معلومة

41: تقليل النترات - علم الأحياء

41: تقليل النترات - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أهداف التعلم

  • حدد الطرق المختلفة التي يمكن أن تقلل بها البكتيريا من النترات

اختبار النترات

يحدد هذا الاختبار إنتاج إنزيم يسمى اختزال النترات ، مما يؤدي إلى تقليل النترات (NO3): يُطلق على الاختبار أيضًا اسم اختبار تقليل النترات. مع هذا الإنزيم ، يتم تقليل النترات إلى نتريت (NO2). ثم يشكل حمض النيتروز الذي يتفاعل مع الكاشف الأول حامض السلفانيليك ، والذي يتفاعل مع الكاشف الآخر naphthylamine لتشكيل اللون الأحمر.

يعتبر تقليل النترات عمومًا بمثابة تنفس لا هوائي يستمد فيه الكائن الأكسجين من النترات.

المواد المطلوبة

  • 1 مرق نترات للمجهول
  • بعد الحضانة:
    • كواشف النترات A (حمض السلفانيليك) و B (النفثيلامين)
    • عصي خشبية للزنك
    • مسحوق الزنك

الإجراء

  1. تلقيح مرق النترات بالبكتيريا المجهولة.
  2. احضن الكائنات الحية في درجة حرارة مثالية ، 30 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة: ابحث عن N.2 الغاز أولاً قبل إضافة الكواشف.
    • أضف 6-8 قطرات من كاشف النتريت أ.
    • أضف نفس عدد قطرات كاشف النتريت ب.
    • يجب أن ترى رد فعل في غضون دقيقة أو أقل.
    • إذا لم تكن قد رأيت إما نتريت أو ن2 غاز، تحتاج إلى إضافة القليل من مسحوق الزنك.
    • القليل من الزنك هو الكمية التي تلتصق بنهاية عود خشبي.
    • يستغرق تقليل النترات غير المستخدمة بواسطة الزنك دقيقتين.

ترجمة

هناك طرق مختلفة يمكن للبكتيريا أن تستخدم فيها النترات كمستقبل نهائي للإلكترون في التنفس اللاهوائي. أول منتج واضح للتخفيض يجب البحث عنه هو الاختزال إلى N2 غاز يسمى نزع النتروجين, داخل أنبوب دورهم. يتم البحث عن هذا أولاً قبل إضافة أي كواشف.

إذا لم يكن هناك غاز نيتروجين ، فلا يزال هناك تفسيران محتملان - اختزال النترات إلى نتريت (NO2) ، أو الاختزال إلى الأمونيا ، أو عدم اختزال النترات على الإطلاق.

يتم إنتاج اللون الأحمر في الوسط فقط عندما يكون النتريت موجودًا في الوسط.

قد يكون هناك تفسيران لنقص النتريت:

  • قد لا يتم تقليل النترات ؛ لا تستطيع البكتيريا استخدام النترات (أ - اختبار)
  • قد يتم اختزال النترات إلى نتريت والذي تم بعد ذلك تقليله بالكامل إلى أمونيا.

للتمييز بين الاحتمالات المذكورة أعلاه ، يضاف مسحوق الزنك. إذا لم تستخدم البكتيريا NO3، ستظل موجودة في الأنبوب. سيقلل الزنك من النترات ، مكونًا نتريتًا ، والذي يتفاعل بعد ذلك مع الكواشف 2 المضافة بالفعل إلى الأنبوب. سوف يتشكل اللون الوردي والأحمر كتأكيد لتقليل النترات السلبية.

تتم الإشارة إلى الاحتمال الأخير ، وهو إنتاج الأمونيا ، في حالة عدم وجود أشكال وردية اللون.

تفاعلن2 غازاللون بعد إضافة الكواشف لون بعد إضافة الزنك
لا3 لا2 لا أحدأحمر(زنك غير مضاف)
لا3 إلى N.2نعملا لون(زنك غير مضاف)
لا3 للأمونيالا أحدلا لونلا لون
لا3 - لا رد فعللا أحدلا لونأحمر وردي

أسئلة

  1. قم بتسمية المنتجين النهائيين الرئيسيين لخفض النترات.
  2. لماذا نضيف مسحوق الزنك؟ متى تضيفه؟
  3. كيف تختلف تعريفات اختزال النترات ونزع النتروجين؟
  4. هل اختزال النترات مسار هوائي أم مسار لاهوائي؟

اختبار تقليل النترات & # 8211 المبدأ ، الإجراء ، الاستخدامات والتفسير

يتطلب التمثيل الغذائي اللاهوائي متقبلًا للإلكترون بخلاف الأكسجين الجوي (O2). تستخدم العديد من البكتيريا سالبة الجرام النترات كمستقبل نهائي للإلكترون.

اختبار اختزال النترات هو اختبار يحدد إنتاج إنزيم يسمى اختزال النترات ، مما يؤدي إلى تقليل النترات (NO3).

يمكن تمييز الأنواع البكتيرية على أساس قدرتها على تقليل النترات إلى غازات النيتريت أو النيتروجين.


ملاحظات حول توليف اختزال | فيزياء النبات

يتم تحويل الأمونيا التي يتم إنتاجها بعد تثبيت النيتروجين على الفور إلى نيتروجين عضوي أو إلى نترات عن طريق البكتيريا الآزوتية مثل النيتروسوموناس في التربة. ثم تمتص النترات من قبل النباتات وتختزل إلى أمونيا عن طريق سلسلة من الإنزيمات التي تتضمن ثمانية إلكترونات تنتقل لكل جزيء من NH3 شكلت.

إن الإنزيم الأول الذي يحول النترات إلى نتريت هو اختزال النترات (NR) ، وهو بروتين معدني. تم التعرف على مكون الهيم لبروتين قليل القسيمات في اختزال NAD (P) -nitrate للنباتات حقيقية النواة السيتوكروم ب -557. يتكون اختزال النترات من Neurospora من نوعين متساويين من السيتوكروم يحتويان على وحدات فرعية. تحتوي البكتيريا بدائية النواة والطحالب الخضراء المزرقة على اختزال نترات الفيروكسين.

