معلومة

استقلاب البيليروبين وتثبيط UGT1A1 في الإنسان مقابل القرد؟

استقلاب البيليروبين وتثبيط UGT1A1 في الإنسان مقابل القرد؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في الإنسان ، يبدو أن UGT1A1 هو الإنزيم الوحيد ذي الصلة بجلوكورونيدات البيليروبين غير المقترن إلى أشكال مطروحة. هل المسار هو نفسه على سبيل المثال قرد Cynomolgus (Macaca fascicularis) في الجسم الحي؟ في حالة تثبيط UGT1A1 بشكل فعال ، هل هناك أي إنزيم محتمل آخر لاستقلاب / غلوكورونيدات البيليروبين غير المقترن في القرد؟ علاوة على ذلك ، يعتبر البيليروبين تحديًا تحليليًا في دراسات تثبيط UGT1A1 في المختبر. تم استخدام Estradiol (3-glucuronidation) كركيزة محددة لـ UGT1A1 البشري. هل تعرف أي ركائز معروفة بأنها خاصة بالقرد UGT1A1؟ أي إشارة ستكون محل تقدير كبير.


UGT1A1 شائع بين معظم الثدييات التي تنتج البيليروبين (الفئران أيضًا). لم أر أي دليل يشير إلى مسار بديل في الثدييات لاستقلاب البيليروبين. انظر إلى مرضى متلازمة جيلبرت (لديهم SNP وهو طفرة تجعل UGT1A1 أقل كفاءة وبالتالي ارتفاع البيليروبين غير المقترن بالبلازما).

أيضًا ، يكون تحليل البيليروبين من البلازما / الأنسجة للأمام بشكل مستقيم إلى حد ما باستخدام اختبارات HPLC أو LCMS. ومع ذلك ، لا يزال تثبيط UGT1A1 في المختبر يمثل تحديًا. أعتقد أن الحيلة ستكون استخدام تقنية كريسبر للتغلب عليها.


استقلاب البيليروبين

يمكن تلخيص التمثيل الغذائي الطبيعي للبيليروبين كسلسلة من الخطوات ، بما في ذلك (1) الإنتاج ، (2) امتصاص خلايا الكبد ، (3) الاقتران ، (4) إفرازه في القنوات الصفراوية ، و (5) توصيله إلى الأمعاء. يمكن أن ينتج اليرقان عن عيوب في أي من خطوات استقلاب البيليروبين هذه.

في البالغين ، يتم إنتاج 250 إلى 350 مجم من البيليروبين يوميًا. ما يقرب من 80٪ إلى 85٪ من هذا البيليروبين مشتق من تدمير خلايا الدم الحمراء الشائخة بواسطة الجهاز الشبكي البطاني. تأتي نسبة 15٪ إلى 20٪ المتبقية من انهيار البروتينات غير الهيموغلوبينية ، مثل الميوغلوبين والسيتوكرومات. يوضح الشكل 7 أ -1 استقلاب البيليروبين. في الخلايا الشبكية البطانية ، يشق إنزيم الهيم أوكسيجيناز الميكروسومي الهيم في بيليفيردين. يتم تقليل البيليفيردين إلى البيليروبين بواسطة إنزيم اختزال العصارة الخلوية biliverdin قبل إطلاقه في الدورة الدموية. في هذا الشكل غير المقترن ، يكون البيليروبين غير قابل للذوبان في الماء وينتقل إلى الكبد بإحكام مرتبطًا بالألبومين.

يزيل الكبد البيليروبين غير المقترن والأنيونات العضوية الأخرى المرتبطة بالألبومين من البلازما. عندما يدخل مركب البيليروبين - الألبومين في الدورة الدموية الجيبية للكبد ، يتم التعرف على ثلاث مراحل أيضية متميزة: (1) امتصاص خلايا الكبد ، (2) الاقتران ، (3) إفرازه في الصفراء. يتم نقل البيليروبين غير المقترن عبر الغشاء الجيبي للخلايا الكبدية إلى السيتوبلازم. داخل خلايا الكبد ، يرتبط البيليروبين غير المقترن بالبروتين السيتوبلازمي ، وهو الجلوتاثيون في هذه الحالة س-ناقل. يقوم إنزيم يوريدين ثنائي فوسفات-غلوكورونيل ترانسفيراز الميكروسومي بربط البيليروبين غير المترافق غير القابل للذوبان مع حمض الجلوكورونيك لتشكيل الأشكال المترافقة القابلة للذوبان في الماء ، البيليروبين أحادي الكلوكورونيد (15٪) والبيليروبين ديجلوكورونيد (85٪). يُفرز البيليروبين المقترن من خلية الكبد إلى القناة الصفراوية بواسطة آلية نقل نشطة.

الإفراز في الصفراء هو خطوة تحديد المعدل في استقلاب البيليروبين. بعد الإفراز ، تتدفق الصفراء عبر نظام تجميع الأقنية الصفراوية ، وقد يتم تخزينها أو لا يتم تخزينها في المرارة ، وتدخل في الاثني عشر. في الدقاق والقولون ، يتم تحويل البيليروبين بواسطة إنزيمات بكتيرية إلى urobilinogen. يتم امتصاص 10٪ إلى 20٪ من urobilinogen من الأمعاء إلى الدورة الدموية البابية ، مما يؤدي إلى دوران معوي كبدي. يمكن إعادة إفراز اليوروبيلينوجين المعاد تدويره في الصفراء عن طريق الكبد أو في البول عن طريق الكلى. يتم تحويل urobilinogen المتبقي في الأمعاء إلى fecobilinogen ، والذي يعطي البراز لونه البني المميز.


مقدمة

لقد وصلت السمنة إلى معدلات وبائية على مستوى العالم ويموت ما لا يقل عن 2.8 مليون شخص كل عام نتيجة زيادة الوزن أو السمنة (منظمة الصحة العالمية). تمثل السمنة أيضًا أهم عامل خطر لمقاومة الأنسولين وأمراض القلب والأوعية الدموية ومرض السكري من النوع 2 (T2D) 1. عادة ما يعاني مرضى T2D من ارتفاع السكر في الدم ويعانون من مضاعفات مثل ارتفاع ضغط الدم والسكتة الدماغية وتصلب الشرايين والسرطان 2. تعد الاستراتيجيات التي تقلل من السمنة بتقليل الوفيات وتحسين نوعية حياة الأفراد المصابين.

تلعب الأنسجة الدهنية دورًا مهمًا في استتباب الجلوكوز واستقلاب الدهون 3،4 عن طريق إنتاج البروتينات المختلفة المعروفة باسم الأديبوكينات أو السيتوكينات الدهنية بما في ذلك عامل نخر الورم α (TNF-α) ، والإنترلوكين -6 ، والبروتين أحادي الخلية 1 ، واللبتين والأديبونكتين 5 ، 6،7. تعمل Adipokines كمفاتيح استقلابية ، تربط الحالة الغذائية للجسم بوظائف أخرى تستهلك الطاقة 8. عدم انتظام الأديبوكينات يؤدي إلى أمراض مرتبطة بالسمنة 9. من بين الأديبوكينات المعروفة ، تتوافق مستويات اللبتين بشكل إيجابي مع الطاقة المخزنة في كتلة الدهون وترتبط مستويات اللبتين المرتفعة بزيادة السمنة والالتهاب الناتج عن زيادة إطلاق السيتوكينات ، مثل TNF-α 10. في المقابل ، يعمل الأديبونكتين كعامل محسس للأنسولين ويعزز أكسدة الأحماض الدهنية وعمل الأنسولين في الكبد وامتصاص الجلوكوز 5،11،12. تظهر الفئران التي تعاني من نقص الأديبونكتين ارتفاعًا في مستويات الجلوكوز والأنسولين في البلازما بعد إطعامها نظامًا غذائيًا عالي الدهون ، ولكن الإفراط في إفراز الأديبونكتين في هذه الفئران عن طريق العدوى الفيروسية الغدية يستعيد حساسية الأنسولين 13. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي الأديبونكتين أيضًا على تأثيرات مضادة للالتهابات ومضادة لتصلب الشرايين ناتجة عن قدرته على قمع تنشيط NF-κB بوساطة TNF-α في الخلايا البطانية 14. يتم زيادة مستويات الأديبونكتين المتداولة بعد فقدان الوزن 15 ، عن طريق تحريض أوكسيجيناز الهيم -1 (HO-1) 16 وعن طريق العلاج بروابط PPARγ ، بما في ذلك thiazolidinediones 17،18.

