معلومة

15.2: طرق قياس التعبير الجيني - علم الأحياء

15.2: طرق قياس التعبير الجيني - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

الطريقة الأكثر بديهية للتحقيق في نمط ظاهري معين هي قياس مستويات التعبير عن البروتينات الوظيفية الموجودة في وقت معين في الخلية. في هذا الفصل ، سننظر في تقنيتين لتوليد بيانات التعبير الجيني: المصفوفات الدقيقة و RNA-seq.

المصفوفات الدقيقة

تسمح المصفوفات الدقيقة بتحليل مستويات التعبير لآلاف الجينات المحددة مسبقًا في تجربة واحدة. المبدأ الأساسي وراء المصفوفات الدقيقة هو تهجين أجزاء الحمض النووي التكميلية. للبدء ، يتم ربط أجزاء قصيرة من الحمض النووي ، والمعروفة باسم المسابير ، بسطح صلب ، والمعروف باسم رقاقة الجينات. بعد ذلك ، يتم نسخ مجموعة RNA ذات الأهمية ، والتي تم أخذها من خلية ، إلى cDNA (DNA التكميلي) عبر النسخ العكسي ، الذي يصنع الحمض النووي من RNA باستخدام ذيل poly-A كأساس. بالنسبة للتتابعات الجينية التي لا تحتوي على ذيل بولي-أ ، يمكن ربط مادة أولية قياسية بنهايات الرنا المرسال. يكون للحمض النووي الناتج مزيدًا من التكامل مع الحمض النووي الموجود على الشريحة أكثر من الحمض النووي الريبي. يتم غسل (كدنا) فوق الشريحة ويؤدي التهجين الناتج إلى تحفيز المجسات إلى التألق. يمكن اكتشاف ذلك لتحديد الوفرة النسبية للـ mRNA في الهدف ، كما هو موضح في الشكل 15.2.

يتم استخدام نوعين أساسيين من المصفوفات الدقيقة حاليًا. رقائق الجينات Affymetrix لها بقعة واحدة لكل جين ولها تحقيقات أطول بترتيب 100 ثانية من النيوكليوتيدات. من ناحية أخرى ، فإن صفائف قليل النوكليوتيد المرقط تحتوي على جينات البلاط ولها مجسات أقصر حول عشرات القواعد.

هناك العديد من مصادر الخطأ في الأساليب الحالية والطرق المستقبلية تسعى لإزالة الخطوات في العملية. على سبيل المثال ، قد يؤدي النسخ العكسي إلى عدم التطابق ، مما يضعف التفاعل مع المسبار الصحيح أو يتسبب في التهجين المتقاطع أو الارتباط بمجسات متعددة. كان أحد الحلول لهذا هو استخدام مجسات متعددة لكل جين ، حيث سيكون التهجين المتقاطع مختلفًا لكل جين. ومع ذلك ، فإن النسخ العكسي ضروري بسبب البنية الثانوية للحمض النووي الريبي. يجعل الاستقرار الهيكلي للحمض النووي من غير المرجح الانحناء وعدم التهجين مع المسبار. يقوم الجيل التالي من التقنيات ، مثل RNA-Seq ، بتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) عندما يخرج من الخلية ، ويسبر أساسًا كل قاعدة من الجينوم.

تسلسل الحمض النووي الريبي

يحاول RNA-Seq ، المعروف أيضًا باسم تسلسل بندقية النسخ بالكامل ، أداء نفس الوظيفة التي تم استخدام مصفوفات الحمض النووي الدقيقة لأدائها في الماضي ، ولكن بدقة أكبر. على وجه الخصوص ، تستخدم المصفوفات الدقيقة للحمض النووي مجسات محددة ، ويعتمد إنشاء هذه المجسات بالضرورة على المعرفة المسبقة بالجينوم وحجم الصفيف الذي يتم إنتاجه. يزيل RNA-seq هذه القيود ببساطة عن طريق تسلسل جميع cDNA المنتجة في تجارب ميكروأري. أصبح هذا ممكنًا بفضل تقنية التسلسل من الجيل التالي. تم تبني هذه التقنية بسرعة في دراسات أمراض مثل السرطان [4]. ثم يتم تحليل البيانات من RNA-seq عن طريق التجميع بنفس الطريقة التي يتم بها تحليل البيانات من المصفوفات الدقيقة عادةً.

