معلومة

دقة تقدير حجم الجينوم عن طريق قياس التدفق الخلوي

دقة تقدير حجم الجينوم عن طريق قياس التدفق الخلوي


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أعمل في مشروع جينوم وأستخدم في السيليكو كتحليل -mer لتقدير حجم الجينوم الخاص بنا بناءً على قراءات Illumina المتاحة. ال كالتقدير القائم على العميل متسق عبر نطاق واسع من ك القيم ، ولكنها أقل بكثير من التقدير السابق بناءً على قياس التدفق الخلوي (الموصوف في الإجراءات التجريبية من هذه الورقة). ما مدى دقة تقديرات حجم الجينوم على أساس التدفق الخلوي؟


كل يوم ، مع تزايد كمية البيانات الجينومية وموارد المعلوماتية الحيوية ، يواجه الباحثون تحديات متزايدة في اختيار النهج الأنسب لتحليل بياناتهم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن فرصة إجراء تحليلات الجينوم المقارنة تتزايد بسرعة. هذا ينطبق بشكل خاص على الفطريات بسبب أحجام الجينوم الصغيرة (أي يعني 1C = 44.2 ميجا بايت). بالنظر إلى هذه الفرص وتهدف إلى اكتساب رؤى جديدة حول تطور التكافؤ ، نركز على مقارنة جودة مجموعات الجينوم الكاملة لأصناف النمل التي تنمو الفطريات (Hymenoptera: Formicidae: Attini) وأحد الأقارب الذين يعيشون بحرية. تكشف تحليلاتنا أن المنهجيات وخطوط الأنابيب المتاحة حاليًا لتحليل بيانات تسلسل الجينوم الكامل تحتاج إلى تحسين. باستخدام مجمعات الجينوم المختلفة ، نظهر أن حجم تجميع الجينوم يعتمد على البرنامج المستخدم. وهذا بدوره يؤثر على تنبؤات عدد الجينات ، حيث ترتبط أرقام الجينات المرتفعة بشكل إيجابي بحجم تجميع الجينوم. علاوة على ذلك ، تعتمد غالبية بيانات حجم الجينوم الفطري المتاحة حاليًا على تقديرات مستمدة من مجموعات الجينوم الكامل التي تم إنشاؤها من بيانات الجينوم قصيرة القراءة ، بدلاً من التقنية الأكثر دقة لقياس التدفق الخلوي. هنا ، قمنا بتقدير أحجام الجينوم الفرداني لثلاثة متعايشات فطرية للنمل عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الفطر الجنبة ostreatus (جاك) ب. كوم. (1871) كمعيار معايرة. وجدنا أن أحجام الجينوم المنشورة بناءً على تجميعات الجينوم أكبر بمقدار 2.5 إلى 3 أضعاف من تقديراتنا بناءً على قياس التدفق الخلوي. لذلك ، نوصي باستخدام قياس التدفق الخلوي لمعايرة خطوط أنابيب تجميع الجينوم مسبقًا ، لتجنب التقديرات غير الصحيحة لأحجام الجينوم وضمان التجميعات القوية.

يتزايد تسلسل الجينوم والتحليلات يوميًا بسبب انخفاض التكاليف ، ومع ذلك ، قد يكون تحليل البيانات صعبًا في بعض الأحيان بسبب التوفر الكبير للبرامج التي من المحتمل أن تؤدي إلى تجميعات جينوم خاطئة. في دراستنا ، أظهرنا أن البرامج المختلفة يمكن أن تؤدي إلى استنتاجات مختلفة لنفس بيانات الجينوم ، أي عندما يكون تجميع الجينوم أطول ، يزداد عدد الجينات التي يمكن توقعها من هذا التجميع أيضًا. نوضح أنه من خلال قياس حجم الجينوم بدقة باستخدام قياس التدفق الخلوي ، يمكن أن تساعد البيانات الناتجة في مراقبة جودة مجموعات الجينوم.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


تحليل أحجام جينوم النبات باستخدام قياس التدفق الخلوي: دراسة حالة توضح النطاق الديناميكي والقياس الخطي

تم تصميم أجهزة قياس التدفق الخلوي في الأصل للعمل مع معلقات الخلايا ، وخلايا الدم النموذجية ، ولا تزال معظم التطبيقات تتضمن عينات من هذا النوع. على الرغم من حقيقة أن الخلايا النباتية وبروتوبلاستسها أكبر بشكل عام من خلايا الدم في الثدييات ، لا يزال من الممكن تحليل هذه الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. في معظم مراحل النمو ، تتكون النباتات العليا من أنسجة وأعضاء ، وتجمعات معقدة ثلاثية الأبعاد من الخلايا مرتبطة ببعضها البعض بواسطة جدران خلوية. وبالتالي ، قبل التحليل ، يجب أولاً معالجة النباتات لإنتاج معلقات خلوية متوافقة مع قياس التدفق الخلوي. تتمثل إحدى الطرق في إذابة جدران الخلايا ، باستخدام الإنزيمات التي تعمل على تحلل مكونات الكربوهيدرات الخاصة بها ، لتحرير الخلايا الأولية ، والتي يمكن بعد ذلك تحليلها بسهولة على جهاز قياس الخلايا.

النهج الثاني ، المفصل هنا مع CytoFLEX ، يتضمن تحليل ليس للبروتوبلاست ، ولكن تعليق النوى المنبعثة من أنسجة وأعضاء النبات عبر إجراء تقطيع بسيط (2). يتضمن الإجراء قطع الخلايا داخل الأنسجة باستخدام شفرة حلاقة قياسية ذات حدين. يتم تنقية المتجانسة باستخدام مرشح شبكي من النايلون يتم من خلاله تمرير النوى المحررة. يتم تلطيخ النوى بعد ذلك بفلوروكرومات خاصة بالحمض النووي ، مما يسمح بتحديد التدفق الخلوي لمحتوى الحمض النووي للنواة الفردية. ينبع الاهتمام بقياس أحجام جينوم النبات من الملاحظة التي تشير إلى أن النباتات الأعلى ، عند تحليلها عبر الأنواع ، تعرض نطاقًا كبيرًا بشكل غير عادي من أحجام الجينوم: الحد الأدنى الحالي لحوالي 0.13 بيكوغرام لكل 2 درجة مئوية لنواة Genlisea margaretae إلى حد أعلى من 304.40 بيكوغرام. لباريس جابونيكا (3). الجينوم الأخير أكبر بحوالي 50 مرة من الجينوم البشري ، والحمض النووي من خلية واحدة من باريس جابونيكا ، عند التمدد ، سيمتد حوالي 91 مترًا.

يوفر قياس التدفق الخلوي إلى جانب إجراء التقطيع وسيلة بسيطة لتحديد أحجام الجينوم التي يمكن تطبيقها بشكل عام عبر الأنواع ، وقد تم اعتماد المنهجية على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم لمعالجة العديد من المشكلات في علم الأحياء الأساسي والتطبيقي ، والبيئة ، والزراعة. وهذا يشمل التطبيقات في مجال التكنولوجيا الحيوية ، مثل مراقبة الاستقرار الجيني بعد التحول وثقافة الأنسجة ، وإعطاء الأولوية للأنواع لتسلسل الجينوم الكامل ، والتحقق من اكتمال تجميعات الجينوم الكاملة ، وتوفير التخطيط المناسب لإجراءات الهندسة الوراثية مثل إنتاج مكتبة الحمض النووي. تشمل التطبيقات في الزراعة التي تستفيد من قياس التدفق الخلوي إنتاج خطوط أحادية الصيغة الصبغية وثنائية الصيغة الصبغية باستخدام مزرعة المبيض / المبيض ، متبوعة بمضاعفة الكولشيسين ، وإنتاج خطوط ثلاثية الصبغيات معقم للبذور ، وإنتاج نباتات تحتوي على مستويات رباعي الصبغيات ومستويات تعدد الصبغيات أعلى ، المرتبطة بالسمات المرغوبة مثل حجم الثمار ، ومراقبة جودة حالة euploidy لحصص البذور التجارية ، وتحديد الأفراد الذين لديهم مستويات تكوينية جديدة وعرض أنماط جديدة للتكاثر (بما في ذلك apomixis) ، وتوصيف التهجين بين الأنواع على أساس محتويات الحمض النووي الوسيط ، وتصنيف توزيعات ploidy داخل مجموعات البلازما الجرثومية ، تحديد الجنس في النباتات ثنائية المسكن ، وتحديد الأنواع الهجينة المتكونة بين الأنواع البرية ، وبين الأنواع البرية والمزروعة.

تشمل التطبيقات في تشريح النبات ، وبيولوجيا الخلية ، وعلم وظائف الأعضاء ، والتنمية التي تستفيد من قياس التدفق الخلوي ، دراسة تنظيم دورة انقسام الخلية والتكرار الداخلي في نمو النبات ، وتأثيرات الإجهاد اللاأحيائي والحيوي على هذه العمليات. أدى قياس التدفق الخلوي أيضًا إلى إجراء تحقيقات واسعة النطاق في مفهوم النمط النووي ، أي التأثير الظاهري لمقدار الحمض النووي النووي ، بغض النظر عن محتواه المعلوماتي المشفر ، على الحجم النووي ، ونسب النواة التي تشغلها الكروموسومات ، ومدد الانقسام والانقسام الاختزالي ، وحجم البذور ، والحد الأدنى من وقت التوليد. يعد قياس التدفق الخلوي مفيدًا أيضًا للكشف عن مزيج الصبغيات والخيمرية. يُعرف تحليل التعبير الجيني كدالة لنوع الخلية ، باستخدام نوى مرتبة التدفق ، بشكل متزايد على أنه مجال مهم للبحث. في التصنيف والنظاميات ، يعتبر قياس التدفق الخلوي لا يقدر بثمن في فحص أنماط التكاثر ، وتحديد الانتواع والعزلة الإنجابية ، ووصف ديناميات السكان في المناطق الهجينة ، واكتشاف أنماط خلوية جديدة وبنية النمط الخلوي على مجموعات كبيرة الحجم ، واكتشاف وتحديد النبات. الأنواع من أجل التنوع البيولوجي والحفظ ، ودراسات آليات تطور الجينوم النباتي مع التركيز على أسباب ونتائج تباين محتوى الحمض النووي النووي ، ومعلومات عن التطور تأتي من دراسة محتويات الحمض النووي عبر السلالات. يمكن أيضًا استخدام التحليلات المقارنة واسعة النطاق لحجم الجينوم لدراسة الارتباطات بين حجم الجينوم والعوامل البيئية ، بين حجم الجينوم وكتلة البذور ، بين حجم الجينوم وثراء الأنواع عبر مجموعات نباتية مختلفة ، مع اقتراح أن الأنواع التي تحتوي على جينومات كبيرة قد تكون كذلك. أكثر عرضة للانقراض ، بين حجم الجينوم والإمكانات الغازية ، وبين مكانة بيئية وحجم الجينوم الأدنى (خاصة النباتات آكلة اللحوم).

نتيجة للزيادة السريعة في مستوى الاهتمام بتحليلات قياس التدفق الخلوي من هذا النوع ، والأعداد الكبيرة المتزايدة للأنواع التي يتم نشر البيانات الخاصة بها ، ظهرت مستودعات قابلة للبحث كمورد قيم لتخصيص محتويات الحمض النووي لأحجام الجينوم ، من خلال توفير علاقات المعايرة ، مع الاقتراب من الإجماع بطريقة من مصادر جماعية. واحدة من أهم هذه الموارد هي قاعدة بيانات Kew C-value ، التي يرعاها خبراء ، وتوفر قيم محتوى الحمض النووي النووي كدالة للجنس والأنواع ، في شكل يمكن البحث فيه عبر الإنترنت (3). يحدد القيمون أيضًا قيم محتوى الحمض النووي النووي ذات المعيار الذهبي & ldquo ، والتي يُعتقد أنها أكثر دقة وقابلية للتكرار (3). بشكل عام ، تقديرات التدفق الخلوي لمحتويات الحمض النووي النووي قابلة للمقارنة مع أحجام التجميعات من تسلسل الجينوم الكامل ، على الرغم من أن وجود الحمض النووي الصبغي عالي التكرار يؤدي عادةً إلى تقديرات أقل لحجم الجينوم تم الحصول عليها من النهج القائمة على التسلسل. تم تحديد العديد من العوامل التي لديها القدرة على الخلط بين معايرة التدفق الخلوي ويمكن تجنبها. على سبيل المثال ، فإن الفلورة الملزمة والنتيجة لبعض الفلوركرومات الخاصة بالحمض النووي محددة بزوج أساسي ، وبالتالي فهي ليست مقياسًا حقيقيًا لكمية الحمض النووي عبر الأنواع التي تحتوي على جينومات نووية بنسب AT: GC مختلفة.