HO-1 هو إنزيم يحد من المعدل والذي يحلل الهيم ويولد كميات مولارية متساوية من البيليفيردين وأول أكسيد الكربون والحديد 19. يمكن تحويل البيليفيردين بسرعة إلى البيليروبين عن طريق اختزال البيليفيردين ويمكن للحديد زيادة تنظيم الفيريتين. لقد ثبت أن HO-1 يلعب أدوارًا مهمة في عكس مقاومة الأنسولين. على سبيل المثال ، يعمل تحريض HO-1 على توعية مسار إشارات الأنسولين في فئران Zucker 20 وفي الفئران التي تعاني من نقص الليبتين (ob / ob) ، وفي الفئران التي تعاني من نقص مستقبلات اللبتين (db / db) وفي الفئران التي يسببها النظام الغذائي للسمنة (DIO) 16،21 ، 22،23،24،25،26،27. يحاكي البيليروبين تأثير تحريض HO-1 ويحسن حساسية الأنسولين في نماذج الفئران البدينة 28. البيليروبين مضاد قوي للأكسدة وله خصائص تنظيمية مضادة للالتهابات 29. على الرغم من استخدام البيليروبين المرتفع بشكل غير طبيعي كمؤشر لالتهاب الكبد وفقر الدم الانحلالي والركود الصفراوي ، فإن البيليروبين المرتفع بشكل معتدل غير المقترن في مرضى متلازمة جيلبرت (1.1 مجم / ديسيلتر إلى 2.7 مجم / ديسيلتر) يرتبط بالوقاية من تصلب الشرايين التاجية وأمراض القلب والأوعية الدموية ، مثل وكذلك أمراض أخرى 30،31،32،33. يشير الارتباط الإيجابي بين البيليروبين غير المقترن والهيم البلازمي الحر والحديد والهيموغلوبين الكربوكسيل في هؤلاء المرضى إلى حلقة ردود فعل إيجابية يتم فيها تحفيز تعبير HO-1 عن طريق البيليروبين غير المقترن 34.

لقد أظهرنا أن الإعطاء الجهازي للبيليروبين يزيد من حساسية الأنسولين عن طريق قمع إجهاد ER والالتهاب في الفئران DIO 35. لقد قمنا الآن بتوسيع هذه الملاحظات وتحققنا فيما إذا كان البيليروبين ينظم استقلاب الدهون كما يظهر في مرضى جيلبرت 34 وما إذا كان البيليروبين ينظم مستويات الأديبوكين في الدم في الفئران DIO. قمنا أيضًا بتقييم الآثار طويلة المدى لعلاج البيليروبين على استقلاب الدهون ومستويات الأديبوكين بعد 7 أسابيع من الانتهاء من علاج البيليروبين.


نتائج

أنسنة UGT1 الفئران وحديثي الولادة فرط بيليروبين الدم.

الأحداث الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء تنظيم UGTs ، وخاصة تلك المشفرة من قبل الإنسان UGT1 عائلة الجينات ، تمت دراستها في الفئران المعدلة وراثيا المتوافقة مع البشر والتي تعبر عن الإنسان UGT1 مكان (TgUGT1 الفئران) في أ Ugt1- لاغ معرفتي (Ugt1 - / - الفئران) (فوجيوارا وآخرون ، 2010). في البشر ، هناك تسعة UGT1A الجينات ، بما في ذلك UGT1A1، التي تم ترميزها بواسطة UGT1 locus (Clarke et al. ، 1997 Mackenzie et al. ، 1997 Gong et al. ، 2001). لفحص أهمية الإنسان UGT1 موضع و UGT1A1 الجين الذي يتحكم في مصل البيليروبين ، طفرة معطلة تمت هندستها في إكسون 4 من الفئران Ugt1a1 الجين ، وتوليد Ugt1 - / - الفئران (نجوين وآخرون ، 2008). يتم ترميز بروتينات UGT1A بواسطة خمسة إكسونات ، مع تسلسل تشفير للإكسونات 2-5 متطابقة. يقع على الكروموسوم 1 ، تنظيم الفأر Ugt1 يتم ترميز الموضع بواسطة & gt150 كيلو دالتون من الحمض النووي ، مع وجود exons 2-5 في الطرف 3′ ومحاطًا على التوالي بمصفوفة من تسعة أكاسيد خارجية تقوم بتشفير الجزء N-terminal من كل بروتين UGT1A. وهكذا UGT1 مكان في البشر و Ugt1 موضع في الفئران بتشفير تسعة وظيفية UGT1A بروتينات ، كل منها يتألف من منطقة N- طرفية فريدة مشفرة بواسطة أحد الإكسونات الخمسة المرافقة بينما تشترك في منطقة C-terminal متطابقة مشفرة بواسطة exons 2-5. عندما متغاير الزيجوت Ugt1 +/− تم تربية الفئران ، ونسلها مع أ Ugt1 - / - وُلد النمط الجيني بلون جلد برتقالي مذهل ناتج عن مستويات مرتفعة للغاية من UCB تطورت إلى SNH مميتة بين 4 و 7 أيام بعد الولادة. لاستعادة الفتك الناتج عن تعبير UGT1A1 من الفئران غير الوظيفية ، TgUGT1 الفئران التي حملت وعبرت عن كامل UGT1 تم عبور locus (Chen et al. ، 2005) مع Ugt1 +/− لتوليد الفئران TgUGT1 / Ugt +/− الفئران. ثم تم تهجير هؤلاء المؤسسين للخلف TgUGT1 / Ugt1 - / - الفئران أو أنسنة UGT1 (hUGT1) الفئران. تعبير عن الإنسان UGT1A1 أنقذ الجين الفتك المنسوب إلى SNH في Ugt1 - / - الفئران (الشكل 2).

أنسنة UGT1 الفئران وحديثي الولادة فرط بيليروبين الدم. Ugt1 - / - تم إنشاء الفئران عن طريق مقاطعة exon 4 الشائع بجين نيومايسين ، مما يضعف وظيفة الجهاز بأكمله Ugt1 المكان. Ugt1 - / - يمكن التعرف على الفئران حديثي الولادة بسهولة من خلال لون بشرتها البرتقالي المميز ، والذي ينتج عن تراكم البيليروبين غير المقترن. فقدان Ugt1 locus و UGT1A1 من خط الجراثيم قاتلة ، مع كل Ugt1 - / - تموت الفئران في غضون أسبوعين بعد الولادة. عندما عبرنا الفئران تحمل الإنسان بأكمله UGT1 موضع الجين باعتباره جينًا متحورًا مع الفئران التي تحمل Ugt1- لاغ أليل ، أنسنة UGT1 الفئران (hUGT1). حضور الإنسان UGT1A1 ينقذ الجين الفتك المرتبط بغياب الفئران UGT1A1. كل حديثي الولادة hUGT1 تصاب الفئران بفرط بيليروبين الدم الوليدي الشديد (SNH). إجمالي مستويات البيليروبين في الدم (TSB) في hUGT1 يزداد عدد المواليد الجدد بعد الولادة ، ويصلون إلى مستويات الذروة في حوالي أسبوعين بعد الولادة مع عودة المستويات إلى المعدل الطبيعي بعد الفطام. غالبية hUGT1 يمكن أن تنضج الفئران حتى سن الرشد. ما يقرب من 10٪ من حديثي الولادة hUGT1 تصاب الفئران بنوبات صرع وتموت. تتراكم هذه الفئران بتركيزات عالية من البيليروبين في أنسجة المخ. ينتج تطوير SNH عن تأخر تعبير الكبد UGT1A1. يرتبط تعبير UGT1A1 في الأمعاء الدقيقة بالحفاظ على فتك hUGT1 الفئران وخفض مستويات TSB.

التنظيم التنموي والأنسجي الخاص بـ UGT1A الجينات في hUGT1 أظهرت الفئران (Chen et al.، 2005 Senekeo-Effenberger et al.، 2007 Fujiwara et al.، 2010 Yueh et al.، 2017) أنها تعكس أنماط تعبير مماثلة كما هو موضح في الأنسجة البشرية (Strassburg et al. ، 1997a ، b، 1998a، b Tukey and Strassburg، 2000) ، مما يتيح لنا الاستفادة من استخدام hUGT1 صُممت الفئران في التجارب لتوصيف الآليات المؤدية إلى التعبير النمائي والمحفز والتطوري للإنسان UGT1A الجينات. كان الاكتشاف المهم اكتشاف أن الإنسان UGT1A1 الجين ، الذي يتأخر في النمو عند الأطفال حديثي الولادة ، يتأخر أيضًا في النمو أو يتم كبته hUGT1 فئران حديثي الولادة (فوجيوارا وآخرون ، 2012). نظرًا لأن UGT1A1 هو الإنزيم الوحيد المسؤول عن استقلاب البيليروبين في الدم ، فإن هذا التأخير في الكبد UGT1A1 يؤدي التعبير الجيني إلى SNH في حديثي الولادة hUGT1 الفئران ، مع نسبة مميتة تؤثر على 10٪ من الأطفال حديثي الولادة ، كما يتضح من ضعف حركي دراماتيكي مع حركات تشبه النوبات. أدمغة hUGT1 تقوم الفئران التي تصاب بنوبات صرع بتركيز البيليروبين في الأنسجة ، وهو ما يتضح من خلال المظهر الأصفر أو اليرقي الشديد (فوجيوارا وآخرون ، 2010). لم يتم تحديد النمط اليرقي إقليميًا كما هو موجود في الكرة الشاحبة والنواة تحت المهاد في أنسجة المخ البشري ، على الرغم من أننا قمنا بتصنيف هذا النمط الظاهري في حديثي الولادة hUGT1 الفئران مثل اليرقان. ذروة تطور مستويات TSB في حديثي الولادة hUGT1 تحدث الفئران في الأيام 10-14 بعد الولادة وتنخفض بشكل حاد خلال الأيام الخمسة التالية. طوال فترة حديثي الولادة ، والتي نصنفها على أنها أول 3 أسابيع بعد الولادة ، يتم قمع تعبير الكبد UGT1A1. تتطابق إزالة TSB في المراحل اللاحقة من فترة الوليد مع الحث التنموي لتعبير UGT1A1 المعوي (Fujiwara et al. ، 2010) (الشكل 2).

