحرير النفق الحالي

يعد قياس نفق الإلكترون من خلال القواعد حيث تنتقل ssDNA من خلال nanopore طريقة تسلسل متناهية الصغر للحالة الصلبة. ركزت معظم الأبحاث على إثبات أنه يمكن تحديد القواعد باستخدام نفق الإلكترون. أجريت هذه الدراسات باستخدام مجهر مجس مسح كقطب استشعار ، وأثبتت أن القواعد يمكن تحديدها بواسطة تيارات نفق محددة. [26] بعد إثبات مبدأ البحث ، يجب إنشاء نظام وظيفي لربط مسام الحالة الصلبة وأجهزة الاستشعار.

صمم الباحثون في مجموعة هارفارد Nanopore مسام الحالة الصلبة بأنابيب نانوية كربونية أحادية الجدار عبر قطر المسام. [27] يتم إنشاء مصفوفات من المسام واستخدام ترسيب البخار الكيميائي لإنشاء الأنابيب النانوية التي تنمو عبر المصفوفة. بمجرد أن ينمو الأنبوب النانوي عبر المسام ، يتم تعديل قطر المسام إلى الحجم المطلوب. يعد الإنشاء الناجح للأنبوب النانوي المقترن بالمسام خطوة مهمة نحو تحديد القواعد أثناء انتقال ssDNA عبر مسام الحالة الصلبة.

طريقة أخرى هي استخدام الأقطاب الكهربائية النانوية على جانبي المسام. [28] [29] تم إنشاء الأقطاب الكهربائية خصيصًا لتمكين تكوين ثقب نانوي في الحالة الصلبة بين القطبين. يمكن استخدام هذه التقنية ليس فقط لاستشعار القواعد ولكن للمساعدة في التحكم في سرعة النقل الأساسي والتوجيه.

تحرير الإسفار

تم تطوير تقنية فعالة لتحديد تسلسل الحمض النووي باستخدام المسام النانوية الصلبة والفلورة.[30] طريقة التسلسل الفلوري هذه تحول كل قاعدة إلى تمثيل مميز للنيوكليوتيدات المتعددة التي ترتبط بمسبار الفلورسنت المكون من dsDNA. مع نظام اللونين المقترح ، يتم تحديد كل قاعدة من خلال تألقين منفصلين ، وبالتالي سيتم تحويلها إلى تسلسلين محددين. تتكون المجسات من فلوروفور وإخماد في بداية ونهاية كل تسلسل ، على التوالي. سيتم إطفاء كل فلوروفور بواسطة المخمد في نهاية التسلسل السابق. عندما يتم نقل dsDNA من خلال ثقب نانوي صلب ، سيتم تجريد حبلا المسبار ، وسوف يتألق الفلوروفور المنبع. [30] [31]

تتميز طريقة التسلسل هذه بسعة 50-250 قاعدة في الثانية لكل مسام ، وسيتسلسل نظام فلوروفور بأربعة ألوان (يمكن تحويل كل قاعدة إلى تسلسل واحد بدلاً من اثنين) ، أكثر من 500 قاعدة في الثانية. [30] تعتمد مزايا هذه الطريقة على قراءة التسلسل الواضحة - باستخدام الكاميرا بدلاً من الطرق الحالية المزعجة. ومع ذلك ، فإن الطريقة تتطلب تحضير عينة لتحويل كل قاعدة إلى كود ثنائي موسع قبل التسلسل. بدلاً من تحديد قاعدة واحدة لأنها تنتقل عبر المسام ،

12 قاعدة مطلوبة لإيجاد تسلسل قاعدة واحدة. [30]

مقارنة بين أنظمة تسلسل المسام النانوية البيولوجية والصلبة بناءً على القيود الرئيسية
بيولوجي الحالة الصلبة
سرعة نقل منخفضة
استنساخ الأبعاد
تحمل الاجهاد
طول العمر
سهولة تصنيع

