معلومة

كيف تحسب عدد المرات التي يقطع فيها الإنزيم بلازميد

كيف تحسب عدد المرات التي يقطع فيها الإنزيم بلازميد


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا مرتبك قليلاً فيما يتعلق بكيفية معرفة الصيغة اللازمة لمعرفة ذلك.

لدي بلازميد يبلغ حجمه 7.3 كيلو بايت وقيل لي إنه مقطوع بإنزيم 4 بي بي. لسبب ما اعتقدت أن الصيغة اللازمة لمعرفة ذلك هي:

(1/4) ^ 4 × 7300

لكنه يعطيني رقمًا منخفضًا لدرجة أنني لا أعتقد أنه صحيح ، لذا فأنا مرتبك قليلاً.


هناك قواطع 4 ^ 4 دولارات و 4 دولارات ، مما يعني أنه مع وجود قاطع 4 ، فإنك تتوقع أن تقطع مرة واحدة كل 256 قاعدة في المتوسط. 7300/256 دولارًا = 28.5 دولارًا ، لذلك تتوقع 28 أو 29 موقعًا مقطوعًا في البلازميد. هذا مطابق لما حسبته.


كيف تحسب عدد المرات التي يقطع فيها الإنزيم البلازميد - علم الأحياء

1.أ. تكرار القطع في تسلسل DNA العشوائي لأنزيم تقييد معين هو مرة واحدة لكل 4 n ، حيث n هو عدد القواعد في تسلسل التعرف على إنزيمات التقييد. 4 مشتق من حقيقة أن هناك أربعة نيوكليوتيدات مختلفة يمكن إدخالها في أي موضع واحد (G ، A ، T ، أو C).

سابقة بمعنى البيئة RI و هين يحتوي dIII على موقع التعرف على ستة قواعد ، لذلك سيتم قطعه مرة واحدة لكل 4 6 ، أو 4096 قاعدة.

هين يحتوي dII على موقع تعرف من خمس قواعد ، لذلك سيتم قطعه مرة واحدة لكل 4 5 أو 1024 قاعدة.

يحتوي Hpa II على موقع التعرف على أربع قواعد ، لذلك سيتم قطعه مرة واحدة لكل 4 4 أو 256 قاعدة.

ب. لتحديد عدد المواقع ، قسّم عدد القواعد في الحمض النووي على متوسط ​​طول أجزاء التقييد الناتجة عن الإنزيم المحدد. حجم l هو 48502 زوجًا أساسيًا ، وبالتالي فإن عدد المواقع المتوقعة هو:

2 أ. قطع مع هين سينتج عن dIII أجزاء من 1 و 2 و 2.5 كيلو قاعدة. قطع مع سابقة بمعنى البيئة سوف ينتج RI أجزاء من 1.5 و 2 و 3.5 كيلو قاعدة. قطع مع كليهما هين dIII و Pvu سوف ينتج II أجزاء من 1 و 1.5 و 2 كيلو قاعدة.

ب. سيتألف cDNA في pBR322 فقط من exons اثنين ، يحيط بهما EcoRI في النهايات. عند قطعه بواسطة EcoRI ، سينتج (كدنا) شظايا 0.5 و 1.5 و 2 كيلو بايت. سوف ينتج عن الهضم باستخدام كل من EcoRI و HindIII شظايا 0.5 و 1 و 1.5 كيلو بايت.

ج. المسبار ذو العلامات الإشعاعية 1 كيلو بايت هو من exon الثاني في cDNA. إذا تم تهجينه إلى الحمض النووي الجيني الذي تم هضمه إلى EcoRI ، فسيتم تهجينه إلى جزء 3.5 كيلو بايت.

د. سيكون المسبار الموسوم إشعاعيًا المشتق من النوع البري (كدنا) قادرًا فقط على التهجين إلى قسم الحمض النووي الجينومي الذي يحتوي على أول إكسون. عندما يتم قطع الحمض النووي الجيني باستخدام HindIII ، يبلغ طول هذه القطعة 2.5 كيلو قاعدة.

ه. لأن طول ملف Pvu جزء التقييد الثاني في المتحولة هو نفس الجزء الخاص بالنوع البري ، ولا يبدو أن هناك أي حذف بين الاثنين PvuII المواقع. لذلك ، فإن الطفرة ليست هي نفسها الموجودة في الجزء د. من المحتمل أن تكون الطفرة هنا طفرة نقطية.

ب. يوجد على الأقل intron واحد ، لأن cDNA الموسوم إشعاعيًا لم يتم تهجينه إلى شظايا 1.5 و 0.5 ، ولكنه تم تهجينه إلى الأجزاء المحيطة. قد تتواجد إنترونات أخرى في شظايا 2.5 و 4.5.

ج. هناك طريقتان يمكن استخدامهما في cDNAs المختبرة وهما التمديد التمهيدي وترجمة نيك. يستخدم التمديد التمهيدي التمهيدي قليل النوكليوتيد وجزء Klenow لتجميع خيط DNA المسمى. في ترجمة نيك ، يتم استخدام كمية صغيرة من DNase لإنشاء النكات في الحمض النووي الريبي. ثم تضاف oligonucleotides المسمى مع DNA Polymerase I لملء الفراغات.