خلال هذه المرحلة التنموية ، يكون التنشيط الغذائي أو المدفوع بيئيًا لـ UGT1A1 الجين وتحريض UGT1A1 في hUGT1 تؤدي الفئران إلى استقلاب البيليروبين وانخفاض حاد في مستويات TSB. رسم خرائط مواقع ربط المستقبلات النووية المرتبطة بـ UGT1A1 أشار الجين إلى أن التنشيط النسخي يمكن تحقيقه عن طريق تنشيط فصيلة فرعية 3 مستقبلات الستيرويد بالإضافة إلى الفئة الفرعية 1 من المستقبلات النووية الغريبة الحيوية (XNRs) (الشكل 3). سوجاتاني وآخرون (2001) تميز لأول مرة بوحدة التحسين المستجيبة للفينوباربيتال (Pb) في الإنسان UGT1A1 الجين الذي يرتبط بالمستقبل النشط التأسيسي (CAR). متي hUGT1 يتم علاج الفئران حديثي الولادة باستخدام الرصاص ، ويتم تحفيز UGT1A1 للكبد وتنخفض مستويات TSB بشكل كبير (Chen et al.، 2012 Shibuya et al.، 2013 Yoda et al.، 2017 Yueh et al.، 2017). ومع ذلك، في hUGT1 / سيارة - / - الفئران ، إدارة Pb لا تحفز UGT1A1 وليس لها تأثير على مستويات TSB الوليدية ، مما يؤكد وراثيًا أن CAR ينظم UGT1A1 الجين. في hUGT1 الفئران UGT1A1 يمكن تحفيز الجين نسبيًا بواسطة XNRs الأخرى ، بما في ذلك مستقبلات الحمل X (PXR) (Chen et al. ، 2012) ، مستقبل alpha المنشط بتكاثر البيروكسيسوم (PPAR)α) (Senekeo-Effenberger et al. ، 2007) ، مستقبلات الكبد X ألفا وبيتا (LXRα/β ملاحظات غير منشورة) ، وأجهزة الاستشعار البيئية ، ومستقبل الهيدروكربون أريل (AhR) (Yueh وآخرون ، 2003 Chen et al. ، 2005 Bonzo et al. ، 2007) ، و Nrf2 (Yueh and Tukey ، 2007 Yoda et al. ، 2017). الإعطاء الفموي أو داخل الصفاق للليغاند القادر على تنشيط هذه المستقبلات عند حديثي الولادة hUGT1 تؤدي الفئران إلى تحريض الكبد أو UGT1A1 المعوي متبوعًا بتخفيضات في مستويات TSB. يؤكد الانخفاض في مستويات TSB في وقت مبكر من نافذة حديثي الولادة أن الفئران تتجنب الخلل الوظيفي العصبي الناجم عن البيليروبين (الشكل 3).

تفعيل وقمع وكبت الإنسان بوساطة المستقبلات النووية UGT1A1 الجين وتأثيره على فرط بيليروبين الدم في hUGT1 الفئران. عناصر ملزمة من NRs المختلفة ، بما في ذلك PPARαو AhR و Nrf2 و CAR و PXR و LXRα، تم تحديدها في منطقة المروج المنبع لموقع بدء النسخ الخاص بـ UGT1A1 الجين. عند ربط الترابط ، يمكن لهذه NRs تجنيد المنشطات والبدء في المصب UGT1A1 التعبير الجيني. متي hUGT1 تعرض الولدان إلى ناهضات NR مختلفة ، ولوحظ انخفاض مستويات البيليروبين في الدم (باستثناء PPARγ). في حالة عدم وجود ligand ، ترتبط بعض NRs بضاغطات NR (مثل NCoR1 و SMRT) وتوظف إنزيم HDAC المعدل للكروماتين لتشكيل مجمع قمعي والحد من تنشيط النسخ. قد يؤدي تعطيل المركب القمعي إلى تحطيم التعبير الجيني. أنسنة UGT1 الفئران التي تعاني من نقص في PXR (hUGT / Pxr - / - و hUGT1 / Pxr - / - / سيارة - / - ) ، ولكن ليس CAR (hUGT1 / سيارة - / - ) ، مع انخفاض مستوى البيليروبين الكلي في الدم. عندما يتم إسكاتها بشكل انتقائي ، فإن عوامل الضغط SMRT أو NCoR1 أو HDACs في خلايا الكبد الأولية المعزولة من hUGT1 الفئران، UGT1A1 لوحظ تفعيل الجينات.

PXR هو هدف الستيرويد وبروتين الكابت ومنظم UGT1A1.

بدأت أهمية PXR كمنظم للتحكم في الغدد الصماء ، واستقلاب الدواء ، وفرط بيليروبين الدم في الظهور عندما توقعنا أن PXR يتحكم في استقلاب الدواء الموجه بواسطة UGT أثناء الحمل. على سبيل المثال ، تكون مستويات TSB المنتشرة أقل عند النساء أثناء الحمل ، مما يشير إلى أن استقلاب البيليروبين يتسارع من خلال المستحث UGT1A1 (Bacq et al. ، 1996). يُظهر Labetalol ، وهو دواء خافض للضغط يتم استقلابه بشكل أساسي بواسطة UGT1A1 ، زيادة في التصفية في الثلث الثاني والثالث من الحمل مقارنة بفترة ما بعد الولادة (Jeong et al. ، 2008). ينتج عن الحمل ارتفاعات كبيرة في الهرمونات أثناء نمو الحمل ، مع زيادة في المنشطات مثل هرمون الاستروجين والبروجستين والقشرانيات السكرية. نظرًا لأنه تم توقع أن يكون PXR هدفًا داخليًا منخفض التقارب لتعميم تجمعات الستيرويد التي ستؤدي في النهاية إلى تغييرات فسيولوجية مثل استقلاب الدواء (Blumberg et al. ، 1998) ، قمنا بفحص تأثير PXR على التحكم في UGT1A الجينات أثناء الحمل في hUGT1 * 1 و hUGT1 * 28 الفئران (فوجيوارا وآخرون ، 2010). الكبار hUGT1 * 28 الفئران مصابة بفرط بيليروبين الدم ، مع مستويات TSB بمتوسط ​​1 مجم / ديسيلتر مقارنة بالمستويات التي لا يمكن اكتشافها في hUGT1 * 1 الفئران. أثناء الحمل وأواخر الحمل ، تكون مستويات TSB في hUGT1 * 28 بلغ متوسط ​​الفئران 0.4 ملغم / ديسيلتر ، أي أقل بنسبة تزيد عن 50٪ من الفئران غير الحامل. أثناء الحمل المتأخر ، يتم تحفيز بروتينات UGT1A في الكبد. تم أيضًا توثيق تنشيط PXR بواسطة تحليل CHIP ، مما يدل على زيادة ارتباط PXR المرتبط بـ UGT1A1 الجين أثناء الحمل المتأخر (Chen et al. ، 2012). لفحص دور PXR كمعدل لاستقلاب الدواء ، عبرنا hUGT1 * 1 الفئران مع Pxr - / - وفحص الفئران التعبير UGT1 موضع في الحامل hUGT1 / Pxr - / - الفئران. بالمقارنة مع hUGT1 الفئران، UGT1A1, -1A3, -1 أ 4, -1 أ 6، و -1 أ 9 التعبير الجيني في hUGT1 / Pxr - / - يتم تقليل الفئران بشكل كبير خلال المراحل المتأخرة من الحمل. عندما كانت تدار الجلوكوكورتيكويد ديكساميثازون (DEX) hUGT1 الفئران ، كل خمسة UGT1A تم تحفيز الجينات المعبر عنها في الكبد. على الرغم من أن تنشيط مستقبلات الجلوكوكورتيكويد بواسطة DEX قد تم تنشيطه مسبقًا UGT1A1 بنيات الجينات المراسل ، لم يكن لـ DEX أي تأثير على تحريض UGT1A1 في hUGT1 / Pxr - / - الفئران ، مما يدل على أن تحريض UGT1A يتم تسهيل الجينات بواسطة السكرية فقط عن طريق تنشيط PXR في الجسم الحي.

إسكات نسخ UGT1A1 الجين.