القيود الرئيسية يحرر

  1. سرعة النقل المنخفضة: السرعة التي تمر بها العينة عبر مسام الوحدة بطيئة بدرجة كافية ليتم قياسها
  2. قابلية استنساخ الأبعاد: احتمالية جعل مسام الوحدة بالحجم المناسب
  3. تحمل الإجهاد: حساسية الوحدة للظروف البيئية الداخلية
  4. طول العمر: طول الفترة الزمنية التي يُتوقع أن تظل فيها الوحدة تعمل
  5. سهولة التصنيع: القدرة على إنتاج وحدة - عادة فيما يتعلق بالإنتاج بالجملة

البيولوجية: مزايا وعيوب

تتميز أنظمة تسلسل الثقوب النانوية البيولوجية بالعديد من الخصائص الأساسية التي تجعلها مفيدة مقارنة بأنظمة الحالة الصلبة - مع كل خاصية مفيدة لنهج التصميم هذا تنبع من دمج البروتينات في تقنيتها. يمكن تسهيل بنية المسام الموحدة ، والتحكم الدقيق في نقل العينة من خلال قنوات المسام ، وحتى اكتشاف النيوكليوتيدات الفردية في العينات عن طريق بروتينات فريدة من مجموعة متنوعة من أنواع الكائنات الحية.

إن استخدام البروتينات في أنظمة التسلسل النانوي البيولوجي ، على الرغم من الفوائد المختلفة ، يجلب معه أيضًا بعض الخصائص السلبية. إن حساسية البروتينات في هذه الأنظمة للإجهاد البيئي المحلي لها تأثير كبير على طول عمر الوحدات بشكل عام. أحد الأمثلة هو أن البروتين الحركي قد يقوم فقط بفك ضغط العينات بسرعة كافية عند نطاق معين من الأس الهيدروجيني بينما لا يعمل بسرعة كافية خارج النطاق - يؤثر هذا القيد على وظيفة وحدة التسلسل بأكملها. مثال آخر هو أن الغشاء البورن قد يعمل بشكل موثوق فقط لعدد معين من الأشواط قبل أن ينهار. يجب التحكم في كلا المثالين في تصميم أي نظام بيولوجي نانوي قابل للتطبيق - وهو أمر قد يكون من الصعب تحقيقه مع الحفاظ على تكاليف مثل هذه التكنولوجيا منخفضة وتنافسية ، إلى الأنظمة الأخرى ، قدر الإمكان. [14]

كان أحد التحديات التي واجهتها طريقة "تسلسل الخيوط" هو تنقيح الطريقة لتحسين الدقة لتكون قادرة على اكتشاف القواعد الفردية. في طرق الأوراق المبكرة ، كان من الضروري تكرار النيوكليوتيد في تسلسل حوالي 100 مرة على التوالي من أجل إنتاج تغيير مميز قابل للقياس. هذه الدقة المنخفضة هي لأن خيط الحمض النووي يتحرك بسرعة بمعدل 1 إلى 5 ميكرو ثانية لكل قاعدة عبر ثقب النانو. هذا يجعل التسجيل صعبًا وعرضة لضوضاء الخلفية ، ويفشل في الحصول على دقة النوكليوتيدات المفردة. تتم معالجة المشكلة إما عن طريق تحسين تقنية التسجيل أو عن طريق التحكم في سرعة خيط الحمض النووي من خلال استراتيجيات هندسة البروتين المختلفة ، ويستخدم Oxford Nanopore `` نهج kmer '' ، لتحليل أكثر من قاعدة واحدة في وقت واحد بحيث تخضع امتدادات الحمض النووي لتكرار الاستجواب بينما يتحرك الخيط عبر قاعدة واحدة في كل مرة. [32] تم استخدام تقنيات مختلفة بما في ذلك الخوارزمية لتحسين أداء تقنية MinION منذ أن تم إتاحتها لأول مرة للمستخدمين. [33] في الآونة الأخيرة تم عرض تأثيرات القواعد المفردة بسبب البنية الثانوية أو أحاديات النيوكليوتيدات المنبعثة. [34] [35]