4 ا. & quoty endstick & quot الناتج عن الهضم بالأنزيمات هي نفسها ، لكن مواقع التقييد الفعلية مختلفة.

ب. بعد عزل البلازميد ، هضمه بكلا الإنزيمين ، وتنقية الجزء 4.5 كيلو بايت ، وربط الجزء ذاتيًا ، وتحويل البلازميد الجديد إلى بكتيريا.

ج. لن يكون هناك باممرحبًا أو Bglالثاني المواقع.

د. يمكنك قطع كلا الإنزيمين مرة أخرى بعد الربط - وهذا من شأنه أن يضمن أن فقط البلازميد الذي يفتقر إلى كلا الموقعين هو الذي يمكن أن يحول البكتيريا.

5. المشي إلى استنساخ يتداخل مع نهاية النقل أو الحذف (سيظهر هذا الاختلاف في البقع الجنوبية من الكائنات الحية مع وبدون خلل وراثي). استخدم استنساخًا من النوع البري لالتقاط جزء تقاطع في سلالة متحولة. استخدم هذا الجزء لالتقاط نسخة من الطرف الآخر للشذوذ الكروموسومي من مكتبة برية.

6.أ. يتم عرض خريطة التقييد للجزء أدناه:

ب. عزل الرنا المرسال والحمض النووي الجيني من الحيوان. قم بتشغيل mRNA على هلام ونقله إلى بقعة (وهذا ما يسمى النشاف الشمالي). باستخدام التمديد التمهيدي أو ترجمة نيك ، قم بتسمية الحمض النووي الجيني المعزول واستخدمه كمسبار لتهجين البقعة. يجب أن يتهجين المسبار مع mRNA المقابل ، ويجب أن يخبرك موقع المسبار على البقعة بحجم mRNA.

ج. انظر أعلاه ، سيتم تعيين cDNA إلى المناطق المعينة بواسطة | ///////// |

7.a. لعزل الحمض النووي فقط ، استخدم RNase (أو القاعدة). لعزل الحمض النووي الريبي ، استخدم الدناز.

ب. استخدم إنزيم تقييد ، وأعد تشغيل الجل ، وأضف أحجام النطاق إذا كان هناك أكثر من حمض نووي واحد ، فيجب أن تضيف ما يصل إلى النطاق الأصلي.

ج. طريقة واحدة لعزل أ D. melanogaster إن تجانس الجين هو إنشاء مسبار مُسمى من المستنسخ جيم الرجلين الجين وتهجينه إلى مكتبة من D. melanogaster الحمض النووي. طريقة أخرى هي إنشاء بادئات من تسلسلات في جين C. elegans واستخدامها في PCR المتماثل من D. melanogaster الحمض النووي الجيني.

د. تشغيل mRNA على هلام ، ونقل RNA إلى وصمة عار ، ثم تهجين لطخة الشمالية مع مسبار المسمى المتولد من الجين.

ه. دع النسل من النوع البري يتزاوج. إذا أظهرت الطفرة اختراقًا غير كامل ، فيجب أن ينتج عن ذرية النوع البري بعض السلالات المتحولة.

8. يتم استخدام النسخ العكسي لصنع (كدنا) من الرنا المرسال ، ويستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيمه.

9. أ. أنا) بام مرحبا الثاني) هين الثالث والثاني) سابقة بمعنى البيئة RI (الرابع) هين dIII و سابقة بمعنى البيئة ري؟

ب. فقط 4 و 5 كيلو بايت بام سوف يتم تهجين شظايا HI (التي تحتوي على exons) على البقع الشمالية (إلى 6 كيلو بايت مرنا) وسيتم العثور على هذا فقط في ممر الكبد.

ج. سيتم العثور على نطاق 2 كيلو بايت و 3 كيلو بايت فقط على البقعة الناتجة عن المناطق الهجينة DNA / RNA التي لم يتم هضمها بواسطة نوكلياز S1 ، مما يؤدي إلى تدهور الأحماض النووية أحادية السلسلة.

د. عن طريق التخلص من 6 كيلو بايت الأولي هينdIII ، تم حذف العناصر التنظيمية اللازمة للنسخ.

10. خطأ ، العكس هو الصحيح.

11. تحتوي YACs (كروموسومات الخميرة الاصطناعية) على عناصر ARS الخميرة (للنسخ المتماثل) ، وشرائح التيلومير ، وعناصر CEN (شرائح السنترومير) التي يمكن أن تحتوي على عدة مئات من كيلو بايت من الحمض النووي. الكوسميدات هي بلازميدات معدلة لها نهايات متماسكة من فج لامدا وتسلسلات بلازميد (للتكرار واختيار الدواء) يمكن أن تحتوي على 20-40 كيلو بايت من الحمض النووي.


تعريف نفسك بالبلازميد المثير للاهتمام

لنبدأ بالبلازميد الكلاسيكي: pBR322 1. غالبًا ما يتم استخدامه كعمود فقري للناقلات المشتقة لأنه يحتوي على جميع الميزات اللازمة لاستنساخ ناجح (الشكل 1). كما ترى من مركز الخريطة ، فإن حجم البلازميد الخطي هو 4361 زوجًا أساسيًا. قبل البدء في العمل مع أي بلازميد ، يُنصح بتجسيده خطيًا عن طريق القطع باستخدام إنزيم تقييد فريد للتحقق من أن الحجم المعلن عنه هو نفسه تقريبًا كما هو متوقع.