النترات و Mo ضروريان لتخليق اختزال النترات. يتضمن الحث بالنترات تخليق البروتين الصمغي المعتمد على mRNA في حين أن التنشيط بواسطة Mo للإنزيم يكون مستقلاً عن تخليق البروتين (انظر أعلاه). إن امتصاص النترات بوساطة الناقل هو عملية تعتمد على ATP.

تمنع الأمونيا امتصاص النترات في بعض الكائنات الحية ولكن وجد أنها غير فعالة في البعض الآخر. يقترن الإطلاق في وسيط OH & # 8211 بنسبة 1: 1 بامتصاص NO3 & # 8211. وصف بوتز وجاكسون (1977) بنية رباعية من اختزال النترات الذي يرتبط بشكل غير محكم بالغشاء. يعمل أحد المونومرات بمثابة تصريح نترات وثلاثة مونومرات أخرى للاختزال.

يحتوي كل مونومر على موقع ربط NADH وموقع يحتوي على Mo. يحتوي كل مونومر أيضًا على 12 حديد غير هيمي ، وذرات من كبريتيد الحمض المتغير و 24 بقايا سيستين. نظرًا لأنه من المعروف أن اختزال النترات هو ركيزة وقابلية للضوء ، فإن دور الضوء لا يزال مثيرًا للجدل.

هناك أدلة معينة على أن الضوء يمد بالطاقة للحفاظ على مستويات بوليبوزوم نشطة لتخليق البروتين. في ظل الظروف الهوائية ، يمكن أن يحل الجلوكوز محل متطلبات الضوء للتحريض ، والتي لولا ذلك كان من الممكن توفيرها عن طريق تفاعل الضوء من خلال عملية التمثيل الضوئي.

على الرغم من أن تقليل النترات يعتمد في النهاية على التمثيل الضوئي لإمداد الاختزال ، إلا أن هذا الاعتماد قد قيل إنه غير مباشر. يتم توفير NADH إلى السيتوبلازم عن طريق نزع الهيدروجين من ثلاثي الفوسفات المصدر من البلاستيدات الخضراء.

يُظهر الزرنيخ ، الذي يفصل إنتاج ATP دون التأثير على توليد NADH ، بوضوح أن الدور الأساسي للضوء في تقليل النترات يكون عبر ATP وليس من خلال توليد NADH من أكسدة المركبات الضوئية.

تم إنشاء علاقة متبادلة بين امتصاص النترات وأيض الكربوهيدرات ، خاصة فيما يتعلق بتزويد NADPH عن طريق مسار فوسفات البنتوز لاختزال النترات. يحدث اختزال النتريت في النباتات الخضراء في البلاستيدات الخضراء ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بعملية الفسفرة الضوئية.

يحتوي هذا الإنزيم من السبانخ على 3 Fe واحد منهم في siroheme والاثنان الآخران يتكونان من ذرتين من كبريتيد الحمض ، وهو مركز كبريت الحديد.


النتريت والنترات البيولوجيا الكيميائية والتأشير

نترات غير عضوية (NO3 -) ، النتريت (NO2 -) وأكسيد النيتروجين هي أنواع نيتروجينية ذات بيولوجيا كيميائية متنوعة ومترابطة. يعد تكوين أكسيد النيتروجين من النترات والنتريت عبر مسار الاختزال "نترات-نيتريت- NO" والذي ينتج عنه توسع الأوعية طريقًا مكملاً ثابتًا لتوسيع الأوعية التقليدي المشتق من NOS. يتم تنشيط النترات ، الموجودة في نظامنا الغذائي والوفرة في أنسجة الثدييات والدورة الدموية ، عن طريق الاختزال إلى النتريت في الغالب عن طريق الميكروبيوم الفموي المتعايش. يتم تسهيل التخفيض اللاحق للنتريت في الجسم الحي ، وهو احتياطي وعائي ثابت من NO ، من خلال عدد من بروتينات العامل المساعد المحتوي على الدم والموليبدينوم. لا يتم تعزيز توليد النتريت أثناء نقص الأكسجة الفسيولوجي والمرضي وفي حالات المرض التي تنطوي على إصابة نقص التروية وإعادة التروية. على هذا النحو ، تم تقييم تعديل مستودعات الأوعية الدموية NO عن طريق النتريت والنترات المزودين من الخارج كنهج علاجي في عدد من الأمراض. في نهاية المطاف ، تخضع البيولوجيا الكيميائية للنترات والنتريت للتركيزات المحلية ، وثوابت توازن التفاعل ، وتوليد وسيطة عابرة ، مع تعديل ثوابت المعدل الحركي عند اختلاف قيم الأس الهيدروجيني الفسيولوجي وتوترات الأكسجين. المقالات المرتبطة: هذه المقالة جزء من قسم خاص بموضوع أكسيد النيتريك بعد 20 عامًا من جائزة نوبل لعام 1998. لعرض المقالات الأخرى في هذا القسم ، قم بزيارة http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bph.v176.2/issuetoc.

© 2018 الجمعية الصيدلانية البريطانية.

الأرقام

عدد لا يحصى من كيمياء النتريت (لا ...

عدد لا يحصى من كيمياء النتريت (NO 2 -) مما يؤدي إلى الحماية والإشارات ...

نشاط NiR للبروتينات الدموية في ...

نشاط NiR للبروتينات الدموية في ا ‐ تنسيق النيتريت النتريت (أي ميغا بايت و Hb). ...

بيانات محاكاة تمثل NiR ...

بيانات محاكاة تمثل نشاط NiR للديوكسي ميوغلوبين و deoxyhaemoglobin في ظل ظروف نقص الأكسجين ، ...

آليات مختلفة من غير المستحثة إنزيميا ...

آليات مختلفة لدورة الأكسدة والاختزال غير المستحثة إنزيمًا (مراكز زرقاء) إلى ferrohaem (مراكز حمراء). ال…

مسار النترات - النتريت - بلا ومبسط ...

مسار النترات - النتريت - NO والبيولوجيا الكيميائية المبسطة للنتريت في الأوعية الدموية. النترات - النتريت - لا ...