اقترح البروفيسور هاجان بايلي في عام 2010 أن إنشاء موقعين للتعرف داخل مسام الهيموليزين ألفا قد يمنح مزايا في التعرف على القاعدة. [36]

يتمثل أحد التحديات التي تواجه "نهج نوكلياز خارجي" ، [37] حيث يغذي إنزيم معالج القواعد الفردية ، بالترتيب الصحيح ، في ثقب النانو ، في دمج نوكلياز خارجي وأنظمة الكشف عن الثقوب النانوية. على وجه الخصوص ، [38] تكمن المشكلة في أنه عندما تتحلل نوكلياز خارجي الروابط الفسفورية بين النيوكليوتيدات في الحمض النووي ، فإن النيوكليوتيدات التي تم إطلاقها لاحقًا لا تكون مضمونة بالضرورة للانتقال مباشرة ، على سبيل المثال ، إلى ثقب نانوي قريب من ألفا هيموليسين. تتمثل إحدى الأفكار في ربط نوكلياز خارجي بالثقب النانوي ، ربما من خلال الارتباط الحيوي بهيموليسين برميل بيتا. [38] قد يتم تبطين المسام المركزية للبروتين ببقايا مشحونة مرتبة بحيث تظهر الشحنات الموجبة والسالبة على جوانب متقابلة من المسام. ومع ذلك ، فإن هذه الآلية تمييزية في المقام الأول ولا تشكل آلية لتوجيه النيوكليوتيدات في مسار معين.


تحديات التسلسل بالتوليف

تم بالفعل دمج تقنية تسلسل الحمض النووي عن طريق التوليف (SBS) ، باستخدام إنزيم البوليميراز أو إنزيم ligase ككيمياء حيوية أساسية ، في العديد من أنظمة تسلسل الحمض النووي من الجيل الثاني بأداء كبير. على الرغم من النجاح الكبير الذي حققته منصات SBS هذه ، تستمر التحديات في الحد من القدرة على تقليل تكلفة تسلسل الجينوم البشري إلى 100000 دولار أو أقل. سيتطلب تحقيق تكلفة منخفضة بشكل كبير مع تحسين الإنتاجية والجودة تكاملًا سلسًا للجهود العلمية والتكنولوجية عبر التخصصات في الكيمياء الحيوية والكيمياء والفيزياء والهندسة. تشمل التحديات تحضير العينة ، وكيمياء الأسطح ، وعلامات الفلورسنت ، وتحسين نظام الركيزة الإنزيمية ، والبصريات ، والأجهزة ، وفهم المفاضلات بين الإنتاجية مقابل الدقة ، وقيود طول القراءة / التدريج. من خلال تأطير هذه التحديات بطريقة يمكن الوصول إليها من قبل مجتمع عريض من العلماء والمهندسين ، نأمل أن نلتمس مدخلات من مجتمع البحث الأوسع حول وسائل تسريع تقدم تقنية تسلسل الجينوم.


ELI5 كيف تعمل الجينات ورسم خرائط الجينوم وتسلسل الحمض النووي وكل ذلك؟

كيف يفعلون ذلك وماذا نتعلم منه؟ فضولي فقط.

الحمض النووي عبارة عن بوليمر طويل من النيوكليوتيدات المتكررة ، والتي يمكن أن تكون واحدة من أربعة أنواع - A ، C ، G ، T. لجميع المقاصد والأغراض ، يمكنك معالجة النيوكليوتيدات على أنها حروف من لغة الحمض النووي. ثلاثة من هذه النيوكليوتيدات ترمز إلى أحماض أمينية معينة - كلمات، إذا أمكنك - وهناك حوالي 20 & quot؛ كلمة & quot في مفردات الحمض النووي البشري. الآن ، إذا قمنا بربط بضع مئات من الأحماض الأمينية معًا ، نحصل على البروتينات - أو جمل. هذه البروتينات لها وظيفة في جسمك - إما في توفير الدعم الهيكلي ، كجزيء إشارة ، يساعدك على هضم الطعام ، وإنتاج جزيء آخر ، وما إلى ذلك. وراثي.