في هذا البروتوكول ، نستخدم بروبيديوم يوديد (PI) باعتباره فلوروكروم الحمض النووي. في وجود ريبونوكلياز للقضاء على الإسهامات في التألق بواسطة الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة ، يقوم PI بإقحام الحلزون المزدوج للحمض النووي ، مما ينتج عنه مضان مكثف له أقصى إثارة عند حوالي 535 نانومتر وحد أقصى للانبعاث عند 617 نانومتر. ملف تعريف البث واسع نسبيًا بعرض طيفي أقصى يبلغ 50٪ يمتد حوالي 100 نانومتر (590-690 نانومتر).

تم استخدام PI لتقييم محتوى الحمض النووي لأربعة أنواع: Arabidopsis thaliana (thale cress) Solanum lycopersicum (الطماطم) ، Zea mays (الذرة) والفليفلة السنوية (الفلفل). توضح الأعضاء المستخدمة في تحضير عينات نبات الأرابيدوبسيس والفليفلة الظاهرة المثيرة للاهتمام المتمثلة في التكرار الداخلي ، حيث تدخل الخلايا الجسدية في جولات متتالية من تكرار الجينوم (المرحلة S) دون الانقسام الفتيلي (4). ينتج عن هذه العملية الحلقية تعدد الصبغيات ، وهو أمر شائع في النباتات (7).

شكل. يقيس التدفق الخلوي بشكل فعال التكاثر في الخلايا النباتية. تصور الصورة الصحيحة أنواعًا مختلفة من تكرار الجينات الانقسامية أثناء دورة الخلية. هذه الأحداث تؤدي إلى أنسجة متعددة الصبغيات. على اليسار يتم تصوير سير العمل لإعداد الأنسجة النباتية عن طريق قياس التدفق الخلوي بما في ذلك البيانات التي تشير إلى نتائج التدوير الداخلي الانقسامي.


2 المواد والطرق

2.1 المواد النباتية

تم تصنيف 127 مُدخلًا باسم فيستوكا أوفينا من 20 دولة من شبكة معلومات موارد الأصول الوراثية التابعة لوزارة الزراعة الأمريكية (GRIN) في عام 2016 (الجدول التكميلي S1). زرعت بذور كل سلالة في أواني الدفيئة (حجم أربعة بوصات) مملوءة بتربة BRK Promix (Premier Tech) في مرفق نمو النبات بجامعة مينيسوتا في سانت بول. بعد الوصول إلى مرحلة أربع إلى خمس أوراق ، تم اختيار خمسة شتلات لكل سلالة عشوائياً وزرعها في حاوية مخروطية بحجم بوصة واحدة. تمت زراعة النباتات لمدة 16 ساعة في اليوم و 8 ساعات ليلاً مع الري اليومي والتسميد الأسبوعي باستخدام سماد Peat-lite 20-10-20 (J.R. Peters Inc.) مع كبريتات الأمونيوم التكميلية والحديد المخلّب بالإضافة إلى Mn (BASF). تم استنساخ الأنماط الجينية الخمسة لكل سلالة نباتيًا إلى ستة مكررات لكل نمط وراثي وزُرعت في مشتل ميداني في محطة التجارب الزراعية في مينيسوتا في سانت بول ، مينيسوتا. فيستوكا أوفينا "كواترو" و F. brevipila تم زرع "منارة" أيضًا في الحقل كمعايير.

2.2 إجراء قياس التدفق الخلوي

لتحديد محتوى الحمض النووي للمدخلات ، تم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام الطريقة التي وصفها Arumuganathan and Earle (1991). نظرًا لأن البذور المستخدمة في هذه الدراسة نتجت عن التلقيح المفتوح ، قمنا بتقييم ثلاثة أنماط وراثية لكل سلالة للحصول على تمثيل أكثر دقة للسكان. عندما لم تكن الأنماط الجينية الثلاثة المختارة في نفس المستوى ، تم تقييم النمط الجيني الرابع. تم تحديد مستوى البلويد للمدخل من خلال ploidy للطرز الجينية الأغلبية (75٪).

طازجة وناضجة F. الأوفينا تم حصاد عينات الأوراق في حقل الحضانة بين الساعة 9:00 صباحًا و 11:00 صباحًا وتم تقليمها إلى 1-2 سم واستخدامها لقياس التدفق الخلوي. تم حصاد أنسجة أوراق نبات الريغراس المعمرة في نفس الوقت في الدفيئة. لكل عينة ، احتوى محلول تلطيخ قياس التدفق الخلوي على 4.29 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم ، و 0.71 مل من محلول تلطيخ CyStain UV Precise P ، و 2.14 ميكرولتر من RNAseA. لتحضير الأنسجة النباتية ، تم استئصال عينة أوراق بحجم 0.5 × 0.5 سم إلى قطع صغيرة باستخدام شفرة حلاقة في 500 ميكرولتر CyStain UV Precise P extract Buffer (Sysmex) وتمريرها عبر مرشح 50 ميكرولتر (Sysmex). تمت إضافة محلول التلوين إلى التدفق من خلال تلطيخ النوى في كل عينة. تم تخزين العينات على الجليد قبل تحميل مقياس التدفق الخلوي. تم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام أداة BD LSRII H4760 (BD Biosciences) مع كاشف ليزر PI باستخدام 480 فولت بحد أدنى 1000 حدث في جامعة مينيسوتا Flow Cytometry Resource. تم تصور البيانات وتحليلها على برنامج BD Biosciences FACSDiva 8.0.1.

2.3 تقدير محتوى الحمض النووي وتحديد مستوى التوليف

2.4 قياس حجم البذور ومقارنتها

بالنسبة لقياسات حجم البذور ، اخترنا البذور من المُدخَلات ذات المستويات المتعدية الشائعة لإجراء مقارنة حجم البذور (إجمالي 92 مُدخلًا). تم أيضًا تضمين Tetraploid Quatro و hexaploid Beacon كمراجع. تم نشر البذور على ماسح ضوئي رقمي (الماسح الضوئي المسطح Epson perfection v6 ، Nagano ، اليابان) وتم مسحها ضوئيًا عند 600 نقطة في البوصة بحجم 2169 × 7019 بكسل. تمت معالجة الصور باستخدام نص برمجي Python مخصص (https://github.com/joanmanbar/seed_morphology) قام بتحويل الصور الأصلية لقياس طول وعرض البذور على التوالي مثل الطول (بالبكسل) للمحاور الرئيسية والثانوية لـ القطع الناقص المناسب ، في حين تم حساب المنطقة على أنها عدد البكسل في البذرة. تم حساب مساحة البذور لما لا يقل عن 10 بذور لكل من المدخلات الـ 92. تم استخدام منطقة البذور لتحليل الارتباط بين مستوى ploidy وحجم البذور وتصور باستخدام حزمة ggplot2 في R (Kahle & Wickham ، 2013).


الملخص

Clusterbean (جيم tetragonoloba) محصول نباتي وصناعي بقولي مهم مع تنوع وراثي واسع ولكن معلومات وراثية وخلوية وجينومية هزيلة. في هذه الدراسة ، تم استخدام إجراء محسن لقياس التدفق الخلوي لتقدير حجم الجينوم لثلاثة أنواع من الفاصوليا العنقودية ، ممثلة بـ جيم tetragonoloba (السيرة الذاتية RGC-936) واثنين من الأقارب البرية (C. serreta و C. senegalensis). لتقدير دقيق للمحتوى الجينومي ، القميص G0/ ز1 تم تحديد مجموعات من الأنسجة المتعددة مثل الأوراق ، و hypocotyl ، والبذور الناضجة واستخدامها مع ثلاثة أنواع نباتية مختلفة. بيسوم ساتيفوم (كأساسي) ، أرز أسيوي، و جليكاين max (ثانوي) ، كمعايير مرجعية خارجية وداخلية. نسيج البذور لعينة الاختبار و ماكس قدمت أفضل تقدير لمحتوى الحمض النووي النووي مقارنة بأنسجة العينات الأخرى والمعايير المرجعية. حجم الجينوم جيم tetragonoloba تم اكتشافه عند 580.9 ± 0.02 ميغابت في الثانية (1 درجة مئوية) ، في حين أن C. serreta و C. senegalensis قُدرت بـ 979.6 ± 0.02 ميغابت في الثانية (1 درجة مئوية) و 943.4 ± 0.03 ميغابت في الثانية (1 درجة مئوية) ، على التوالي. وهكذا ، فإن الأقارب البرية تؤوي ، ما يقرب من ضعف محتوى الجينوم من حبة العنقود المزروعة. نتائج هذه الدراسة ستثري قاعدة البيانات الجينومية لعائلة البقوليات ويمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق للدراسات التطورية وعلم الجينوم.


تحليل أحجام جينوم النبات باستخدام قياس التدفق الخلوي: دراسة حالة توضح النطاق الديناميكي والقياس الخطي

تم تصميم أجهزة قياس التدفق الخلوي في الأصل للعمل مع معلقات الخلايا ، وخلايا الدم النموذجية ، ولا تزال معظم التطبيقات تتضمن عينات من هذا النوع. على الرغم من حقيقة أن الخلايا النباتية وبروتوبلاستس أكبر بشكل عام من خلايا الدم في الثدييات ، لا يزال من الممكن تحليل هذه الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. في معظم مراحل النمو ، تتكون النباتات العليا من أنسجة وأعضاء ، وتجمعات معقدة ثلاثية الأبعاد من الخلايا مرتبطة ببعضها البعض بواسطة جدران خلوية. وبالتالي ، قبل التحليل ، يجب أولاً معالجة النباتات لإنتاج معلقات خلوية متوافقة مع قياس التدفق الخلوي. تتمثل إحدى الطرق في إذابة جدران الخلايا ، باستخدام الإنزيمات التي تقوم بتحلل مكونات الكربوهيدرات الخاصة بها ، لتحرير الخلايا الأولية ، والتي يمكن بعد ذلك تحليلها بسهولة على جهاز قياس الخلايا.

النهج الثاني ، المفصل هنا مع CytoFLEX ، يتضمن تحليل ليس للبروتوبلاست ، ولكن تعليق النوى المنبعثة من أنسجة وأعضاء النبات عبر إجراء تقطيع بسيط (2). يتضمن الإجراء قطع الخلايا داخل الأنسجة باستخدام شفرة حلاقة قياسية ذات حدين. يتم تنقية المتجانسة باستخدام مرشح شبكي من النايلون يتم من خلاله تمرير النوى المحررة. يتم تلطيخ النوى بعد ذلك بفلوروكرومات خاصة بالحمض النووي ، مما يسمح بتحديد التدفق الخلوي لمحتوى الحمض النووي للنواة الفردية. ينبع الاهتمام بقياس أحجام جينوم النبات من الملاحظة التي تشير إلى أن النباتات الأعلى ، عند تحليلها عبر الأنواع ، تعرض نطاقًا كبيرًا بشكل غير عادي من أحجام الجينوم: الحد الأدنى الحالي لحوالي 0.13 بيكوغرام لكل 2 درجة مئوية لنواة Genlisea margaretae إلى حد أعلى من 304.40 بيكوغرام. لباريس جابونيكا (3). الجينوم الأخير أكبر بحوالي 50 مرة من الجينوم البشري ، والحمض النووي من خلية واحدة من باريس جابونيكا ، عندما يتمدد ، سيمتد حوالي 91 مترًا.