50٪ O2‐ المشبعة أو ص 50) حيث يتم تعظيم معدل تقليل النتريت بواسطة deoxyHb. ينتج نشاط NiR ميثب وما يعادل NO (المعادلة (6)). يتفاعل الميثب مع النتريت ليشكل NO جذريًا2 • ‐ ferrohaem الذي يتفاعل بسرعة مع NO لتوليد N.2ا3 (الشكل 4 ، المسار أ) ، المسؤولة عن تكوين RSNO (المعادلة (9)). ن2ا3 هي إحدى الآليات التي يُقترح من خلالها NO للهروب من كرات الدم الحمراء وتوليد NO (المعادلة (4)) في العضلات الملساء. يمكن أيضًا التقاط NO تلقائيًا عن طريق deoxyHb الذي يولد nitrosyl ‐ Hb (المعادلة (7) ، غير ظاهر) ثم أطلق سراحهم عبر النتروزيل التأكسدي (المعادلتان (11) و (12) ، غير ظاهر) ، أو قد يتفاعل NO مع أوكسي هب لتحرير النترات (المعادلة (2)). يتم إفراز النترات من البلازما إلى الغدد اللعابية (أعلى اليمين) ، بدء العملية من جديد. XO و eNOS الموجودان في كل من الخلايا البطانية وسطح كرات الدم الحمراء يُشتبه في أنهما يولدان أكسيد النيتروجين من النتريت ، ولكن فقط في ظل ظروف نقص الأكسجة والحمضية (أسفل اليسار). أخيرًا ، يتم إنتاج النتريت بواسطة سيرولوبلازمين بروتين البلازما النحاسي من أكسيد النيتروجين ، مما يمنع ثنائي أكسيد النيتروجين إلى النترات أو النيتروز المختزل بواسطة ferrihaems (غير ظاهر).


تحويل النترات إلى أمونيا بواسطة النباتات

النيتروجين في النترات (NO3 & # 8211) موجود في حالة شديدة التأكسد بينما في الأمونيا في شكل مخفض. لذلك ، فإن تحويل النترات إلى أمونيا هو عملية اختزالية. يتم تقليل النترات إلى الأمونيا في العديد من الخطوات التي تتم بوساطة إنزيمات محددة.

في كل خطوة يتم إضافة إلكترونين وفي النهاية لا3 & # 8211 حيث يتم تحويل النيتروجين الذي يحتوي على 5 شحنات موجبة إلى NH43 حيث يحتوي النيتروجين على 3 شحنات سالبة. يتم توفير الإلكترونات عن طريق أنزيم مخفض I Le. و NADH (نيكوتيناميد Adenine Dinucleotide) وإنزيم مخفض II أي NADPH (فوسفات نيكوتيناميد Adenine Dinucleotide).

(1) اختزال النترات إلى نتريت:

يتم تقليل النترات إلى النتريت في وجود إنزيمات تقليل النترات والشيتاز مما يتطلب تقليل الإنزيم المساعد الأول (NADH) أو الإنزيم المساعد الثاني (NADPH).

تم عزل هذا الإنزيم وهو بروتين موليبدوفلافو مع مجموعة سلفهيدريل فعالة لأول مرة في شكل نقي للغاية بواسطة إيفانز وناسون في عام 1953 من أوراق فول الصويا وبواسطة Nason و Evans (1954) من Neurospora (فطر). يمكن أن تستخدم الإنزيمات المعزولة من Neurospora فقط الإنزيم المساعد الثاني (NADPH) بينما يمكن أن يستخدم الإنزيم المعزول من أوراق فول الصويا كلاً من الإنزيم المساعد الأول (NADH) والثاني (NADPH).

يحتوي هذا الإنزيم على FAD (Flavin Adenine Dinucleotide) كمجموعته الاصطناعية التي ترتبط بالموليبدينوم (Mo). التخفيض الفعلي لـ NO إلى NO2 & # 8211 كما هو موضح في الشكل 9.1. يتم نقل الإلكترونات من الإنزيم المساعد المختزل إلى FAD الذي يتضاءل (FADH2). من انخفاض FADH2 يتم نقل الإلكترونات في النهاية إلى NO3 & # 8211 من خلال الموليبدينوم بحيث N02 & # 8211 و H.2تتشكل O.

(يحدث اختزال النترات بشكل رئيسي في الأوراق الخضراء والجذور. يوجد اختزال نترات الإنزيمات في العصارة الخلوية).

وفقًا للنتائج الأكثر حداثة ، فإن إنزيم اختزال نترات الإنزيم هو في الواقع إنزيم معقد وشيزيم في النباتات العليا وكذلك الكائنات الحية الدقيقة. هذا المركب هو وحدة 8 S حيث NADPH - السيتوكروم ب557 يحدث الاختزال كوحدة فرعية منفصلة (3.7-4.5 ثانية). هذا الأخير مرتبط باختزال النترات بواسطة بروتين رابط الموليبدينوم (Mo).

وبالتالي ، فإن نقل الإلكترونات من الإنزيمات المساعدة إلى النترات (كما هو موضح في الشكل 9.2) يتضمن خطوتين:

(ط) في الخطوة الأولى ، يتم نقل الإلكترونات من NADH / NADPH إلى cyt. ب557 من خلال FAD. يتم تحفيز هذه الخطوة بواسطة NADPH - اختزال السيتوكروم b557.

(2) من Cyt.b557 يتم نقل الإلكترونات إلى NO3 & # 8211 من خلال Mo في الخطوة الثانية والتي يتم تحفيزها بواسطة اختزال النترات لمركب اختزال النترات.

(السيتوكروم b و Mo هما حاملات إلكترون واحدة. ومن ثم ، يلزم جزيئين من كل منهما لنقل 2e- من خلالهما. يتم تحرير بروتونين عندما يتم نقل الإلكترونات من FADH المختزل2 إلى Cyt.b بينما هناك حاجة إلى بروتونين (2H +) في المكان الأخير. ذلك لأن Cyt.b و Mo يمكنهما حمل الإلكترونات فقط).

إنزيم اختزال النترات هو نوع محرض من الإنزيم. يتم تحريض تركيبه في العديد من أنسجة النبات بواسطة NO3 – .