عادة ما يكون الحمض النووي مزدوج الشريطة ، ولكل حرف شريكه المقابل بين الخيوط. إذا كان A على خيط واحد ، فيجب أن يكون T. ويعارضه بشكل مباشر. وينطبق الشيء نفسه مع C و G. أثناء تكرار الحمض النووي ، يتحلل الحمض النووي ويصبح وحيدًا. بروتينات خاصة - DNA polymerase - تضيف النيوكليوتيدات واحدة تلو الأخرى إلى DNA أحادي الجديلة ، وفقًا لقواعد الحروف المذكورة أعلاه.

تسلسل الحمض النووي هو ما يفعله المرء لفك & quotletters & quot من الحمض النووي. تعتمد معظم التقنيات الحديثة على أعمال فريدريك سانجر - مع تسمية تقنية التسلسل باسمه (تسلسل سانجر). ما فعله كان عبقريًا - لقد سمح بتكاثر الحمض النووي بشكل طبيعي ، ولكن بدلاً من النيوكليوتيدات الطبيعية ، ألقى بنوع خاص منها قف تكرار. إذن ما يحدث في النهاية هو أننا نحصل على خيوط ذات أطوال مختلفة ، تتوقف عند أحرف مختلفة في الجملة. من خلال دراسة أطوال خيوط الحمض النووي هذه ، يمكن للمرء فك شفرة اللغة. على سبيل المثال ، إذا ألقى سانجر النوكليوتيدات الخاصة & quotC & quot ، ووجد أجزاء من الحمض النووي بطول 4 و 8 ، فعندئذ كان يعلم أن الحرفين الرابع والثامن يجب أن يكونا & quotC & quot. تكرر نفس العملية لأحرف أخرى.

في الوقت الحاضر ، نستخدم الفلورة بشكل أساسي لاكتشافه. نعلق جزيء الفلورسنت بالنيوكليوتيدات. تم تصميم هذه الجزيئات لتتوهج عندما يتم قطعها ، ولدينا بوليميريز الحمض النووي لدينا يقطع المسبار الفلوري عند إضافة النوكليوتيدات التالية. علاوة على ذلك ، يمكننا إضافة مختلفة ملون المجسات ، بحيث يمكن للمرء أن يتوافق مع كل حرف. الآن نترك بوليميريز الحمض النووي يقوم بعمله ، ونقوم ببساطة & اقتباس & اقتباس الألوان للحصول على التسلسل.


6.1.3 التلاعب بمعاينة بطاقات فلاش الجينوم

ما هي الهندسة الوراثية؟

- تغيير التركيب الجيني للكائن الحي

- تؤخذ الجينات من كائن حي وتوضع في كائن آخر

- لتشكيل الحمض النووي معاد التركيب

- يتم بعد ذلك إنتاج البروتين المشفر بواسطة الجين بواسطة كائن معدل وراثيا

- الدنا من كائنات / مصادر مختلفة مرتبطة ببعضها البعض عن طريق الربط التكميلي

لماذا نقوم بهندسة الكائنات الحية وراثيا؟

- لتحسين أو إدخال ميزة في المستلم:

- الجين المقاوم لمبيدات الأعشاب: يمكن أن يقتل الأعشاب الضارة ولا يضر بالمحاصيل

- الجين المتحكم في النمو يعزز نمو العضلات في الماشية

- هندسة الكائنات الحية لإنتاج منتجات مفيدة:

أعط لمحة عامة عن عمليات نقل الجينات

1. يتم تحديد الجينات وقطعها أو صنعها

2. يتم إنتاج نسخ متعددة من الجين

3. يتم إدخال الجين في المتجه للتسليم إلى الخلية المطلوبة

4. إدخال الجين في الخلايا المتلقية عن طريق الناقل والخلايا تعبر عن الجين

5. تحديد الخلايا المحولة وراثيا واستنساخها

صف كيفية الحصول على الجين المطلوب في الهندسة الوراثية

- يمكن الحصول على mRNA من الخلايا حيث يتم التعبير عن الجين

- يتم استخدام النسخ العكسي لتشكيل خيط واحد من الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام mRNA كقالب

- إضافة البادئات وبوليميراز الحمض النووي يمكن أن يجعل هذا الـ cDNA إلى طول مزدوج تقطعت به السبل من الحمض النووي مع ترميز تسلسل أساسي للبروتين

إذا عرف العلماء تسلسل النوكليوتيدات للجين:

- يمكن تصنيع الجين باستخدام تخليق آلي متعدد النوكليوتيدات

- أو يمكن تضخيم (نسخ) الجين من الحمض النووي الجيني من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

- أو يمكن استخدام مسبار الحمض النووي لتحديد موقع الجين داخل الجينوم ومن ثم يمكن قطع الجين باستخدام إنزيمات التقييد

ما هي إنزيمات نوكلياز التقييد؟

- مصنوعة من البكتيريا والعتائق للحماية من هجوم فيروس العاثيات

- يقطعون الحمض النووي الفيروسي الغريب ، ويمنعون الفيروسات من صنع نسخ

- يتم حماية الحمض النووي بدائيات النواة من عمل هذه نوكليازات من خلال ميثيلته في مواقع التعرف

- سميت وفقًا للبكتيريا التي تم الحصول عليها منها على سبيل المثال. EcoR1

- تُستخدم في البيولوجيا الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية لأنها تتعرف على تسلسلات محددة داخل طول الحمض النووي وتشق الجزيء هناك

كيف تعمل إنزيمات نوكلياز التقييد؟

- قطع الحمض النووي في مواقع التعرف المحددة والتي يبلغ طولها 4-6 أزواج قاعدية

- تتعرف الإنزيمات على تسلسل متناوب (على سبيل المثال من 5 'إلى 3')

- يقوم البعض بقطع متعرج تاركًا أطرافًا لزجة ، بينما يقوم البعض الآخر بعمل قطع ينتج عنه نهايات غير حادة

- يحتاج البعض إلى Mg 2+ كعامل مساعد

كيف يتم صنع نسخ متعددة من الجين في الهندسة الوراثية؟

- باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

كيف يمكنك وضع الجين في ناقل لتسليمه إلى الخلية المتلقية؟

- يمكن خلط البلازميدات من البكتيريا مع إنزيمات تقييدية تقطع DNA البلازميد في مواقع تمييز محددة

- كشف البلازميد المقطوع عن قواعد نيوكليوتيدات غير متزاوجة تسمى النهايات اللاصقة

- إذا تمت إضافة قواعد النوكليوتيدات الحرة ، والمكملة للنهايات اللاصقة للبلازميد ، إلى نهايات الجين المراد إدخاله ، فيجب أن يصلب الجين والبلازميد (الارتباط)

- يحفز DNA ligase هذا التلدين

- ختم الجين في فيروس موهن (ضعيف) يمكنه نقله إلى الخلية المضيفة

- ضع الجين داخل الجسيمات الشحمية

- يربط ligase النيوكليوتيدات معًا

- يحفز تكوين التساهمية (روابط فوسفوديستر)

- ختم العمود الفقري للسكر والفوسفات

لماذا تحتاج إلى طرق مختلفة لمساعدة الناقل على الدخول إلى الخلية المتلقية؟

- لا يعبر الحمض النووي بسهولة غشاء البلازما الخاص بالمستقبل

ما هي الطرق التي تساعد المتجه للوصول إلى الخلية المتلقية؟

- المعالجة بالصدمة الحرارية: تعرض البكتيريا لفترة متناوبة من البرودة (0 درجة مئوية) والحرارة (42 درجة مئوية) في وجود كلوريد الكالسيوم