يوفر قياس التدفق الخلوي إلى جانب إجراء التقطيع وسيلة بسيطة لتحديد أحجام الجينوم التي يمكن تطبيقها بشكل عام عبر الأنواع ، وقد تم اعتماد المنهجية على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم لمعالجة العديد من المشكلات في علم الأحياء الأساسي والتطبيقي ، والبيئة ، والزراعة. وهذا يشمل التطبيقات في مجال التكنولوجيا الحيوية ، مثل مراقبة الاستقرار الجيني بعد التحول وثقافة الأنسجة ، وإعطاء الأولوية للأنواع لتسلسل الجينوم الكامل ، والتحقق من اكتمال تجميعات الجينوم الكاملة ، وتوفير التخطيط المناسب لإجراءات الهندسة الوراثية مثل إنتاج مكتبة الحمض النووي. تشمل التطبيقات في الزراعة التي تستفيد من قياس التدفق الخلوي إنتاج خطوط أحادية الصيغة الصبغية وثنائية الصيغة الصبغية باستخدام مزرعة المبيض / المبيض ، متبوعة بمضاعفة الكولشيسين ، وإنتاج خطوط ثلاثية الصبغيات معقم للبذور ، وإنتاج نباتات تحتوي على مستويات رباعي الصبغيات ومستويات تعدد الصبغيات أعلى ، المرتبطة بالسمات المرغوبة مثل حجم الثمار ، ومراقبة جودة حالة euploidy لحصص البذور التجارية ، وتحديد الأفراد الذين لديهم مستويات تكوينية جديدة وعرض أنماط جديدة للتكاثر (بما في ذلك apomixis) ، وتوصيف التهجين بين الأنواع على أساس محتويات الحمض النووي الوسيط ، وتصنيف توزيعات ploidy داخل مجموعات البلازما الجرثومية ، تحديد الجنس في النباتات ثنائية المسكن ، وتحديد الأنواع الهجينة المتكونة بين الأنواع البرية ، وبين الأنواع البرية والمزروعة.

تشمل التطبيقات في تشريح النبات ، وبيولوجيا الخلية ، وعلم وظائف الأعضاء ، والتنمية التي تستفيد من قياس التدفق الخلوي ، دراسة تنظيم دورة انقسام الخلية والتكرار الداخلي في نمو النبات ، وتأثيرات الإجهاد اللاأحيائي والحيوي على هذه العمليات. أدى قياس التدفق الخلوي أيضًا إلى إجراء تحقيقات واسعة النطاق في مفهوم النمط النووي ، أي التأثير الظاهري لمقدار الحمض النووي النووي ، بغض النظر عن محتواه المعلوماتي المشفر ، على الحجم النووي ، ونسب النواة التي تشغلها الكروموسومات ، ومدد الانقسام والانقسام الاختزالي ، وحجم البذور ، والحد الأدنى من وقت التوليد. يعد قياس التدفق الخلوي مفيدًا أيضًا للكشف عن مزيج الصبغيات والخيمرية. يُعرف تحليل التعبير الجيني كدالة لنوع الخلية ، باستخدام نوى مرتبة التدفق ، بشكل متزايد على أنه مجال مهم للبحث. في التصنيف والنظاميات ، يعتبر قياس التدفق الخلوي لا يقدر بثمن في فحص أنماط التكاثر ، وتحديد الانتواع والعزلة الإنجابية ، ووصف ديناميات السكان في المناطق الهجينة ، واكتشاف أنماط خلوية جديدة وبنية النمط الخلوي على مجموعات كبيرة الحجم ، واكتشاف وتحديد النبات. الأنواع من أجل التنوع البيولوجي والحفظ ، ودراسات آليات تطور الجينوم النباتي مع التركيز على أسباب ونتائج تباين محتوى الحمض النووي النووي ، ومعلومات عن التطور تأتي من دراسة محتويات الحمض النووي عبر السلالات. يمكن أيضًا استخدام التحليلات المقارنة واسعة النطاق لحجم الجينوم لدراسة الارتباطات بين حجم الجينوم والعوامل البيئية ، بين حجم الجينوم وكتلة البذور ، بين حجم الجينوم وثراء الأنواع عبر مجموعات نباتية مختلفة ، مع اقتراح أن الأنواع التي تحتوي على جينومات كبيرة قد تكون كذلك. أكثر عرضة للانقراض ، بين حجم الجينوم والإمكانات الغازية ، وبين مكانة بيئية وحجم الجينوم الأدنى (خاصة النباتات آكلة اللحوم).

نتيجة للزيادة السريعة في مستوى الاهتمام بتحليلات قياس التدفق الخلوي من هذا النوع ، والأعداد الكبيرة المتزايدة للأنواع التي يتم نشر البيانات الخاصة بها ، ظهرت مستودعات قابلة للبحث كمورد قيم لتخصيص محتويات الحمض النووي لأحجام الجينوم ، من خلال توفير علاقات المعايرة ، مع الاقتراب من الإجماع بطريقة من مصادر جماعية. واحدة من أهم هذه الموارد هي قاعدة بيانات Kew C-value ، التي يرعاها خبراء ، وتوفر قيم محتوى الحمض النووي النووي كدالة للجنس والأنواع ، في شكل يمكن البحث فيه عبر الإنترنت (3). يحدد القيمون أيضًا قيم محتوى الحمض النووي النووي ذات المعيار الذهبي & ldquo ، والتي يُعتقد أنها أكثر دقة وقابلية للتكرار (3). بشكل عام ، تقديرات التدفق الخلوي لمحتويات الحمض النووي النووي قابلة للمقارنة مع أحجام التجميعات من تسلسل الجينوم الكامل ، على الرغم من أن وجود الحمض النووي الصبغي عالي التكرار يؤدي عادةً إلى تقديرات أقل لحجم الجينوم تم الحصول عليها من النهج القائمة على التسلسل. تم تحديد العديد من العوامل التي لديها القدرة على الخلط بين معايرة التدفق الخلوي ويمكن تجنبها. على سبيل المثال ، فإن الفلورة الملزمة والنتيجة لبعض الفلوركرومات الخاصة بالحمض النووي محددة بزوج أساسي ، وبالتالي فهي ليست مقياسًا حقيقيًا لكمية الحمض النووي عبر الأنواع التي تحتوي على جينومات نووية بنسب AT: GC مختلفة.

في هذا البروتوكول ، نستخدم بروبيديوم يوديد (PI) باعتباره فلوروكروم الحمض النووي. في وجود ريبونوكلياز للقضاء على الإسهامات في التألق بواسطة الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة ، يقوم PI بإقحام الحلزون المزدوج للحمض النووي ، مما ينتج عنه مضان مكثف له أقصى إثارة عند حوالي 535 نانومتر وحد أقصى للانبعاث عند 617 نانومتر. ملف تعريف البث واسع نسبيًا بعرض طيفي أقصى يبلغ 50٪ يمتد حوالي 100 نانومتر (590-690 نانومتر).

تم استخدام PI لتقييم محتوى الحمض النووي لأربعة أنواع: Arabidopsis thaliana (thale cress) Solanum lycopersicum (الطماطم) ، Zea mays (الذرة) والفليفلة السنوية (الفلفل). توضح الأعضاء المستخدمة في تحضير عينات نبات الأرابيدوبسيس والفليفلة الظاهرة المثيرة للاهتمام المتمثلة في التكرار الداخلي ، حيث تدخل الخلايا الجسدية في جولات متتالية من تكرار الجينوم (المرحلة S) دون الانقسام الفتيلي (4). ينتج عن هذه العملية الحلقية تعدد الصبغيات ، وهو أمر شائع في النباتات (7).

شكل. يقيس التدفق الخلوي بشكل فعال التكاثر في الخلايا النباتية. تصور الصورة الصحيحة أنواعًا مختلفة من تكرار الجينات الانقسامية أثناء دورة الخلية. هذه الأحداث تؤدي إلى أنسجة متعددة الصبغيات. على اليسار يتم تصوير سير العمل لإعداد الأنسجة النباتية عن طريق قياس التدفق الخلوي بما في ذلك البيانات التي تشير إلى نتائج التدوير الداخلي الانقسامي.


حول تطبيق قياس التدفق الخلوي في تحديد الحجم الجينومي لنباتات الخيزران

دوى: 10.11833 / j.issn.2095-0756.20200212
  • تاريخ الحصول عليه: 2020-03-18
  • تاريخ Rev Recd: 2020-09-28
  • متوفر على الانترنت: 2021-01-21
  • تاريخ النشر: 2021-01-21

الملخص: موضوعي يهدف هذا البحث إلى دراسة تأثير أنسجة المادة وطريقة العلاج على حجم جينوم نباتات الخيزران بهدف نهائي هو تحسين دقة تحديد حجم الجينوم لنبات البامبو. طريقة مع اختيار أوراق وبراعم أنواع مختلفة من الخيزران كمواد ، واستخدام الأرز كمعيار مرجعي بينما تم تحديد وقت التلوين النووي لـ 9 تدرجات مختلفة ، أي 1 ، 3 ، 5 ، 7 ، 9 ، 12 ، 18 ، 24 و 30 دقيقة ، تم إجراء تحقيق لمواقع الأنسجة والمواد الملونة لنباتات الخيزران المختلفة باستخدام قياس التدفق الخلوي. نتيجة (1) مع نفس أنواع الخيزران ، كانت الأوراق والبراعم متشابهة في ذروة التألق وحجم الجينوم مع نطاق اختلاف حجم الجينوم بمقدار 0.04

0.20 ص. (2) تختلف أنواع الخيزران الـ 12 في وقت تلطيخها النووي ، مع كثافة التألق سينوبامبوسا توتسيك, سينوبامبوسا توتيسيك F. ألبو ستراتا, بسيودوساسا جابونيكا فار. تسوتسوميانا, بسيودوساسا جابونيكا F. أكيبونو, Indocalamus ديكور, ساسايلا جلابرا F. ألبو ستراتا و شيمونوبامبوسا ماموريا F. فاريغاتا الوصول إلى الحد الأقصى خلال دقيقة واحدة ، أي مجمع بامبوسا و Phyllostachys sulphurea الوصول إلى الحد الأقصى في غضون 3 دقائق ، ذلك من Pseudosasa amabilis فار. امبيليس و Thyrsostachy ssiamensis الوصول إلى الحد الأقصى في غضون 5 دقائق ، بينما من Phyllostachys sulphurea (ورقة) تصل إلى الحد الأقصى في غضون 7 دقائق. (3) تختلف شدة التألق لـ 12 الخيزران بشكل كبير من 1 إلى 30 دقيقة ، وكلها تتجاوز 5 ٪ باستثناء ورقة P. امبيليس فار. امبيليس, T. ssiamensis ، تعدد الإرسال وإطلاق النار S. توتسيك. في الواقع ، فإن كثافة الأسفار P. جابونيكا فار. تسوتسوميانا و S. glabra F. ألبو ستراتا وصلت إلى 12.93٪ و 12.88٪ على التوالي. (4) أما بالنسبة لحجم الجينوم لـ 12 نوعًا من الخيزران ، ونوعين من الخيزران الخشبي الاستوائي تعدد الإرسال و T. ssiamensis تغيرت من (2.64 ± 0.54) بيكوغرام إلى (2.69 ± 1.01) بيكوغرام ، ومع ذلك ، تغيرت الأنواع العشرة من الخيزران الخشبي المعتدل من (3.76 ± 1.51) بيكوغرام إلى (5.73 ± 1.85) بيكوغرام من 10 أنواع من الخيزران المعتدل ، الجينوم حجم فيلوستاشيس تغيرت من (3.76 ± 1.51) بيكوغرام إلى (3.91 ± 0.95) بيكوغرام ، ومع ذلك فإن جنس البامبو الآخر تغير من (4.82 ± 0.54) بيكوغرام إلى (5.73 ± 1.85) بيكوغرام ، والذي من الواضح أنه أكبر من فيلوستاشيس. استنتاج (1) يمكن استخدام كل من أوراق وبراعم الخيزران كمواد تجريبية لتحديد أحجام الجينوم عن طريق قياس التدفق الخلوي. يكون لوقت التلوين النووي تأثير معين على تحديد حجم جينوم الخيزران من 3 إلى 5 دقائق كوقت تلطيخ مثالي. (2) من الواضح أن حجم الجينوم لأنواع الخيزران الخشبية الاستوائية أصغر من حجم أنواع الخيزران الخشبي المعتدل بينما من بين أنواع الخيزران الخشبية المعتدلة ، فإن حجم جينوم فيلوستاشيس من الواضح أنها أصغر من الأنواع الأخرى من الخيزران. [الفصل ، 1 شكل. 5 علامة التبويب. 29 المرجع.]