تُظهر الأسهم السوداء اتجاه النسخ ، وهو أمر ضروري للاستنساخ. إذا قمت باستنساخ الجين الذي تريده في منتصف جين آخر ، فتأكد من نسخ كلاهما في نفس الاتجاه. خلاف ذلك ، يمكن أن يتداخل المروج الأصلي مع التعبير الجيني الخاص بك.


1. لماذا كان من المهم العثور على إنزيم يقطع البلازميد في موقع واحد فقط؟ ماذا يمكن أن يحدث إذا تم قطع البلازميد في أكثر من موقع؟ تريد ببساطة فتح الحمض النووي الدائري بحيث يمكن إدخال الحمض النووي البشري في الدائرة. إذا قطعت الإنزيمات في أماكن متعددة ، فستحصل على شظايا متعددة.

2. ما هو إنزيم التقييد الذي استخدمته؟ __ هناك عدة ممكنة __ اسأل المجموعات الأخرى عما استخدموه وقارن بين البلازميدات المعدلة وراثيًا النهائية. لماذا قد يكون هناك بعض الأطوال المختلفة؟ يعتمد ذلك على المكان الذي يقطع فيه الإنزيم الحمض النووي البشري ، فقد يكون قد صنع جزءًا أطول

3. لماذا كان من المهم التخلص من أي إنزيمات تقطع البلازميد في موقع التكاثر؟ إذا كنت تريد نسخ الحمض النووي الخاص بك ، فأنت بحاجة إلى البكتيريا لتكون قادرة على التكاثر ، فإن موقع التكاثر ضروري

4. لماذا من المهم قطع البلازميد والحمض النووي البشري بنفس إنزيم التقييد؟ يجب أن تتطابق النهايات بحيث يمكنك لصقها معًا

5. هل توجد إنزيمات التقييد بشكل طبيعي في الكائنات الحية؟ إذا كان الأمر كذلك ، فما هو الغرض منها؟ يهاجمون ويدمرون الغزاة ، مثل الفيروسات

6. لماذا لا تكون إنزيمات التقييد التي خلقت & quotblunt & quot النهايات مفيدة في إعادة التركيب مثل تلك التي تخلق نهايات لزجة؟ لن تلتصق النهايات الحادة بالحمض النووي الآخر

7. في النشاط ، قمت بمحاكاة تكوين كائن بكتيري مؤتلف. لكل من المواد التالية ، حدد ما تمثله؟
مقص ______ إنزيم تقييد _ ___
شريط ______ ligase _________


الاستخدامات التقليدية لاستنساخ الحمض النووي

لاستنساخ الحمض النووي التقليدي باستخدام نوكليازات داخلية مقيدة استخدامات متعددة. الحمض النووي المؤتلف المعبر عنه (تسلسل الحمض النووي الذي يرمز إلى تخليق البروتين) ، عند إدخاله في المعلومات الجينية للبكتيريا ، يحفز البكتيريا على إنتاج البروتين المستهدف.

هذه هي الطريقة التي يقوم من خلالها مهندسو الوراثة في شركات الأدوية بتصنيع الأنسولين البشري والألبومين البشري وبعض اللقاحات والأجسام المضادة وحيدة النسيلة وهرمون النمو البشري بتكلفة أقل بكثير من تكلفة استخراج هذه المنتجات من الكائنات متعددة الخلايا. يستخدم الحمض النووي المؤتلف أيضًا لتشخيص الأمراض الوراثية وإنتاج المضادات الحيوية على نطاق واسع.

يعد تحليل الجينات قطاعًا واسعًا يقوم فيه المهندسون الوراثيون بإدخال تسلسل الحمض النووي المؤتلف المشقوق (rDNA) لمساعدتنا على فهم ما تفعله جينات معينة. من خلال فهم الجينات ، لدينا البيانات التي نحتاجها لإجراء تعديلات يمكنها القضاء على المرض.

المحاصيل المعدلة وراثيا هي نتيجة لتقنيات الاستنساخ الجزيئي التقليدية حيث تكون مقاومة الحشرات ومبيدات الأعشاب والمزيد من المنتجات لكل هكتار هي الأهداف الرئيسية. تعمل هذه الطريقة أيضًا على تحسين تثبيت النيتروجين في النباتات والمحاصيل.

تستخدم صناعة المطاعم الحمض النووي المؤتلف في عمليات التخمير وصنع الجبن ، وكذلك للكشف عن وجود البكتيريا المسببة للأمراض والفطريات على الأسطح المستخدمة في تحضير الطعام.

ومع ذلك ، لتحقيق نتائج قد تحسن من صحتنا أو مصادرنا الغذائية ، فإن معرفتنا بوظيفة كل جين أمر ضروري. بمجرد اكتشاف وظيفة تسلسل الحمض النووي ، يمكن استخدامها بشكل صحيح. كان استنساخ الحمض النووي التقليدي هو أول تقنية مستخدمة في مجال رسم خرائط الجينوم والتي علمتنا ، على مدى سنوات عديدة ، كيف يتم التعبير عن الجينات. مع وجود إنزيمات تقييد اصطناعية جديدة ، لا يمكن توقع تقدم الهندسة الوراثية إلا خلال العقود القليلة القادمة.