في تربية التجارب لخلق hUGT1 / Pxr - / - الفئران ، تحليل مستويات TSB في حديثي الولادة hUGT1 و hUGT1 / Pxr - / - أظهرت الفئران أن PXR يلعب دورًا رئيسيًا في التحكم في مستويات TSB أثناء التطوير. في حديثي الولادة hUGT1 / Pxr - / - الفئران ، يتم تحفيز الكبد UGT1A1 عند مقارنته بتعبيره في hUGT1 الفئران (Chen et al. ، 2012). زيادة مستويات UGT1A1 في الكبد hUGT1 / Pxr - / - الفئران تؤدي إلى انخفاض مستويات TSB. تشير هذه النتيجة إلى أنه في حالة عدم وجود يجند داخلي ، يؤدي الدور الفسيولوجي لـ PXR إلى قمع UGT1A1 الجين خلال التطور المبكر. الأهم من ذلك ، منع تنشيط UGT1A1 يتم التحكم في الجين بواسطة PXR في الكبد من خلال عمليات نمو حديثي الولادة ، منذ حذفه عند البالغين hUGT1 / Pxr - / - الفئران ليس لها تأثير على UGT1A1 التعبير الجيني ، باستثناء الفئران الحوامل. وبالتالي يشارك PXR في إسكات النسخ من UGT1A1 الجين (الشكل 3).

بالاقتران مع المستقبلات النووية ، يتم تحقيق إسكات النسخ أو القمع إلى حد كبير مع اثنين من مثبطات المثبطات النووية النموذجية ، وسيط إسكات مستقبلات هرمون الريتينويد وهرمون الغدة الدرقية (SMRT) ، والمستقبلات النووية 1 (NCoR1) (فرانسيس وآخرون ، 2003 Mottis et al. ، 2013) ، مما يشير إلى أن NCoR1 و / أو SMRT يشاركان في التحكم في تعبير UGT1A1 أثناء التطوير. من الناحية الميكانيكية ، تتفاعل بروتينات الكابح مع XNRs ، مثل RXR و LXR و PPAR و PXR ، للتحكم في أنماط التعبير الجيني بشكل جماعي عن طريق تجنيد إنزيمات معدلة للكروماتين تحد من إمكانية الوصول إلى الحمض النووي النووي وتنشيط النسخ. في حالة عدم وجود المستقبل النووي أو الكابح ، تتعاون المنشطات الإضافية مع مجموعة مختلفة من الإنزيمات المعدلة للكروماتين لتعزيز تنشيط النسخ. في التجارب التي استهدفت حذف NCoR1 / SMRT في الأنسجة أو خطوط الخلايا المختلفة ، يؤدي حذف الكابح تلقائيًا إلى تنشيط nonligand لـ XNRs ، مما يسهل التنشيط النسخي للجينات المستهدفة XNR (Li et al. ، 2013). غالبًا ما يوفر التنشيط النسخي للجينات المستهدفة النهائية عن طريق XNRs التي يتم تنشيطها تلقائيًا توقيعًا جينوميًا يمكن استخدامه لتحديد XNR الدقيق المتضمن في الاستجابة. لتحديد ما إذا كان NCoR1 و SMRT متورطون في قمع UGT1A1 الجين في الكبد ، ضربة قاضية لـ NCoR1 و SMRT في حديثي الولادة hUGT1 تؤدي الخلايا الكبدية بواسطة siRNA إلى القضاء على UGT1A1 (تشين وآخرون ، 2017). شوهدت تأثيرات مماثلة بعد استئصال HDAC1 أو HDAC3 ، مما يشير إلى أن NCoR1 و SMRT متورطان جنبًا إلى جنب مع HDAC1 / HDAC3 في قمع التعبير عن UGT1A1 التعبير الجيني. في حين أن ضربة قاضية للجينات في زراعة الأنسجة هي أداة فعالة لتحديد الأحداث التنظيمية المحتملة ، فإن الضربة القاضية المحددة للأنسجة في الجسم الحي توفر دليلًا إضافيًا على التأثير الكيميائي الحيوي والفسيولوجي لدورها في التوازن الطبيعي. مع وجود دليل على أن PXR جنبًا إلى جنب مع NCoR1 و SMRT مرتبطان بقمع حديثي الولادة لتعبير الكبد UGT1A1 ، بدأت التجارب باستخدام الحذف الشرطي لـ NCoR1 لفحص الآليات الجزيئية التي تربط تطور حديثي الولادة بالكبد والأمعاء UGT1A1 التعبير الجيني (الشكل 3).

دور مهم لـ NCoR1 في التنظيم UGT1A1 ظهر التعبير الجيني عند الولدان (Chen et al. ، 2017). أنشأنا floxed Ncor1 الفئران تحت أ hUGT1 معرفتي (TgUGT1 /يوgt1 - / - /نكور 1 و / و ) ، سميت باسم فئران الأمم المتحدة F / F ، ثم أخرجت NCoR1 في الكبد (ΔHEP UN الفئران) والأنسجة المعوية (ΔIEC UN الفئران) من hUGT1 الفئران. عندما تم فحص مستويات TSB في الفئران حديثي الولادة ، من النوع البري F / F الأمم المتحدة و ΔHEP UN أظهرت الفئران أنماطًا مماثلة من فرط بيليروبين الدم عند الأطفال حديثي الولادة كما لوحظ في hUGT1 الفئران. لم يكن لحذف NCoR1 في أنسجة الكبد أي تأثير على الكبد UGT1A1 التعبير الجيني. اللافت للنظر ، بعد الحذف المعوي النوعي لـ NCoR1 ، تضاءل تطور فرط بيليروبين الدم الوليدي تمامًا في ΔIEC UN الفئران. أدى تأثير حذف NCoR1 المعوي إلى إلغاء التعبير المعوي UGT1A1 مع تحريض كبير للبروتين الذي يحدث في كل من المحور الطولي [أي ، جميع أقسام الأمعاء الدقيقة (SI)] وكذلك محور الزغابات الخفية. ميكانيكيًا ، لوحظ إلغاء أو تحريض UGT1A1 بعد خروج القاضية NCoR1 فقط أثناء نمو حديثي الولادة ، نظرًا لأن إلغاء ضغط UGT1A1 لم يحدث عند البالغين ΔIEC UN الفئران. تشير هذه الملاحظة المثيرة للاهتمام إلى أن NCoR1 يلعب دورًا رئيسيًا كبروتين مضاد في عمليات تنموية مهمة مرتبطة بالتوازن المعوي. قد تكون هذه العمليات مرتبطة بشكل مباشر أو غير مباشر بإلغاء قمع UGT1A1 الجين (الشكل 4).

NCoR1 يقمع الإنسان UGT1 التعبير الجيني أثناء التطوير. NCoR1 F / F تم عبور الفئران إلى hUGT1 لتوليد F / F الأمم المتحدة الفئران ، والتي تم تهجينها بدورها مع الفئران الحاملة لـ Cre recombinase وطردت NCoR1 على وجه التحديد في الكبد (ΔHEP UN ) والأنسجة المعوية (ΔIEC UN ). تم فحص مستويات البيليروبين في الدم في الفئران حديثي الولادة ، ΔHEP UN أظهرت الفئران نمطًا مشابهًا لفرط بيليروبين الدم عند الأطفال حديثي الولادة hUGT1 (F / F UN ) الفئران ، ولكن هذا النمط قد تضاءل تمامًا بالضربة القاضية NCoR1 في القناة المعوية لـ ΔIEC UN الفئران. كما ظهر تغير تراكم البيليروبين في الأنسجة الدهنية. تحريض الأمعاء في UGT1A1 ΔIEC UN لوحظت الفئران وكانت الأبرز خلال مرحلة النمو ولكنها لم تحدث بعد الفطام أو في مرحلة البلوغ. يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني ± SEM ، **ص& lt0.01، ***ص& lt0.001 ، ****ص& lt0.0001 ، اختبار الطالب. تحليل ANOVA ثنائي الاتجاه لـ ΔIEC UN ضد F / F الأمم المتحدة (ص& lt0.0001).

عندما أجرينا التنميط النسخي للأنسجة المعوية من خلال تنفيذ تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي F / F الأمم المتحدة و ΔIEC UN حددت الفئران وتحليل علم الوجود الجيني المسار الأيضي باعتباره المسار الأكثر تغيرًا بشكل ملحوظ في ΔIEC UN الفئران ، تليها الفسفرة المؤكسدة واستقلاب الدواء. حذف NCoR1 عزز التعبير عن PPARα و LXRα الجينات المستهدفة ، مما يشير إلى أن NCoR1 رست على هذه الجينات أثناء نمو حديثي الولادة. كان لحذف NCoR1 تأثير كبير على استقلاب الأحماض الدهنية والطاقة ، بالإضافة إلى التمثيل الغذائي للدهون والكوليسترول. تمت زيادة مستويات Messenger RNA لجينات دورة TCA وجينات الفسفرة المؤكسدة بشكل متناسق. أشارت هذه المسارات الأيضية المتسارعة إلى أن NCoR1 كان يقمع المسارات الرئيسية الضرورية لنضج الخلايا الظهارية وتكوينها. في ΔIEC UN في الفئران حديثي الولادة ، كان متوسط ​​طول الأمعاء الدقيقة أطول بمقدار ∼8٪ وأثقل بنسبة 15٪ من متوسط ​​طول الأمعاء الدقيقة. F / F الأمم المتحدة القمامة ، مما يشير إلى زيادة تكاثر الأمعاء. أشارت نتائج علم الأنسجة والفحص المجهري الإلكتروني إلى نضوج حدود الفرشاة والميكروفيلي بشكل كبير ΔIEC UN . عندما فحصنا إشارات الانتشار الخلوي ، تمت زيادة المناعة المناعية لـ Ki-67 ، وهي علامة خلوية للتكاثر ، في كليهما ΔIEC UN الاثني عشر والصائم. لدعم هذه النتيجة ، أظهر تلطيخ البرومودوكسيوريدين ، المستخدم للكشف عن الخلايا المتكاثرة ، زيادة تدريجية في الخلايا الظهارية الإيجابية. أظهرت هذه النتائج أن حذف NCoR1 كان العامل المساعد لتسريع تكاثر الخلايا وتعزيز تكاثر الخلايا الظهارية. دعماً للتكاثر الخلوي ، تم إحداث انتظام في نضوج الأمعاء. ΔIEC UN الفئران ، جنبًا إلى جنب مع علامات النضج الأخرى التي تضمنت الإثني عشر الخاصة Akp3 الجين والخاصة بالشيوخ Krt20 الجين. أكدت هذه الدراسات أن تعبير NCoR1 حديثي الولادة يعمل على قمع التعبير الجيني ، بما في ذلك UGT1A1 ، بينما يتحكم ميكانيكيًا في التغيرات التنموية الكامنة وراء نضج الأمعاء من مرحلة حديثي الولادة إلى أنسجة البالغين.