流式细胞 术 是 指 利用 流式细胞 仪 对 悬浮 细胞 或 微粒 等 进行 分析 的 现代 分析 该 该 对 一些 的 细胞 和 进行 分析 和 分 选 还可 对 动植物 基因 组 大小 及 倍性 水平 等 进行 测定 和 分析 [1-3]。 在 分析 植物 基因 组 大小 过程 中 , 与 传统 福尔 根 染色 相比 , , 术 具有 速度 快 、 准确性 高等。 因此 , 目前 流 式细胞 术 在 植物 基因 组 大小 研究 中 发挥 了 重要 的 作用 , 约 265 种 菊 科 النجمية 植物 、 157 种 莎草 科 Cyperaceae 植物 及 191 种 毛茛 属حوذان植物 的 基因 组 大小 已 通过 流式细胞 仪 被 测定 [2، 4 - 7] , 大量 植物 的ج值 (指 单倍体 细胞核 的 DNA 含量) 数据库 已 建立 [8]。 基因 组 大小 信息 可 植物 系统 分类 基因 组 测序 及 重 研究 提供 参考 , 因此 , 植物 基因 组 大小 测量 精度 至关重要 [9 - 10]。 竹类 植物 是 重要 的 森林 资源 , 全世界 约 119 属 1482 种 , 在 分布 分布 的 37 属 500 余 种 , 变种 变 100 余 种 [11-13]。 在 竹类 植物 基因 组 学研究 中 , 目前 仅有 毛竹فيلوستاشيس إيدوليس、 莪 莉 竹اوليرا لاتيفوليا、 芸香 竹Raddia guianensis及 瓜 多 竹Guadua angustifolia等 竹 种 完成 了 全 基因 组 测序 工作 , 在 整个 竹类 植物 中 所占 比例 不足 0.2٪ [10 ، 14-15]。 另外 , 在 竹类 植物 基因 组 大小 研究 中 , 约 200 个 竹 种 的 基因大小 通过 流式细胞 仪 被 测定 , 由于 不同 研究者 所 用 实验 、 类型 及 实验 方法 不同 部分 竹 种 在 测量 一定 [16-19]。 流 式 样品 制作 主要 分为 细胞核和 染色 2 个 步骤 , 因 不同 植物 细胞 内含 物 及 代谢 物 成分 不同 , 所 用 细胞核 提取 在 上 上 较大 差异 往往 会 重点 关注 细胞核 液 , 而 忽略 染色 时间 对 实验 结果 的影响。 因此 , 为了 进一步 提高 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 精度 , 本 分析 了 样品 部位 及 染色 时间 对 基因 组 大小 测定 结果 的 , 并 在 此 基础 上 揭示基因 组 大小 , 以 期 为 竹类 植物 系统 分类 及 基因 组 测序 等 提供 参考。

1.1材料

以 已 测序 的 水稻أرز أسيوي为 参照 。12 个 竹 种 清单 及 采样 信息 见 表 1。 流式细胞 仪 分析 的 材料 要求 是 幼嫩 的 组织 部位 , 不能 冷冻 和 干燥 等 处理。 植物 叶片 和 笋 均可 满足 实验要求 , 而且 方便 采集 , 特别 是 竹笋 更 适合 长时间 保存。 唐 竹سينوبامبوسا توتسيك、 茶 竿 竹Pseudosasa amabilis فار. امبيليس、 孝顺 竹مجمع بامبوسا及 黄皮 刚 竹Phyllostachys sulphurea等 4 个 竹 种 同时 以 叶片 和 笋 为 材料 , 花叶 唐 竹سينوبامبوسا توتيسيك F. ألبو ستراتا、 黄皮 绿 筋 竹Phyllostachys sulphurea、 平安 竹بسيودوساسا جابونيكا فار. تسوتسوميانا、 柳叶 细竹Thyrsostachy ssiamensis、 花叶 赤 竹ساسايلا جلابرا F. ألبو ستراتا、 美丽 箬竹Indocalamus ديكور、 曙 筋 矢 竹بسيودوساسا جابونيكا F. أكيبونو及 红 秆 寒竹شيمونوبامبوسا ماموريا F. فاريغاتا等 8 个 竹 种 主要 是 从 国内外 一些 竹 种 园 收集 而来。 这些 种 数量 有限 , 笋 , 因此 , 这 8 个 竹 种 均以 叶片 为 材料。

竹 种材料 来源经纬度竹 种材料 来源经纬度
孝顺 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق茶 竿 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق
柳叶 细竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق平安 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق
黄皮 刚 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق曙 筋 矢 竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق
黄皮 绿 筋 竹浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق花叶 赤 竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق
唐 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق美丽 箬竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق
花叶 唐 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق红 秆 寒竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 شمالاً ، 119 ° 26′00 شرق

الجدول 1. وصف التوزيع الجغرافي لـ 12 نوعًا من الخيزران

1.2方法

1.2.1.流式细胞 仪 样品 制备

对于 竹类 植物 叶片 样品 , 选取 顶端 尚未 展开 的 心 叶 或 心 叶 已 展开 的 对于 样品 , 选择 新鲜 的 嫩 笋 , 实验 过程 中 剥去 笋 壳。 用 双面 刀片 切 取一段 面积 约 1 سم 2 或 厚度 约 1.0 مم 的 叶片 , 面积 约 0.25 سم 2 的 嫩 笋 置于 干净 的 培养皿 中 , 然后 向 培养皿 中 加入 500 ميكرولتر 细胞核 提取 液 (cystain UV دقيق P Nuclei Extraction Buffer , بارتك , 编号 5003) 润湿 样品 , 用 锋利 的 双面 刀片 迅速 将 样品 剁碎 , 将 培养皿 倾斜 静置 1

دقيقتان , 使 细胞核 提取 充分 , 之后 向 培养皿 中 加入 2 مل DAPI (4،6-Diamidino-2-phenylindole) 染色液 (مخزن مؤقت للأشعة فوق البنفسجية دقيق من السيستين , PARTEC , 编号 5003) 对 细胞核 进行 染色 , 然后 用30 目的 滤 头 将 样品 过滤 到 进 样 管 中 , 准备 上 机 测 样。

1.2.2.流式细胞 仪 样品 测定

根据 前期 多次 预 实验 结果 , 设置 样品 染色 时间 为 1、3、5、7、9、12、18、24 和 30 دقيقة 共 9 个 梯度 , 利用 流式细胞 仪 (محلل بارتيك CyFlow ploidy) 对 样品 进行测定测定 为了 确保 测量 结果 的 准确性 , 每次 实验 先 以 水稻 为 参照 , 分析 测序 毛竹 的 组 大小 , 在 此 基础 再 对 其他 竹 种 基因 大小 进行 测量 和 分析。 为了 误差 , 每个种 设置 3 个 不同 重复 , 变异 系数 控制 在 5٪ 以内。

1.2.3.不同 竹 种 的 DNA 含量 分析

登录ج值 数据库 网站 (http://www.rbgkew.org.uk/cval/homepage.html) , 查出 水稻 二倍体 基因 组 对应 的 DNA 含量 2ج为 1.0 بيكوغرام 并 推算 待测 竹 种 的 2ج值 : 待测 竹 种 2ج 值 (pg) = (待测 竹 种 峰值 / 水稻 峰值) × 水稻 2ج 值 (1.0 pg) , 水稻 单倍体 基因 组 大小 为 466 ميجا بايت [20]。 据此 可以 推算 出 相应 竹 种 基因 组 对应 的 碱基 数。

2.1.植物 叶片 和 笋 基因 组 大小 测量 结果 分析

. . . 2ج所 对应 的 峰 , 右侧 较低 的 峰 为 4ج细胞 所 对应 的 峰 , 且 相同 类型 细胞 对应 的 荧光 强度 值 也 几乎 一致 (图 1A1

شكل 1. قيمة ذروة التدفق الخلوي لبعض أوراق الخيزران ويطلق النار

. .对应 的 基因 组 大小 并非 完全 吻合 , 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 孝顺 竹 及 黄皮 刚 竹叶 片 对应 的 2ج值 分别 为 (5.03 ± 2.33) 、 (4.82 ± 0.54) 、 (2.64 ± 0.50) 和 (3.76 ± 1.51) pg 而 笋 对应 的 2ج值 分别 为 (4.99 ± 1.56) 、 (5.02 ± 1.99) 、 (2.72 ± 0.59) 和 (3.86 ± 2.31) pg 其中 茶 竿 竹 、 孝顺 竹叶 片 2ج值 略 小于 笋 对应 的 2ج值 , 差值 分别 为 0.20、0.10 和 0.08 pg , 而 唐 竹叶 片 2ج值 比 其 笋 略大 0.04 pg (表 2)。 虽然 4 个 竹 种 叶片 和 笋 所获 组 组 大小 完全 , 但是 差值 非常 小 在 误差 允许 范围 内。 因此 , 对 竹类 植物 而言其 叶片 和 笋 均可 作为 其 基因 组 大小 研究 的 材料。

物种材料 部位2ج值 ± 标准 差 / ص基因 组 大小 ±
标准 差 / ميغا بايت
水稻 叶片1.00±0.00860.00±0.00
唐 竹 叶片5.03±2.334 325.80±2.33
4.99±1.564 291.40±1.56
茶 竿 竹 叶片4.82±0.544 145.20±0.54
5.02±1.994 317.20±1.99
孝顺 竹 叶片2.64±0.542 270.40±0.54
2.72±0.592 339.20±0.59
黄皮 刚 竹叶片3.76±1.513 233.60±1.51
3.86±2.313 319.60±2.31

الجدول 2. حجم الجينوم لأوراق وبراعم 4 أنواع من الخيزران

2.2.时间 对 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 影响

表 3 表明 : 12 个 竹 种 一定 时间 内 达到 最大 荧光 强度 值 后 , 染色 时间 延长 强度 值 均有 不同 程度 的 , 当 染色 时间 延长 大部分 竹 种 的 荧光强度 值 基本 减少 到 最小。 首先 , 同一 竹 种 的 叶片 和 笋 的 染色 时 长 及 荧光 变化 也不 完全相同 以 唐 唐 为例 叶片 叶片 染色 دقيقة واحدة 荧光 强度 即 达到 最大 , 之后 随着 染色 时间 延长 ,荧光 强度 值 不断 减少 , 当 染色 时间 延长 到 30 دقيقة 时 , 荧光 强度 值 减少 到 最小 , 约 6.23٪ , 而 唐 竹笋 最大 荧光 强度 则 出现 在 3 دقائق , 之后 随着 染色 时间 延长 , 荧光 强度 不断 减少, 染色 30 دقيقة 时 , 其 荧光 强度 减少 到 119.75 ± 1.40 , 约 减少 2.67٪ (表 3 和 表 4)。 其次 , 12 个 竹 种 荧光 强度 在 0

