معلومة

ما الذي يتحكم في إسكات جينات معينة أثناء تمايز الخلايا؟

ما الذي يتحكم في إسكات جينات معينة أثناء تمايز الخلايا؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إنني مفتون بحقيقة أن جميع خلايا أجسامنا تستخدم نفس الحمض النووي. كيف تتمايز الخلايا خلال انقسامات ما بعد الإخصاب؟

قرأت عن إسكات الجينات ، والذي يمكن أن يكون إجابة على هذا. لكني ما زلت لا أفهم كيف تقرر الخلايا أي جين يُفترض أن تسكت ، عن طريق صنع الحمض النووي الريبي الدقيق.

ضع في اعتبارك أن الزيجوت بدأ في الانقسام. أفترض أن السياق الكيميائي والفيزيائي لكل خلية ابنة سيكونان متشابهين إلى حد ما في البداية. إذن كيف يمكن أن يكون هناك تفاضل؟ هل هناك سلطة إشرافية موجودة في البيضة الملقحة التي تقرر ماذا تصنع من كل خلية ابنة؟


يتم التحكم في تمايز الخلايا خلال فترة ما بعد الإخصاب من خلال مجموعة من الجينات التنظيمية تسمى الجينات المثلية ، وهي الجينات التي "تختار" هوية شرائح أو هياكل كاملة في أجسام الكائنات الحية النامية. يقوم هذا الجين بترميز عامل النسخ الذي يتم التعبير عنه في منطقة معينة من الكائن الحي بدءًا من تطوره المبكر ، أي مرحلة الجنين. تغير عوامل النسخ تعبير الجينات المستهدفة لتفعيل "البرنامج" الجيني المناسب لكل جزء.

تحتوي عوامل النسخ المثلية الموضحة في الرسم البياني أعلاه [التناظر بين جينات Hox في الفئران والبشر] على منطقة بروتين مرتبطة بالحمض النووي تسمى المجال الداخلي ، والتي يتم ترميزها بواسطة جزء من الحمض النووي يسمى homeobox. جينات الحيوانات التي تحتوي على تسلسلات homobox هي يشار إليها على وجه التحديد باسم جينات Hox. هذه العائلة من الجينات مسؤولة عن تحديد مخطط الجسم العام ، مثل عدد أجزاء الجسم للحيوان ، وعدد الزوائد وموضعها ، واتجاه رأس الحيوان - الذيل.

بالإضافة إلى هذه الجينات ، تتضمن سلسلة التطور المبكر الجينات التالية:

  • جينات التأثيرات الأمومية: هذه هي الجينات التي تضع الأم mRNAs في خلية البويضة قبل الإخصاب. بعض mRNAs "مرتبطة" برأس أو ذيل الجنين وتكون مسؤولة عن إعداد قطبية الرأس والذيل. تقوم جينات التأثيرات الأمومية بتشفير منظمات النسخ أو الترجمة التي تتحكم في بعضها البعض وكذلك الجينات الأخرى.
  • جينات الفجوة: يتم تنشيطها من خلال التفاعلات بين المنتجات البروتينية لجينات التأثيرات الأمومية ، كما أنها تنظم بعضها البعض. إنهم مسؤولون عن تحديد مناطق كبيرة متعددة الأجزاء في العديد من الكائنات الحية.
  • جينات القواعد الزوجية: يتم تشغيلها عن طريق التفاعلات بين جينات الفجوة ، ويتم تحسين أنماط تعبيرها من خلال التفاعلات مع بعضها البعض. تظهر في "خطوط" متعددة على طول الجنين ، مشابه في النمط لأجزاء الكائن البالغ. عندما يكون جين القاعدة الزوجية مفقودًا بسبب الطفرة ، هناك فقدان للبنى في مناطق المقطع حيث يتم التعبير عن الجين بشكل طبيعي .

لمزيد من المعلومات يمكنك الرجوع إلى هذا الرابط: - انقر هنا 1 - انقر هنا 2 - انقر هنا 3


يتطلب تنشيط وتعطيل الجينات المختلفة عملية تمايز الخلايا. يتم التحكم في التعبير الجيني المسؤول عن تمايز الخلايا عن طريق إشارات داخلية وخارجية. هذه الإشارات المنظمة من داخل وخارج الخلية مسؤولة عن التطور الجنيني.

تتحكم البيئة المحيطة بالخلية ، مثل الجزيئات الصغيرة والبروتينات ودرجة الحرارة والأكسجين ، في التعبير الجيني. يأخذ الاتصال الخلوي أماكن لتقرير مصير خلية معينة من خلال تفاعل الإشارات بين البروتينات المركبة حول الخلية. يمكن أن تكون هذه البروتينات مورفوجينات أو عوامل نمو أو سيتوكينات. هذه الإشارات الخارجية تطلق الإشارات بين الخلايا التي تحفز التعبير عن الجينات. يؤدي التغيير في التعبير الجيني عن طريق تشغيل الجين أو إيقاف تشغيله ، إلى تنظيم إنتاج الجين.

يتم تنظيم التعبير الجيني جوهريًا عن طريق تعديل الحمض النووي. يتم تغيير الحمض النووي والكروماتين كيميائيا. التغيير في تأثير الكروماتين على التعبير الجيني عن طريق التحكم في ارتباط الجينات بعوامل النسخ. تُعرف هذه التعديلات الكيميائية اللاجينية باسم مثيلة الحمض النووي وتعديل هيستون. يلعب تعديل الكروماتين دورًا مهمًا في التعبير الجيني أثناء نمو الخلية. على سبيل المثال ، تلعب البروتينات المسؤولة عن تعديل الكروماتين دورًا مهمًا في تمايز خلايا العضلات. عوامل النسخ MyoD و MEF تنظم الإنزيمات المسؤولة عن تعديل الكروماتين ، مثل هيستون أسيتيل ترانسفيرازات و ديستيلازس.

عبر: https://www.nature.com/scitable/topicpage/gene-expression-regulate-cell-differentiation-931/#

يساعد تعديل الكروماتين في التعبير الجيني المستمر المطلوب أثناء تمايز الخلايا. إن إسكات الجين المتضمن في عملية التطور الجنيني ، يعزز تطور الخلايا إلى أنواع خلايا ناضجة. يتم إسكات الجين عن طريق جعل الجينات غير قابلة للوصول إلى آلات النسخ ، وعندما تكون الجينات مطلوبة مرة أخرى في نوع الخلية البالغة ، فإن تعديل الكروماتين يفتح الحمض النووي ويجعله متاحًا للنسخ.

أنواع الخلايا الجنينية لها مناطق معينة لتعديل الكروماتين التي تنظم التعبير الجيني المطلوب للتطور الجنيني. يمكن لهذه المناطق تعديل التعبير الجيني عن طريق تنشيط أو إسكات الجينات.

عبر: (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16630819)


خلفية

يتم التحكم في تكون الدم عن طريق التفاعلات بين الخلايا الجذعية المكونة للدم وبيئتها المكروية. تؤثر هذه التفاعلات على الاحتفاظ بالخلايا الجذعية في منافذ محددة ، وتوسع الخلايا الجذعية والسلفية ، وتباعد السلالة والتمايز [1]. تعتبر جزيئات الالتصاق منظمات رئيسية لتفاعلات الخلايا الخلوية وتؤثر على جوانب متعددة من تكون الدم [1-4]. في الواقع ، تعمل الأجسام المضادة ضد جزيئات الالتصاق المختلفة بما في ذلك VLA-4 و VCAM-1 على تثبيط قدرة الخلايا الجذعية المكونة للدم على ملء النخاع العظمي للفئران المشععة [5] ، وقد أظهرت الدراسات القاضية للجينات الخاصة بالإنتجرينات دورها الحاسم في التوجيه والتوجيه. استعمار الأعضاء المكونة للدم الأولية في مرحلة متأخرة مثل الكبد الجنيني [6 ، 7]. في الآونة الأخيرة ، تورط تعبير N-cadherin في الاحتفاظ بالخلايا الجذعية المكونة للدم في مكانة نخاع العظم [8-10] على الرغم من أن هذا الادعاء لا تدعمه دراسات أخرى [11]. على النقيض من دورهم في التوجيه ، فإن فهمنا لبيولوجيا جزيء الالتصاق في التزام النسب والتمايز غير محدد بشكل جيد.

مستضد الخلايا المكونة للدم ، المعروف أيضًا باسم جزيء التصاق خلية الكريات البيض المنشط (ALCAM / CD166) ، هو عضو في عائلة الغلوبولين المناعي الفائقة. يتم التعبير عنه على سطح الخلايا المكونة للدم الأكثر بدائية في كبد الجنين البشري ونخاع العظام لدى الجنين والكبار [12]. وجدت دراسات أخرى تعبير ALCAM على مجموعات فرعية من الخلايا اللحمية في الأديم المتوسط ​​شبه الأبهر والمواقع الأولية الأخرى لتكوين الدم في الجنين البشري [13]. التفاعلات بوساطة ALCAM مهمة أثناء التطور العصبي [14] ، ونضج الخلايا الجذعية المكونة للدم في الأنسجة المكونة للدم [12 ، 15] ، والاستجابات المناعية [16] وفي تطور الورم [17]. تمنع الأجسام المضادة لـ ALCAM تكوين مستعمرة النخاع الشوكي في المختبر بواسطة آلية تبقى مجهولة [18]. لقد أظهرنا سابقًا أن ALCAM متورط في تناسخ الخلايا الأحادية عبر الطبقات الأحادية البطانية [19]. أكثر حداثة في الجسم الحي أظهرت الدراسات أن ALCAM ضروري لهجرة الخلايا الأحادية عبر الحاجز الدموي الدماغي [20]. تشير دراسات أخرى إلى أن تفاعل ALCAM على الخلايا المتغصنة مع رابطة الخلايا التائية CD6 مطلوب من أجل التنشيط الأمثل للخلايا التائية [21]. بينما تسلط هذه الدراسات الضوء على دور ALCAM في بيولوجيا خلايا كريات الدم البيضاء الناضجة والمنشطة ، لا توجد حاليًا معلومات عن دور ALCAM في بيولوجيا الخلية المكونة للدم.