تنظيم NCoR1 والتعبير عن الأمعاء UGT1A1.

قد يكون NCoR1 المعوي حجر الزاوية في التحكم في استقلاب البيليروبين في الخلايا الظهارية المعوية (IECs) أثناء نافذة حديثي الولادة. تم ربط القدرة الوظيفية لـ NCoR1 على تعزيز خصائصه القمعية مع المستقبلات النووية بالإضافة إلى قدرتها على تنشيط النسخ الجيني بأحداث الفسفرة (Mottis et al. ، 2013 Jo et al. ، 2015) ، التي يتحكم فيها عدد من كينازات مختلفة (Fernández-Majada et al.، 2007 Huang et al.، 2009 Choi et al.، 2013). على سبيل المثال ، ارتبط فقدان NCoR1 النووي في سرطان الجلد الخبيث بالفسفرة المعتمدة على IKK لبقايا سيرين NCoR1 محددة (Gallardo et al. ، 2015). عندما يتم فسفرة NCoR1 ، فإنه ينفصل عن الكروماتين ويهاجر إلى السيتوبلازم ، وهي حركة تحفز أحداث إلغاء النسخ. أسست النتائج من دراساتنا أيضًا روابط وثيقة بين تنشيط IKK ، ووظيفة NCoR1 ، والتخفيضات في مستويات TSB في hUGT1 الفئران (Chen et al. ، 2017). IKK المعويβ أمر بالغ الأهمية في التحكم في التمثيل الغذائي الأساسي للبيليروبين المعتمد على UGT1A1. عندما IKKβ تم حذفه في IECs بتنسيق hUGT1 الفئران (hUGT1 / Ikkβ ΔIEC الفئران) ، ينخفض ​​التعبير الأساسي عن UGT1A1 المعوي في الفئران حديثي الولادة ، مما يؤدي إلى ارتفاعات في مستويات TSB مميتة (Liu et al. ، 2016). عندما يتم نزع الفسفرة NCoR1 ، من المحتمل أن يكون موجودًا عند IKKβ تم حذفه ، نفترض أن مجمع NCoR1 / NR يشدد ارتباطه بالكروماتين لتحسين قمع النسخ ، كما لوحظ من خلال تقليل أكبر في تعبير IEC عن UGT1A1. تم اختبار هذه الفرضية عن طريق الإفراط في التعبير عن IKK النشطβ في IECs ، وهو حدث أدى إلى إلغاء جينات النضج المعوي ، مثل الاستجابات المذكورة أعلاه التي وثقناها عندما تم حذف NCoR1 (Chen et al. ، 2017). قدرة IKK المنشط بشكل أساسيβ لتقليد إجراءات حذف NCoR1 أيضًا عندما hUGT1 عولجت الفئران حديثي الولادة عن طريق الفم بالكادميوم (Cd 2+) ، حيث تعمل كمحفز قوي للإجهاد التأكسدي ومنشط لـ IKKβ (NF) -κمسار B (Liu et al. ، 2016). أدى علاج الكادميوم إلى تحريض الأمعاء لـ UGT1A1 ، وانخفاض حاد في مستويات TSB ، وتحريض جينات نضج الأمعاء ، وهي الأحداث التي لوحظت عند حذف NCoR1. يمكن أن يكون الحث المعتمد على Cd 2+ للأمعاء UGT1A1 مدفوعًا بتنشيط IKK ، والذي يمكن من خلاله أن يساهم بشكل مباشر أو من خلال آليات بديلة في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). ومن المثير للاهتمام أن كلا العمليتين يمكن أن تلعب دورًا في استهداف فسفرة NCoR1 ، وهو حدث من شأنه أن يؤدي إلى تنشيط الأمعاء UGT1A1 الجين.

الإجهاد التأكسدي وتنظيم UGT1A1.

مع العلم أن التعبير التأسيسي لـ IKK المعويβ أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على مستويات التعبير المناسب من UGT1A1 الجين ، على الأرجح من خلال تنشيط وتعديل NCoR1 ، قمنا بفحص تأثير الإجهاد التأكسدي المعوي تجاه تحريض UGT1A1. ينبع الأساس المنطقي لهذه التجربة من النتائج التي توصل إليها IKKβ/ NF-κيستجيب المسار B لتغيرات الأكسدة والاختزال ، مثل التعديلات في ROS. لإجراء هذه التجربة وإلغاء دور IKKβ, hUGT1 و hUGT1 / Ikkβ ΔIEC عولجت الفئران عن طريق الفم إما باستخدام Cd 2+ أو الزرنيخ (As 3+) ، وكلاهما معروف بإحداث إجهاد مؤكسد كبير (Santra et al. ، 2000 Ercal et al. ، 2001 Li et al. ، 2002 Liu et al. ، 2003 López وآخرون ، 2006). غير معالج hUGT1 / Ikkβ ΔIEC أظهرت الفئران انخفاضًا في التعبير المعوي UGT1A1 ومستويات مرتفعة من TSB ، مع وفاة معظم الفئران بسبب SNH (Liu et al. ، 2016). عند حديثي الولادة hUGT1 عولجت الفئران عن طريق الفم إما باستخدام Cd 2+ أو As 3+ ، تم تحفيز UGT1A1 المعوي وتم خفض مستويات TSB (Liu et al. ، 2016 Yoda et al. ، 2017). وبالمثل ، عندما hUGT1 / Ikkβ ΔIEC عولجت الفئران بـ Cd 2+ أو As 3+ ، تم إحداث الإجهاد التأكسدي في الأمعاء ، بما يتناسب مع تحريض UGT1A1 وخفض مستويات TSB. أثناء حديثي الولادة دون علاج hUGT1 / Ikkβ ΔIEC تراكمت في الفئران مستويات سامة من TSB التي كانت مميتة ، والعلاج الفموي باستخدام Cd 2+ أو As 3+ أدى إلى تحريض UGT1A1 المعوي وخفض مستويات TSB (Fujiwara et al. ، 2012 Liu et al. ، 2016). يؤدي الزرنيخ ، وهو محفز للإجهاد التأكسدي ، إلى التنشيط السريع لبروتين كيناز p38 المنشط بالميتوجين (Yoda et al. ، 2017) والكيناز خارج الخلية المنظم بالإشارة ، وكلاهما مستشعران للإجهاد التأكسدي. ومن المثير للاهتمام ، أن العلاج الفموي As 3+ أكد أن جينات علامة نضج IEC قد تم تحفيزها أيضًا. بالإضافة إلى ذلك ، التعبير عن Glb1, Nox4، و Lrp2 تم تقليل الجينات ، التي يتم تنظيمها عند الانتقال من الرضاعة إلى الفطام ، وتقليد نفس النمط الذي لوحظ في ΔIEC UN الفئران. قد يؤدي تنشيط MAPK والكيناز الذي ينظم الإشارة خارج الخلية بواسطة As 3+ إلى تحفيز نشاط كيناز في IECs ، مما يعزز إلغاء التعبير الجيني بطريقة تعتمد على NCoR1.

الافتراض الوقائي للإجهاد التأكسدي في الأنسجة والخلايا هو وجود أو تطور نظام دفاع قوي لمواجهة السميات المحتملة المرتبطة بتوليد ROS. The formation of oxidative stress, induced by natural diet or through environmental exposure, sets into motion a unique signaling cascade that activates gene families that regulate cytoprotective proteins to provide an active defense against cellular damage. The central mediator of this defense is the nuclear E2-factor related factor 2 (Nrf2), which exists as an Nrf2-Keap1 complex that is sensitive to ROS (Wasserman and Fahl, 1997). Activation of Nrf2 sets into motion transcriptional activation of target genes following binding to unique enhancer sequences identified as antioxidant response elements (AREs) (Wasserman and Fahl, 1997 Nguyen et al., 2000). The ARE sequences are clustered with the AhR xenobiotic response element flanking the UGT1A1 gene and bind activated Nrf2 (Yueh and Tukey, 2007). The antioxidant response can target the UGT1A1 gene, in addition to other genes responsive to ROS, such as NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1 (McWalter et al., 2004), glutathione-س-transferase, and heme oxygenase (Alam et al., 1999). Thus induction of these genes following oxidative stress provides a molecular footprint that can be leveraged to identify substances that activate the Nrf2-Keap1 complex in providing antioxidant protection.