في الطحالب الخضراء المزرقة ، يتم تقليل مصدر الإلكترونات في تقليل النترات.

تنظيم اختزال النترات:

كما ذكرنا سابقًا ، فإن اختزال النترات هو نوع محرض من الإنزيم. يتم تصنيعه de novo في الخلايا عند الركيزة أي NO3 & # 8211 موجود ويتفكك عندما لا3 & # 8211 غائب. اقترح بعض العمال (Kaiser and Huber ، 1994) أن اختزال النترات يخضع لتعديل ما بعد متعدٍ يتضمن فسفرة عكسية لبعض بقايا السيرين التي لها تأثير تنظيمي على اختزال النترات.

تعمل المستويات الخفيفة والكربوهيدراتية والعوامل البيئية الأخرى على تحفيز بروتين فوسفاتيز البروتين الذي يزيل الفسفرة بعض بقايا السيرين لبروتين إنزيم اختزال النترات. هذا يؤدي إلى تنشيط إنزيم اختزال النترات.

في الظلام وبوجود المغنيسيوم ++ ، يتم تحفيز بروتين كيناز الذي يفسفر نفس بقايا السيرين لبروتين إنزيم اختزال النترات. هذا يؤدي إلى تعطيل إنزيم اختزال النترات.

يُعتقد أن تنظيم اختزال النترات ، يتم تحقيق النشاط بطريقة أفضل وأسرع (في ثوانٍ) من خلال عملية الفسفرة - نزع الفسفرة من خلال تخليق هذا الإنزيم وانهياره الذي قد يستغرق ساعات.

(2) تقليل النتريت إلى أمونيا:

يحدث في وجود إنزيم اختزال النتريت الذي يحفز الاختزال 6e من NO2 & # 8211 إلى NH4 + ربما مع تكوين النيتروكسيل (NOH) أو hyponitrite (H2ن2ا2) وهيدروكسيلامين (NH2OH) كوسائط كما يلي:

المصدر المباشر للإلكترونات لتقليل NO2 & # 8211 هو تقليل الفريدوكسين في البلاستيدات الخضراء. تعمل نيوكليوتيدات البيريدين المختزلة كمانحين للإلكترون في الأنسجة غير الخضراء.

تم عزل إنزيم اختزال النتريت لأول مرة بواسطة Nason وزملاؤه من Neurospora وأوراق فول الصويا.

تم العثور على اختزال النتريت في البلاستيدات الخضراء في الأوراق. في الجذور ، يوجد في البلاستيدات.

يتكون إنزيم اختزال النتريت من بولي ببتيد واحد 63 كيلو دالتون يحتوي على مجموعتين اصطناعيتين ، مجموعة الحديد والكبريت (Fe4 س4) وهيم متخصص. تسمى هاتان المجموعتان البدائيتان أيضًا باسم siroheme والتي ربما تتوسط في نقل ستة إلكترونات كما هو موضح في الشكل. 9.3

كان يُعتقد سابقًا أن اختزال النتريت إلى أمونيا ينطوي على تكوين مركبين وسيطين ، أي الهيبونيتريت (H2ن2ا2) وهيدروكسيلامين (NH2OH) لكن من المشكوك فيه لأن: -

(ط) الهيبونيتريت غير مستقر تمامًا.

(2) هيدروكسيلامين سام.

(3) علاوة على ذلك ، لم يتم ملاحظتهم مطلقًا في Free State في الزنازين.

يُعتقد الآن عمومًا أن الهيبونيتريت والهيدروكسيلامين قد يتشكلان في أفضل الأحوال على سطح الإنزيم ولا يتركان السطح إلا عندما يتم اختزالهما تمامًا إلى وسيط إضافي أو الأمونيا. (لا3 والضوء يحث على نسخ m-RNA لإنزيم اختزال النتريت. من المعروف أن السكروز يحفز هذا الحث بينما يقوم الأسباراجين والجلوتامين بقمعه).


نهج بيولوجيا الشبكة لنزع النتروجين في Pseudomonas aeruginosa

الزائفة الزنجارية هي عضو مرن استقلابيًا في بكتيريا Gammaproteobacteria. في ظل الظروف اللاهوائية ووجود النترات ، يمكن لـ P. aeruginosa إجراء نزع النتروجين (الكامل) ، وهي عملية تنفسية لتقليل النترات المبعثرة إلى غاز النيتروجين عن طريق النتريت (NO2) وأكسيد النيتريك (NO) وأكسيد النيتروز (N2O). تركز هذه الدراسة على فهم تأثير الظروف البيئية على أداء نزع النتروجين البكتيري ، باستخدام نموذج رياضي لشبكة التمثيل الغذائي في P. aeruginosa. على حد علمنا ، هذا هو أول نموذج رياضي لنزع النتروجين لهذه البكتيريا. يشير تحليل السلوك طويل المدى للشبكة في ظل تغير مستويات تركيز الأكسجين (O2) والنترات (NO3) والفوسفات (PO4) إلى أن تركيز PO4 يؤثر بشدة على أداء نزع النتروجين. يقدم النموذج ثلاثة تنبؤات حول نشاط نزع النتروجين من P. aeruginosa في ظل ظروف بيئية مختلفة ، وقد تم التحقق من صحة هذه التنبؤات تجريبياً أو دعمها بواسطة الأدبيات البيولوجية ذات الصلة. أحد الدوافع وراء هذه الدراسة هو التقاط تأثير PO4 على شبكة التمثيل الغذائي لنزع النتروجين من P. aeruginosa من أجل تسليط الضوء على آليات تراكم غازات الدفيئة N2O أثناء استنفاد الأكسجين الموسمي في البيئات المائية مثل بحيرة Erie (بحيرات Laurentian العظمى ، الولايات المتحدة الأمريكية. ). تتيح محاكاة الإنتاج الميكروبي لغازات الدفيئة في الأنظمة المائية اللاهوائية مثل بحيرة إيري فهمًا أعمق للتأثيرات البيئية المساهمة التي ستنير الدراسات حول واستراتيجيات العلاج الخاصة بالمواقع الأخرى التي تعاني من نقص الأكسجين في جميع أنحاء العالم.