مصفوفات التعبير الجيني

كثيرا ما تستخدم المصفوفات الدقيقة و RNA-seq لمقارنة ملامح التعبير الجيني للخلايا في ظل ظروف مختلفة. كمية البيانات الناتجة عن هذه التجارب هائلة. يمكن للمصفوفات الدقيقة تحليل آلاف الجينات ، ويمكن لـ RNA-seq ، من حيث المبدأ ، تحليل كل جين يتم التعبير عنه بنشاط. يتم قياس مستوى التعبير لكل من هذه الجينات عبر مجموعة متنوعة من الظروف ، بما في ذلك الدورات الزمنية ومراحل التطور والأنماط الظاهرية والصحي مقابل المريض وعوامل أخرى.

لفهم ما تنقله الخريطة الحرارية لمصفوفة التعبير الجيني (الشكل 15.4) ، علينا أولاً أن نفهم ما تخبرنا به مصفوفة بيانات التعبير. باستخدام المصفوفات الدقيقة و RNA-seq ، يمكننا الحصول على مستوى التعبير الجيني في شكل كمي في التجربة. إذا كانت لدينا تجارب متعددة ، فيمكننا إنشاء مصفوفة قيم (الشكل 15.5) تمثل قيمة السجل (T / R) ، حيث T هو مستوى التعبير الجيني في عينة الاختبار و R هو مستوى التعبير الجيني في العينة المرجعية.

تمت إزالة Expression Matrix بسبب قيود حقوق النشر.

الشكل 15.4: تحويل الشكل 4 إلى خريطة حرارية
إذا تصورنا المصفوفة كخريطة حرارية ، فسنحصل على المصفوفة الملونة الجديدة التالية:

يمكن تجميع هذه المصفوفات بشكل هرمي لتوضيح العلاقة بين أزواج الجينات وأزواج الأزواج وما إلى ذلك ، مما يؤدي إلى إنشاء مخطط شجر يمكن فيه ترتيب الصفوف والأعمدة باستخدام خوارزميات ترتيب الأوراق المثلى.

الصورة في المجال العام. تم إنشاء هذا الرسم البياني باستخدام برنامج Cluster من Michael Eisen ، والمتوفر من rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm ، مع البيانات المستخرجة من قاعدة بيانات StemBase لبيانات التعبير الجيني.

من خلال الكشف عن البنية الخفية لجزء طويل من الجينوم ، نحصل على نظرة ثاقبة لما يفعله جزء من الجين ، وبالتالي نفهم المزيد عن السبب الجذري لمرض غير معروف.

تزداد هذه القوة التنبؤية والتحليلية بسبب القدرة على جمع البيانات ؛ أي ، التجميع على طول كلا بعدي المصفوفة. تسمح المصفوفة بمقارنة ملامح تعبير الجينات ، وكذلك مقارنة تشابه الحالات المختلفة مثل الأمراض. التحدي ، رغم ذلك ، هو لعنة الأبعاد. مع زيادة مساحة البيانات ، يتضاءل تجميع النقاط. في بعض الأحيان ، يمكن تقليل البيانات إلى مسافات ذات أبعاد أقل للعثور على بنية في البيانات باستخدام التجميع لاستنتاج النقاط التي تنتمي معًا بناءً على القرب.

يمكن أن يمثل تفسير البيانات أيضًا تحديًا ، حيث قد تكون هناك ظواهر بيولوجية أخرى قيد اللعب. على سبيل المثال ، إكسونات ترميز البروتين لها كثافة أعلى ، بسبب حقيقة أن الإنترونات تتحلل بسرعة. في الوقت نفسه ، ليست كل الإنترونات خردة وقد يكون هناك غموض في التضفير البديل. هناك أيضًا آليات خلوية تعمل على تحطيم النسخ الشاذة من خلال التحلل الوسيط غير الحسّي.