CAR, Oxidative Stress, and UGT1A1.

Some of the more potent inducers of oxidative stress are the isothiocyanates (ITCs). Regarded as an important component of our diet, cruciferous vegetables (i.e., broccoli, Brussels sprouts, cauliflower, watercress) have been linked to a lower incidence of cancer development (Murillo and Mehta, 2001) because they produce antioxidative metabolites that induce cytoprotective proteins, such as the UGTs, believed to protect tissue from dietary or environmental toxicity such as cancer. These vegetables are rich in glucosinolates, which are hydrolyzed by plant myrosinases following chewing or by microflora in the gastrointestinal tract to form ITCs (Shapiro et al., 2001a,b, 2006), the active anticarcinogenic metabolites. Isothiocyanates activate the Nrf2-Keap1 complex, initiating a series of events leading to induction of ARE containing target genes (Nguyen et al., 2003). We rationalized that ITC treatment would induce intestinal and potentially liver UGT1A1 in hUGT1 mice and serve as an efficient modulator of neonatal hyperbilirubinemia by inducing UGT1A1 and lowering TSB levels. When neonatal hUGT1 mice were treated orally with phenethyl isothiocyanate (PEITC), TSB levels were reduced to normal after 24 hours (Yoda et al., 2017). Induction of UGT1A1 was dramatic in both liver and small intestines, but the impact on the classic Nrf2-target genes Nqo1 و Gsta1/2 was not significant. We showed previously that oral As 3+ , which generates a potent antioxidant response, has a dramatic impact on Gsta1 و Gsta2 induction while also upregulating several of the cytochrome P450 2 and 4 subfamilies (Liu et al., 2016), indicating that the antioxidant response potentially initiated by PEITC treatment could be influencing the activation of additional signaling pathways. A screen of potential target genes induced by XNRs resulted in prominent induction of Cyp2b10/CYP2B10 in both liver and SI, indicating that CAR may be involved in the PEITC induction of UGT1A1 (Fig. 5).

PEITC regulates UGT1A1 gene expression through ROS-mediated nuclear receptor signaling. Consumption of cruciferous vegetables leads to the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS activates Nrf2 nuclear translocation, thus facilitating Nrf2-antioxidant response element (ARE) signaling and the transcriptional activation of the susceptible target genes. In addition, ROS are linked to the activation of CAR in both liver and small intestines, which results in the induction of Cyp2b10 and UGT1A1. إضافة ن-acetylcysteine (NAC) blocks ROS production, nullifying both CAR and Nrf2 activation.

To examine the component of CAR linking induction of UGT1A1 and CYP2B10 by PEITC, hUGT1/Car −/− were bred to generate CAR knockout hUGT1/Car −/− and heterozygous hUGT1/Car −/+ littermates. على حد سواء hUGT1/Car −/− و hUGT1/Car +/− neonatal mice develop hyperbilirubinemia at the same rate. When treated with an oral dose of PEITC, UGT1A1 and CYP2B10 were induced in liver and SI of hUGT1/Car +/− mice, with a total reduction in TSB levels. The induction of hepatic UGT1A1 was significant and most likely drove the metabolism of bilirubin, leading to the reduction in TSB levels. In liver tissue from PEITC-treated hUGT1/Car −/− mice, there was no expression of CYP2B10 or UGT1A1, indicating that CAR was essential for induction by PEITC. In SI, the induction of CYP2B10 was also absent, yet TSB levels were significantly reduced. In the absence of CAR, there was induction of UGT1A1 in the SI, which we expect was responsible for the reduction in TSB levels. While the induction by PEITC in SI could be attributed to activation of Nrf2, there was no significant transcriptional activation of other ARE target genes. The possibility exists that PEITC induction of intestinal UGT1A1 in neonatal mice is being driven by a mechanism that is independent from CAR and Nrf2 activation (Fig. 5).

Confirmation that CAR underlies CYP2B10 and UGT1A1 induction by PEITC was validated in adult hUGT1/Car +/− و hUGT1/Car −/− الفئران. In liver and SI, oral PEITC treatment induced CYP2B10 in a strictly CAR-dependent fashion. Significant induction of CYP2B10 by PEITC in these tissues was generated only in hUGT1/Car +/− mice, with no response in hUGT1/Car −/− mice in either tissue, leaving us to speculate that induction of CYP2B10 by PEITC involved activation of CAR. A different pattern of induction was observed with UGT1A1 expression. In liver, UGT1A1 expression was greatly reduced in hUGT1/Car −/− mice, clearly linking CAR activation with UGT1A1 expression. However, in SI, PEITC treatment effectively induced UGT1A1 in both hUGT1/Car +/− و hUGT1/Car −/− mice, indicating that alternative CAR processes, such as activation of Nrf2, are responsible for the induction. In addition, Nrf2 target genes were induced in both liver and SI, confirming that the actions of PEITC are also initiating an ARE response. These findings indicate that two important signaling events, the activation of CAR and Nrf2, are linked to induction of UGT1A1 (Fig. 5).

Independently, the activation of CAR by ligands or the activation of Nrf2 by oxidative stress can facilitate the induction of UGT1A1. However, with PEITC treatment, evidence suggests that CAR and Nrf2 are linked in the induction of liver UGT1A1. To separate an antioxidative response initiated by PEITC from activation of CAR and induction of UGT1A1, we first administered adult hUGT1 الفئران ن-acetylcysteine (NAC) for 3 weeks in their drinking water. Cysteine is the rate-limiting substrate for the synthesis of glutathione (GSH), and thus supplementation of NAC promotes the resynthesis of GSH and the neutralization of free radicals (Rizzardini et al., 1994). GSH has antioxidant properties in addition to facilitating the activity of enzymatic antioxidant systems, including GSH peroxidase and GSH reductase. After 2 weeks of NAC exposure, the mice were treated with PEITC, and antioxidant responses were measured. In the absence of NAC exposure, PEITC treatment leads to robust induction of Nrf2 target genes Nqo1, Gsta1، و Gsta2، جنبا إلى جنب مع UGT1A1 و Cyp2b10. In mice exposed to NAC and treated with PEITC, Cyp2b10 gene expression was completely suppressed, along with Nqo1, Gsta1، و Gsta2. While PEITC induces oxidative stress that targets Nrf2 target genes, induction of UGT1A1 and CYP2B10 is dependent upon CAR. These findings indicate that induction of liver UGT1A1 by PEITC is dependent upon both Nrf2 and CAR, while the generation of oxidative stress is a prerequisite toward CAR activation and induction of UGT1A1 and CYP2B10 (Fig. 5).

Breast Milk-Induced Hyperbilirubinemia.

Breast milk (BM) plays a significant role in neonatal hyperbilirubinemia (Newman and Gross, 1963 Fujiwara et al., 2015), termed breast milk jaundice (BMJ) and is characterized by prolonged increases in unconjugated bilirubin. Infants with BMJ have elevated TSB levels above 10 mg/dl that can reach levels above 20 mg/dl, approaching the range that can induce bilirubin-induced neurologic toxicities. The prolonged increases in TSB levels during the neonatal window in hUGT1 mice indicate that breast milk may be participating in the development of hyperbilirubinemia. When neonatal hUGT1 mice were fed human breast milk, the mice continued to develop jaundice (Fujiwara et al., 2012). Clinical studies have demonstrated that newborns with jaundice given a formula diet have lower levels of TSB than breast-fed newborns, indicating that breast milk facilitates the repression of UGT1A1 (Schneider, 1986 Huang et al., 2004). To examine if we could replicate this effect in hUGT1 mice, neonatal mice were given a diet of baby formula for 72 hours (Fujiwara et al., 2012). After formula treatment, TSB levels were reduced over 95% compared with breast-fed mice. Formula induced UGT1A1 in intestinal tissue, which correlated with the reductions in TSB levels. Of significance, formula also induced the CAR target gene Cyp2b10 and PXR target gene Cyp3a11, indicating that formula targeted activation of CAR and PXR. When formula was given to neonatal hUGT1/Car −/− أو hUGT1/Pxr −/− mice, intestinal UGT1A1, Cyp2b10, and Cyp3a11 were induced in both strains, indicating formula was not activating either CAR or PXR. However, formula feeding led to activation of IκB/NF-κB target genes, linking activation of NF-κB with induction of intestinal UGT1A1. Given the finding that formula leads to activation of NF-κB and induction of intestinal UGT1A1 in neonatal hUGT1 mice, it can be speculated that the repressive effects of BM are tied with inhibition of the IKK/NF-κB pathway.