بيان تضارب المصالح

تضارب المصالح: أعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة.

الأرقام

الشكل 1. شبكة تنظيم نزع النتروجين من ص ...

الشكل 1. شبكة تنظيم نزع النتروجين من P. الزنجارية .

تشير الأسهم الصلبة الخضراء إلى الانتظام والأحمر ...

الشكل 2. حالات ثابتة لنزع النتروجين ...

الشكل 2. حالات ثابتة لشبكة نزع النتروجين تحت ظروف بيئية مختلفة.


الاستنساخ والنترات تحريض نترات اختزال مرنا

النترات هي المصدر الرئيسي للنيتروجين المأخوذ من التربة بواسطة النباتات العليا ولكنه يتطلب اختزال الأمونيا قبل دمجه في الأحماض الأمينية. أول إنزيم في مسار الاختزال هو إنزيم محفز بالنترات ، اختزال النترات (EC 1.6.6.1). تم استخدام مصل مضاد متعدد النسيلة محدد ضد اختزال نترات الشعير المنقى للترسيب المناعي في الجسم الحي البروتين المسمى و في المختبر منتجات الترجمة ، مما يدل على أن تحريض النترات يزيد من بروتين اختزال النترات و mRNA القابل للترجمة. تم عزل واستنساخ (كدنا) جزئي لاختزال نترات الشعير وتحديده من خلال الترجمة المختارة المختلطة. يُظهر تحليل تهجين لطخة الحمض النووي الريبي أن تحريض النترات يتسبب أيضًا في زيادة ملحوظة في مستوى الحالة المستقرة لنترات اختزال الرنا المرسال.


اختزال النترات مقرونًا بالأكسدة الجرثومية للكبريتيد في رواسب النهر

نترات (NO - 3 ) غالبًا ما تتم إزالته بشكل أساسي من خلال نزع النتروجين الميكروبي المقترن بأكسدة الكربون. بدلا من ذلك ، لا - 3 قد يتم تقليله بواسطة بكتيريا كيميائية تغذوية باستخدام الكبريتيد كمتبرع إلكتروني. كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد NO - 3 عملية الاختزال بأكسدة الكبريتيد تحت مختلف NO- 3 تركيزات المدخلات في رواسب الأنهار.

المواد والأساليب

تحت لا - 3 تم استخدام تركيزات المدخلات من 0.2 إلى 30 ملي مولار ، مفاعلات التدفق المملوءة برواسب النهر من نهر بيرل ، الصين ، لقياس عمليات أكسيد النيتروجين المحتملة. 3 الاختزال والكبريتات (SO 2− 4 ) إنتاج. أجريت تحليلات البيولوجيا الجزيئية لدراسة الآليات الميكروبية المعنية.

نتائج ومناقشة

في وقت واحد لا3 - الإزالة و SO4 تمت ملاحظة 2− إنتاج مع اختلاف NO - 3 جمعت التركيزات في عينات الرواسب على أعماق مختلفة. يحتمل ، لا - 3 وصلت نسبة الإزالة من 72 إلى 91٪ و SO 2− 4 تراوحت معدلات الإنتاج من 0.196 إلى 0.903 ملي مولار ساعة -1. لا المحتملة - 3 معدلات الإزالة مرتبطة خطيًا بـ NO - 3 تركيزات المدخلات. بينما SO 2− 4 أصبحت عملية الإنتاج مستقرة ، لا - 3 كانت عملية الاختزال لا تزال رد فعل من الدرجة الأولى ضمن نطاق NO - 3 تركيزات المدخلات. مع انخفاض NO - 3 تركيزات الإدخال ، لا - 3 تمت الإزالة بشكل رئيسي من خلال مسار مغاير NO - 3 تخفيض إلى NH + 4 ، بينما مع ارتفاع NO - 3 تركيزات لا - 3 كانت الإزالة من خلال مسار نزع النتروجين.

الاستنتاجات

في حين أن معظم لا - 3 في الرواسب عن طريق نزع النتروجين غير المتجانسة ، أكسيد النيتروجين الذي يحركه الكبريتيد 3 يمثل التخفيض ما يصل إلى 26 ٪ من إجمالي NO- 3 إزالة تحت NO أقل - 3 تركيزات. التوزيعات الرأسية لـ NO - 3 تخفيض وثاني أكسيد الكبريت 2− 4 كانت عمليات الإنتاج مختلفة بسبب المجتمعات البكتيرية المتغيرة ذات العمق.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


اختبار تقليل النترات

بين البشر النيسرية والأنواع ذات الصلة ، وثلاثة أنواع و [مدش] N. الغشاء المخاطي, نزل M.، و K. denitrificans تقليل النترات. اختبار تقليل النترات هو اختبار حاسم للتمييز بين N. gonorrhoeae و K. denitrificans، لا سيما عند سلالات K. denitrificans يبدو أنها مكورات ثنائية سالبة الجرام في المسحات الملطخة.

مبدأ

يمكن تمييز الأنواع البكتيرية على أساس قدرتها على تقليل النترات إلى غازات النيتريت أو النيتروجين. بين ال Neisseriaceae من أصل بشري ، من سلالات النيسرية الغشاء المخاطي, الموراكسيلا النزلية، و Kingella denitrificans تقليل النترات. سلالات نزل M. و K. denitrificans تم تعريفها بشكل خاطئ على أنها N. gonorrhoeae. يسمح اختبار اختزال النترات بالتمييز بين هذه الأنواع التي تكون نترات موجبة و N. gonorrhoeae (نترات سلبية). قد يقترن تقليل النترات بالتنفس اللاهوائي في بعض الأنواع.

يظهر المسار الكيميائي الحيوي الذي ينطوي عليه اختزال النترات في الشكل 1. يتم تقليل النترات إلى نتريت والذي يمكن بعد ذلك تقليله إلى أكسيد النيتريك أو أكسيد النيتروز أو النيتروجين (الشكل 1).

الشكل ل. مسار اختزال النترات.