اختيار والتحقق من صحة الجينات المرجعية لقياس التعبير الجيني في Toona ciliata تحت ظروف تجريبية مختلفة عن طريق التحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCR

قبل دراسة التعبير الجيني للكائنات الحية المختلفة ، من المهم تحديد الجين المرجعي الأفضل. في الوقت الحاضر ، الطريقة الأكثر دقة للكشف عن التعبير الجيني هي PCR في الوقت الحقيقي الكمي (RT-qPCR). باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحصول على جينات مرجعية مستقرة في أنظمة بيولوجية مختلفة وتحت ظروف مختلفة. Toona ciliata Roem (T. ciliata). هو نوع من الأخشاب ثمين وسريع النمو. في هذه الدراسة ، تم تحديد 20 جينًا مرجعيًا باستخدام RT-qPCR ، كشرط أساسي لتحليل التعبير الجيني في المستقبل. تم استخدام أربع طرق مختلفة ، geNorm ، و NormFinder ، و BestKeeper ، و RankAggreg لتقييم ثبات التعبير عن الجينات المرجعية العشرين المرشحة في الأنسجة المختلفة في ظل ظروف مختلفة.

نتائج

أظهرت النتائج التجريبية ذلك أنبوب- α كان الجين المرجعي الأكثر ثباتًا عبر جميع العينات و UBC17 كان الأكثر استقرارًا في الأوراق والسيقان الصغيرة هيبسيبيلا روبوستا (H. روبوستا) وعلاجات ميثيل جاسمونيت (MeJA). بالإضافة الى، PP2C59 و UBC5B كانت الجينات الأفضل أداءً في الأوراق السفلية H. روبوستا العلاج في حين HIS1 و ACT7 كانت أفضل الجينات المرجعية في السيقان الصغيرة. أفضل جينات مرجعية كانت 60S-18 و أنبوب- α بعد العلاج عند 4 درجات مئوية. التعبير عن HIS6 و MUB1 كان الأكثر استقرارًا تحت علاج PEG6000. تم التحقق من دقة الجينات المرجعية المحددة باستخدام عامل النسخ MYB3 (TcMYB3) الجين.

الاستنتاجات

هذا هو التقرير الأول للتحقق من أفضل الجينات المرجعية لتطبيع التعبير الجيني في T. ciliata في ظل ظروف مختلفة ، مما سيسهل التوضيح المستقبلي للوائح الجينات في هذا النوع.


المنتج الأساسي لجينات ترميز البروتين هو mRNAs. عندما نتحدث عن قياس التعبير الجيني ، نريد فحص مستويات الحالة المستقرة لمرنا معين داخل الخلية. يتم تحقيق ذلك عادةً عن طريق البدء بعدد كبير من الخلايا وحصاد جميع الرنا المرسال من جميع الخلايا. تتمثل إحدى طرق قياس مستوى التعبير عن مرنا لجين واحد فقط في إجراء لطخة شمالية. تشمل الطرق الحساسة الأخرى: مقايسة حماية نوكلياز S1 ، ومقايسة حماية RNAse ، ومقايسة تمديد التمهيدي.

كما تم استخدام المصفوفات الدقيقة على نطاق واسع لقياس مستويات التعبير لآلاف الجينات في نفس الوقت في تجربة واحدة.

مع ظهور منهجية RNA-Seq ، من الممكن حساب عدد النصوص في التجربة (إذا كان لديك جينوم مرجعي متسلسل)

وفقًا لبيانات الجيل التالي:

لم أكن أعمل مباشرة مع mRNA ، لكن ما حصلت عليه من عالم المعلومات الحيوية كان شيئًا كهذا: تقوم باستخراج mRNA الخاص بك ، وتسلسله ، وتصفيته وفقًا للجودة وطول الأمبير ، وتجميعه وما لديك بعد ذلك هو شيء مثل "النصوص". تلك التي تحسبها: xy of transcript1 & amp yx of transcript2. أنت تبحث أيضًا عن الأشكال الإسوية وفي النهاية تقوم بتصحيح هذا العدد وفقًا للقراءات الأولية التي قمت بحسابها. بمقارنة النصوص بأحد عناصر التحكم ، يمكنك قياس ما إذا كانت أعلى أم أقل تنظيمًا (يعد تعيين قراءة عنصر التحكم على أنه "صفر" مثل قراءة 1234 لنسخة واحدة أمرًا طبيعيًا. في العينة 2 لديك 5000 قراءة لهذا النص. يبدو أن الجين هو منظم). وبقدر ما أعرف هو تقريبًا الطريقة التي يتم بها إجراء تقديرات / تقديرات التعبير الجيني.