- ستصبح الجدران والأغشية أكثر مسامية وتسمح بالناقل المؤتلف

- هذا لأن أيونات الكالسيوم تحيط بالجزء السلبي من جزيئات الحمض النووي والفوسفوليبيدات في غشاء الخلية. هذا يقلل من التنافر بين الدنا الغريب وأغشية الخلايا المضيفة

- التثقيب الكهربائي: يتم تطبيق نبضة عالية الجهد لتعطيل أغشية الخلايا

- الصهر الكهربائي: يمكن أن تساعد المجالات الكهربائية على إدخال الحمض النووي في الخلايا

- تعداء: يمكن تعبئة الحمض النووي في العاثية التي يمكن أن تصيب الخلية المضيفة

- تأنا يتم إدخال البلازميدات (المؤتلفة) في البكتيريا أغروباكتريوم توميفاسيانز التي تصيب بعض النباتات وتدخل جينومها بشكل طبيعي في جينومات الخلية المضيفة

- مسدس الجينات: قطع صغيرة من الذهب / التنجستن مطلية بالحمض النووي وتطلق في الخلايا النباتية

لماذا يتعين عليك تحديد الخلايا التي تم التقاط الجين بنجاح؟

- لا تحتوي كل البكتيريا على الجين بسبب

- قد لا تكون بعض البكتيريا قد تناولت البلازميد

- ربما تكون بعض البلازميدات قد انسدت احتياطيًا بعد قطعها باستخدام إنزيم التقييد ، لذلك لم يأخذوا الجين

- البكتيريا الوحيدة التي نريدها هي تلك التي تحتوي على البلازميد الذي يحتوي على الجين المعني

كيف تتعرف على الخلايا التي تم امتصاصها بنجاح بواسطة الجين واستنساخها في الهندسة الوراثية؟

- الجينات المتماثلة للطلاء والمقاومة للمضادات الحيوية

- جين علامة الفلورسنت من أسماك الهلام

ما هو النسخ العكسي؟

- الفيروسات القهقرية ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية ، التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الذي يحقن في جينوم المضيف ، لديها إنزيمات النسخ العكسي التي تحفز إنتاج الحمض النووي الريبي

- يستخدمون RNA الخاص بهم كقالب

- هذا عكس النسخ

- هذه الإنزيمات مفيدة للهندسة الوراثية

كيف يصنع الأنسولين من البكتيريا المعدلة وراثيا؟

- يمكن للعلماء الحصول على mRNA من خلايا بيتا في جزيرة لانجرهانز في البنكرياس البشري

1. تؤدي إضافة إنزيمات النسخ العكسي إلى تكوين خيط واحد من cDNA ، كما أن العلاج ببوليميراز الدنا يصنع خيطًا مزدوجًا: الجين

2. إضافة نيوكليوتيدات حرة غير مزاوجة في نهايات الحمض النووي تنتج نهايات لزجة

3. مع إنزيم ligase ، يمكن إدخال جين الأنسولين في البلازميدات المستخرجة من بكتيريا الإشريكية القولونية

- هذه تسمى الآن البلازميدات المؤتلفة ، لأنها تحتوي على DNA مُدرج

4. يتم خلط بكتيريا الإشريكية القولونية مع البلازميدات المؤتلفة وتتعرض لصدمة حرارية في وجود أيونات كلوريد الكالسيوم ، لذلك سوف تمتص البلازميدات

لماذا يجب احتواء البكتيريا بأمان عند صنع الأنسولين؟

- البكتيريا المعدلة وراثيا لها مقاومة لبعض المضادات الحيوية ، فنحن لا نريدها أن تهرب من المعامل إلى البرية