يعتمد اختبار اختزال النترات على اكتشاف النتريت في الوسط بعد الحضانة بالكائن الحي. إذا كان موجودًا في الوسط ، فسوف يتفاعل النتريت مع حمض السلفانيليك (كاشف النترات أ) لتكوين مركب عديم اللون (حمض النتريت-سلفانيليك). سينتج عن هذا المركب بعد ذلك راسب أحمر (برونتوسيل) عند إضافة كاشف النترات ب (ألفا نافثيلامين) إلى الاختبار كما هو موضح في الشكل 2.

الشكل 2. تمثيل تخطيطي لاكتشاف النتريت في الوسط.

يتم إنتاج اللون الأحمر في الوسط فقط عندما يكون النتريت موجودًا في الوسط. عدم وجود لون أحمر في الوسط بعد إضافة حمض السلفانيليك وألفا نفتيل أمين يعني فقط أن النتريت غير موجود في الوسط. قد يكون هناك تفسيران لهذه الملاحظة.

  • قد لا يكون النترات قد تم تقليله لأن الضغط سالب النترات.
  • قد يتم تقليل النترات إلى نتريت والذي تم بعد ذلك تقليله تمامًا إلى أكسيد النيتريك أو أكسيد النيتروز أو النيتروجين والذي لن يتفاعل مع الكواشف التي تتفاعل مع النتريت ، وتكون السلالة موجبة للنترات.

يجب إجراء مزيد من الاختبارات على أي وسيط اختبار يعطي نتيجة سلبية بعد إضافة كواشف النترات لتحديد أي من التفسيرين يكون دقيقًا.

اختبار ناجح للحد من النترات يعتمد على إجراء الاختبار في ظل الظروف الصحيحة.

  1. سيحدث التفاعل بشكل أفضل إذا كان الوسط الأساسي يدعم نمو الكائن الحي. ومع ذلك ، على الرغم من أن بعض النيسرية لا تنمو الأنواع بشكل جيد في وسط المرق ، يمكن إجراء اختبار اختزال النترات بنجاح في وسط لا يدعم النمو عن طريق تلقيح الوسط بكثافة لتوفير إنزيم مُشكل مسبقًا لحدوث التفاعل.
  2. يحدث تفاعل النترات فقط في ظل الظروف اللاهوائية. يتم توزيع الوسيط المحتوي على النترات في أنابيب لإعطاء مساحة سطح منخفضة: نسبة العمق التي تحد من انتشار الأكسجين في الوسط ، على سبيل المثال ، يتم توزيع 5 مل من الوسط في أنبوب قطره 13 مم. النيسرية والأنواع ذات الصلة تستخدم الأكسجين في الوسط وتنتج بسرعة ظروفًا لاهوائية مثالية للحد من حدوث النترات.

يتم إجراء اختبار اختزال النترات في وسط يحتوي على 0.2٪ نترات البوتاسيوم. يتم تلقيح الوسط بكثافة بثقافة نقية للكائن الحي المشتبه به ويتم تحضينه عند 35 درجة مئوية إلى 36.5 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. في حاضنة مع أو بدون ثاني أكسيد الكربون الإضافي.

تم الكشف عن اختزال النترات باستخدام كواشف Griess Llosvay وحمض السلفانيليك و alpha-naphthylamine. يضاف حمض السلفانيليك (كاشف النترات أ) إلى خليط الحضانة ويشكل معقدًا (حمض النتريت-سلفانيليك) مع أي نتريت موجود في الوسط. عند إضافة ألفا نفتيل أمين (كاشف النترات ب) إلى الوسط المحتضن ، سيتم تكوين راسب أحمر (برونتوسيل) مع أي مركب حمض نتريت-سلفانيليك موجود في الوسط.

يمكن الإبلاغ عن كائن حي بأنه إيجابي النترات إذا ظهر لون أحمر في الوسط بعد إضافة كواشف النترات A و B إلى الوسط، مما يشير إلى أن الكائن الحي قد قلل من النترات إلى نتريت.

لا يعني عدم وجود لون أحمر بعد إضافة كلا الكواشف تلقائيًا أن الكائن الحي غير قادر على تقليل النترات. قد تكون السلالات قد خفضت النترات إلى نتريت ، ثم اختزلت النتريت تمامًا إلى غازات نيتروجينية لم يتم اكتشافها عند إضافة كواشف النترات A و B إلى الوسط. إذا لم يتغير لون الوسط بعد إضافة حمض السلفانيليك وألفا نفتيل أمين ، تتم إضافة كمية صغيرة (نقطة ldquoknife & rdquo) من غبار الزنك إلى الوسط المحتضن. يعمل غبار الزنك على تحفيز اختزال النترات إلى نتريت كيميائيًا. وبالتالي ، إذا لم يتم تقليل النترات بواسطة الكائنات الحية ، أي أنها سلبية النترات ، فسيتم تقليلها بواسطة غبار الزنك وسيظهر اللون الأحمر في الوسط المحتضن في غضون 15 دقيقة. إذا لم يتطور لون في الوسط المحتضن بعد إضافة غبار الزنك ، فإن الكائنات الحية لم تقلل النترات إلى نتريت فحسب ، بل قللت النتريت إلى غازات نيتروجينية ، فهذه الكائنات هي أيضًا موجبة للنترات.

على الرغم من تزويد وسط النترات بأنابيب دورهام المقلوبة للكشف عن إنتاج الغاز ، إلا أنه لم يتم تسجيل إنتاج الغاز النيسرية محيط. على الرغم من أن بعض الأنواع قد تقلل من النترات بعد النتريت إلى غازات نيتروجينية ، إلا أن الغاز قد لا يتراكم في الأنبوب. يعتمد تراكم الغاز على معدل إنتاجه. عندما يتم إنتاج الغاز ببطء شديد ، فقد يذوب في الوسط ولا يتراكم في أنبوب دورهام.

متطلبات العينة

العينة المثلى: ثقافة نقية لمكورات مكورة سالبة الجرام إيجابية أوكسيديز (النيسرية النيابة. أو نزل M.) على أجار الشوكولاتة المحتضن في جو غني بثاني أكسيد الكربون عند 35 درجة مئوية إلى 36.5 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة.