While IκB kinase (IKK) is an upstream component of NF-κB signaling, it is linked to propagating the cellular response to inflammation (Karin, 2009) and plays an important role in neonatal intestinal UGT1A1 expression (Fujiwara et al., 2012). Human breast milk, especially colostrum, is rich in human milk oligosaccharides (HMOs) (Bode, 2015 Lin et al., 2017) that bind to Toll-like receptors (TLRs) and prevent activation of the receptors by pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), which are expressed by microflora (He et al., 2016a Newburg et al., 2016). When TLRs are activated, they initiate intracellular signaling events that result in regulation of IKK and NF-κB. In comparison with term babies and adults, preterm children express higher concentrations of TLRs, and if activated, could induce an IKK/NF-κB inflammatory response that results in sepsis or necrotizing enterocolitis (NEC) (He et al., 2016a,b Niño et al., 2016). Components of breast milk block intestinal TLR activation by PAMPs, which in turn blocks downstream IKK phosphorylation. Since we have demonstrated that targeted deletion of intestinal IKKβ في hUGT1 mice represses newborn intestinal UGT1A1, we can speculate that IKK activity is directly linked to intestinal UGT1A1 expression. This concept is further supported by findings that when intestinal TLRs are activated in neonatal hUGT1 mice by agents, such as LPS, or IKK is directly activated by Cd 2+ , intestinal UGT1A1 is induced followed by a reduction in TSB levels. Thus the delayed expression of intestinal UGT1A1 can be traced to breast milk inhibition of TLR activation, which controls downstream activation of IKK. This concept can be highly relevant toward understanding the underlying mechanism associated with BMJ, since NCoR1 activity controls intestinal maturation and is directly linked to induction of intestinal UGT1A1. This also may explain why a diet of formula, which lacks TLR binding glycans, allows downstream activation of the IKK/NCoR1 loop, induction of intestinal UGT1A1, and a reduction in TSB levels. Equation would naturally dilute the concentrations of the TLR binding glycans allowing activation of the TLRs by PAMPs, followed by derepression of NCoR1 and induction of intestinal UGT1A1.


المبادئ العامة

1.07.4.2 Glucuronosyl Transferases

Glucuronosyl transferases are a family of enzymes that catalyze the transfer of glucuronic acid from uridine diphosphate (UDP)-glucuronic acid to acceptor molecules containing hydroxyl, phenol, carboxylic acid, thiol, or amine groups ( Mulder 1992 Tukey and Strassburg 2000 ). Kinetic studies have shown that these enzymes follow a random sequential mechanism. Glucuronosyl transferases are located in the endoplasmic reticulum, and their biosynthesis can be induced by a number of drugs and xenobiotics. Some forms of glucuronosyl transferases are coordinately induced with cytochromes P450. Conjugation with glucuronic acid makes lipophilic molecules much more water-soluble and readily excretable, and therefore is considered a detoxication pathway. However, acyl glucuronides can undergo structural rearrangements and react with nucleophilic groups in cells ( Faed 1984 Ritter 2000 ). Thus glucuronidation of some molecules may represent bioactivation. For example, the acyl glucuronide of the hypolipidemic drug clofibrate acylates cellular macromolecules ( Faed 1984 ). However, the toxicological significance of this reaction is unclear.


UGT1A6

Common UGT1A6 Polymorphisms

UGT1A6 is a phenol-metabolizing UGT, primarily involved in the glucuronidation of simple phenols and planar arylamines 5,93 that mediates the conjugation of many currently prescribed drugs including antidepressants, neuroleptics and β-adrenoreceptor blockers. 93,129,130,131,132,133,134 The UGT1A6 gene has been found to be polymorphic with at least four alleles characterized by three SNPs in the coding sequence. The unmodified ‘wild-type’ allele is referred to as UGT1A6 * 1, while the allele characterized by the presence of both missense polymorphisms at codons 181 (Thr 181 Ala) and 184 (Arg 184 Ser) is referred as UGT1A6 * 2. 130 Although these two mutations are usually linked, both mutations have been observed separately. A single mutation at codon 184 is designated UGT1A6 * 3 and a single mutation at codon 181 is designated UGT1A6 * 4 (Table 4). 130,135 Functional studies by Ciotti وآخرون 130 revealed that the protein encoded by the UGT1A6 * 2 allele has lower activity towards several phenolic compounds (27–75% of the rate of the wild-type enzyme). Also, 3-ا-methyl-dopa and methyl salicylate were conjugated at 41–74% of the wild-type rate, whereas a series of β-blockers were metabolized at 28–69% of the normal level. The clinical implications of these variant alleles still remain to be determined. The data reported by Ciotti وآخرون 130 has suggested that the UGT1A6 * 2 low-activity allele is frequent in the population (frequency of 0.173). The impact of single substitutions at codons 181 ( * 4) and 184 ( * 3) was not assessed في المختبر. The allelic distribution as a function of ethnicity was further assessed in a second study conducted by Lampe وآخرون. 135 They reported higher frequencies of the UGT1A6 * 2 and UGT1A6 * 3 alleles compared to previous studies, with distributions being slightly different between Caucasian and Asian populations (Table 4). In a population composed of healthy Caucasian subjects (ن=103), frequencies of 0.010 and 0.024 were observed for the alleles UGT1A6 * 3 and UGT1A6 * 4 and the genotype frequencies were found to be in Hardy–Weinberg equilibrium (Table 4).

The combined distribution of polymorphisms in the TATA-box region of the UGT1A1 promoter and polymorphisms in UGT1A6 was assessed in the study of Lampe وآخرون. 135 A significant linkage disequilibrium between genotypes for UGT1A1 * 28 and UGT1A6 * 2 was observed in both Caucasian and Asian populations. Homozygous variants were observed in 8% of the cases and 43% of individuals had at least one variant allele for both UGT1A1 * 28 and UGT1A6 * 2. Therefore, for compounds metabolized by these two hepatic UGT enzymes, neither of them would theoretically be able to compensate for the deficiency of the other enzyme since low-activity UGT1A6 and UGT1A1 alleles are closely linked.

Modulation of Colon Adenoma Risk by UGT1A6 Genotypes

The group of Bigler وآخرون 136 have explored the role of UGT1A6 polymorphic variations in relation to the risk of developing colon adenoma. In their population-based study, 474 adenoma cases and 563 control subjects were genotyped for the variations at codons 181 and 184 of UGT1A6. Regression analyses, adjusted for age, sex, smoking and hormone replacement therapy, did not reveal any significant increase in the risk of developing adenoma in subjects carrying variant UGT1A6 alleles. However, the UGT1A6 genotype was shown to modulate colon adenoma risk in aspirin users (OR=0.53 (95% CI=0.33–0.86)) and nonaspirin NSAID users (OR=0.47 (95% CI=0.24–0.92)) when compared to aspirin and nonaspirin NSAID users carrying the UGT1A6 wild-type genotype, respectively. These results suggest that the UGT genotype modulates the efficacy of chemopreventive drugs, such as NSAID.


Neonatal Jaundice

الفيزيولوجيا المرضية

Kernicterus, which is characterized by a deposition of unconjugated bilirubin in brain cells, may occur in neonates as the result of hyperbilirubinemia and the immaturity of the blood-brain barrier. Unconjugated bilirubin is the major breakdown product of heme and is normally glucuronidated in liver . Bilirubin diglucuronide is excreted in feces by way of the bile. When this process is altered, the unconjugated bilirubin may be deposited in the basal ganglia, hippocampus and hypothalamic nuclei as bilirubin-phosphatidylcholine precipitate, where it gives rise to neuronal necrosis. Clinical manifestations of this condition may include weakness in drinking, vomiting , attacks of fever , convulsions, reflex anomalies, shrill shrieking, apathy, muscular hypertonicity, cramps, opisthotonus, strabismus, nystagmus and apnea. The lethality rate is about 75%. Survival is accompanied by cerebral paresis, deafness and mental retardation Kuntz and Kuntz (2002) .


نتائج

HMOX1 promoter variants and CRC risk

HMOX1 L/M/S-allele carrier status was not found to be associated with CRC risk (Table 1) neither was the A(-413)T variation (Table 1). However, a diplotype analysis revealed that the A23/A30 diplotype (indicating A(-413)T and (GT)ن genetic variations (GT)23 belonging to the S allele class, while (GT)30 belonging to the M allele class) was associated with a substantially increased risk of CRC as it occurred only rarely in the control population. This association remained significant after adjustment for age and sex (OR 95%CI: 12.1 3.2–46.3, ص & lt 0.001). LD was strong for both analyzed promoter gene variants (د′ for A23 = −0.914, ص = 10 −20 and د′ for A30 = 0.923, ص = 10 −20 ).

UGT1A1 promoter variants and CRC risk

The UGT1A1*28 allele carrier status was associated with a 20% decrease in risk of CRC (Table 1). To determine if age influenced the results, both groups were stratified according to age into 10-year age groups. The CRC risk in these subgroups was estimated separately for men and women. A consistent protective effect of UGT1A1*28 allele was observed mainly in men, whereas in women, this effect was less pronounced. The overall results showed a substantial decrease in CRC risk in males (0.75 [0.58–0.96]), but only a nonsignificant decline in females (0.88 [0.66–1.18]). The logistic regression and the stratified analyses provided practically identical results. Therefore, the latter, more intuitive results are reported in our study.