物种部位染色 时间 对应 的 荧光 强度 峰值
1357912182430 دقيقة
水稻 24.67±0.3824.42±0.4824.2±0.5224.16±0.4224.07±0.3623.94±0.3823.8±0.3423.47±0.2723.15±0.24
唐 竹 123.98±2.33123.32±2.68122.24±3.14121.48±3.27120.81±2.72119.83±2.84118.59±3.08117.32±2.55116.25±2.19
121.85±1.51123.04±1.56122.77±1.23122.11±1.51121.86±0.78120.82±0.35120.67±0.09119.75±1.40119.87±0.60
茶 竿 竹 118.13±1.24118.81±0.59118.97±0.54118.52±1.03117.99±0.92116.27±1.73115.82±2.62115.75±2.24115.31±2.43
123.39±1.90123.67±2.00123.75±2.00123.18±2.09122.57±1.57121.37±1.87119.56±2.31118.80±1.68118.85±1.24
孝顺 竹 64.07±0.4465.20±0.5464.92±0.5964.63±0.2264.88±0.4464.54±0.8363.85±0.8363.70±0.8663.35±0.74
67.22±0.5966.90±1.1565.60±1.9764.72±2.0763.71±2.9062.85±3.1764.79±1.6460.61±5.9059.81±6.10
黄皮 刚 竹 91.20±1.8392.27±1.6092.50±1.5292.70±1.3692.54±1.3691.98±1.9190.64±2.2790.11±1.9387.70±1.09
95.21±1.8395.35±2.3194.46±3.3292.72±3.2292.09±2.8191.10±2.2889.01±2.7488.30±2.0387.66±1.87
黄皮 绿 筋 竹95.84±1.1996.37±0.9595.66±1.2295.74±1.2395.10±1.5394.68±1.8593.47±1.8192.32±2.2591.27±3.96
平安 竹 134.17±0.93133.44±0.57132.43±1.18131.34±1.49130.17±1.63129.10±1.93125.12±4.50122.36±6.36116.82±8.22
花叶 唐 竹 126.61±1.96125.97±1.71125.58±2.88124.25±2.10123.76±1.86122.98±2.18120.92±2.30118.80±3.17117.99±2.33
花叶 赤 竹 132.17±1.58131.67±1.67131.36±1.46129.64±2.47127.77±3.32124.73±3.37122.08±3.05118.56±3.82115.14±3.52
曙 筋 矢 竹 141.29±1.85141.20±1.47140.06±2.06139.30±2.20138.50±1.63137.64±1.84135.40±2.90133.01±2.20129.62±3.47
美丽 箬竹 133.08±1.14132.59±2.03130.98±3.10130.03±2.85127.63±2.80125.61±3.61121.71±4.26119.82±5.21116.67±6.85
柳叶 细竹 65.67±1.4765.88±0.8366.25±1.0166.23±0.6866.09±0.4066.14±0.4266.39±0.8365.12±1.4763.30±0.96
红 秆 寒竹 132.82±0.97132.29±1.73131.62±1.88131.36±2.02130.12±2.22130.10±2.21127.39±3.91126.18±3.35123.87±3.58

الجدول 3. متوسط ​​القيمة في أوقات الصباغة المختلفة لـ 12 نوعًا من الخيزران

竹 种材料 部位最大 荧光 强度最小 荧光 强度荧光 强度 减少 值变化 比例 /٪
唐 竹 123.98±2.33116.25±2.197.736.23
123.04±1.56119.75±1.403.292.67
茶 竿 竹 118.97±0.54115.31±2.433.653.07
123.75±2.00118.80±1.684.954.00
孝顺 竹 65.20±0.5463.35±0.741.852.84
67.22±0.5959.81±6.107.4111.02
黄皮 刚 竹 92.70±1.3687.70±1.095.005.39
95.35±2.3187.66±1.877.698.07
黄皮 绿 筋 竹96.37±0.9591.27±3.965.105.30
平安 竹 134.17±0.93116.82±8.2217.3512.93
花叶 唐 竹 126.61±1.96117.99±2.338.626.81
花叶 赤 竹 132.17±1.58115.14±3.5217.0312.88
曙 筋 矢 竹 141.29±1.85129.62±3.4711.678.26
美丽 箬竹 133.08±1.14116.67±6.8516.4112.33
柳叶 细竹 66.39±0.8363.30±0.962.954.45
红 秆 寒竹 132.82±0.97123.87±3.588.956.74

الجدول 4. تغيير شدة الإسفار بمقدار 12 بامبو

.寒竹 染色 دقيقة واحدة 即 达到 最大 荧光 强度 , 染色 时间 延长 到 3 دقائق 时 , 荧光 强度 略有 衰减 , 但 减少 不明显 (表 3) ; 孝顺 竹 和 黄皮 绿 筋 竹 最大 荧光 强度 出现 在 3 دقائق , 但与 1、5 دقيقة 对应 的 荧光 强度 相差 不明显 (表 3) ; 茶 竿 竹 和 柳叶 细竹 最大 荧光 强度 出现 5 دقائق , 其中 茶 竿 竹 最大 荧光 强度 与其 3 دقائق 时 的 荧光 强度 最接近 , 而 柳叶 细竹 最大 荧光 强度 与其 7 دقائق 时 的 荧光 强度 最接近 , 只有 黄皮 刚 竹 最大 强度 出现 7 دقائق , 但 与 5、9 دقيقة 对应 的 峰值 十分 接近 (表 3)。 以 笋 为 材料 时, 荧光 强度 随 染色体 时间 变化 情况 与 叶片 相似 , 其中 孝顺 竹 的 笋 最大 荧光 强度 出现 在 دقيقة واحدة , 唐 竹 和 黄皮 刚 竹 竹 种 笋 的 最大 强度 出现 在 在 3 دقائق , 茶 竿 竹 最大 荧光 强度出现 在 5 دقائق (表 3)。 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 孝顺 竹 和 黄皮 刚 竹 4 个 竹 同时 以 叶片 和 笋 为 , 但是 叶片 和 笋 对应 的 荧光 曲线 图 也不 完全相同 , 例如 黄皮刚 竹笋 的 最大 荧光 强度 出现 3 دقائق , 叶片 最大 荧光 强度 却 出现 在 7 دقائق (表 3)。 综上所述 , 无论 是 叶片 还是 竹笋 , 当 染色 时间 延长 到 3 دقائق 时 , 75٪ 的 竹 种已 达到 最大 荧光 强度 值 , 延长 到 5 دقائق 时 , 已有 91.67٪ 竹 种 达到 最大 荧光 强度。 因此 , 为 确保 竹类 基因 组 大小 测定 结果 的 准确性 , 竹类 植物 染色 时间 最好 控制 在7 دقائق 以内 , 以 3

2.3 12 个 不同 属 种 竹 种 的 基因 组 大小 分析

表 5 表明 : 孝顺 竹 和 柳叶 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (2.64 ± 0.54) 和 (2.69 ± 1.01) pg 明显 小于 其他 10 个 种 ; 其次 为 刚 竹 属فيلوستاشيس黄皮 刚 竹 和 黄皮 绿 竹 , 对应 的 2ج值 分别 为 (3.76 ± 1.51) 和 (3.91 ± 0.95) pg 明显 小于 一些 竹 属 的 竹 种 为 唐 竹سينوبامبوسا的 唐 竹 和 花叶 唐 竹 , 对应 的 基因 组 大小 分别 (5.03 ± 2.33) 和 (5.13 ± 1.96) pg 赤 竹 属ساسيلا的 花叶 赤 竹 、 箬竹 属إندوكالاموس的 美丽 箬竹 及 寒竹 属شيمونوبامبوسا的 红 秆 寒竹 3 个 竹 种 组 大小 比较 相近 , 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (5.36 ± 1.58) 、 (5.39 ± 1.14) 和 (5.38 ± 0.97) pg 茶 竿 、 平安 竹 和 曙 筋 竹 在 分类上 虽然 为 同一 属 , 但 差异 较大 , 这 3 竹 种 的 基因 (4.82 ± 0.54) 、 (5.44 ± 0.93) 和 (5.73 ± 1.85) pg

物种2ج值 ± 标准 差 / ص基因 组 大小 ± 标准 差 / ميغا بايت物种2ج值 ± 标准 差 / ص基因 组 大小 ± 标准 差 / ميغا بايت
水稻 1.00±0.00860.00±0.00茶 竿 竹 4.82±0.544 145.20±0.54
孝顺 竹 2.64±0.542 270.40±0.54平安 竹 5.44±0.934 678.40±0.93
柳叶 细竹 2.69±1.012 313.40±1.01曙 筋 矢 竹5.73±1.854 927.80±1.85
黄皮 刚 竹 3.76±1.513 233.60±1.51花叶 赤 竹5.36±1.584 609.60±1.58
黄皮 绿 筋 竹3.91±0.953 362.60±0.95美丽 箬竹5.39±1.144 635.40±1.14
唐 竹 5.03±2.334 325.80±2.33红 秆 寒竹5.38±0.974 626.80±0.97
花叶 唐 竹 5.13±1.964 411.80±1.96
说明 : 以 12 个 竹 种 叶片 对应 的 最大 荧光 强度 值为 依据 , 对其 基因 组 大小 进行 了 计算

الجدول 5. حجم جينوم 12 نوعًا مختلفًا من الخيزران

كومار 等 [18] 研究 表明 : 分布 在 新加坡 的 孝顺 竹 基因 组 大小 为 (3.11 ± 0.02) pg ZHOU 等 [19] 研究 表明 : 中国 中国 的 竹 为 (2.78 ± 0.02) pg .式 细胞 仪 测定 植物 基因 组 大小 过程 中 , 细胞核 提取 液 、 染色液 浓度 染色液 类型 及 时间 等均 会对 基因 组 产生 一定 影响 [21-23] كومار 等 [18] 以 烟草نيكوتيانا تاباكوم为 对照 , 采用 碘化 丙 啶 (PI) 荧光 染料 对 细胞核 进行 染色 , 为了 去除 烟草 等 植物 细胞 一些 特殊 的 内含 物 , 细胞核 提取 液 中 加入 了 一定 量 的 聚乙烯 吡咯烷酮 (PVP)。 如果 PVP浓度 过 大 , 在 一定 程度 上 会 影响 细胞核 与 荧光 染料 的 结合 , 进而 染色 染色 [24]。 本 研究 与 زهو 等 [19] 的 实验 方法 相似 , 均以 水稻 为 对照 , 用 DAPI 对 细胞核 进行. ) 和 (4.82 ± 0.54) pg , 比 ZHOU 等 [19] 研究 的 2 个 竹 种 的 组 略大 差异 可能 是 由于 染色 造成 的。 本 研究 染色 时间 对 竹类 植物 基因 组大小 测定 结果 存在 一定 影响 , 且 不同 竹 种 对 染色 时间 要求 并不 完全相同 , 大部分 竹 种 的 细胞核 可以 被 快速 染色 , 如 红 秆 寒竹 、 美丽 箬竹 及 曙 筋 矢 竹 等 1 دقيقة 即可 达到最大 荧光 值 ; 还有 少量 竹 种 染色 较慢 , 如 茶 竿 竹 和 黄皮 刚 竹 等 需 5

٧ دقائق

.遵循遵循 几个 原则 : ① 对照 物种 已 测序 , 且 基因 组 大小 与 待测 物种 组 大小 间 显 著 差异 , 以便 区分 峰 和 样品 峰 ; ② 样品 与 待测 样 具有 一定 的 相似 性 ; .竹 种 在 经过 长时间 、 长距离 运输 后 , 部分 材料 萎蔫 或者 细胞核 结构 改变 已达 实验 要求 不同 对照 对 竹类 植物 大小 测定 结果 是否 存在 , 本 研究 尝试 同时 利用 水稻 和 毛竹لا شيء毛竹基毛竹基 组 大小 与 待测 竹 种 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿 筋 竹 、 茶 竹 及 唐 等 竹 种 的 基因 组 较小 , 因此 测量 过程 中 毛竹 的 峰 和 待测 竹 种 峰 间 存在大 区域 的 重叠 和 干扰。 水稻 与 竹类 植物 同属 禾本科 Poaceae , 其 种子 通过 催芽 2