إعادة النظر

المصطلحات والمفاهيم

  • خطي
  • علامة الوزن الجزيئي
  • انزيم التقييد
  • موقع التقييد
  • ملفوف للغاية مقابل الحمض النووي الخطي

راجع الأسئلة

  1. لماذا يهم إذا كان الحمض النووي الموجود في مادة هلامية ملفوفًا بشكل فائق؟
  2. لماذا من المهم إضافة الإنزيم أخيرًا عند إعداد هضم التقييد؟
  3. في الاختبار ، كن مستعدًا لحساب كميات جميع المكونات في ملخص التقييد ، كما هو موضح في هذه الصفحة.

التسلسل¶

يشرح هذا القسم كيفية تكوين المتجه وإدخال الحمض النووي بشكل عام.

إجراء¶

يستغرق هذا أربعة أيام على الأقل لاستخراج DNA البلازميد المربوط.

تحضير العينات (عدة ساعات)

ارى تضخيم PCR قسم لمزيد من التفاصيل. بعد التضخيم ، يجب عليك تنقية الحمض النووي للمنتج نظرًا لوجود بوليميراز / نوكلياز داخلي وقد يؤثر هذا البروتين على خطوات المصب.

إذا كنت ترغب في استخدام الحمض النووي المستخرج من البلازميد ، فتأكد من أن تركيز العينة كافٍ.

تقدير تركيز العينة (ساعة واحدة)

استخدم الصيغة التالية لحساب الكتلة المطلوبة لعملية الهضم

رسالة النظام: ERROR / 3 (/home/docs/sites/readthedocs.org/checkouts/readthedocs.org/user_builds/molecular-biology-protocols/checkouts/latest/DNA.rst، السطر 562)

أمر LaTeX غير معروف: النقاط

هضم الكتلة المناسبة لعينة الحمض النووي. اضبط حجم محلول الهضم باستخدام | ddH2O | . ارى هضم التقييد قسم لمزيد من التفاصيل. افترض القسم نفس شرط هذا الإجراء.

بعد هضمها ، تترسب إلى 10 | ul | بواسطة ترسيب الإيثانول

ارى ربط الحمض النووي قسم لمزيد من التفاصيل. افترض القسم نفس شرط هذا الإجراء.

تحويل (بين عشية وضحاها)

ارى بروتوكولات لـ | الإشريكية القولونية | بروتوكولات لمزيد من التفاصيل. احتضان عند 37 | C | بين عشية وضحاها

ارى بروتوكولات لـ | الإشريكية القولونية | بروتوكولات لمزيد من التفاصيل. في معظم الأوقات ، يكفي اختيار 5 مستعمرات لكل عينة (يعتمد على صعوبة الربط)

عزل مستعمرة واحدة (بين عشية وضحاها)

نقل مستعمرة معزولة إلى متوسطة (بين عشية وضحاها)

لاستخراج DNA البلازميد ، اختر مستعمرة وخففها إلى 2 | مل | SOC واحتضانها عند 37 | C | بين عشية وضحاها


طريقة الاستنساخ القائمة على إنزيم التقييد

يعتمد الاستنساخ المستند إلى إنزيم التقييد على شيئين: أولاً ، يعتمد على قدرة إنزيمات التقييد على "قطع" شظايا الحمض النووي ، أي الجزء والناقل. ثانيًا ، يتطلب الاستنساخ المستند إلى إنزيم التقييد إنزيم DNA ligase "لصق" جزء الحمض النووي في الناقل. تعتبر هذه الطريقة أرخص نسبيًا عند مقارنتها بطرق الاستنساخ الأخرى.

استنساخ الحمض النووي المستند إلى إنزيم التقييد. 1. يتم إضافة التسلسلات القصيرة التي تحتوي على مواقع تقييد إلى نهايات 5 'من البادئات أثناء تضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). 2. يتم هضم كل من الناقل وجزء الحمض النووي بواسطة إنزيمات تقييدية لإنشاء نهايات متماسكة. 3. يتم ربط المتجه وجزء الحمض النووي. 4. يدخل الحمض النووي المؤتلف الخلية المضيفة أثناء التحول.


تحليل معمل pGLO

البلازميدات عبارة عن قطع من الحمض النووي الدائرية الموجودة في البكتيريا والتي يمكنها ترميز الجينات التي يمكن أن تسبب للبكتيريا "ميزات" إضافية. مع بلازميد pGLO ، تتسبب هذه "الميزة" الإضافية في توهج البكتيريا (من البروتين الأخضر الفلوري الذي تم إدخاله) ولديها أيضًا مقاومة للأمبيسيلين (من بروتين بيتا لاكتاماز). بإضافة بلازميد pGLO ، ستتمكن بكتيريا الإشريكية القولونية من النمو على أجار مع سكر الأرابينوز والأمبيسلين. السبب الرئيسي لعمل هذا المختبر هو فهم أفضل لكيفية سيطرة الجينات على السمات ، وأفضل طريقة للقيام بذلك هي عن طريق إجراء الطفرات. هناك عدة طرق مختلفة لتشكيل الطفرات وفي هذا المختبر يتم ذلك عن طريق إضافة ينقولات إلى بلازميد pGLO ثم النظر في كيفية تأثير الينقولات على مظهر البكتيريا وتنموها. من خلال النظر في كيفية نمو البكتيريا ومظهرها ، يمكننا تحديد مكان إدخال الينقولات ، وهذا يساعدنا على فهم أفضل لكيفية سيطرة الجينات على السمات. في العينة التي عملنا بها مع البكتيريا المُطفرة لم تتوهج باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية الذي يخبرنا أن الينقولات المُدخلة في جين araC ، وتم تأكيدها في هلام الرحلان الكهربائي.