في هذه الدراسة ، قمنا بفحص تعبير ALCAM في خطوط الخلايا المكونة للدم البشرية. تم استنساخ جين ALCAM وتم تمييزه وظيفيًا في خطوط الخلايا K562. تم التحقيق في تأثير ALCAM على التمايز الضخم للخلايا K562.


مقدمة

التوقف المؤقت للنسخ هو الظاهرة التي تختبر فيها الجينات بدء النسخ دون استطالة. كان يعتقد في البداية أنه يحدث فقط في حالات نادرة مثل جينات الصدمة الحرارية ذبابة الفاكهة (تمت مراجعتها في [1]) ، اقترح كروم وآخرون أن التوقف المؤقت قد يكون آلية أكثر عمومية بناءً على التحليل التفصيلي للماوس ج- myc الجين [2]. كشفت الدراسات الحديثة التي أجريت باستخدام الترسيب المناعي للكروماتين متبوعًا بتهجين الرقاقة (ChIP-chip) أو التسلسل العميق (ChIP-seq) أن التوقف المؤقت للنسخ يحدث بالفعل في جزء كبير من الجينات في الثدييات [1] ، [3] ، [ 4] ، [5] ، [6] ، [7] و ذبابة الفاكهة [8] ، [9] خلايا. تم وصف النصوص القصيرة غير المنتجة في كل من المعنى ومضاد المعنى [10] ، [11] في العديد من الجينات ، ويبدو أن العديد من الجينات التنظيمية التنموية متوقفة مؤقتًا في كل من أنواع الخلايا متعددة القدرات والمتباينة. في المقابل ، لا تظهر جينات التدبير المنزلي النشطة بشكل عام توقفًا نسخيًا مؤقتًا [12]. يشير هذا إلى أن الإيقاف المؤقت للنسخ هو آلية واسعة النطاق للتحكم في برامج التعبير الجيني الخاصة بنوع الخلية.

على الرغم من هذه التطورات ، فإن الأهمية الفسيولوجية للتوقف المؤقت عن النسخ لا تزال غير واضحة. لاحظنا أن معظم دراسات التوقف المؤقت ، حتى الآن ، ركزت على الخلايا في حالة الثبات. افترضنا أن التوقف المؤقت قد يكون مهمًا للسماح للخلايا بتغيير مستويات التعبير الجيني بسرعة استجابة للإشارات البيئية. يوفر تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات نحو الخلايا الأكثر التزامًا نظامًا نموذجيًا بشريًا لدراسة واحدة من أكثر التغيرات الدراماتيكية للحالات الخلوية. سعينا إلى فهم كيفية تنظيم جهاز النسخ ديناميكيًا حيث يتم إنشاء أنماط جديدة من التعبير الجيني أثناء التمايز. لاختبار الفرضية القائلة بأن الإيقاف المؤقت للنسخ هو حالة انتقالية رئيسية للتعبير الجيني ، استخدمنا نظامًا موجهًا لتمييز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عن الأديم المتوسط ​​المبكر [13] وحددنا تدفق مواضع ترميز البروتين بين الحالات النشطة والمتوقفة مؤقتًا والصامتة باستخدام مزيج من الترسيب المناعي للكروماتين وتحليل النسخ 3 & # x02032.


مناقشة

في هذه الدراسة ، حددنا ديناميكيات إسكات الجينات على (المستقبل) Xi بواسطة RNA-seq الخاص بالأليل أثناء تمايز ESCs الأنثوية. قمنا بتحسين تعيين تسلسل الحمض النووي الريبي الخاص بالأليل بواسطة GSNAP [46] في إجراء فعال ومباشر ، وبالتالي الحصول على ملفات تعريف التعبير الجيني عالية الدقة غير المتحيزة من كلا الأليلين. تكشف حركية إسكات الجينات الفردية خلال XCI عن عنصر خطي في انتشار التعطيل على Xi. يتم دعم ذلك من خلال زيادة مسافة أربع مجموعات حركية مرتبطة بإسكات الجينات ، وكذلك من خلال النسبة العالية لإسكات الجينات بالقرب من XIC في مراحل مبكرة جدًا من XCI. قد يكون الهروب من XCI لثلاث مناطق بعيدة جدًا عن XIC ، في ES_Ts متباينة ذات ستة توقفات وكذلك في NPCs ، نتيجة للانتشار الخطي غير الكامل. لقد ثبت أن الإسكات بوساطة XCI لا يمكن أن يحدث إلا في فترة زمنية قصيرة من التطور / التمايز الجنيني يشار إليها أيضًا باسم "نافذة الفرصة" [53]. نتيجة لذلك ، قد تفشل الخلايا التي لا تكمل XCI خلال هذا الإطار الزمني في تعطيل أجزاء من الكروموسوم X الموجودة على مسافة أكبر من XIC وبالتالي يتم إسكاتها في وقت متأخر. الشخصيات غير القابلة للعب المستخدمة في الدراسة الحالية ، وكذلك الشخصيات غير القابلة للعب التي تم إنشاؤها بواسطة Gendrel et al. [52] التي توجد بها مناطق الهروب أيضًا ، تم اشتقاقها من ES_Ts ذات ست توقفات ESCs [35]. أثناء التمايز المكثف في المختبر تجاه الشخصيات غير القابلة للعب ، ربما تكون مجموعة فرعية من ESCs قد أكملت XCI (NPC_129-Xi) ، بينما في الخلايا الأخرى تظل عملية XCI غير مكتملة (* NPC_129-Xi و NPC_Cast-Xi). في الخلايا الأخيرة ، تظل أجزاء من Xi نشطة ، حيث لا يتم إسكاتها خلال نافذة الفرصة. على ما يبدو ، يتم التسامح مع نشاط الجينات غير الصامتة على Xi في NPCs ، على الرغم من أنه قد يؤثر على قابلية الخلية للحياة حيث لاحظنا أن خطوط * NPC_129-Xi و NPC_Cast-Xi NPC تُظهر مضاعفة مرات مقارنة بـ NPC_129-Xi.

إذا كانت مناطق الهروب بالفعل ناتجة عن XCI غير مكتمل أثناء نافذة الفرصة ، فإن توطينها في مناطق بعيدة جدًا عن XCI من شأنه أن يدعم نموذجًا خطيًا لانتشار XCI من XIC على X (في المستقبل). ومع ذلك ، على غرار ما تم عرضه لـ XCI المطبوع من الأب Xi أثناء التطور المبكر للفأر [54] ، فإن الخطية تشرح بوضوح فقط جزءًا من ديناميكيات الإسكات التي نلاحظها. يتم تعطيل الجينات المختلفة بالقرب من XIC في وقت متأخر ولا تظهر أي علامات على إسكات في نقاط زمنية مبكرة ، بينما يتم إسكات الجينات الأخرى البعيدة جدًا عن XIC مبكرًا. لذلك ، من المحتمل أن تلعب المكونات الأخرى مثل التنظيم المكاني للكروموسوم X و TADs (كما هو موضح أدناه) وبيئة الكروماتين المحلية أدوارًا مهمة في ديناميات إسكات على Xi. وبالفعل ، فقد ثبت أن أقدم المناطق تحتوي على إشغال مخصب لـ زيست تنتشر عبر كروموسوم X الخطي بأكمله ، لكن لديها قربًا مكانيًا من XIC [17 ، 18]. علاوة على ذلك ، يؤثر مستوى التعبير الجيني أيضًا على حركية إسكات XCI ، حيث نلاحظ أن الجينات المعبر عنها بشكل كبير تظهر تأخيرًا طفيفًا ولكن مهمًا في الإسكات مقارنة بالجينات المعبر عنها بشكل منخفض. قد يكون هذا بسبب حقيقة أن هذه الجينات المعبر عنها بشكل كبير تستغرق وقتًا أطول لتغيير بيئة الكروماتين المحلية عن طريق وضع علامات مرتبطة بالإسكات ، مثل H3K27me3 [22 ، 55 ، 56]. من ناحية أخرى ، يؤثر استقرار مختلف الحمض النووي الريبي أيضًا على حركية الإسكات المرتبط بـ X أثناء XCI. تتمتع RNAs المستقرة بعمر نصفي أطول ، وبالتالي ، ستظهر ديناميكيات إسكات أبطأ في تحليلنا. أظهرت دراسة حديثة تبحث في ثبات النصوص المرتبطة بـ X زيادة عامة في نصف العمر للنصوص المرتبطة بـ X مقابل النصوص الجسدية [57 ، 58]. من بين النصوص المرتبطة بـ X ، تراوح عمر النصف بين 2 و 15 ساعة ، وكان متوسط ​​عمر النصف 6 ساعات. نظرًا لأن هذا الإطار الزمني أقصر بكثير من مسار التمايز EB لمدة 8 أيام ، فمن المحتمل أن يكون لاستقرار الحمض النووي الريبي تأثير ضئيل على التجميع الذي قمنا به (الشكل 4). بدلاً من ذلك ، تم إملاء التجميع عن طريق إسكات النسخ على الكروماتين.