عينة غير مقبولة: ثقافات العزلات على أجار الشوكولاتة المحتضنة في جو غني بثاني أكسيد الكربون عند 35 درجة مئوية إلى 36.5 درجة مئوية لأكثر من 24 ساعة.

العوامل المساومة التي تؤثر على نتائج الاختبار:

  • يجب تلقيح وسط الاختبار بكثافة كافية للسماح بالتفاعل مع الإنزيمات مسبقة التشكيل. قد لا يسمح اللقاح غير الكافي للكائنات الحية باستخدام الأكسجين لإنتاج ظروف لاهوائية يمكن أن يحدث فيها تقليل النترات.
  • قد يؤدي إضافة الكثير من غبار الزنك إلى الأنبوب المحتضن إلى تقليل سريع جدًا للنترات بعد النتريت إلى غازات نيتروجينية بحيث لا يتم اكتشاف النتريت.

استقرار العينة: الكشف عن اختزال النترات لـ النيسرية والأنواع ذات الصلة تعتمد على وجود الإنزيمات مسبقة التشكيل.

  • يجب إجراء الاختبارات فقط باستخدام اللقاح المأخوذ من 24 ساعة.
  • يجب تلقيح وسط النترات في غضون 30 دقيقة. إزالة الثقافة من الحاضنة قد يؤدي التعرض المطول للثقافة في درجة حرارة الغرفة إلى تضاؤل ​​نشاط الإنزيم.

متوسطة / الكواشف

واسطة: مرق النترات (مرق القلب يحتوي على 0.2٪ نترات البوتاسيوم)

مرق القلب (ديفكو) ، 25.0 غرام
نترات البوتاسيوم 2.0 جرام
ماء مقطر ، 1000.0 مل

  1. قم بإذابة المكونات في الماء المقطر واضبط المحلول على درجة الحموضة 7.0.
  2. الاستغناء عن 5 مل من المرق في أنابيب 16 مم × 100 مم مع إدراج الغاز (أنابيب دورهام ، 6 مم × 50 مم).
  3. الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية.

يحفظ بدرجة حرارة 4 مئوية إلى 10 درجات مئوية (مبرد) حتى يتم استخدامه. قم بتدفئة الوسط إلى درجة حرارة الغرفة قبل التلقيح.

الكواشف: محلول حمض السلفانيليك (كاشف النترات أ): 0.8٪ في حمض الخليك 5N
الاسم الكيميائي: 4-أمينوبنزين حمض السلفونيك
قم بتخزين كاشف النترات أ في درجة حرارة 15 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة) لمدة تصل إلى 3 أشهر ، في الظلام. يمكن تخزين الكواشف في عبوات زجاجية بنية داكنة يمكن تغليفها بورق الألمنيوم لضمان الظلام.

محلول ألفا نفتيل أمين (كاشف نترات ب): 0.6٪ في حمض الخليك 5N
الاسم الكيميائي: N ، N-dimethyl-1 naphthylamine
قم بتخزين كاشف النترات B في درجة حرارة 2 مئوية إلى 8 درجات مئوية (مبرد) لمدة تصل إلى 3 أشهر ، في الظلام. يمكن تخزين الكواشف في عبوات زجاجية بنية داكنة يمكن تغليفها بورق الألمنيوم لضمان الظلام.

مسحوق الزنك ، درجة كاشف: يحفظ في درجة حرارة الغرفة (15 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية).

تحذير: حمض الخليك تآكل. قد يؤدي ملامسة الجلد إلى ظهور بثور وحروق. في حالة التلامس ، اغسل العينين والجلد فورًا بكمية كبيرة من الماء (لمدة 15 دقيقة على الأقل).

مراقبة الجودة / إجراء الاختبار

  • تحكم إيجابي اختزال النترات: Kingella denitrificans، مركز السيطرة على الأمراض 10236
  • تحكم النترات سالب اختزال: النيسرية البنية، ATCC 43069

يتم تخزين سلالات QC في -70 درجة مئوية في محلول مرق الصويا الذي يحتوي على 20٪ الجلسرين. يجب تأكيد تفاعلات سلالات التحكم في الوقت الذي يتم فيه تحضير المخزونات المجمدة. يمكن تخزين سلالات مراقبة الجودة في درجة حرارة -70 درجة مئوية لمدة تصل إلى عامين.

يتم اختبار سلالات QC بنفس طريقة العزلات السريرية. يجب استنبات سلالات QC مرة واحدة على الأقل بعد الثقافة الأولية من العينة المجمدة قبل إجراء الاختبار. يمكن استنبات العزلات السريرية من وسط انتقائي أو ثقافات فرعية منقاة. تأكد من أن الثقافات نقية.

  1. يتم تخزين قوارير سلالات التحكم في درجة حرارة -70 درجة مئوية.
  2. ضع خطًا على أطباق أجار الشوكولاتة أو أجار GC المكمل للعزل. احتضان عند 35 درجة مئوية إلى 36.5 درجة مئوية في جو غني بثاني أكسيد الكربون لمدة 18 إلى 24 ساعة.

باستخدام مسحة معقمة ، قم بإعداد معلق ثقيل للمستعمرات المعزولة جيدًا من ثقافة نقية للعزلة المحتضنة على وسط الشوكولاتة عند 35 درجة مئوية إلى 36.5 درجة مئوية في جو غني بثاني أكسيد الكربون لمدة 18 إلى 24 ساعة. تلقيح وسط الاختبار لإعطاء عكارة شديدة.

ملحوظة: سلالات N. gonorrhoeae والبعض الآخر النيسرية النيابة. قد لا تنمو في هذا الوسط. وبالتالي ، قد يعتمد التفاعل على الإنزيم المشكل مسبقًا.

بعد 48 ساعة. إضافة الحضانة ، مع ماصات باستير ، 5 قطرات من الكاشف # أ ، متبوعة بـ 5 قطرات من الكاشف # ب لكل أنبوب. هز الأنبوب جيدًا لخلط الكواشف مع الوسط.