竹类 植物 主要 分为 草本 竹 种 和 木本 竹 种 2 个 基本 类型。 根据 分布 木本 竹 分为 温带 木本 竹 种 和 木本 竹 2 类型 [11 , 26]。木本 竹 种 染色体 数目 比较 稳定 , 基本上 为 2ن=48(2ن代表 体 细胞 染色体 数 , 即 是 单倍体 的 2 倍) , 热带 木本 竹 种 染色体 数目 表现 比较 复杂 , 主要 有 2ن=64,2ن=70±2,2ن=96,2ن= 104 等 多种 类型 [19، 27-29]。 本 研究所 分析 的 12 个 中 , 孝顺 竹 细竹 为 热带 木本 竹 种 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿 筋لا شيء数目 并不 呈 正 相关 , 孝顺 竹 和 柳叶 细竹 2 个 竹 种 染色体 数目 另外 10 温带 木本 竹 种 , 但 大小 却 明显 小于 温带 木本 种 , 这 与 一些 温带 竹 种和 热带 竹 种 研究 的 情况 类似 [16، 18-19، 25]。 部分 竹 种 测序 结果 表明 : 竹类 是 异 源 植物 植物 , 分为 A 、 B 、 C 和 D 等 4 个不同 的 亚基 因 组 , 长期 进化 过程 中 C 基因 组 竹 种 分别 与 B 和 D 基因 组 竹 种 杂交 形成 染色体 组 类型 分别 BBCC 和 CCDD 的 异 源 四倍体 竹 种 (2ن= 48) , 之后 A 基因 组 竹 种 又 与 基因 组 类型 为 BBCC 的 异 源 四倍体 竹 种 杂交 形成 染色体 类型 为 AABBCC 的 异 源 六倍 体 竹 种 (2ن= 72) [14].温带 竹 种 虽然 染色体 数目 相同 , 但 基因 组 大小 却 存在 较大 差异 , 2ج值为 3.76

5.73 ص 相差 近 1.52 倍。 这些 竹 种 中 , 刚 竹 的 黄皮 刚 和 对应 对应 组 (3.76 ± 1.51) 和 (3.91 ± 0.95) pg , 明显 小于.红 秆 寒竹 3 个 竹 种 组 大小 十分 接近。 因此 , 12 个 不同 的 的 大小 测定 结果 , 赤 箬竹 箬竹 属 及 属 竹 种 在 染色体 组 组成 类型 上相近 , 与 刚 竹 属 竹 种 在 染色体 组 类型 上 存在 较大 差异。

[1] TAVARES M G، CARVALHO C R، SOARES F. تغير حجم الجينوم في ميليبونا الأنواع (Hymenoptera: Apidae) والتجميع الفرعي حسب محتوى الحمض النووي الخاص بهم [J]. اعتذار, 2010, 41(6): 636 − 642.
[2] SKOKANOVÁ K ، PERNÝ M ، ŠPANIEL S ، وآخرون. اختلاف محتوى الحمض النووي النووي بين الأصناف المعمرة للجنس سماوي (Asteraceae) في أوروبا الوسطى والمناطق المجاورة [J]. مصنع Syst Evol, 2012, 298(8): 1463 − 1482.
[3] ZONNEVELD B J M، IREN F V. تحليل التدفق الخلوي لمحتوى الحمض النووي في Hosta يكشف عن الكيميرات ploidy [J]. Euphytica, 2000, 111(2): 105 − 110.
[4] ليبنيروفا الأول ، بورس بي ، هوروفا إل ، وآخرون. تطور حجم الجينوم في كاريكس (Cyperaceae) فيما يتعلق بعدد الكروموسومات وتكوين القاعدة الجينومية [J]. آن بوت, 2013, 111(1): 79 − 94.
[5] باول ي ، دنكل إف جي ، شميدت م ، وآخرون. التمايز المناخي في apomictic متعدد الصيغ الصبغية حوذان اوريكوموس معقدة في أوروبا [J]. BMC Ecol, 2018, 18(1): 16.
[6] وانغ جوانجيان ، زانغ شياو مينغ ، تشيان مين ، وآخرون. تباين عدد الكروموسومات وحجم الجينوم في كولوكاسيا (Araceae) من الصين [J]. J مصنع الدقة, 2017, 130(6): 989 − 997.
[7] 火 艳 ، 招 雪晴 ، 黄 厚 毅 ، 等.观赏 石榴 表 型 遗传 多样性 分析 [J].大学 学报، 2020، 37(5): 939 − 949. هوانغ يان ، زاو شيويه تشينغ ، هوانغ هويي ، وآخرون. التنوع الجيني المظهري لأصناف الزينة من الرمان [J]. J تشجيانغ أ& أمبيرجامعة F, 2020, 37(5): 939 − 949.
[8] BENNETT M D، LEITCH I J. كميات الحمض النووي النووي في كاسيات البذور: التقدم والمشكلات والآفاق [J]. آن بوت, 2005, 95(1): 45 − 90.
[9] 洪森 荣 ، 曾 清华 ، 谭 鑫 ، 等.上饶 早 梨 "六月雪" 和 "黄皮 消" 全 基因 组 重 测序 分析 [J].农林 大学 学报، 2019، 36(2): 227 − 235. HONG Senrong، ZENG Qinghua، TAN Xin، وآخرون. تحليل كامل لإعادة تسلسل الجينوم لصنفين ("Liuyuexue" و "Huangpixiao") من بيريوس بيريفوليا في Shangrao [J]. J تشجيانغ أ& أمبيرجامعة F, 2019, 36(2): 227 − 235.
[10] PENG Zhenhua ، LU Ying ، LI Lubin ، وآخرون. مشروع الجينوم لأنواع الغابات غير الخشبية سريعة النمو موسو بامبو (Phyllostachys heterocycla) [J]. نات جينيه, 2013, 45(4): 456 − 461.
[11] مجموعة Bamboo Phylogeny. تصنيف قبلي وشبه قبلي محدث للبامبو (Bambusoideae: Poaceae) [J]. عبادة الخيزران, 2012, 25(1): 3 − 27.
[12] INOUE A، TOCHIHARA S، SATO M، وآخرون. التوزيع الشامل للعقدة في ثلاثة أنواع من الخيزران (فيلوستاشيس spp.) [J]. الأشجار, 2017, 31: 1271 − 1278.
[13] LI Dezhu ، XIA Nianhe ، STAPLETON C ، وآخرون. فلورا الصين, “بامبوسيا"[م]. بكين: مطبعة العلوم ، 2006: 7 & # 8722180.
[14] GUO Zhenhua ، MA Pengfei ، YANG Guoqian ، وآخرون. تقدم تسلسلات الجينوم نظرة ثاقبة على الأصل الشبكي والسمات الفريدة للخيزران الخشبي [J]. مصنع مول, 2019, 12(10): 1353 − 1365.
[15] ZHAO Hansheng ، GAO Zhimin ، WANG Le ، وآخرون. الجينوم المرجعي على مستوى الكروموسوم وأطلس التضفير البديل لخيزران موسو (Phyllostachys edulis) [J]. جيجاسينس, 2018, 7(10). دوى: 10.1093 / gigascience / giy115.
[16] جيليس J ، VALENTE P ، BRIDTS C ، وآخرون. تقدير محتوى الحمض النووي للبامبو باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجهري المسح بالليزر متحد البؤر[م]. سان دييغو: Academic Press ، 1997: 215 & # 8722223.
[17] GUI Yijie و WANG Sheng و QUAN Liyan ، وآخرون. حجم الجينوم وتكوين تسلسل خيزران موسو: دراسة مقارنة [J]. Sci China Life Sci. علوم الحياة في الصين, 2007, 50(5): 1 − 6.
[18] KUMAR P P ، TURNER I M ، RAO A N ، وآخرون. تقدير محتوى الحمض النووي لأنواع مختلفة من الخيزران والقش [J]. مندوب التكنولوجيا الحيوية النباتية, 2011, 5(4): 317 − 322.
[19] ZHOU Mingbing ، XU Chuangmei ، SHEN Lifen ، وآخرون. تطور أحجام الجينوم في Bambusoideae الصينية (Poaceae) فيما يتعلق بالنمط النووي [J]. الأشجار, 2017, 31: 41 − 48.
[20] يو جون ، هو سونغنيان ، وانغ جون ، وآخرون. مسودة تسلسل جينوم الأرز (أرز أسيوي L. ssp. إنديكا) [J]. علم, 2002, 296(5565): 79 − 92.
[21] LOUREIRO J ، CAPELO A ، BRITO G ، وآخرون. التكاثر الدقيق العرعر الفينيقي من إإكسبلنتس النبات البالغ وتحليل ثبات البلوي باستخدام قياس التدفق الخلوي [J]. مصنع بيول, 2007, 51: 7 − 14.
[22] DOLEŽEL J، GREILHUBER J، SUDA J. تقدير محتوى الحمض النووي النووي في النباتات باستخدام قياس التدفق الخلوي [J]. نات بروتوك, 2007, 2(9): 2233 − 2244.
[23] شودري آر آر ، باساك إس ، راميش إيه إم ، وآخرون. محتوى الحمض النووي النووي بونجاميا بيناتا L. واستقرار حجم الجينوم للنباتات المجددة في المختبر [J]. البروتوبلازما, 2014, 251(3): 703 − 709.
[24] 陈 丙 义 ، 黄金凤 ، 高 志红 ، 等. 6 种 野生 草莓 的 核 型 分析 [J].西北 植物 学报، 2012، 32(8): 1567 − 1572. تشين بينجي ، هوانغ جينفنغ ، غاو زيهونغ ، وآخرون. تحليل النمط النووي لستة أنواع من الفراولة البرية [J]. اكتا بوت بوريالي الغرب الخطيئة, 2012, 32(8): 1567 − 1572.
[25] 贾芳信 ، 周明兵 ، 陈荣 ، 等. 4 种 竹子 的 核 型 及其 基因 组 大小 [J].林业 科学، 2016، 52(9): 57 − 66. JIA Fangxin و ZHOU Mingbing و CHEN Rong ، وآخرون. النمط النووي وحجم الجينوم في أربعة أنواع من الخيزران [J]. الخيال سيلف الخطيئة, 2016, 52(9): 57 − 66.
[26] YANG Hanqi ، YANG Junbo ، PENG Zhenhua ، وآخرون. تحليل التطور الجزيئي والتطوري للفاكهة للمجموعات الرئيسية من الخيزران الخشبي القديم المداري (Gramineae: Bambusoideae) استنادًا إلى ITS النووية وجين GBSSI وتسلسل DNA trnL-F البلاستيد [J]. مول علم تطور الوراثة, 2008, 48(3): 809 − 824.
[27] 陈瑞阳 ، 李秀兰 ، 宋文芹 ، 等.中国 主要 经济 植物 基因 组 染色体 图谱 Ⅳ [M].北京: 科学 出版社، 2002، 625 & # 8722628.
[28] 李秀兰 ، 林汝顺 ، 冯学琳 ، 等.中国 部分 丛生 竹类 染色体 数目 报道 [J].植物 分类 学报 ، 2001 ، 39(5): 433 − 442. لي شيولان ، لين روشون ، فنغ شيولين ، وآخرون. أعداد الكروموسومات لبعض حيوانات الخيزران الأصلية في الصين أو التي تم تقديمها إليها [J]. Acta Phytotaxon Sin, 2001, 39(5): 433 − 442.
[29] 李秀兰 ، 刘松 ، 宋文芹 ، 等. 40 散 生 竹 的 染色体 [J].植物 分类 学报 ، 1999 ، 37(6): 541 − 544. LI Xiulan، LIU Song، SONG Wenqin، وآخرون. عدد الكروموسومات أربعين نوعا من البامبو المتناثرة [J]. Acta Phytotaxon Sin, 1999, 37(6): 541 − 544.
اتبع حصة