تتوافق مناطق الهروب الثلاثة المحددة في الدراسة الحالية (الشكلان 5 و 6) إلى حد كبير مع TADs كما هو موضح في ESCs الأنثوية غير المتمايزة. جنبًا إلى جنب مع ملاحظة أن مجموعات الهروب في الإنسان ترتبط ارتباطًا وثيقًا بـ TADs ، يشير هذا إلى دور وظيفي لـ TADs خلال XCI. سابقًا ، تم إشراك TADs في تنظيم XCI داخل XIC ، مع وجود مروجي Tsix و Xist في TADs المجاورة مع مصائر نسخية معاكسة [59]. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن TADs تتوافق مع مجموعات الجينات المنظمة بشكل منسق [59]. تشير الملاحظة الحالية إلى أن المناطق التي تهرب من XCI تتوافق مع TADs تشير إلى أن الجينات داخل TADs يتم تنظيمها بشكل مشترك للحث على الإسكات بطريقة من نوع المجال خلال XCI. قد يعني هذا أن TADs هي المقصورات الوظيفية في بنية الكروماتين ذات الرتبة الأعلى التي تستهدف التعطيل أثناء بدء XCI. بمجرد استهدافه ، قد يتم نشر الإسكات داخل TAD بحيث تصبح الجينات المرتبطة به معطلة. لا يزال يتعين حل كيفية عمل هذا ، ولكن الآليات الوظيفية قد تشبه تلك التي تعمل في الإسكات اللاجيني بعيد المدى (LRES) والتي من خلالها يمكن قمع مناطق كبيرة (حتى ميغا بايت) من الكروموسومات بشكل مشترك [60].

سويًا ، نلاحظ أن ديناميكيات XCI تتلاءم مع النماذج ثنائية الطور المقترحة سابقًا والتي يحدث فيها الانتشار الثانوي للتعطيل عبر ما يسمى بعناصر الترحيل أو محطات الطريق أو محطات الإرساء ، والتي لا تزال طبيعتها بعيدة المنال [18 ، 21 ، 22 ، 61] (انظر Ng et al. [62] للاطلاع على مراجعة حديثة). تشير دراستنا إلى أن TADs هي الأهداف الأساسية أثناء انتشار XCI ، وبعد ذلك يحدث الانتشار الثانوي داخل TADs. من المحتمل أن تكون مشاركة TADs في XCI في وقت مبكر جدًا أثناء عملية التعطيل ، حيث تبين أن Xi لديها منظمة كروموسومية أكثر عشوائية في مراحل لاحقة حيث يتم تقليل التنظيم العالمي في TADs واتصالات طويلة المدى محددة داخل TADs ضاعت [35 ، 59 ، 63]. هناك إمكانية مثيرة للاهتمام لمزيد من التحقيق في دور TADs أثناء تعطيل Xi (المستقبلي) وهي التحقيق في إسكات الجينات داخل TADs خلال XCI - على سبيل المثال ، خلال دورة وقت تكوين EB التي أجريناها. ومع ذلك ، فإن الدقة الحالية لـ RNA-seq الخاصة بالأليل تفتقر إلى الدقة لمثل هذا التحليل ، ويرجع ذلك أساسًا إلى (1) العدد المحدود للمواقع متعددة الأشكال المتاحة للتمييز بين الأليلات و (2) العمق العالي جدًا للتسلسل الضروري للحصول على أليل موثوق دعوات محددة للجينات المعبر عنها بشكل منخفض (والتي بحكم التعريف سيكون لها تغطية منخفضة على المواقع متعددة الأشكال). بالنسبة للدراسة الحالية ، حصلنا على معلومات أليلية لـ 259 جينًا مرتبطًا بـ X خلال دورة وقت التمايز EB ، بينما تتكون الكروموسومات X من 124 TADs (ملف إضافي 7: الجدول S5). هذا العدد المتوسط ​​من الجينات لكل TAD غير كافٍ لدراسة ديناميكيات التعبير داخل TADs.

إلى جانب الجينات الموجودة في مناطق الهروب ، لا توجد أي من الجينات المتبقية على الكروموسوم X في مجموعات من جينات الهروب المتجاورة. أيضًا ، تشترك جينات الهروب الأخرى في احتلال TAD حيث يتم توطينها مع الجينات التي تخضع لـ XCI. لذلك ، من المحتمل أن يتم توجيه هروب الجينات خارج مناطق الهروب من خلال السمات اللاجينية بخلاف TADs. قد يكون هذا هو الحال أيضًا بالنسبة لجين الهروب المعروف Ddx3x ، والذي يعد جزءًا من منطقة الهروب 2 ولكنه ليس جزءًا من TAD المرتبط بهذه المنطقة. بجانب جينات الهروب المذكورة في الجدول 1 ، اكتشفنا بعض الهروب منخفض المستوى (جدًا) في جميع خطوط NPC الثلاثة:

يُظهر 50 جينًا & lt10٪ مساهمة Xi في التعبير الكلي للجين (في معظم الحالات & lt1٪) يتوافق في الغالب مع خمس علامات تسلسل أو أقل (ملف إضافي 5: الجدول S4). اقترحت دراسة حديثة أبلغت عن اكتشاف مماثل في NPCs أن هذا مرتبط بالاسترخاء في الحالة اللاجينية في NPCs وكذلك في الخلايا الجذعية العصبية في أنسجة المخ [52] ، مما يشير إلى أن إعادة التنشيط من Xi يمكن أن تحدث لهذه الجينات. أيضًا بالنسبة لجينات الهروب الفردية مثل Kdm5c ، فقد تم الإبلاغ عن أنه تم إسكاتها في البداية في بداية XCI ، وبعد ذلك يتم إعادة تنشيطها لاحقًا أثناء التطور من Xi [38 ، 50]. ومع ذلك ، فإن غالبية جينات الهروب في الشخصيات غير القابلة للعب التي تم تحديدها في الدراسة الحالية (إلى حد كبير) تهرب من الإسكات أثناء إنشاء XCI ، لأنها موجودة في المجموعات الحركية "المتأخرة" أو "غير الصامتة" 3 أو 4 في تمايز الإناث EB . يشير هذا إلى أن جينات الهروب مستبعدة بالفعل من XCI منذ البداية ، وأن معظم جينات الهروب هذه ، من المحتمل أن تحتوي على سمات وراثية (epi) تستبعدها من أن يتم إسكاتها أثناء انتشار XCI.

من خلال تحديد المستويات العالمية للتعبير الجيني في مراحل مختلفة من التمايز والتطوير ، توفر بياناتنا علاوة على ذلك نظرة ثاقبة لديناميكيات تعويض الجرعة بين كروموسوم X والجسيمات الذاتية. في ESCs ، يكون المستوى المتوسط ​​للتعبير الجيني المرتبط بـ X في الإناث والذكور أعلى بمقدار 1.50 و 0.86 ضعفًا ، على التوالي ، من التعبير من الجينات الصبغية (ملف إضافي 1: الشكل S1 الشكل 2 ج). بالمقارنة مع ESCs ، يتم تقليل التعبير عن الجينات الأنثوية المرتبطة بـ X في الخلايا الجذعية للخلايا الجذعية (EpiSCs) ، في حين يتم زيادة التعبير عن جينات الذكور المرتبطة بـ X. التعبير الجسدي مستقر نسبيًا بين ESCs و EpiSCs للإناث والذكور. ينتج عن هذا مستويات متشابهة جدًا من التعبير بين الجينات الجسدية والجينات المرتبطة بـ X في EpiSCs للذكور والإناث (ملف إضافي 1: الشكل S1) ، بما يتماشى مع الملاحظات السابقة لـ Lin et al. [23]. يتم الحصول على ديناميكيات متشابهة جدًا أثناء تمايز EB ، حيث يتم تنظيم الجينات المرتبطة بـ X قليلاً من Xa في الإناث (الشكل 2 ج) وكروموسوم X المفرد في الخلايا الجذعية الجنينية للذكور (الشكل 3 ب ، اللوحة اليمنى). يشير هذا إلى أن التعويض الكامل للجرعة في أنواع الخلايا المتمايزة يتم تحقيقه عن طريق تنظيم الجينات على Xa في الإناث وكروموسوم X المفرد في خلايا الذكور أثناء التطور الجنيني المبكر.


النقاط الرئيسية

أثناء التمايز الخلوي ، لا يلزم سوى مجموعات فرعية محددة من الجينات لتنفيذ الوظيفة المتخصصة للخلية. تم إسكات البقية. يتم حزم المناطق غير النشطة للكروموسوم في نسخ متغايرة غير نشطة ، بوساطة إلغاء تنشيط هيستون ، هذه المناطق فريدة لكل نوع خلية متمايزة.

التقوية الجينية هي شرط أساسي لتنشيط الجينات. هذا يفتح بنية الكروماتين بحيث يكون الحمض النووي متاحًا لبروتينات المنشط اللازمة للنسخ. مطلوب أستلة هيستون للتوسط في فتح الكروماتين هذا.