تمت دراسة البلازميدات في الأبحاث الجينية منذ أن اكتشفها جوشوا ليدربيرج عام 1952. لقد تم استخدامها لمعرفة كيفية تفاعل بكتيريا معينة مع أنواع مختلفة من المضادات الحيوية ولتغيير كيفية عمل البكتيريا عن طريق إضافة أشياء إلى البلازميدات. في هذا المعمل ، كان البلازميد الذي ركزنا عليه هو بلازميد pGLO. يحتوي هذا البلازميد على ثلاث مناطق تشفير رئيسية سننظر فيها. المنطقة الجينية الأولى هي المنطقة التي تشفر إنزيم بيتا لاكتاماز (bla). يتم إنتاج بروتين بيتا لاكتاماز وإفرازه بواسطة البكتيريا التي تحتوي على البلازميد. يعمل بيتا لاكتاماز على تثبيط نشاط الأمبيسلين الموجود في أجار المغذيات LB ، مما يسمح بنمو البكتيريا. يمكن فقط للبكتيريا المحولة التي تحتوي على البلازميد وبيتا لاكتاماز السريع أن تعيش على الألواح التي تحتوي على الأمبيسلين. " (ليثرمان 2011). البروتين الفلوري الأخضر (GFP) هو رمز جيني يتم إدخاله في بلازميد pGLO ليجعله يتوهج باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بمساعدة جين araC. يقوم جين araC بتشفير البروتين الذي يرتبط بالأرابينوز والمنطقة المحفزة أيضًا في وجود الأرابينوز ، عندما يرتبط بالمنطقة المحفزة لجين GFP فإنه يترجم البروتين الذي سيجعل البكتيريا تتوهج باللون الأخضر.

لا تحدث الطفرات كثيرًا في الطبيعة ولكن يمكن استخدامها بانتظام في مختبرات الوراثة للمساعدة في دراسة الوظائف المختلفة للبكتيريا والبلازميدات. من خلال إجراء الطفرات على البكتيريا ، يمكننا أن نفهم بشكل أفضل كيف تقوم البكتيريا بترجمة الجينات وكيف تتفاعل مع بيئتها عندما يتغير شيء ما. هناك طريقتان لتشكيل الطفرات مثل استخدام المواد الكيميائية أو الأشعة السينية. في هذه التجربة ، يتم إجراء الطفرات عن طريق إدخال ينقولات في بلازميد pGLO. سيتم إدخال الينقولات Tn5 في جين pGLO الذي يشفر Tn5 transposon لبروتين يؤدي إلى مقاومة الكاناميسين ، مما سيساعدنا في معرفة ما إذا كان الينقولات قد تم إدخالها بشكل صحيح.

بعد إدخال الينقولات في بلازميد pGLO ، ستمتصه بكتيريا الإشريكية القولونية من خلال التحول. يحدث التحول عندما تأخذ البكتيريا الحمض النووي المجاني من محيطها. بمجرد أخذ البلازميدات في البكتيريا نمت على أغار مغذية مع مجموعات مختلفة من الأمبيسيلين والكاناميسين والأرابينوز جنبًا إلى جنب مع مجموعات التحكم لمعرفة كيف تأثرت البكتيريا الطافرة بالنقولات.

تستخدم البكتيريا إنزيمات تقييدية من تلقاء نفسها للتخلص من العاثيات إما عن طريق قطع البروتينات التي تصنعها أو عن طريق قطع العاثية مباشرة (Aude). نحن قادرون على استخدام هذه الإنزيمات المقيدة للقيام بهضم إنزيم التقييد لقطع البلازميدات التي تم إدخالها في البكتيريا. تُستخدم إنزيمات التقييد بشكل شائع لقطع الحمض النووي في تسلسلات نيوكليوتيد معينة. غالبًا ما يكون هذا لصنع "قطعة جديدة من الحمض النووي المؤتلف ، ويتبعها ربط قطعتين معًا." (ليثرمان 2011). تم قطع البلازميدات في مواقع معروفة من البلازميد باستخدام إنزيمات Nde 1 و EcoR1. بمعرفة كمية أزواج القاعدة الموجودة في البلازميد (5400 نقطة أساس) ومكان قطع إنزيمات التقييد ، يمكننا فحص القطع المختلفة من البلازميد المقطوع لمعرفة مكان إدخال الينقولات.