Serum bilirubin levels in CRC patients and controls

CRC patients displayed significantly lower serum bilirubin levels, when compared to the controls (9.8 ضد. 11.35 μmol/L, ص < 0.001 Fig. 1). This difference was more pronounced in males (10.08 ضد. 12.8 μmol/L, ص < 0.001) than in females (9.17 ضد. 10.22 μmol/L, ص = 0.023 (Fig. 1). As age and gender are potential confounders of the association between serum bilirubin levels and the CRC risk, we controlled for their effects by multiple binary logistic regression analysis. The results indicated that CRC risk was explained by serum bilirubin levels [OR (95% CI) = 0.93 (0.88–0.97)], age [OR (95% CI) = 1.08 (1.06–1.10)], but not gender [OR (95% CI) = 1.00 (0.65–1.55)]. Furthermore, the data also implied that each 1 μmol/L decrease in serum bilirubin was associated with a 7% increase in CRC risk (Table 2). When stratified according to gender, this association was again stronger in males than in females (Fig. 1). In accord with that the occurrence of unconjugated hyperbilirubinemia, similar to that found in individuals with Gilbert's syndrome (>17.1 μmol/L), was almost two times lower in CRC patients than in the control population [OR (95% CI) = 0.55 (0.31–0.98)]. In addition, a trend demonstrating possible association between low serum bilirubin and progressive cancer disease was observed (10.3 ضد. 6.6 μmol/L, ص = 0.06 for patients with N1 compared to N3 disease 10.05 ضد. 8.1 μmol/L, ص = 0.22, for patients with M0 ضد. M1 disease), regardless of low statistical power.

Serum bilirubin levels in a subset of studied subjects. Data expressed as median and IQ range. Mann–Whitney Rank Sum test was used for comparison of analyzed variables.

Analysis of serum bilirubin levels in subjects clustered according to individual genotypes (Table 3) revealed that the presence of (TA)7 allele in the promoter of UGT1A1 is associated with increased serum bilirubin levels in both CRC patients and in control subjects (Table 3). The results also indicate that the number of GT repeats in the promoter region of HMOX1 did not affect serum bilirubin levels. However, the T(-413)T carriers had substantially lower serum bilirubin levels in both CRC and control groups (Table 3). Interestingly, a diplotype A23/A30 linked with an increased CRC risk was not associated with exceptionally low serum bilirubin levels, suggesting that these variants may modulate the CRC risk by some other mechanisms. The data consistently indicate that serum bilirubin levels were substantially lower in CRC patients within all studied genotype groups (Table 3).


مقدمة

Vertebrates evolved with the UGT (يوDP-زlucuronosylرransferase) gene family, 1, 2 a set of endoplasmic reticulum-specific enzymes that catalyze the transfer of glucuronic acid from uridinediphospho-glucuronic acid to various lipophilic substrates. This reaction is crucial to the processing of bilirubin and endogenous hormones, the elimination of therapeutic drugs from the circulation, and the inactivation of environmental toxins. الانسان UGT1A locus on chromosome 2q37 contains 13 promoters/first exons that encode nine proteins sharing a common C-terminus encoded by the 3′ exons 2–5. 3 The lead exon in any given transcript is predicted to be spliced to the four common exons to generate a functional enzyme. Each product is named for the UGT1A locus and an additional number representing the spliced first exon. For the enzyme product, this lead exon encodes the amino-terminal substrate specificity and the common exons encode the UDP-glucuronic acid-accepting domain. This multiple tandem exon structure is a shared feature of several important genes and may provide a common mechanism for directing cell- and tissue-specific gene expression. 4

Products of the UGT1A locus metabolize endogenous molecules such as thyroxine, estrone, and bilirubin. Of the nine UGT1A isoenzymes, UGT1A1 has the greatest bilirubin-conjugating activity, 1 required for elimination of bilirubin. Diminished production or activity of this enzyme leads to the hyperbilirubinemic syndromes described by Crigler–Najjar and Gilbert 5, 6, 7, 8 these syndromes have been associated with several common and rare variants of UGT1A1. 1, 8, 9, 10, 11 Genome-wide scanning of healthy human pedigrees has linked serum bilirubin levels most strongly to the chromosome 2q37 region containing UGT1A. 12 However, bilirubin levels also depend on the rate of production of bilirubin. Hence, the severity of inherited hemolytic syndromes such as glucose 6-phosphate dehydrogenase deficiency and sickle cell anemia may be exacerbated or mitigated by variants of UGT1A and these interactions may have affected the evolutionary history of this gene in different human populations. 13, 14, 15

While the primary selective pressure for UGT1A enzyme function may have been metabolism of endogenous molecules, UGT1A function is necessary for elimination of exogenous compounds such as the anti-cancer drug irinotecan. 16, 17, 18 The same common UGT1A1 variants associated with mild elevations of serum bilirubin are associated with diminished في المختبر glucuronidation of the active irinotecan metabolite, SN-38, 19, 20, 21, 22 and prolonged exposure and increased toxicity in patients receiving this agent. 23, 24, 25 As shown by Sai وآخرون., 25 re-sequencing of the UGT1A1 gene in 85 Japanese patients treated with irinotecan confirmed that the haplotypes containing lower expression variants were associated with both a low SN-38G/SN-38 AUC ratio and elevated pretreatment bilirubin concentration. Importantly, however, additional haplotypes appeared to have distinct modifying effects on the SN-38 AUC ratio and total bilirubin level phenotypes, suggesting that more complete genetic variation data for UGT1A may better predict bilirubin and irinotecan metabolism phenotypes. As common genetic variants of the UGT1A locus may better predict toxicity of irinotecan than conventionally used variables, 26 ongoing clinical trials have been designed to test the safety and efficacy of adjusting doses of irinotecan according to patients’ UGT1A الأنماط الجينية.

For the anti-keloid/anti-allergy agent tranilast, hyperbilirubinemia is a common toxicity. 27 A staged, genome-wide analysis has associated three single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the UGT1A locus with this toxicity. 28 Although it is reasonable to assume that the association between hyperbilirubinemia and these pharmacologic agents is based on genetic variation at UGT1A1, for other metabolic/toxicologic phenotypes of UGT1A, the overlapping tissue distributions and substrate affinities of enzymes encoded by this locus may complicate interpretation of single genotype or single exon–haplotype association studies. As suggested by the results of Sai وآخرون., 25 detailed knowledge of the interindividual genetic variability across this region, especially if focused on the segments most likely to affect expression and activity of these enzymes, could yield a better understanding of the pathopharmacology of new drugs.

The analysis of patterns of human variation is an important prerequisite for designing association studies aimed at assessing the role of genetic variation in drug response phenotypes. Re-sequencing approaches to the study of human variation may provide information to clarify the relative roles of common and rare variants on gene regulation and function. ل UGT1A, a re-sequencing approach is complicated by the size of the region, spanning approximately 200 kb. Many previous studies of the breadth of human diversity of pharmacologically relevant genes have focused on exon re-sequencing and في المختبر assays of protein function. 29, 30 Such studies are likely to identify many functional variants, but may miss functional non-coding sequence variants, 31 as have already proved important for UGT1A1. 8, 11, 32 To focus on the regions of the entire UGT1A locus most likely to affect clinical phenotypes, we identified 29 kb of non-coding sequence highly conserved between humans and four mammalian species and re-sequenced these regions as well as over 8 kb of exon sequence in 72 individuals from three ethnic populations.

Typically, genotype/phenotype association studies of UGT1A have been performed on populations derived predominantly from a single population (e.g. Japanese, European, European-American), but the variants selected for genotyping are often based on allele frequency data generated from a population of greater ethnic diversity than the test group. To provide information useful to the interpretation of published studies and the design of future studies we present (1) a comparative genomics analysis aimed at identifying evolutionary conserved regions most likely to affect UGT1A function, (2) the relationship between the degree of sequence conservation across species and the proportion of polymorphic variants at conserved coding and non-coding sites, (3) the frequency distribution of coding variants as a function of the probability of an effect on enzyme function, and (4) differences in allele frequency and linkage disequilibrium (LD) of newly and previously identified variants in European-Americans, Asians, and African-Americans.


ملخص

Clinical studies show that individuals with elevated bilirubin concentrations, in the absence of liver pathology, are at reduced risk of CKD, CVD, and related mortality. Mildly elevated bilirubin concentrations are consistently associated with reduced vascular resistance (10, 52), improved eGFR (25, 145), renal tubular function, and slowing of the progression of kidney damage (1), in the absence of comorbidities including liver dysfunction and bacterial infection (42, 133, 167). Multiple mechanisms likely explain the protective effect of bilirubin (Fig. 3), including antioxidant and anti-inflammatory effects, suggesting that it could represent a biomarker and potential therapeutic target to reduce CKD/CVD risk (19). Indeed, recent studies have identified numerous molecules that either induce HO activity or partially inhibit UGT1A1, which could be used therapeutically to induce the protective effects of bilirubin in individuals at increased risk of CVD/CKD (81, 105, 184, 199).


شاهد الفيديو: الصفراء - وظائف الكبد -. حسام زغلول. معامل أوتولاب للتحاليل الطبية (قد 2022).


تعليقات:

  1. Inachus

    أتفق تماما مع قال كل ما سبق.

  2. Franco

    آسف لمقاطعتك ، أردت أن أعرب عن رأيي أيضًا.

  3. Burhardt

    لديك مدونة جيدة.

  4. Sadal

    فقط ما هو ضروري.



اكتب رسالة