يتم تنظيم الكروموسومات والجينات في مناطق نووية محددة ، تسمى مناطق الكروموسوم داخل هذا ، وتقع المناطق النشطة المحتملة في الأطراف. تحتل هذه المناطق مواقع غير عشوائية في نواة الطور البيني ، خاصة بكل نوع خلية. من المقترح حدوث تغييرات في العمارة النووية أثناء التمايز.

تحدث الوظائف النووية مثل النسخ أيضًا في أجزاء محددة من النواة. لذلك ، قد تسمح العمارة النووية للجينات النشطة بالتوطين في المناطق المسموح بها للنسخ.

دليل من ذبابة الفاكهة سوداء البطن والثدييات تشير إلى أن وضع الجين بالقرب من الهيتروكروماتين المركزي غالبًا ما يعزز إسكات الجين وبالمثل ، فإن عزل الجين في حجرة متساهلة غالبًا ما يسمح بفتح الكروماتين الموروث بشكل ثابت للموضع.

يُقترح تعديل بنية الكروماتين على مناطق كبيرة عن طريق تجميع البروتينات على رابطة الدول المستقلة- عناصر فاعلة تسمى عناصر كاتم الصوت. البروتينات التي ترتبط بهذه العناصر تشمل بروتينات السير في الخميرة ، وبروتينات بولي كومب فيها ذبابة الفاكهة. يقترح هذا الهيكل القمعي للانتشار على طول الكروموسوم.

تشير الدراسات إلى أن العناصر المُحسِنة يمكنها مواجهة أحداث الإسكات هذه. يُقترح ربط عناصر المُحسِّن لتجنيد الجين إلى منطقة في النواة غنية بعوامل النسخ وأسيتيل هيستون المطلوبة لتنشيط النسخ.

يرتبط السرطان باضطراب أنماط التعبير الجيني والفوضى العالمية لتنظيم الكروموسوم داخل النواة.


المقدمة

الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) هي المجموعة التأسيسية للخلايا التي ستؤدي في النهاية إلى ظهور الأمشاج الناضجة. على عكس الكائنات الحية التي تحتوي على خط جرثومي محدد بشكل فسيفساء ، يتم تحديد الخلايا الجرثومية الأولية في جنين الفأر من خلال آلية استقرائية تتطلب وجود العديد من البروتينات العظمية المنشأ (BMPs) المنبثقة من الخلايا الجسدية المحيطة (Fujiwara et al. ، 2001 Lawson et al. ، 1999 Ying et al.، 2000 Ying and Zhao، 2001). يمكن أولاً اكتشاف الخلايا الجرثومية الأولية في الأديم المتوسط ​​خارج الجنين في 7.25 يومًا بعد الجماع (DPC) (Ginsburg et al. ، 1990). بنسبة 8.5 نقطة في البوصة ، تدخل الخلايا الجرثومية الأولية الجنين المناسب وتهاجر بنشاط من خلال الأديم الباطن المعى الخلفي ، مستعمرة الغدد التناسلية النامية بين 10.5 و 11.5 ديسيبلون. خلال هذا الوقت ، تتكاثر الخلايا الجرثومية الأولية من مجموعة أولية من 45 خلية عند 7.5 ديسيبلون إلى 25000 خلية عند 13.5 ديسي سي عند توقف التكاثر (تام وسنو ، 1981). يبدأ التمايز الجنسي للخط الجرثومي عند 13.5 نقطة في البوصة مع دخول الخلايا الجرثومية الأنثوية المرحلة الأولى من الانقسام الاختزالي. داخل الغدد التناسلية الذكرية ، تمنع الإشارة التي يعتقد أنها تنشأ من حبال الخصية الدخول في الانقسام الاختزالي ويدخل ذكر الخلايا الجرثومية الأولية في توقف الانقسام بمقدار 14.5 dpc (McLaren ، 1983). قبل هذه التغييرات ، كانت الخلايا الجرثومية الأولية للذكور والإناث غير مبالية جنسياً ، وقادرة على اتباع مسار الذكور أو الإناث (McLaren and Southee ، 1997).

بعد فترة وجيزة من دخول الخلايا الجرثومية الأولية إلى الحواف البولية التناسلية ، تخضع الخلايا الجرثومية للذكور والإناث على حد سواء لمجموعة مشتركة من التغييرات المستقلة عن التمايز الجنسي. تحدث التغييرات في مورفولوجيا الخلية وخصائص التصاق الخلية أثناء انتقال الخلايا الجرثومية إلى حالة غير مهاجرة (De Felici et al. ، 1992 Donovan et al. ، 1986 Garcia-Castro et al. ، 1997). تتوقف الخلايا الجرثومية الأولية للذكور والإناث أيضًا عن التكاثر ، وقد قللت من القدرة على تكوين خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات (ماتسوي وآخرون ، 1992 مكلارين ، 1984 ريسنيك وآخرون ، 1992) ، وتخضع لموجة من موت الخلايا المبرمج (Coucouvanis et al. ، 1993 Wang et. آل ، 1998). تترافق أحداث التمايز هذه مع تغييرات في التعبير الجيني مثل بعض جينات واصمات الخلايا الجرثومية ، مثل Tnap (Akp2 - الماوس الجينوم المعلوماتية) و Zfp148، خاضعة للتنظيم (Donovan et al. ، 1986 Hahnel et al. ، 1990 Takeuchi et al. ، 2003). الجينات الأخرى بما في ذلك مفه (دي دي اكس 4 - معلوماتية جينوم الماوس) ، Scp3 (Sycp3 - معلوماتية جينوم الماوس) ، دزل ، مجيب 4 و Gcna1 خلال هذا الوقت (Cooke et al.، 1996 Di Carlo et al.، 2000 Fujiwara et al.، 1994 Osterlund et al.، 2000).

بالإضافة إلى أحداث التمايز المذكورة أعلاه ، تتوسط الخلايا الجرثومية الأولية في عمليتين أساسيتين في مجال الوراثة اللاجينية. أولاً ، تعيد أنثى الخلايا الجرثومية الأولية تنشيط كروموسوم X الصامت ، مما يضمن أن كل بويضة تحمل كروموسوم X نشطًا (Monk and McLaren، 1981 Tam et al.، 1994). ومن المثير للاهتمام ، أن القدرة على إعادة تنشيط كروموسوم X غير النشط لا تقتصر على الخلايا الجرثومية الأنثوية ، حيث تمتلك الخلايا الجنسية الذكرية XXY أيضًا هذه القدرة على إعادة التنشيط (Mroz et al. ، 1999). ثانيًا ، تحمل الخلايا الجرثومية المهاجرة علامات بصمة خاصة بالوالدين من أصل معين ومستويات عالية من المثيلة الخاصة بالأليل التي تساهم في التعبير أحادي الموازي في الخلايا الجرثومية الأولية المهاجرة. تصبح هذه المناطق الميثيلية التفاضلية ناقصة الميثيل حيث تستعمر الخلايا الجرثومية الأولية الغدد التناسلية ، مما يؤدي إلى فقدان البصمة والتعبير الجيني biallelic (Hajkova et al. ، 2002 Lee et al. ، 2002 Szabo et al. ، 2002). ومع ذلك ، فإن هذه الموجة من إزالة الميثيل لا تقتصر على المواقع المطبوعة وجينات الكروموسوم X ، حيث أن العديد من الجينات غير المطبوعة والتسلسلات المتكررة تظهر أيضًا انخفاض الميثيل في هذا الوقت (Hajkova et al.، 2002 Lane et al.، 2003 Lees- موردوك وآخرون ، 2003).

لقد تم التحقيق في الآليات التنظيمية الكامنة وراء تمايز الخلايا الجرثومية بعد الهجرة. تشير العديد من الدراسات إلى أن التطوير المستمر لـ PGC ينظمه برنامج داخلي للخلية بدلاً من الإشارات الاستقرائية من الغدد التناسلية. تدخل الخلايا الجرثومية الأولية الموجودة في مواقع خارج الرحم الانقسام الاختزالي وتبدأ في التعبير عن علامة ما بعد الهجرة GCNA1 في الموعد المحدد دون التعرض للتلال البولي التناسلي (وانج وآخرون ، 1997). لقد ثبت أن الخلايا الجذعية الجنينية تتمايز لتشكل خلايا شبيهة بـ PGC يمكنها الاستمرار في تكوين خلايا تشبه كل من البويضات والخلايا المنوية ، مما يدل أيضًا على أن تمايز PGC يمكن أن يحدث بشكل مستقل عن بيئة الغدد التناسلية (Geijsen et al. ، 2004 Hubner et al. ، تويوكا 2003 وآخرون ، 2003). أخيرًا ، تم اقتراح وقف تكاثر الخلايا الجرثومية ليكون جوهريًا في الخلية (Ohkubo et al. ، 1996).

لقد اختبرنا سابقًا إمكانات الخلايا الجرثومية السابقة للهجرة في التمايز في الثقافة وأبلغنا أن 8.5 dpc من الخلايا الجرثومية الأولية للبكتيريا في ثقافة المغذي يمكن أن تفرق للتعبير عن GCNA1 في الجدول الزمني الصحيح (Richards et al. ، 1999). والمثير للدهشة أن معدل التمايز في المزرعة زاد عندما تعرضت الخلايا الجرثومية الأولية لعامل إزالة ميثيل الحمض النووي 5-أزاسيتيدين أو مثبط هيستون ديستيلاز trichostatin A (معتوق وريسنيك ، 2003). يشير هذا إلى أن الآليات اللاجينية قد تساهم في تنظيم تمايز الخلايا الجرثومية.