استخدم مجموعة أدوات الإدراج Tn5 لإدخال ترانسبوسون Tn5 في بلازميد pGLO. كانت الخطوة الأولى هي خلط 6.4 ميكرولتر من الماء ، و 1 ميكرولتر من محلول تفاعل EZ Tn5 10X ، و 1 ميكرولتر من 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر من pGLO بلازميد ، و 0.6 ميكرولتر من Tn5 transposon ، و 1 ميكرولتر من EZ-Tn5 transposase (يساعد على إدخال ترانسبوسون. ) بهذا الترتيب وتخلط بالدوامة ، ثم أجهزة الطرد المركزي. احضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ، ثم أخرج الأنبوب ودور مرة أخرى وأعد الأنبوب إلى الحاضنة لمدة 50 دقيقة أخرى. أدر مرة أخرى وأضف 1 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى الأنبوب واخلطه جيدًا ودور السائل في قاع الأنبوب مرة أخرى. أنبوب تسخين إلى 70 درجة لمدة 10 دقائق يخزن في الفريزر للمرة القادمة.

نقل 1.5 مل من بكتريا قولونية إلى ثلاثة أنابيب microcentrifudge ووضعها على الجليد لمدة 10 دقائق. أنابيب الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة والتخلص من جميع المواد الطافية. أضف 300 ميكرولتر من CaCl المثلج2 لجميع الأنابيب الثلاثة ، قم بحل الحبيبات تمامًا عن طريق الماصات ووضع الأنابيب على الجليد لمدة دقيقتين. أنابيب الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة وتجاهل المادة طافية. أضف 60 ميكرولتر من CaCL2 على كل أنبوب مرة أخرى وإعادة تعليق الحبيبات برفق ووضعها على الجليد لمدة 10 دقائق. قم بتسمية الأنابيب الثلاثة ، بدون DNA ، و pGLO wt ، و pGLO mutant. لا تضف شيئًا ، 1 ميكروليتر من pGLO DNA ، و 1 ميكروليتر من تفاعل pGLO للطفرات Tn5 لكل أنبوب على التوالي. اخلطي الأنابيب بلطف عن طريق النقر عليها وضعيها على الثلج لمدة 15 دقيقة. قم بصدم الأنابيب بالحرارة عند 42 درجة لمدة 90 ثانية بالضبط ثم العودة إلى الجليد على الفور لمدة دقيقتين. أضف 1 مل من مرق LB إلى الأنابيب ثم انقل محتويات كل أنبوب إلى أنبوب اختبار واحتضان عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة مع الرج. احصل على 5 لوحات أجار مختلفة وقم بتسميتها كما هو موضح في الجدول 1 وقم بتسميتها. نقل البكتيريا إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة وقم بتدويرها لمدة دقيقة واحدة وإزالة 500 ميكرولتر من المادة الطافية ، وإعادة تعليق البكتيريا في المرق. أضف 200 ميكرولتر من كل تفاعل إلى أطباق أجار الخاصة بها وانشر البكتيريا على ألواح أجار. احضن الأطباق عند 37 درجة في غرفة التحضير ليوم واحد.

الجدول 1. أضاف الحمض النووي إلى اللوحات والتنبؤات المختلفة.

تحضير اثنين من أنابيب الثقافة المعقمة مع 5 مل من مرق LB ، واحد مع الأمبيسيلين والآخر مع كاناميسين ، والذي هو التسمية. افحص اللوحات واختر مستعمرة من النوع البري وضع المستعمرة في مرق LB باستخدام الأمبيسلين. انظر إلى اللوحة التي تحتوي على متحولة pGLO وانظر لترى ما إذا كانت أي من المستعمرات تتوهج باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المستعمرة التي تم اختيارها لهذه التجربة كانت بيضاء. خذ مستعمرة وضع في مرق LB مع كاناميسين. ضع الأنابيب في الحاضنة عند 37 درجة واحتضانها طوال الليل. انظر إلى كل اللوحات وقارن النتائج مع توقعاتك. الحصول على الثقافات من الحاضنة ونقلها إلى أنبوب 15 مل إلى أجهزة الطرد المركزي. تدور في أجهزة الطرد المركزي المبردة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة الطافية. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت P1 (يزيل الحمض النووي الريبي) لكل حبة بكتيرية وأعد تعليق الحبيبات ، ثم انقلها على الفور إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف 250 ميكرولتر من محلول P2 (تحلل الخلايا) واخلطه بقلبه لمدة لا تزيد عن 5 دقائق. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت N3 (درجة الحموضة مثالية لربط العمود) واخلطه على الفور عن طريق قلب الأنبوب. تدور لمدة 10 دقائق حتى تتشكل حبيبة بيضاء. طاف الماصة في أعمدة تدور منفصلة وتدور لمدة 30 ثانية ثم تجاهل التدفق خلال. أضف 750 ميكرولتر من محلول البولي إيثيلين (يغسل الحمض النووي) إلى العمود وتدور لمدة 30 ثانية وتجاهل التدفق. ضع العمود في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد 1.5 مل أضف 50 ميكرولتر من الماء (شطف الحمض النووي) لتدوير العمود واتركه يقف لمدة دقيقة واحدة. تدور لمدة دقيقة واحدة ثم تخلص من عمود الدوران وحافظ على التدفق من خلاله. قم بقياس تركيزات عينتي الحمض النووي ، ثم ضعها في المجمد للأسبوع القادم. كان تركيز الحمض النووي من النوع البري 68.2 جرام / ميكروليتر بنقاوة 1.84 وكان تركيز الحمض النووي المتحور 81.9 جرام / ميكروليتر بنقاوة 1.64 والتي لم تكن نقية.