تقنية لقياس ديناميكيات التعبير لكل جين في خلية واحدة

يعمل ألون إم كلاين في قسم بيولوجيا الأنظمة ، كلية الطب بجامعة هارفارد ، بوسطن ، ماساتشوستس 02115 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

لفهم الأنظمة المعقدة والتحكم فيها ، يجب أن نكون قادرين على قياس ديناميكيات الأجزاء المكونة لها. في علم الأحياء ، من المحتمل أن يكون التعبير الجيني هو المثال النهائي لنظام معقد ، مع أكثر من 20000 جين تنظم وظائف الأنسجة البشرية. ومع ذلك ، فإننا نفتقر إلى الأدوات اللازمة لقياس مدى اختلاف الجينات في التعبير في الخلايا الفردية بمرور الوقت. في ورقة في طبيعة سجيةلا مانو وآخرون. وصف 1 طريقة قوية تمكن من تقدير مستوى ومعدل تغيير التعبير في وقت واحد لكل جين في خلية واحدة. هذا النهج له آثار كبيرة على دراسة الديناميات الخلوية ، لا سيما في تطور المرض والعمليات المعقدة مثل التطور الجنيني.

اقرأ الورقة: سرعة الحمض النووي الريبي للخلايا المفردة

يواجه علماء الأحياء مشكلة تشغيلية عند محاولة فهم التغيرات الديناميكية في التعبير الجيني التي تحدث مع تقدم الخلايا في العمر أو تمايزها أو إصابتها بالمرض. من ناحية أخرى ، تتضمن التقنيات التي تمكن الباحثين من قياس تعبير جميع الجينات في خلية معينة على نطاق واسع تدمير الخلية المعنية. يحظر هذا التحليل بمرور الوقت وبالتالي يوفر فقط لمحة سريعة عن التعبير الجيني. من ناحية أخرى ، يمكن استخدام التقنيات التي تتيح القياس طويل المدى للتعبير الجيني في الخلايا الحية لتتبع عدد محدود فقط من الجينات 2.

حاولت مجموعتي والعديد من الآخرين سابقًا استنتاج ديناميكيات التعبير لجميع الجينات في الخلية من القياسات المدمرة للخلايا المفردة ، عن طريق تنظيم قياسات اللقطة في "مسارات" مستمرة تقارب ديناميكيات التعبير. ولكن نظرًا لأن ديناميكيات التعبير الجيني المختلفة يمكن أن تؤدي إلى نفس اللقطات ، فإن حتى الخوارزميات الأكثر تعقيدًا يمكن أن تنتج نتائج غير صحيحة 3.

لا مانو وآخرون. تغلبت جزئيًا على هذه المشكلة التشغيلية من خلال إدراك أن اللقطات الحالية للتعبير الجيني يمكن ، في الواقع ، توفير معلومات ديناميكية حسنة النية. حلل المؤلفون البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. يتم استخدام هذا النهج بشكل نموذجي لقياس وفرة نسخ RNA الرسول لكل جين في كل خلية من عينة. لكن الباحثين أظهروا أن تسلسلات الحمض النووي الريبي هذه قدمت أيضًا معلومات حول ما إذا كان التعبير عن كل جين يتزايد أو يتناقص في الوقت الذي تم فيه إجراء القياس.

لا مانو وآخرون. استغل حقيقة أن الرنا المرسال المنسوخ حديثًا يحتوي على مقاطع تم قطعها لاحقًا (مقسمة) أثناء تكوين الرنا المرسال الناضج. بالنسبة للجين الذي يتم التعبير عنه بثبات ، فإن جزءًا صغيرًا من mRNA الخاص به سيوجد دائمًا في شكل غير ناضج وغير مقسم ، لأن النسخ القديمة يتم استبدالها باستمرار بأخرى جديدة. عندما يتم تنشيط الجين للتو ، ستكون هناك نسبة أعلى بكثير من النسخ غير الناضجة لفترة قصيرة. على العكس من ذلك ، عندما يتم كبح التعبير عن الجين ، ستنخفض نسبة النسخ قصيرة العمر وغير الموصولة قبل أن تتحلل نسخ mRNA الناضجة الأطول عمراً. لذلك ، بالنسبة لكل جين في الخلية ، يمكن استخدام نسبة mRNA غير المقسمة إلى mRNA المقسم لاستنتاج ديناميكيات التعبير اللحظي مباشرة - أي `` سرعة RNA '' لكل جين ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لاستنتاج التغييرات الخلوية التي تحدث في منديل (الشكل 1).