هنا ، نحقق أيضًا في دور مثيلة الحمض النووي في عملية تمايز PGC. نقدم دليلًا على أن العديد من الجينات الخاصة بالخلايا الجرثومية بعد الهجرة يتم إزالتها في الخلايا الجرثومية لأنها تستعمر التلال التناسلية وأن إزالة ميثيل الحمض النووي تتحكم في التعبير الزمني لهذه الجينات في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن هذه الجينات الخاصة بالخلايا الجرثومية بعد الهجرة يتم التعبير عنها خارج الرحم في الأجنة المتحولة لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي ، مما يشير إلى أن مثيلة الحمض النووي هي آلية لإسكات الجينات الخاصة بالخلايا الجرثومية في الأنسجة الجسدية. توفر هذه النتائج أول دليل في الجسم الحي على تنظيم الجينات الجنينية الخاصة بالأنسجة بوساطة التغيرات الديناميكية في مثيلة الحمض النووي.


تنظيم الجينات بواسطة H3K9me3 في التنمية

دور H3K9me3 في تنظيم الجينات في الأنسجة الجسدية

في الميتازوان ، يكون تكوين الأمشاج والتكوين الجنيني المبكر مصحوبًا بإعادة برمجة جينية واسعة النطاق يتم خلالها محو معظم علامات الكروماتين ، بما في ذلك H3K9me3 ، لمنح القدرة الكاملة للزايجوت وإعادة إنشائها لاحقًا. إن إعادة إنشاء H3K9me3 في الأنسجة الجسدية أمر ضروري لتطور النمو الطبيعي في ذبابة الفاكهة والثدييات. ومن المثير للاهتمام ، أن فقدان مؤثرات الإسكات التي تتحكم بشكل أساسي في ترسيب H3K9me3 في الهيتروكروماتين التأسيسي يؤدي إلى أنماط ظاهرية أقل حدة من اضطراب ترسيب H3K9me3 خارج الهيتروكروماتين التأسيسي. على سبيل المثال ، الفئران الطافرة لاغية مزدوجة بالنسبة لاثنين من paralogs SUV 39 ، والتي تتمركز بشكل أساسي في المناطق المركزية ، وتعرض عدم استقرار الكروموسومات والعيوب المتعددة ، ومع ذلك فإن بعض الحيوانات تعيش حتى سن الرشد (Peters et al. ، 2001). على العكس من ذلك ، عند فقدان SetDB1 / ESET ، والتي تشارك بشكل أساسي في ترسيب H3K9me3 خارج الهيتروكروماتين التأسيسي ، تفشل كتلة الخلية الداخلية للجنين قبل الزرع في التكون بشكل صحيح ، مما يؤدي إلى قاتلة ما قبل الزرع (دودج وآخرون ، 2004). وبالمثل ، في ذبابة الفاكهة, سو (فار) 3-9 الطفرات الفارغة قابلة للحياة وخصبة (Tschiersch et al. ، 1994) ، بينما SetDB1 طفرات فقدان الوظيفة مميتة متماثلة اللواقح (Seum et al. ، 2007). فقدان العديد من أفراد عائلة HP1 من قراء H3K9me3 ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة ينتج عن Su (var) 2-5 / HP1a والفأر Cbx1 / HP1 أيضًا أنماطًا قاتلة من الناحية التنموية (Aucott et al. ، 2008 Eissenberg et al. ، 1990 Eissenberg et al. ، 1992 Kellum and Alberts ، 1995) ، مما يبرز الدور الأساسي لـ H3K9me3 في التطور المبكر.

H3K9me3 في الجنين المبكر و ESCs

تأتي معظم المعرفة الحالية حول دور H3K9me3 في التطور الجسدي المبكر من الدراسات التي أجريت على أنظمة الفئران ، والتي أظهرت أن إسكات الجينات بواسطة H3K9me3 مهم بشكل خاص أثناء التطور الجنيني قبل الزرع ، والتجديد الذاتي لـ ESC ، وتمايز الخلايا والتزام نسب الخلية.

ثبت جيدًا أن هناك تفاعلًا معقدًا بين H3K9me وميثلة الحمض النووي في أجنة الثدييات (Allis and Jenuwein، 2016 Cedar and Bergman، 2009). يوفر مثيلة الحمض النووي نمطًا مستقرًا وراثيًا من الإسكات ، والذي يتم محوه مؤقتًا أثناء تكوين الأمشاج وعند الإخصاب ، مع حدوث إعادة المثيلة في وقت الزرع (Reik et al. ، 2001 Smith et al. ، 2012 Wu et al. ، 2016). خلال هذا الوقت ، يتوسط H3K9me3 قمع الجينات واللينقولات ، ويوجه إعادة إنشاء مثيلة الحمض النووي لاحقًا (Allis and Jenuwein ، 2016 Cedar and Bergman ، 2009). مع تقدم التطور ، يتم إسكات الجينات المرتبطة بتعدد القدرات ، بينما يتم تنشيط الجينات المشاركة في مصائر الخلايا البديلة ، هذه العمليات تشمل أيضًا H3K9me3. كشفت الخرائط عالية الدقة لـ H3K9me3 في جنين الفأر بواسطة ChIP-seq عن توقيت منظم بدقة لإنشاء H3K9me3 في عناصر جينومية مختلفة (Wang et al. ، 2018). H3K9me3 is present at some developmental genes and some long terminal repeats (LTRs) in oocytes and zygotes, but is lost at the two-cell stage. However, globally the two-cell stage is characterized by a stark increase in H3K9me3, which initially accumulates predominantly on LTRs (Wang et al., 2018). Depletion of SetDB1, KAP1/Trim28, Sumo2 and the histone chaperone Chaf1a leads to H3K9me3 loss and upregulation of several LTRs. In addition, many embryos arrest at the blastocyst stage upon knockdown of these factors, highlighting their importance for proper early development (Wang et al., 2018). As development continues into the implantation stage, H3K9me3 also begins to appear at host genes where different lineages acquire distinct H3K9me3 signatures. Typically, in a specific cell type H3K9me3 is deposited at genes that are characteristic of alternative cell fates (Wang et al., 2018). Thus, the H3K9me3 mark appears to suppress lineage-inappropriate gene expression.

The role of SetDB1-mediated TE, and gene repression and cell fate control is also apparent from studies in mouse ESCs. As in early embryos, LTRs in ESCs are marked by H3K9me3. Depletion of KAP1/Trim28, SetDB1/ESET and its co-factor MCAF1/ATF7IP, the KRAB-ZFP Zfp809, Morc2a, Chaf1a/b, Sumo2 and SUMO pathway enzymes leads to pervasive upregulation of multiple (partially overlapping) ERV targets (Cossec et al., 2018 Fukuda et al., 2018 Karimi et al., 2011 Martens et al., 2005 Matsui et al., 2010 Mikkelsen et al., 2007 Rowe et al., 2010 Wolf and Goff, 2007 Yang et al., 2015). In addition, depletion of the H3K9me3 effectors SetDB1, KAP1 and several KRAB-ZFPs from ESCs leads to de-repression of a subset of protein-coding genes (Ecco et al., 2016 Karimi et al., 2011 Rowe et al., 2013 Wolf et al., 2015b). Notably, a significant fraction of genes activated upon SetDB1 or Trim28 depletion reside in proximity to TEs (mostly ERV and LINEs), and many become transcribed from alternative TSSs residing in concomitantly upregulated ERV regions, thereby forming chimeric transcripts (Karimi et al., 2011 Rowe et al., 2013). Furthermore, SetDB1 and H3K9me3 have been reported to occupy promoter regions in ESCs and early embryos, suggesting that they directly target specific host genes (Bilodeau et al., 2009 Karimi et al., 2011 Wang et al., 2018 Yuan et al., 2009). Consistent with a role for H3K9me3-dependent silencing in maintaining cell fate, depletion of silencing factors from ESCs is generally associated with loss of cell identity. For example, depletion of KAP1/Trim28, Chaf1a, SUMO2/3 or the SUMO E2 ligase Ubc9 leads to conversion of the transcription profile of ESCs to a state resembling that of the two-cell embryo, i.e. a two-cell (2C)-like state, suggesting that these factors maintain the ESC state by repressing 2C-specific genes, including the master regulator of the 2C state Dux (Cossec et al., 2018 Ishiuchi et al., 2015 Macfarlan et al., 2012). Elimination of SetDB1 from ESCs also alters their fate, with cells reported to either die or shift to trophoblast-like fate (Bilodeau et al., 2009 Yeap et al., 2009 Yuan et al., 2009). A large fraction of genes repressed by SetDB1/H3K9me3 are developmental regulators (Bilodeau et al., 2009 Karimi et al., 2011 Yuan et al., 2009). Notably, a subset of genes repressed by SetDB1/H3K9me3 in ESCs also encode factors normally expressed in testis and oocytes (Karimi et al., 2011). A recent study suggested that SetDB1 can be directly guided to at least some germline-specific genes in ESCs by the transcription factor MAX (Tatsumi et al., 2018). Moreover, many genes associated with the germline transcriptional program, such as P-granule components and meiosis genes, are also occupied by SUMO in ESCs (Cossec et al., 2018). Together, these data suggest that, in ESCs, H3K9me3-mediated repression involving SetDB1 and SUMO also plays an important role in maintaining cell identity by suppressing alternative fates. Interestingly, some targets of SetDB1/H3K9me3 in ESCs are also marked by H3K27me3 and DNA methylation, indicating several layers of repression for certain genomic targets (Bilodeau et al., 2009 Karimi et al., 2011).