افحص المعلق بحثًا عن لون أحمر وردي والذي يجب أن يتطور في غضون بضع دقائق إذا كان الوسط لا يزال دافئًا. قد يستغرق التفاعل وقتًا أطول قليلاً إذا كان الوسط باردًا عند إضافة الكواشف.

إذا تحول المعلق إلى اللون الوردي والأحمر قبل إضافة مسحوق الزنك ، تكون التلاوة موجبة ويتم الانتهاء من الاختبار. لا تقم بتنفيذ الخطوة 4.

ردود الفعل التي لوحظت مع التحكم المتوسط ​​غير الملقح ، والعزلات سلبية النترات ، والإيجابية النترات موضحة في الشكل 3 ، الشكل 4 ، والشكل 5 ، على التوالي.

إذا كان التعليق عديم اللون بعد إضافة الكواشف A و B ، إضافة كمية صغيرة (4-5 ملغ & ldquosharp سكين نقطة & rdquo) من غبار الزنك إلى الوسط. قم برج الأنبوب بقوة واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.

إذا ظل الوسيط عديم اللون بعد إضافة مسحوق الزنك ، تكون نتيجة الاختبار إيجابية.
إذا تحول الوسط إلى اللون الوردي بعد إضافة مسحوق الزنك تكون النتيجة سلبية.

الشكل 3. لوحظ التفاعل مع متوسط ​​النترات غير الملقح.

الشكل 4. لوحظ التفاعل مع الأنواع السلبية من النترات.

الشكل 5. لوحظت التفاعلات مع الأنواع الإيجابية للنترات.

جدول مراقبة الجودة:

مشاكل وحلول امبير

The nitrate reduction test may give false-negative or false positive results if the medium is not produced accurately or the test is not performed accurately. The reaction in this test is dependent upon a number of factors.

  • Failure to detect pink color in the uninoculated medium control tube after the addition of Zn dust may be due (1) to the medium not containing nitrate or (2) to the addition of too much zinc dust which has catalyzed the reduction of nitrate beyond nitrite to nitrogenous gases. The simplest solution is to obtain more nitrate medium ensuring that nitrate has been added to the base medium. Alternatively, inoculate the medium with a positive control strain, but test for a reaction after a shorter incubation time strains of N. mucosa will produce a positive nitrite reaction after a few hours incubation. If the medium is confirmed to contain nitrate, repeat the test until you have determined the correct amount of zinc dust to add. It is critical to learn how much zinc dust to add to the test. Addition of too much zinc dust can result in a false-positive result.
  • If a pink color is detected in the uninoculated medium control after nitrate reagents A and B have been added to the medium, the medium is contaminated with nitrite. The only solution is to obtain a new batch of medium that is not contaminated with nitrite.
  • In medium containing nitrate, the failure of the positive control strain, Kingella denitrificans, to give a positive reaction would occur only if the strain is not K. denitrificans. Recheck the identity of the positive control strain. Select a new culture of the control strain and repeat the test. Similarly, if a positive nitrate reductase test is obtained with the negative control strain, N. gonorrhoeae, either the negative control strain is not N. gonorrhoeae or the culture is contaminated with a nitrate-positive organism. Recheck the purity and identity of gonococcal reference strain. Repeat test with a pure culture of a confirmed culture of N. gonorrhoeae.
  • The nitrate reduction reaction indicates the ability of organisms to reduce nitrate, a reaction that occurs only under anaerobic conditions the reaction will not occur if the organisms receive a continuous supply of oxygen. Thus, the reaction may not occur in still cultures (particularly of slow-growing species) in which the medium is distributed in shallow layers that permit oxygen to diffuse into the medium. A test to determine if oxygen is present in the medium may be made by adding a drop of oxidase reagent to the medium. If the medium turns purple, the medium contains oxygen and the nitrate reduction reaction may not occur. If the medium remains colorless, the medium does not contain oxygen and the nitrate reduction test may occur. It has been noted that N. gonorrhoeae cells use up the oxygen rapidly if sufficient cells are inoculated into the medium. If oxidase reagent is added after approximately 1 to 2 hr incubation, the medium will remain clear. Because the oxidase reagent kills the gonococci present in the medium, the medium will gradually turn purple, starting at the top of the tube, as the oxygen diffuses into the medium. If the medium is dispensed in tubes of different dimensions from those suggested above, ensure that the surface area-to-depth ratio is at least equal to or smaller than those suggested above. If the diameter of the tube into which the medium is dispensed is larger than that described above, use a larger volume of medium to maintain the same surface area-to-depth ratio.

The nitrate reduction reaction may not occur if the medium in which the test is performed does not permit normal growth of the organism. However, the test may be performed in a medium that does not support growth of the organisms if the inoculum is sufficiently dense that preformed enzymes can exhaust the existing oxygen supply and reduce the nitrate at a faster rate than that at which the oxygen diffuses into the medium.

ملحوظة: To check that the oxygen has been removed from the medium, add 2 to 3 drops of oxidase reagent to a duplicate of the inoculated medium. If the oxygen has been adequately removed from the medium, the oxidase reagent will not turn purple immediately. If the medium contains dissolved oxygen, the oxidase reagent will turn purple. Note also that the nitrate reduction test may be performed in medium to which the oxidase reagent has been added.

Limitations of Test

If the test is performed properly and quality control strains give appropriate results, there should be no limitations to this test. Care must be taken to ensure that all components of the test are performed properly .

No identification of genus or species can be made on the basis of the nitrate reduction test alone.

Results, Interpretation, and Reporting

Isolates may be reported as Nitrate-positive if nitrite (pink color) is detected in the inoculated medium after the addition of reagents A and B أو if no color is detected in the medium after the addition of zinc dust.

Isolates may be reported as Nitrate-negative if nitrite is not detected (no color change) after the addition of reagents A and B, أو if a pink color develops after the addition of zinc dust to the inoculated medium.

فهرس

Knapp JS, Clark VL. Anaerobic growth of النيسرية البنية coupled to nitrite reduction. Infect Immun 198446:176-181.

Skerman VBD. 1967. p.218 &ndash 220. A guide to the identification of the genera of bacteria. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD.


شاهد الفيديو: الكيمياء - 3ث - الكشف عن أنيون النترات (يونيو 2022).