استخدم خريطة التقييد لتحديد عدد العصابات في البلازميدات البرية المقطوعة في أماكن مختلفة.

الجدول 2. أحجام حزم البلازميدات من النوع البري مع قطع مختلفة.

امزج كل محلول بناءً على ما يحتاجه كل أنبوب. استخدم تركيز الحمض النووي لتحديد كمية الحمض النووي التي يجب إضافتها إلى كل أنبوب (500 / تركيز = مقدار الحمض النووي المطلوب).

الوزن المقطوع غير مقطوع متحولة Nde1 بالوزن Nde1 متحولة EcoR1 بالوزن EcoR1 متحولة وزن Nde1 + EcoR1 Nde1 + EcoR1 متحولة
ماء 12.67 13.9 10.17 11.4 10.17 11.4 10.12 11.4
10X عازلة لا أحد لا أحد 2Buffer 4 2Buffer 4 2 عازلة EcoR1 2 عازلة EcoR1 2 عازلة EcoR1 2 عازلة EcoR1
الحمض النووي: 5 ميليغرام 7.33 6.1 7.33 6.1 7.33 6.1 7.33 6.1
إنزيم Nde1 (20 وحدة / ميكروليتر) لا أحد لا أحد .5 .5 لا أحد لا أحد .5 .5
إنزيم EcoR1 (20 وحدة / ميكروليتر) لا أحد لا أحد لا أحد لا أحد .5 .5 .5 .5

الجدول 3. مخاليط من كل أنبوب. (الكل في ميكرولتر)

ضع الأنابيب الثمانية في الحاضنة عند 37 درجة لمدة 1.5 ساعة حتى يستمر التفاعل ، بمجرد 1.5 ساعة ، ضع الأنابيب في المجمد للمرة القادمة.

قم بتخفيف المخزن المؤقت 50X إلى المخزن المؤقت 1X أضف 20 ملي لترًا من المخزن المؤقت 1X TAE في أسطوانة مدرجة ثم أضف 980 ملي لترًا من الماء إلى الأسطوانة. جعل 1.2٪ هلام agarose يزن 0.6 جرام من مسحوق agarose ويفرغ في قارورة ، ثم خذ 50 مل من 50X TAE العازلة وأضفه إلى القارورة. امزج الاغاروز والعازل ثم ضعه في الميكروويف لمدة دقيقة أو حتى يصبح المحلول صافياً. دع القارورة تبرد حتى يمكنك لمسها دون حرق نفسك. ضع الدرج في صندوق الجري بحيث يكون كلا الجانبين لأعلى والمشط في مكانه واسكب محلول الاغاروز في الدرج. دع الاغاروز يجلس حتى يصبح لونه أبيض حليبي ويتصلب. أثناء الانتظار ، قم بتحميل 2 ميكرولتر من 10 × صبغة تحميل لكل أنبوب واخلطه عن طريق الماصة. اخفض جوانب الدرج ثم املأ صندوق التشغيل بمخزن TAE حتى يغطي الجزء العلوي من الجل. قم بتحميل سلم 1 كيلو بايت في أقصى الطرف الأيسر بـ 10 لترات ميكروية من سلم 1 كيلو بايت. خذ تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل من الأسبوع السابق واملأ الفراغات الثمانية التالية في الجل بـ 20 ميكرو لترًا من تفاعلات هضم التقييد بالترتيب. بعد تحميل الجل ، قم بتشغيل الجل لمدة 45 دقيقة تقريبًا عند 100 فولت ، تحقق بشكل دوري لمعرفة ما إذا كانت الأصباغ تتحرك أسفل الجل. بمجرد أن تقترب الصبغة من منتصف الطريق لأسفل الهلام ، أخرجه من صندوق التشغيل وضع الجل في صندوق تلطيخ. صب SYBR الأخضر في مربع التلوين حتى يغطي SYBR الأخضر الجزء العلوي من الجل ، قم بتدوير الصندوق كل 5 دقائق. يرتبط SYBR الأخضر بالحمض النووي ويسمح لنا بإلقاء نظرة على الحمض النووي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. بعد 15 دقيقة ، أخرج الجل من العلبة واسكب SYBR الأخضر مرة أخرى في الزجاجة. خذ الجل وضعه في صندوق للأشعة فوق البنفسجية والتقط صورة للجيل الخاص بك لترى نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بك.

عندما تم فحص البكتيريا لأول مرة ، لم تتوهج البكتيريا المطفرة باللون الأخضر عند وضعها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية مما يعني أن الينقولات يمكن أن تدخل نفسها إما في جين araC أو في جين GFP.

الجدول 4. نتائج لوحات أجار.

عند خلط إنزيمات التقييد ، تم الخلط بين إنزيم التقييد كمخزن مؤقت عند إضافته إلى الأنابيب الطافرة التي تؤدي إلى أن تكون الأنابيب الطافرة غير قابلة للقراءة على الجل.