- لذلك ، فقد تم تعطيل الجين ، مما يعني أنهم لا يستطيعون تصنيع عنصر غذائي معين

كيف تسلسل فريد سانجر الحمض النووي في عام 1975؟

- استخدم خيطًا واحدًا من الحمض النووي كقالب لأربع تجارب

- احتوى كل طبق على محلول مع القواعد الأربعة بالإضافة إلى بوليميريز الحمض النووي

- تمت إضافة نسخة معدلة من إحدى قواعد الحمض النووي إلى كل طبق

- تم تعديله بالطريقة التي تم دمجها في الخيط التكميلي المركب للحمض النووي ، فلا يمكن إضافة المزيد من القواعد

- تم تمييز كل قاعدة معدلة أيضًا بنظير مشع

- مع تقدم التفاعل ، تم إنشاء آلاف شظايا الحمض النووي بأطوال متفاوتة

- تم تمرير شظايا الحمض النووي عبر مادة هلامية بالرحلان الكهربي

- انتقلت الأجزاء الأصغر إلى مسافة أبعد ، لذا تم فرزها حسب الطول

- تمت قراءة قاعدة النوكليوتيدات في نهاية كل جزء وفقًا لملصقها الإشعاعي

- على الرغم من أن هذا كان فعالًا وآمنًا ، إلا أنه كان عليه أن يحسب كل قاعدة واحدة تلو الأخرى ، لذلك كان يستغرق وقتًا طويلاً

كيف تم استنساخ الحمض النووي للسماح لهم بالتسلسل في تسلسل الحمض النووي المبكر؟

- تم عزل الجين باستخدام إنزيمات تقييدية من بكتيريا

- يتم بعد ذلك إدخال الحمض النووي في البلازميد البكتيري ثم في مضيف الإشريكية القولونية ، والذي ينقسم عدة مرات ، مما يتيح نسخ البلازميد مع الحمض النووي

- تم بعد ذلك عزل أطوال الحمض النووي باستخدام تقنيات تحضير البلازميد ثم تسلسلها

متى تم تطوير أول آلة لتسلسل الحمض النووي؟

- الأصباغ الفلورية المستخدمة بدلاً من الأصباغ المشعة

- كان على الفنيين قراءة الصور الشعاعية الذاتية

ما هو التسلسل عالي الإنتاجية؟

- تم استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب لتطوير طرق سريعة ورخيصة لتسلسل الجينوم

وصف التسلسل الحراري غير مكتمل.

- يتضمن توليف خيط واحد من الحمض النووي ، مكملًا للخيط المراد تسلسله ، قاعدة واحدة في كل مرة ، أثناء الكشف ، عن طريق انبعاث الضوء ، أي قاعدة تمت إضافتها في كل خطوة

1. يتم تقطيع طول طويل من الحمض النووي ليتم تسلسله ميكانيكيًا إلى شظايا من 300 إلى 800 زوج قاعدي باستخدام البخاخات

2. تتحلل هذه الأطوال بعد ذلك إلى DNA أحادي الجديلة (ssDNA)

- هذه هي قوالب الحمض النووي وهي مجمدة

3. يتم إضافة مادة أولية متسلسلة ثم يتم تحضين الحمض النووي مع إنزيمات DNA polymerase و ATP sulfurylase و luciferase و apyrase وركائز adenosine 5 'phosphosulfate (APS) و luciferin

- تتم إضافة واحد فقط من النوكليوتيدات الأربعة الممكنة ، ATP ، TTP ، CTP ، GTP في وقت واحد ويتم اكتشاف أي ضوء متولد

- يتم دمج نيوكليوتيد واحد منشط ، مثل TTP ، في الخيط التكميلي للحمض النووي

- عند حدوث ذلك ، يتم تحرير فوسفوريلين إضافيين على شكل بيروفوسفات (PPأنا)


شاهد الفيديو: تضاعف DNA ونسخ وترجمة RNA. الأحياء. الجزيئات الضخمة (يونيو 2022).