H3K9me3 functions in lineage commitment and cell differentiation

Gene repression through SetDB1-dependent H3K9 methylation is not restricted to ESCs and pre-gastrulation embryos. Despite a prevailing model that TEs in adult somatic tissues of mammals are silenced by DNA methylation, KRAB-ZFP/KAP1/SetDB1-dependent transcriptional repression was reported to control several cell type-specific subsets of ERVs in a range of adult mouse cell types, including embryonic fibroblasts (MEFs), pre-adipocytes, hepatocytes and B-lymphocytes (Collins et al., 2015 Ecco et al., 2016 Fasching et al., 2015 Kato et al., 2018 Wolf et al., 2015b).

Multiple examples highlight a role for H3K9me3 in cell type-specific gene regulation. High resolution analysis of heterochromatin formation in murine cells from different germ layers, and from hepatic and pancreatic lineages revealed that the number of H3K9me3-marked regions in different lineages increases from early developmental stages until gastrulation, although H3K9me3 is subsequently removed as cells progress into specific lineages (Nicetto et al., 2019). Transient deployment of H3K9me3 in germ layer cells is required to repress genes associated with mature cell function, and failure to properly establish this mark leads to expression of lineage-inappropriate genes later on (Nicetto et al., 2019). Silencing by SUV39H1-dependent H3K9me3 and HP1α deposition was shown to be involved in lineage commitment of Th2 lymphocytes by repressing Th1-specific loci (Allan et al., 2012), and in adipogenesis by restricting the expression of master regulatory genes until differentiation is required (Matsumura et al., 2015). H3K9me3-mediated regulation of host genes and TEs by SetDB1 has also been implicated in transcriptome regulation and normal cell fate switches during murine neurogenesis and oligodendrocyte differentiation (Jiang et al., 2017 Liu et al., 2015 Tan et al., 2012). Notably, SetDB1-repressed genes in neuronal tissue are enriched in factors characteristic for other lineages, and particularly in germline-specific genes (Tan et al., 2012). Germline genes are also targets of SetDB1- and SUMO-mediated repression in ESCs (as mentioned above), pointing to a ubiquitous role of this pathway in suppressing germ cell fate. Finally, Hi-C analysis of SetDB1-depleted postnatal mouse forebrain neurons revealed alterations in chromosomal conformation resulting from CTCF binding to cryptic sites normally occupied by H3K9 and DNA methylation (Jiang et al., 2017).

The H3K9me3 mark has also been found to impede cell re-programming (Becker et al., 2016). Studies in human embryonic fibroblasts, for example, identified over 200 H3K9me3-enriched genomic regions, with an average size of 2.2 Mb, that are refractory to binding of the pioneer transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and Myc (OKSM), thereby impeding re-programming to pluripotency (Soufi et al., 2012). Knockdown of the HMTs SUV39H1 and SetDB1, the histone chaperone CAF1 subunits Chaf1a and Chaf1b, Cbx3/HP1γ, Sumo2 and SUMO pathway components, or overexpression of the Jmjd2c demethylase, improve OKSM binding and reprogramming of fibroblasts to induced pluripotent cells in human or murine systems (Borkent et al., 2016 Cheloufi et al., 2015 Chen et al., 2013 Cossec et al., 2018 Onder et al., 2012 Soufi et al., 2012 Sridharan et al., 2013). Similar ‘reprogramming-resistant regions’ (RRRs) marked by H3K9me3 impede epigenetic reprogramming upon somatic cell nuclear transfer, with overexpression of the H3K9 demethylase Kdm4d or simultaneous depletion of the two SUV39 paralogs partially releasing this impediment (Matoba et al., 2014). Notably, a detailed study of the role of SUMO in the reprogramming of MEFs to pluripotency revealed that, in this context, SUMO is required to maintain the activity of fibroblast-specific enhancers (Cossec et al., 2018). This function is in stark contrast to the role of SUMO in ESCs, where it suppresses RRRs and the 2C-like transcriptome, highlighting a context-dependent function of protein SUMOylation (Cossec et al., 2018).

The role of H3K9me3 in somatic tissues in fruit flies is less well understood. dSetDB1/Eggless is the only essential HMT in D. melanogaster. dSetDB1 appears to be responsible for initial deposition of H3K9me3 and HP1 at many regions in the early embryo (Seller et al., 2019), and dSetDB1 mutations are associated with a wide variety of developmental defects and lethality (Brower-Toland et al., 2009 Stabell et al., 2006 Tzeng et al., 2007). As SetDB1-dependent H3K9me3 is present at multiple genomic loci, including nearly the entire chromosome 4 (which contains 79 genes and is enriched in repeats), the severe phenotypes of SetDB1 loss-of-function mutations are likely due to pleiotropic effects. Factors that recruit SetDB1 to its genomic targets in fly somatic tissues have yet to be established. في ذبابة الفاكهة, mutations in RNAi factors, including Piwi, affect PEV and H3K9me3 in somatic tissues not known to have an active piRNA pathway (Gu and Elgin, 2013 Pal-Bhadra et al., 2004). As piRNA/Piwi are maternally loaded into the egg (but not zygotically expressed outside of the gonads), an attractive model is that maternal piRNA/Piwi complexes guide initial heterochromatin establishment in the early embryo, which is later maintained piRNA independently. There are also some H3K9me3-marked genes in regions that do not have local TEs and cannot be targeted by piRNA, pointing to the existence of piRNA-independent targeting mechanisms (Ninova et al., 2019b). DNA-binding proteins that recruit SetDB1 analogous to the vertebrate-specific KRAB-ZFP family have not been identified.

H3K9me3 and gene silencing in germ cells

Germline specification, gonad development and gametogenesis are highly orchestrated processes associated with extensive epigenetic re-programming. As germ cells carry the genetic material to be transmitted to offspring, they must also be well protected from damaging TE activity. Chromatin modification by H3K9me3 plays an essential role in germ cell development and fertility in both vertebrate and invertebrate animals. Most current understanding of transcriptional repression by H3K9me3 in germ cells comes from studies in the male germline of mice, and in the female germline of ذبابة الفاكهة.

In mice, a population of epiblast cells in the post-implantation embryo forms primordial germ cells (PGCs): the precursors of oocytes and spermatozoa. SetDB1 depletion at early stages of development (prior to E6.5 by Sox2Cre cKO and at E9.5 by TnapCre cKO) was shown to repress PGC formation and lead to gonadal hypotrophy in adults (Liu et al., 2014 Mochizuki et al., 2018). During PGC-like cell induction, SetDB1 was suggested to directly repress several transcription factors involved in mesoderm cell fate, thereby maintaining proper cell identity (Mochizuki et al., 2018). In E13.5 PGCs, SetDB1 was shown to control H3K9me3 levels and repress a subset of retrotransposons from the ERV and LINE1 classes, as well as a number of host genes (Liu et al., 2014). As in other systems, many genes deregulated upon SetDB1 loss are not directly marked by H3K9me3 but reside in the proximity of or initiate their transcription from within TEs (Liu et al., 2014). The factors that guide H3K9 methylation by SetDB1 in early PGCs are not known. Metazoan germline cells typically possess an active piRNA pathway. However, Miwi2, the only nuclear Piwi protein in mice, is not expressed until E14.5-15.5 (Aravin et al., 2008), thus H3K9me3 deposition before this stage is likely piRNA independent. It is possible that, as in other tissues, TEs in early germ cells are repressed by KRAB-ZFPs, but this hypothesis needs to be addressed.

In addition to functioning in PGCs and testis, SetDB1 has been shown to regulate the expression of host genes, several TEs and associated chimeric transcripts in mouse oocytes (Eymery et al., 2016 Kim et al., 2016). While mammalian oocytes express Piwi proteins and piRNAs, the mechanisms of H3K9me3 establishment at different genomic targets in this system has not been comprehensively characterized.