الشكل 2. الصف 1 هو سلم 1 كيلو بايت. 2 بلازميد من النوع البري غير المقطوع. 3 قطع البرية من نوع nde. 4 قطع بيئية من النوع البري. 5 قطع من النوع البري eco / nde. 6 متحولة غير مقطوعة. 7 قطع nde متحولة. 8 قطع صديقة للبيئة متحولة. 9 eco / nde قطع متحولة

من هذا الهلام يمكننا أن نرى أن القطع البرية غير المقطوعة و EcoR1 هي نفسها وهو ما كان متوقعًا. هناك أربعة نطاقات على النوع البري EcoR1 / Nde1 مقطوعة في مناطق 300 و 500 وفي مناطق 1000 و 2000. وثلاثة نطاقات على Nde1 تقطع في مناطق 300 و 1000 و 2000. لذلك كانت جميع العينات من النوع البري في المكان الذي كان من المتوقع أن تكون فيه. لسوء الحظ ، لا يمكن قراءة العينات الطافرة.

الشكل 3. الصف 1 هو سلم 1 كيلو بايت. 2 بلازميد من النوع البري غير المقطوع. 3 قطع البرية من نوع nde. 4 قطع بيئية من النوع البري. 5 قطع من النوع البري eco / nde. 6 متحولة غير مقطوعة. 7 قطع nde متحولة. 8 قطع صديقة للبيئة متحولة. 9 eco / nde قطع متحولة.

في هذا الشكل ، يمكنك أن ترى أنه في الصف 6 لم ينتقل بقدر ما هو من النوع البري غير المقطوع في الصف 2 الذي يخبرنا أن الينقولات موجودة في العينة. بالنظر إلى الصفين 7 و 9 ، يوجد شريط مفقود عند حوالي 1800 زوج أساسي كما هو الحال في الصفين 3 و 5. هذا هو المكان الذي يتم فيه إدخال الينقولات نفسها في جين araC الموجود في أحد قطع Nde1 التي تبلغ حوالي 1800 قاعدة. -أزواج. في الهلام ، تؤدي إضافة الينقولات إلى هذه المنطقة إلى بقاء شريط 1،800 مرة أخرى حيث يوجد 2800 شريط زوج أساسي ويجعله يبدو وكأنه شريط واحد فقط على الجل.

تم العثور على الينقولات في جين araC لبلازميد pGLO من نتائج الهلام. مع وجود الينقولات في جين araC ، فإنه لا يصنع البروتين الذي يرتبط بالمنطقة المحفزة لجين GFP مما أدى إلى عدم توهج البكتيريا المطفرة باللون الأخضر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قد يفسر إدخال الينقولات في جين araC أيضًا سبب قلة النمو المتحور على الصفيحة التي وُضعت عليها البكتيريا الطافرة. كانت مشكلة الجل الأصلي هي إضافة المزيد من الإنزيم إلى الأنابيب مما جعل العينات المتحولة غير قابلة للقراءة على الجل.

Aude A Bourniquel، Thomas A Bickle ، إنزيمات تقييد معقدة: محركات جزيئية مدفوعة بـ NTP ، Biochimie ، المجلد 84 ، الإصدار 11 ، 1 نوفمبر 2002 ، الصفحات 1047-1059 ، ISSN 0300-9084 ، 10.1016 / S0300-9084 (02) 00020- 2.

دليل مختبر علم الوراثة Leatherman J. 2011. جامعة شمال كولورادو


كيف تحسب الوزن الجزيئي للحمض النووي؟

إذا كان لديك جزيء كبير من الحمض النووي ، فمن المحتمل أن تقوم بتقطيعه إلى أجزاء أصغر باستخدام ما يسمى بإنزيم تقييد الحمض النووي.

الخطوة 2. هلام الكهربائي

ثم ستضع عينات معدة بشكل صحيح من محلول الحمض النووي في آبار نظام الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز وتطبق جهدًا كهربائيًا لفترة زمنية محددة.

في أحد الآبار ، يمكنك أيضًا وضع "سلم الحمض النووي": عينة تحتوي على أجزاء من الحمض النووي مع أرقام معروفة من أزواج القواعد.


(من www.slideshare.net)

قد يبدو الجل النهائي كما يلي:

الممرات الموجودة على كل طرف هي السلالم. تتناسب المسافات المقطوعة مع الكتلة المولية للشظايا.

الخطوه 3. احسب عدد أزواج القاعدة في شظاياك

قم بإنشاء منحنى قياسي من سلالمك عن طريق رسم السجل (أزواج القاعدة) (bp) مقابل المسافة المقطوعة (د).

ستحصل على رسم بياني مثل هذا:

إذا انتقلت إحدى شظاياك بمقدار 1.80 سم ، فستكون قد حسبت

#log ("bp") = "-0.4637 × 1.80 + 4.3366" = 3.501 #

الخطوة 4. احسب الكتلة المولية للجزء.

متوسط ​​كتلة زوج الأساس هو 650 ش.

ومن ثم ، فإن كتلة الشظية هي

# 3176 لون (أحمر) (إلغاء (اللون (أسود) ("bp"))) × "650 u" / (1 لون (أحمر) (إلغاء (اللون (أسود) ("bp"))) = 2.06 × 10 ^ 6 لون (أبيض) (ل) "u" #


شاهد الفيديو: ماهوالبلازميد شرح plasmid (يونيو 2022).