مناقشة

يكشف تحليلنا أن FCM يوفر بيانات دقيقة عن التركيب الأساسي ، والتي ترتبط بنتائج الأساليب البيوكيميائية المستقلة. على الرغم من أننا لم نتمكن من التأكد مما إذا كانت الاختلافات التي لوحظت بين تقديرات FCM و TMA ناتجة عن التحيز المنهجي لأي من FCM أو TMA ، فإن الاختلاف الملحوظ في ج. 2 ٪ في محتوى GC المقدّر يوفر تقديرًا عمليًا لحدود الدقة لبيانات FCM التي تم الحصول عليها من قياسات الأنواع البعيدة نسبيًا مع بنية جينوم غير معروفة سابقًا. والجدير بالذكر أن هذا التوقع استند إلى نتائج تجربة مصممة بعناية تم فيها استخدام معيار فردي لجميع القياسات ، وتم إجراء القياسات باستخدام نفس الأدوات وفي غضون أيام قليلة متتالية. مع إدخال تعديلات على هذا التصميم وإدخال مصادر أخرى للتحيز المحتمل ، قد يزداد الانحراف أحيانًا. تجربتنا الحالية مع قياسات محتوى GC في العديد من الأصناف ، بما في ذلك المدخلات المتنوعة لمختلف الأصناف اوريزا الأنواع (Šmarda وآخرون.2008 P. Šmarda وآخرون.، غير منشورة) ، تشير إلى أن هذا التحيز سيكون إلى حد كبير من الأصل المنهجي ، في حين أن العوامل البيولوجية ، مثل الوجود المحتمل للاختلاف داخل النوع ، سيكون لها تأثير ضئيل للغاية على دقة وتكرار تقديرات محتوى GC للأنواع.

كشفت تجاربنا أن طول ربط DAPI الأنسب لقياسات FCM لمحتوى GC ليكون أقل بقليل من 4 ، والذي يقع ضمن حدود أطوال ربط DAPI (بين 3 و 4) المتوقعة عمومًا في دراسات oligonucleotide التجريبية (انظر المقدمة). على الرغم من عدم اليقين العام فيما يتعلق بالقيمة الدقيقة لطول الربط لـ DAPI الخاص بـ AT المستخدم ، فإن تغيير هذه المعلمة كان له تأثير محدود عبر نطاقات محتوى GC للنبات المدروسة وعلى التطابق العام بين التقديرات التي تم الحصول عليها باستخدام FCM والطرق البديلة الأخرى. ومن ثم ، فإن طول ربط DAPI البالغ 4 الذي أوصى به Barow & Meister (2002) قد لا يزال يستخدم كتقريب عالمي وقوي بما فيه الكفاية ، مما يتيح تحليل FCM موثوق به لمحتوى GC عبر مجموعة متنوعة من الأنواع النباتية. ومع ذلك ، لا يزال يتعين توخي بعض العناية عند مقارنة الأصناف ذات الصلة البعيدة بتركيبات جينوم مختلفة للغاية ومحتويات GC ، والتي قد تكون أهمية استخدام طول الربط الصحيح لها كبيرة. قد تكون هذه الاختلافات متوقعة ، على سبيل المثال ، عند مقارنة جينومات النبات مع الجينومات المنظمة إيزوكور للفقاريات ذوات الدم الحار (على سبيل المثال ، الإنسان والفأر والدجاج Eyre-Walker & Hurst، 2001 Constantini وآخرون.، 2009) ، والتي لا يمكن التوصية بها حاليًا كمعايير مرجعية آمنة لحساب محتوى GC في المصنع باستخدام FCM. هذه نقطة حرجة ، لأن المعايير المستخدمة حاليًا في FCM لحساب التكوين الأساسي تستند إلى المقارنة مع تسلسل الإنسان أو الدجاج (Doležel وآخرون.، 1992 Marie & Brown ، 1993 Barow & Meister ، 2002 Doležel & Greilhuber ، 2010) ، وتأثير الزخرفة الأساسية المختلفة على تقديرات محتوى GC الناتجة للمعايير المرجعية النباتية غير معروف. نظرًا لأن تأثير محتوى GC للمعيار يبدو أكثر أهمية من معرفة طول الربط للتقدير الصحيح لمحتوى GC في النباتات ، فإننا نفضل أن تستند حسابات محتوى GC في المصنع مع FCM إلى يا ساتيفا"Nipponbare" (GC = 43.6٪) كمعيار مرجعي أساسي. أربع مجموعات مختلفة (Vij وآخرون.، 2006) بشكل مستقل يا ساتيفا"نيبونبار" و ج. 95٪ من تسلسلها الجينومي معروف ، بما في ذلك عدد المناطق المركزية شديدة التكرار (مشروع تسلسل جينوم الأرز الدولي ، 2005) ، والتي غالبًا ما تكون غائبة في المشاريع الجينية "الكاملة" المنفذة في نباتات أخرى (على سبيل المثال في أرابيدوبسيس بينيت وآخرون.، 2003 مايستر ، 2005).

على عكس التباين الكبير في قياسات FCM التي تم الحصول عليها من خلال مقارنة الأنواع البعيدة نسبيًا مع منظمات الجينوم المتناقضة ، فإن التجربة مع اوريزا وبعض تحليلاتنا السابقة مع أنواع العشب ذات الصلة (Šmarda وآخرون.، 2008) بوضوح أن FCM هي طريقة حساسة تمكن من اكتشاف الاختلافات الصغيرة في محتوى GC بين الأصناف ذات الصلة الوثيقة بهياكل الجينوم المماثلة وربما الزخرفة الأساسية المماثلة. في المقارنات بين الأنواع وثيقة الصلة ، مع الاستخدام المتسق لمعيار واحد ، قد يكون دقة FCM في حدود أعشار GC٪. لا تتطلب التجارب التي تتم فيها مقارنة سلسلة من العينات بمعيار واحد أي معرفة بمحتوى GC للمعيار ، ويمكن ببساطة حساب التقديرات باستخدام عامل الصبغة فقط ، مما يتيح استخدام أي نوع كمعيار (Barow & مايستر ، 2002 مايستر وبارو ، 2007). وبالتالي ، يبدو أن حساب قيمة GC المطلقة يمثل مشكلة فنية لا ينبغي أن تمنع الباحث من استخلاص استنتاجات حول معنى اختلاف التركيب الأساسي الملحوظ ، حتى لو ظل محتوى GC الدقيق للمعيار غير معروف.

للبحوث المتعلقة بتكوين القاعدة تقليد طويل في البحوث الميكروبيولوجية ، حيث تمثل التركيبة الأساسية معيار تصنيف مهمًا (Stackebrandt & Liesack ، 1993 Stackebrandt وآخرون.، 2002) ، ومثل حجم الجينوم ، فهو مؤشر مهم لبيئة الأنواع (Rocha & Danchin ، 2002 Musto وآخرون.، 2006 Mann & Phoebe-Chen ، 2010). إن الأبحاث المماثلة حول حجم وديناميكيات تطور الجينوم فيما يتعلق بالتركيب الأساسي (جودة الحمض النووي) وأهميته بالنسبة للبيئة وتوزيع الأنواع غير متوفرة على نطاق واسع في النباتات بسبب عدم وجود بيانات كافية لتكوين قاعدة الحمض النووي. لذلك ، يوفر FCM أداة مفيدة للإكمال المستقبلي لبيانات التكوين الأساسي في النباتات وتوضيح الديناميات التطورية للتكوين الأساسي وأهميته البيولوجية.

تمثل بيانات FCM الحالية الخاصة بنا على محتوى GC أدنى وأعلى محتويات GC التي لوحظت في النباتات الوعائية (الجدول 1) وتشير إلى أن نطاق محتوى GC في monocots هو 14 ٪ على الأقل. ينتج هذا النطاق الواسع جزئيًا عن محتوى GC المرتفع للغاية الموجود للأعشاب ، بما يتوافق مع جميع دراسات FCM السابقة (Barow & Meister ، 2002 Meister & Barow ، 2007) وبيانات التسلسل (راجع Šmarda & Bureš ، 2012). يتوافق المحتوى العالي للغاية من GC في Poaceae مع النمط غير المعتاد لتكوين GC لجينات العشب (Kuhl وآخرون.، 2004 قوه وآخرون.، 2007) ، وقد يساعد توضيح قوى الاختيار التي تتوسط في وظيفة هذه الجينات على تحسين معرفتنا بشكل كبير بوظيفة محتوى GC (Šmarda & Bureš ، 2012). تشير الأدلة الحديثة إلى أن هذه الزيادات العالمية في محتوى GC قد تتزامن مع الاختلاف داخل الجين في تنظيم الجينات وفي التحسين العام للاستجابة للضغط (تاتارينوفا وآخرون.، 2010) ، والتي قد تكون مسؤولة جزئيًا عن النجاح التطوري الشديد للأعشاب في العصور الجيولوجية الحديثة (Šmarda & Bureš ، 2012). اقترحت الدراسات في جينومات البكتيريا والفقاريات عدة فرضيات حول القوى الدافعة لتكوين قاعدة الحمض النووي والتأثير الذي قد يحدثه تغيير محتوى GC على بيئة الأنواع (تمت مراجعته في Šmarda & Bureš ، 2012). واحدة من أكثر الفرضيات التي نوقشت على نطاق واسع هي فرضية الثبات الحراري ، والتي تشير إلى زيادة تحمل الكائنات الغنية بالـ GC لدرجات حرارة أعلى بسبب الاستقرار الحراري العالي للحمض النووي الغني بـ GC مقابل AT (Galtier وآخرون.، 1999 فينوغرادوف ، 2003 موستو وآخرون.، 2006 برناردي ، 2007 بوتشياريلي وآخرون.، 2009). استنادًا إلى حقيقة أن توليف أزواج قاعدة GC يتطلب طاقة أكبر (Rocha & Danchin ، 2002) ، فقد تتكون الكائنات الحية سريعة النمو ، على سبيل المثال ، بشكل تفضيلي من نيوكليوتيدات AT ، والتي لها تكلفة أقل ويسهل تركيبها ، ومن المتوقع حدوث انخفاض في محتوى GC الجينومي (مقارنة بالأقارب المقربين) في الأنواع الطفيلية وسريعة النمو ، والأنواع ذات الجينومات الكبيرة جدًا أو الأنواع التي تعيش في بيئات محدودة الموارد (على سبيل المثال ، محدودة من حيث العناصر الغذائية أو الضوء أو المنافسين Šmarda & Bureš ، 2012). سيكون من المفيد اختبار هذه الفرضيات في النباتات في المستقبل القريب.

يمكن الوصول بسهولة إلى قياس محتوى GC للمختبرات التي تجري قياسات FCM لمحتوى الحمض النووي ولديها على الأقل مصدرين مستقلين لضوء الإثارة (متضمن داخل نفس أو يقع على مقاييس تدفق مختلفة). يتطلب قياس FCM لمحتوى GC تعديلات طفيفة فقط على الإجراءات القياسية لقياسات محتوى الحمض النووي وله نفس المتطلبات لجودة وكمية الأنسجة (راجع Doležel وآخرون.، 2007 Greilhuber وآخرون.، 2007). الاختلافات الوحيدة هي في استخدام صبغة أخرى خاصة بالقاعدة (Barow & Meister ، 2002) وقياس العينة في مقياس التدفق الخلوي المنفصل بالتوازي مع الإجراء القياسي لقياس محتوى الحمض النووي. يتكون تعديلنا لهذا الإجراء لأغراض قياسات محتوى GC فقط من تقطيع العينة والمعيار لكل من الأصباغ معًا في طبق بتري واحد والحسابات الزوجية للنتائج المقابلة (بدلاً من مقارنة متوسطات قياسات DAPI و PI على مدى عدة أيام) ، مما يساعد على الحد من الآثار المحتملة للأيضات الثانوية والتباين اليومي في الأدوات / المشغلين. في ضوء بساطة التعديلات المستخدمة ، والتخفيضات التي تحققت في الوقت المطلوب لإجراء القياسات والتكاليف المرتبطة بها ، نأمل أن يجد قياس محتوى GC في النباتات بواسطة FCM تطبيقًا أوسع في المستقبل القريب .