في ذبابة الفاكهة, H3K9me3-mediated silencing is best understood in the ovary. Of the two main H3K9 HMTs that induce trimethylation in ذبابة الفاكهة, SetDB1/Eggless is required throughout the entire course of oogenesis, from germ cell differentiation to egg maturation, as well as for the somatic follicular cells that support the ovary, while Su(var)3-9 is not essential for fertility (Clough et al., 2007 Clough et al., 2014). Functionally, SetDB1/Eggless acts at multiple levels, including the control of TE expression by the piRNA pathway and repression of lineage-specific genes. Unlike Su(var)3-9 (Sienski et al., 2015), SetDB1 is involved in piRNA-dependent TE repression not only by being part of the piRNA-mediated transcriptional silencing pathways but also by regulating piRNA production. في D. melanogaster, primary piRNAs are generated from discrete genomic loci termed piRNA clusters (Brennecke et al., 2007). Most piRNA clusters in germ cells are characterized by a unique epigenetic landscape consisting of H3K9me3, the germline-specific HP1 variant Rhino/HP1d (a ذبابة الفاكهة-specific HP1 homolog) and several other factors that are required for their transcription and piRNA production (Andersen et al., 2017 Chen et al., 2016 Mohn et al., 2014 Rangan et al., 2011). In the nucleus, piRNA-loaded Piwi proteins recognize nascent transcripts of active TEs and induce local H3K9 trimethylation and co-transactional silencing (Klenov et al., 2011 LeThomas et al., 2013 Rozhkov et al., 2013 Sienski et al., 2012). SetDB1/Eggless depletion leads to H3K9me3 loss from TE targets and loss of piRNAs (Rangan et al., 2011). While loss of H3K9me3 at TE targets is probably partly due to loss of piRNA guides, several lines of evidence show that SetDB1 is also directly involved in H3K9me3 deposition downstream of the piRNA/Piwi complex. Piwi is not known to interact with any HMTs. However, two of Piwi's interacting partners, Panoramix (Panx)/Silencio and the SUMO E3 ligase Su(var)2-10, induce H3K9me3 deposition when recruited to chromatin in a process that is dependent on SetDB1 and its conserved co-factor Wde (ATF7IP/MCAF1 in mammals) (Ninova et al., 2019a preprint Sienski et al., 2015 Yu et al., 2015). Furthermore, SetDB1/Wde recruitment requires SUMO and the SUMO E3 ligase activity of Su(var)2-10 (Ninova et al., 2019a preprint). Collectively, these findings lead to a model in which Su(var)2-10 interacts with Piwi/Arx/Panx and acts to induce SUMO-dependent recruitment of Wde/SetDB1, which in turn deposits H3K9me3 at piRNA targets (Ninova et al., 2019a preprint) (Fig. 3B).

As in mammalian systems, epigenetic silencing of TEs affects the host transcriptome of ذبابة الفاكهة germ cells. For example, H3K9me3 loss is associated with activation of cryptic promoters within TE sequences, the appearance of chimeric or truncated transcripts and mis-regulation of canonical gene isoforms (Ninova et al., 2019b). Finally, even though the piRNA pathway is the only known mode of H3K9me3 deposition in ذبابة الفاكهة ovaries, a recent ChIP-seq study revealed a number of discrete H3K9me3 peaks at euchromatic genes that are conserved, show no evidence of TE insertions or targeting by piRNAs, and do not lose H3K9me3 upon Piwi depletion, i.e. are likely piRNA-independent (Ninova et al., 2019b). About 20% of these H3K9me3-marked genes become upregulated upon knockdown of the SUMO ligase Su(var)2-10, suggesting that they are regulated in a SUMO-dependent manner and possibly through SetDB1. Notably, this set primarily includes genes characteristic of other tissues such as the testis or the central nervous system (Ninova et al., 2019b). It was recently demonstrated that the H3K9me3 effectors SetDB1, Wde and HP1a are required to confer transcriptional repression of male germline fate in the ovary (Smolko et al., 2018). Among other targets, SetDB1/Wde-dependent H3K9me3 suppresses the male-specific isoform of the master regulator of sex identity phf7 (Smolko et al., 2018). Thus, in addition to its role in constitutive heterochromatin and TE repression, epigenetic regulation by H3K9me3 in the female germline appears to grant tissue-specific gene repression to secure female germ cell identity (Ninova et al., 2019b Smolko et al., 2018). The presence of discrete and TE-independent H3K9me3 peaks in otherwise euchromatic regions in female germ cells suggests the existence of a piRNA-independent mode of SetDB1 recruitment, and a regulatory mechanism that restricts H3K9me3 spreading in this genomic context.

Interestingly, a recent study in ذبابة الفاكهة showed a role for the conserved factor L(3)mbt in lineage-inappropriate gene repression in the female germline and soma (Coux et al., 2018). The mammalian L3MBTL2 homolog (involved in PRC1.6) is also required for the repression of germline-specific genes in mouse ESCs (Maeda et al., 2013 Stielow et al., 2018 Tatsumi et al., 2018). In the future, it would be worthwhile comparing targets of SetDB1/H3K9me3 and other silencing complexes, and investigating any potential cooperation between them.


الوصول إلى المستند

  • APA
  • مؤلف
  • BIBTEX
  • هارفارد
  • اساسي
  • RIS
  • فانكوفر

Zinc finger proteins orchestrate active gene silencing during embryonic stem cell differentiation. / Kwak, Sojung Kim, Tae Wan Kang, Byung Hee Kim, Jae Hwan Lee, Jang Seok Lee, Han Teo Hwang, In Young Shin, Jihoon Lee, Jong Hyuk Cho, Eun Jung Youn, Hong Duk .

In: Nucleic Acids Research , Vol. 46, No. 13, 27.07.2018, p. 6592-6607.

مخرجات البحث: المساهمة في المجلة ›المقال› مراجعة الأقران

T1 - Zinc finger proteins orchestrate active gene silencing during embryonic stem cell differentiation

N1 - Publisher Copyright: © The Author(s) 2018. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.

N2 - Transcription factors and chromatin remodeling proteins control the transcriptional variability for ESC lineage commitment. During ESC differentiation, chromatin modifiers are recruited to the regulatory regions by transcription factors, thereby activating the lineage-specific genes or silencing the transcription of active ESC genes. However, the underlying mechanisms that link transcription factors to exit from pluripotency are yet to be identified. In this study, we show that the Ctbp2-interacting zinc finger proteins, Zfp217 and Zfp516, function as linkers for the chromatin regulators during ESC differentiation. CRISPR-Cas9-mediated knock-outs of both Zfp217 and Zfp516 in ESCs prevent the exit from pluripotency. Both zinc finger proteins regulate the Ctbp2-mediated recruitment of the NuRD complex and polycomb repressive complex 2 (PRC2) to active ESC genes, subsequently switching the H3K27ac to H3K27me3 during ESC differentiation for active gene silencing. We therefore suggest that some zinc finger proteins orchestrate to control the concise epigenetic states on active ESC genes during differentiation, resulting in natural lineage commitment.

AB - Transcription factors and chromatin remodeling proteins control the transcriptional variability for ESC lineage commitment. During ESC differentiation, chromatin modifiers are recruited to the regulatory regions by transcription factors, thereby activating the lineage-specific genes or silencing the transcription of active ESC genes. However, the underlying mechanisms that link transcription factors to exit from pluripotency are yet to be identified. In this study, we show that the Ctbp2-interacting zinc finger proteins, Zfp217 and Zfp516, function as linkers for the chromatin regulators during ESC differentiation. CRISPR-Cas9-mediated knock-outs of both Zfp217 and Zfp516 in ESCs prevent the exit from pluripotency. Both zinc finger proteins regulate the Ctbp2-mediated recruitment of the NuRD complex and polycomb repressive complex 2 (PRC2) to active ESC genes, subsequently switching the H3K27ac to H3K27me3 during ESC differentiation for active gene silencing. We therefore suggest that some zinc finger proteins orchestrate to control the concise epigenetic states on active ESC genes during differentiation, resulting in natural lineage commitment.


الحواشي

Ambrosio, F., Kadi, F., Lexell, J., Fitzgerald, G. K., Boninger, M. L., and Huard, J. (2009). The effect of muscle loading on skeletal muscle regenerative potential: an update of current research findings relating to aging and neuromuscular pathology. أكون. J. Phys. ميد. Rehabil. 88, 145�. doi: 10.1097/phm.0b013e3181951fc5

Bentzinger, C. F., Von Maltzahn, J., Dumont, N. A., Stark, D. A., Wang, Y. X., Nhan, K., et al. (2014). Wnt7a stimulates myogenic stem cell motility and engraftment resulting in improved muscle strength. J. خلية بيول. 205, 97�. doi: 10.1083/jcb.201310035

Chiang Chan, M., Atasoylu, O., Hodson, E., Tumber, A., Leung, I. K. H., Chowdhury, R., et al. (2015). Potent and selective triazole-based inhibitors of the hypoxia-inducible factor prolyl-hydroxylases with activity in the murine brain. بلوس واحد 10:e0132004. doi: 10.1371/journal.pone.0132004

Cirillo, F., Resmini, G., Ghiroldi, A., Piccoli, M., Bergante, S., Tettamanti, G., et al. (2017). Activation of the hypoxia-inducible factor 1alpha promotes myogenesis through the noncanonical Wnt pathway, leading to hypertrophic myotubes. FASEB J. 31, 2146�. doi: 10.1096/fj.201600878r

Clarke, L., and van der Kooy, D. (2009). Low oxygen enhances primitive and definitive neural stem cell colony formation by inhibiting distinct cell death pathways. الخلايا الجذعية 27, 1879�. doi: 10.1002/stem.96

Dengler, V. L., Galbraith, M., and Espinosa, J. M. (2014). Transcriptional regulation by hypoxia inducible factors. Crit. Rev. Biochem. مول. بيول. 49, 1�. doi: 10.3109/10409238.2013.838205

Di Carlo, A., De Mori, R., Martelli, F., Pompilio, G., Capogrossi, M. C., and Germani, A. (2004). Hypoxia inhibits myogenic differentiation through accelerated MyoD degradation. J. بيول. تشيم. 279, 16332�. doi: 10.1074/jbc.m313931200

Eliasson, P., and Jonsson, J. I. (2010). The hematopoietic stem cell niche: low in oxygen but a nice place to be. J. Cell Physiol. 222, 17�. doi: 10.1002/jcp.21908