تحليل أحجام جينوم النبات باستخدام قياس التدفق الخلوي: دراسة حالة توضح النطاق الديناميكي والقياس الخطي

تم تصميم أجهزة قياس التدفق الخلوي في الأصل للعمل مع معلقات الخلايا ، وخلايا الدم النموذجية ، ولا تزال معظم التطبيقات تتضمن عينات من هذا النوع. على الرغم من حقيقة أن الخلايا النباتية وبروتوبلاستس أكبر بشكل عام من خلايا الدم في الثدييات ، لا يزال من الممكن تحليل هذه الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. في معظم مراحل النمو ، تتكون النباتات العليا من أنسجة وأعضاء ، وتجمعات معقدة ثلاثية الأبعاد من الخلايا مرتبطة ببعضها البعض بواسطة جدران خلوية. وبالتالي ، قبل التحليل ، يجب أولاً معالجة النباتات لإنتاج معلقات خلوية متوافقة مع قياس التدفق الخلوي. تتمثل إحدى الطرق في إذابة جدران الخلايا ، باستخدام الإنزيمات التي تقوم بتحلل مكونات الكربوهيدرات الخاصة بها ، لتحرير الخلايا الأولية ، والتي يمكن بعد ذلك تحليلها بسهولة على جهاز قياس الخلايا.

النهج الثاني ، المفصل هنا مع CytoFLEX ، يتضمن تحليل ليس للبروتوبلاست ، ولكن تعليق النوى المنبعثة من أنسجة وأعضاء النبات عبر إجراء تقطيع بسيط (2). يتضمن الإجراء قطع الخلايا داخل الأنسجة باستخدام شفرة حلاقة قياسية ذات حدين. يتم تنقية المتجانسة باستخدام مرشح شبكي من النايلون يتم من خلاله تمرير النوى المحررة. يتم تلطيخ النوى بعد ذلك بفلوروكرومات خاصة بالحمض النووي ، مما يسمح بتحديد التدفق الخلوي لمحتوى الحمض النووي للنواة الفردية. ينبع الاهتمام بقياس أحجام جينوم النبات من الملاحظة التي تشير إلى أن النباتات الأعلى ، عند تحليلها عبر الأنواع ، تعرض نطاقًا كبيرًا بشكل غير عادي من أحجام الجينوم: الحد الأدنى الحالي لحوالي 0.13 بيكوغرام لكل 2 درجة مئوية لنواة Genlisea margaretae إلى حد أعلى من 304.40 بيكوغرام. لباريس جابونيكا (3). الجينوم الأخير أكبر بحوالي 50 مرة من الجينوم البشري ، والحمض النووي من خلية واحدة من باريس جابونيكا ، عندما يتمدد ، سيمتد حوالي 91 مترًا.

يوفر قياس التدفق الخلوي إلى جانب إجراء التقطيع وسيلة بسيطة لتحديد أحجام الجينوم التي يمكن تطبيقها بشكل عام عبر الأنواع ، وقد تم اعتماد المنهجية على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم لمعالجة العديد من المشكلات في علم الأحياء الأساسي والتطبيقي ، والبيئة ، والزراعة. وهذا يشمل التطبيقات في مجال التكنولوجيا الحيوية ، مثل مراقبة الاستقرار الجيني بعد التحول وثقافة الأنسجة ، وإعطاء الأولوية للأنواع لتسلسل الجينوم الكامل ، والتحقق من اكتمال تجميعات الجينوم الكاملة ، وتوفير التخطيط المناسب لإجراءات الهندسة الوراثية مثل إنتاج مكتبة الحمض النووي. تشمل التطبيقات في الزراعة التي تستفيد من قياس التدفق الخلوي إنتاج خطوط أحادية الصيغة الصبغية وثنائية الصيغة الصبغية باستخدام مزرعة المبيض / المبيض ، متبوعة بمضاعفة الكولشيسين ، وإنتاج خطوط ثلاثية الصبغيات معقم للبذور ، وإنتاج نباتات تحتوي على مستويات رباعي الصبغيات ومستويات تعدد الصبغيات أعلى ، المرتبطة بالسمات المرغوبة مثل حجم الثمار ، ومراقبة جودة حالة euploidy لحصص البذور التجارية ، وتحديد الأفراد الذين لديهم مستويات تكوينية جديدة وعرض أنماط جديدة للتكاثر (بما في ذلك apomixis) ، وتوصيف التهجين بين الأنواع على أساس محتويات الحمض النووي الوسيط ، وتصنيف توزيعات ploidy داخل مجموعات البلازما الجرثومية ، تحديد الجنس في النباتات ثنائية المسكن ، وتحديد الأنواع الهجينة المتكونة بين الأنواع البرية ، وبين الأنواع البرية والمزروعة.

تشمل التطبيقات في تشريح النبات ، وبيولوجيا الخلية ، وعلم وظائف الأعضاء ، والتنمية التي تستفيد من قياس التدفق الخلوي ، دراسة تنظيم دورة انقسام الخلية والتكرار الداخلي في نمو النبات ، وتأثيرات الإجهاد اللاأحيائي والحيوي على هذه العمليات. أدى قياس التدفق الخلوي أيضًا إلى إجراء تحقيقات واسعة النطاق في مفهوم النمط النووي ، أي التأثير الظاهري لمقدار الحمض النووي النووي ، بغض النظر عن محتواه المعلوماتي المشفر ، على الحجم النووي ، ونسب النواة التي تشغلها الكروموسومات ، ومدد الانقسام والانقسام الاختزالي ، وحجم البذور ، والحد الأدنى من وقت التوليد. يعد قياس التدفق الخلوي مفيدًا أيضًا للكشف عن مزيج الصبغيات والخيمرية. يُعرف تحليل التعبير الجيني كدالة لنوع الخلية ، باستخدام نوى مرتبة التدفق ، بشكل متزايد على أنه مجال مهم للبحث. في التصنيف والنظاميات ، يعتبر قياس التدفق الخلوي لا يقدر بثمن في فحص أنماط التكاثر ، وتحديد الانتواع والعزلة الإنجابية ، ووصف ديناميات السكان في المناطق الهجينة ، واكتشاف أنماط خلوية جديدة وبنية النمط الخلوي على مجموعات كبيرة الحجم ، واكتشاف وتحديد النبات. الأنواع من أجل التنوع البيولوجي والحفظ ، ودراسات آليات تطور الجينوم النباتي مع التركيز على أسباب ونتائج تباين محتوى الحمض النووي النووي ، ومعلومات عن التطور تأتي من دراسة محتويات الحمض النووي عبر السلالات. يمكن أيضًا استخدام التحليلات المقارنة واسعة النطاق لحجم الجينوم لدراسة الارتباطات بين حجم الجينوم والعوامل البيئية ، بين حجم الجينوم وكتلة البذور ، بين حجم الجينوم وثراء الأنواع عبر مجموعات نباتية مختلفة ، مع اقتراح أن الأنواع التي تحتوي على جينومات كبيرة قد تكون كذلك. أكثر عرضة للانقراض ، بين حجم الجينوم والإمكانات الغازية ، وبين مكانة بيئية وحجم الجينوم الأدنى (خاصة النباتات آكلة اللحوم).

نتيجة للزيادة السريعة في مستوى الاهتمام بتحليلات قياس التدفق الخلوي من هذا النوع ، والأعداد الكبيرة المتزايدة للأنواع التي يتم نشر البيانات الخاصة بها ، ظهرت مستودعات قابلة للبحث كمورد قيم لتخصيص محتويات الحمض النووي لأحجام الجينوم ، من خلال توفير علاقات المعايرة ، مع الاقتراب من الإجماع بطريقة من مصادر جماعية. واحدة من أهم هذه الموارد هي قاعدة بيانات Kew C-value ، التي يرعاها خبراء ، وتوفر قيم محتوى الحمض النووي النووي كدالة للجنس والأنواع ، في شكل يمكن البحث فيه عبر الإنترنت (3). يحدد القيمون أيضًا قيم محتوى الحمض النووي النووي ذات المعيار الذهبي & ldquo ، والتي يُعتقد أنها أكثر دقة وقابلية للتكرار (3). بشكل عام ، تقديرات التدفق الخلوي لمحتويات الحمض النووي النووي قابلة للمقارنة مع أحجام التجميعات من تسلسل الجينوم الكامل ، على الرغم من أن وجود الحمض النووي الصبغي عالي التكرار يؤدي عادةً إلى تقديرات أقل لحجم الجينوم تم الحصول عليها من النهج القائمة على التسلسل. تم تحديد العديد من العوامل التي لديها القدرة على الخلط بين معايرة التدفق الخلوي ويمكن تجنبها. على سبيل المثال ، فإن الفلورة الملزمة والنتيجة لبعض الفلوركرومات الخاصة بالحمض النووي محددة بزوج أساسي ، وبالتالي فهي ليست مقياسًا حقيقيًا لكمية الحمض النووي عبر الأنواع التي تحتوي على جينومات نووية بنسب AT: GC مختلفة.

في هذا البروتوكول ، نستخدم بروبيديوم يوديد (PI) باعتباره فلوروكروم الحمض النووي. في وجود ريبونوكلياز للقضاء على الإسهامات في التألق بواسطة الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة ، يقوم PI بإقحام الحلزون المزدوج للحمض النووي ، مما ينتج عنه مضان مكثف له أقصى إثارة عند حوالي 535 نانومتر وحد أقصى للانبعاث عند 617 نانومتر. ملف تعريف البث واسع نسبيًا بعرض طيفي أقصى يبلغ 50٪ يمتد حوالي 100 نانومتر (590-690 نانومتر).

تم استخدام PI لتقييم محتوى الحمض النووي لأربعة أنواع: Arabidopsis thaliana (thale cress) Solanum lycopersicum (الطماطم) ، Zea mays (الذرة) والفليفلة السنوية (الفلفل). توضح الأعضاء المستخدمة في تحضير عينات نبات الأرابيدوبسيس والفليفلة الظاهرة المثيرة للاهتمام المتمثلة في التكرار الداخلي ، حيث تدخل الخلايا الجسدية في جولات متتالية من تكرار الجينوم (المرحلة S) دون الانقسام الفتيلي (4). ينتج عن هذه العملية الحلقية تعدد الصبغيات ، وهو أمر شائع في النباتات (7).

شكل. يقيس التدفق الخلوي بشكل فعال التكاثر في الخلايا النباتية. تصور الصورة الصحيحة أنواعًا مختلفة من تكرار الجينات الانقسامية أثناء دورة الخلية. هذه الأحداث تؤدي إلى أنسجة متعددة الصبغيات. على اليسار يتم تصوير سير العمل لإعداد الأنسجة النباتية عن طريق قياس التدفق الخلوي بما في ذلك البيانات التي تشير إلى نتائج التدوير الداخلي الانقسامي.


شاهد الفيديو: Quantifying Illumina Next-Gen Sequencing Libraries using digital PCR on the QuantStudio 3D (قد 2022).


تعليقات:

  1. Dorran

    بشكل ملحوظ ، هذه الرسالة الثمينة

  2. Rodric

    إنه لأمر مؤسف أنني لا أستطيع التحدث الآن - لقد تأخرت عن الاجتماع. لكنني سأكون حرة - سأكتب بالتأكيد ما أعتقد.



اكتب رسالة