Garcia-Prat, L., Sousa-Victor, P., and Munoz-Canoves, P. (2013). Functional dysregulation of stem cells during aging: a focus on skeletal muscle stem cells. FEBS J. 280, 4051�. doi: 10.1111/febs.12221

Gough, N. R. (2012). Focus issue: wnt and beta-catenin signaling in development and disease. علوم. الإشارة. 5:eg2. doi: 10.1126/scisignal.2002806

Gustafsson, M. V., Zheng, X., Pereira, T., Gradin, K., Jin, S., Lundkvist, J., et al. (2005). Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. ديف. زنزانة 9, 617�. doi: 10.1016/j.devcel.2005.09.010

Higashimura, Y., Nakajima, Y., Yamaji, R., Harada, N., Shibasaki, F., Nakano, Y., et al. (2011). Up-regulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene expression by HIF-1 activity depending on Sp1 in hypoxic breast cancer cells. قوس. بيوتشيم. بيوفيز. 509, 1𠄸. doi: 10.1016/j.abb.2011.02.011

Hoppe, G., Yoon, S., Gopalan, B., Savage, A. R., Brown, R., Case, K., et al. (2016). Comparative systems pharmacology of HIF stabilization in the prevention of retinopathy of prematurity. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 113, E2516�. doi: 10.1007/978-1-4612-2808-0_1

Hubbi, M. E., and Semenza, G. L. (2015). Regulation of cell proliferation by hypoxia-inducible factors. أكون. J. Physiol. Cell Physiol. 309, C775�.

Kim, W., and Kaelin, W. G. Jr. (2003). The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. بالعملة. رأي. Genet. ديف. 13, 55�. doi: 10.1016/s0959-437x(02)00010-2

Krock, B. L., Skuli, N., and Simon, M. C. (2011). Hypoxia-induced angiogenesis: good and evil. Genes Cancer 2, 1117�. doi: 10.1177/1947601911423654

Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., and Rudnicki, M. A. (2007). Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. زنزانة 129, 999�. doi: 10.1016/j.cell.2007.03.044

Le Grand, F., Jones, A. E., Seale, V., Scime, A., and Rudnicki, M. A. (2009). Wnt7a activates the planar cell polarity pathway to drive the symmetric expansion of satellite stem cells. الخلية الجذعية للخلايا 4, 535�. doi: 10.1016/j.stem.2009.03.013

Liu, W., Wen, Y., Bi, P., Lai, X., Liu, X. S., Liu, X., et al. (2012). Hypoxia promotes satellite cell self-renewal and enhances the efficiency of myoblast transplantation. تطوير 139, 2857�. doi: 10.1242/dev.079665

Majmundar, A. J., Lee, D. S., Skuli, N., Mesquita, R. C., Kim, M. N., Yodh, A. G., et al. (2015). HIF modulation of Wnt signaling regulates skeletal myogenesis in vivo. تطوير 142, 2405�. doi: 10.1242/dev.123026

Maxwell, P. H., and Eckardt, K. U. (2016). HIF prolyl hydroxylase inhibitors for the treatment of renal anaemia and beyond. نات. القس نفرول. 12, 157�. doi: 10.1038/nrneph.2015.193

Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., and Quinones-Hinojosa, A. (2010). Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. الخلية الجذعية للخلايا 7, 150�. doi: 10.1016/j.stem.2010.07.007

Ohlendieck, K. (2011). Proteomic profiling of fast-to-slow muscle transitions during aging. أمام. فيسيول. 2:105. doi: 10.3389/fphys.2011.00105

Piccoli, M., Conforti, E., Varrica, E., Ghiroldi, A., Cirillo, F., Resmini, G., et al. (2017). NEU3 sialidase role in activating HIF-1α in response to chronic hypoxia in cyanotic congenital heart patients. كثافة العمليات J. Cardiol. 230, 6�. doi: 10.1016/j.ijcard.2016.12.123

Razban, V., Lotfi, A. S., Soleimani, M., Ahmadi, H., Massumi, M., Khajeh, S., et al. (2012). HIF-1alpha overexpression induces angiogenesis in mesenchymal stem cells. Biores Open Access. 1, 174�. doi: 10.1089/biores.2012.9905

Reano, S., Angelino, E., Ferrara, M., Malacarne, V., Sustova, H., Sabry, O., et al. (2017). Unacylated ghrelin enhances satellite cell function and relieves the dystrophic phenotype in duchenne muscular Dystrophy mdx model. الخلايا الجذعية 35, 1733�. doi: 10.1002/stem.2632

Scaringi, R., Piccoli, M., Papini, N., Cirillo, F., Conforti, E., Bergante, S., et al. (2013). NEU3 sialidase is activated under hypoxia and protects skeletal muscle cells from apoptosis through the activation of the epidermal growth factor receptor signaling pathway and the hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha. J. بيول. تشيم. 288, 3153�. doi: 10.1074/jbc.m112.404327

Tanaka, S., Terada, K., and Nohno, T. (2011). Canonical Wnt signaling is involved in switching from cell proliferation to myogenic differentiation of mouse myoblast cells. جيه مول. الإشارة. 6:12. doi: 10.1186/1750-2187-6-12

von Maltzahn, J., Bentzinger, C. F., and Rudnicki, M. A. (2011). Wnt7a-Fzd7 signalling directly activates the Akt/mTOR anabolic growth pathway in skeletal muscle. نات. خلية بيول. 14, 186�. doi: 10.1038/ncb2404

von Maltzahn, J., Zinoviev, R., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., and Rudnicki, M. A. (2013). A truncated Wnt7a retains full biological activity in skeletal muscle. نات. كومون. 4:2869.

Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., and Semenza, G. L. (1995). Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 92, 5510�. doi: 10.1073/pnas.92.12.5510

Xie, L., Yin, A., Nichenko, A. S., Beedle, A. M., Call, J. A., and Yin, H. (2018). Transient HIF2A inhibition promotes satellite cell proliferation and muscle regeneration. J. كلين. استثمار. 128, 2339�. doi: 10.1172/jci96208

Xuan, L., Xin-Xin, C., Ya-Jing, C., Ting-Ting, W., Huaxi, X., Huiyong, Y., et al. (2018). Therapeutic potential of a prolyl hydroxylase inhibitor FG-4592 for Parkinson’s Diseases in vitro and in vivo: regulation of redox biology and mitochondrial function. أمام. Aging Neurosci. 10:121. doi: 10.3389/fnagi.2018.00121

Yang, X., Yang, S., Wang, C., and Kuang, S. (2017). The hypoxia-inducible factors HIF1alpha and HIF2alpha are dispensable for embryonic muscle development but essential for postnatal muscle regeneration. J. بيول. تشيم. 292, 5981�. doi: 10.1074/jbc.m116.756312

Yeh, T., Leissing, M. T., Abboud, I. M., Thinnes, C. C., Atasoylu, O., Holt-Martyn, J. P., et al. (2017). Molecular and cellular mechanisms of HIF prolyl hydroxylase inhibitors in clinical trials. تشيم. علوم. 8, 7651�. doi: 10.1039/c7sc02103h

Yuen, T. J., Silbereis, J. C., Griveau, A., Chang, S. M., Daneman, R., Fancy, S. P. J., et al. (2014). Oligodendrocyte-encoded HIF function couples postnatal myelination and white matter angiogenesis. زنزانة 158, 383�. doi: 10.1016/j.cell.2014.04.052

Keywords : Hypoxia-inducible factor-1α, WNT7a, myogenesis, hypertrophy, Prolyl-hydroxylases, FG-4592

Citation: Cirillo F, Resmini G, Angelino E, Ferrara M, Tarantino A, Piccoli M, Rota P, Ghiroldi A, Monasky MM, Ciconte G, Pappone C, Graziani A and Anastasia L (2020) HIF-1α Directly Controls WNT7A Expression During Myogenesis. أمام. تطوير الخلية. بيول. 8:593508. doi: 10.3389/fcell.2020.593508

Received: 10 August 2020 Accepted: 20 October 2020
Published: 11 November 2020.

Susan Tsivitse Arthur, University of North Carolina at Charlotte, United States

Eoin P. Cummins, University College Dublin, Ireland
Sivareddy Kotla, University of Texas MD Anderson Cancer Center, United States
Colin E. Evans, Northwestern University, United States

Copyright © 2020 Cirillo, Resmini, Angelino, Ferrara, Tarantino, Piccoli, Rota, Ghiroldi, Monasky, Ciconte, Pappone, Graziani and Anastasia. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.



تعليقات:

  1. Kigazilkree

    حسنًا ، لقد رأيت بالفعل شيئًا كهذا

  2. Yaremka

    اكتب جيدًا ، نجاح في المستقبل

  3. Tojajora

    إنه محق تمامًا

  4. Yozshushicage

    في السنة الأولى ، كانت تدرس بجد في السنوات القليلة الأولى ، سيكون الأمر أسهل! كل التجاويف خاضعة للحب! عصا سحرية من حكاية خرافية روسية: تلوح ثلاث مرات - وتختفي أي رغبة ... العاهرة تأخذ المال ليس لأنها تنام معك ، ولكن على الرغم من ذلك لا تزعج أعصابك. لا يمكنك وضعها هناك بدون جهد! الأفعى ذات النظارة هي دودة.

  5. Macdomhnall

    اليوم قرأت الكثير عن هذا الموضوع.



اكتب رسالة