الشكل 1 | قياس التغيرات الديناميكية في التعبير الجيني عبر الأنسجة المعقدة. أعندما ينضج الرنا المرسال ، تتم إزالة أجزاء من النسخة غير الناضجة - وهي عملية تسمى الربط. عندما يزداد التعبير عن الجين ، لوحظت زيادة عابرة في نسبة النصوص غير الناضجة وغير المقسمة مقارنةً بالنصوص الناضجة والمقسمة في الخلية. على النقيض من ذلك ، تظهر نسبة أعلى من النصوص المقسمة لفترة قصيرة عندما ينخفض ​​التعبير عن الجين (غير معروض). لا مانو وآخرون. قام 1 بقياس نسبة النسخ غير المقسمة إلى النسخ المقسمة لكل جين في خلية واحدة لحساب كمية تسمى سرعة RNA ، والتي تكشف كيف يتغير التعبير الجيني. ب، من خلال قياس سرعة الحمض النووي الريبي في آلاف الخلايا في الأنسجة (هنا ، في الخلايا العصبية في دماغ الفأر النامي) ، يمكن للمؤلفين إنشاء خرائط لا تظهر فقط مدى ارتباط الخلايا ببعضها البعض (مع التقارب المشار إليه بألوان متشابهة) ، ولكن أيضًا الخلايا التي ستصبح مشابهة لها في المستقبل (يشار إليها بالسهام) ، وفقًا لتغيرات التعبير الجيني التي تمر بها. تتتبع سرعة الحمض النووي الريبي (RNA) بنجاح الأسلاف المبكرة (البرتقالية والأصفر) التي أدت في النهاية إلى ظهور مجموعة من أنواع الخلايا المتباينة (الدوائر الزرقاء المتقطعة). (ب مقتبس من الشكل 3 ج من المرجع. 1.)

تم استخدام هذا النهج بالفعل في مجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي 4 ، 5. لا مانو وآخرون. أدركت أنه يمكن تطبيق الطريقة على بيانات الخلية المفردة ، والتي تعتبر أكثر فائدة لها. توفر هذه البيانات صورة عالية الدقة للعمليات الديناميكية - لا سيما في الأنسجة المعقدة ، والتي تحتوي على العديد من أنواع الخلايا ذات أنماط التعبير الجيني المتنوعة التي يتم دمجها في تحليلات مجمعة. وجد المؤلفون أن الخوارزميات الموجودة لتحليل البيانات من تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية تتجاهل بشكل روتيني المعلومات حول الرنا المرسال غير الناضج وغير المصقول. من خلال إعادة صياغة خطوط الأنابيب الحسابية الخاصة بهم لإنقاذ هذه البيانات ، يمكنهم استعادة المعلومات حول كل من الأشكال المقسمة وغير المتشابكة لكل نسخة ، وبالتالي توقع سرعة الحمض النووي الريبي.

كما هو الحال في كثير من الأحيان ، كان لا مانو يتطلب الكثير من الجهد والبراعة التقنية وآخرون. لترجمة فكرتهم الأولية إلى مجموعة قوية من خوارزميات العمل. من بين التحديات التي كان عليهم التغلب عليها حقيقة أن قياس التعبير الجيني في الخلايا المفردة يمكن أن يكون صاخبًا. وذلك لأن معظم جزيئات الرنا المرسال في كل خلية تُفقد في محاولة لتسلسلها ، مما يترك للباحثين فقط صورة غير مكتملة للتعبير الجيني. كان التحدي الآخر هو تحديد كيفية استنتاج النسبة الأساسية للنصوص المقسمة إلى غير المقسمة لكل جين عندما يخضع لنسخ مستقر. احتاج المؤلفون إلى تطبيق مناهج متطورة في الإحصاء والتعلم الآلي لحل هذه المشكلات.

يوضح La Manno وزملاؤه بشكل جميل فائدة نهجهم باستخدام مجموعات البيانات المنشورة والمجمعة حديثًا. على سبيل المثال ، أظهروا أن سرعة الحمض النووي الريبي يمكن أن تكتشف بدقة الزيادات والنقصان في التعبير الجيني الذي من المعروف أن الخلايا في الجنين تخضع لها لأنها تتمايز عن نوع خلية يسمى خلية القمة العصبية إلى خلايا كرومافين في الغدد الكظرية. استخدم المؤلفون أيضًا سرعة الحمض النووي الريبي للتحقيق في ديناميكيات التعبير الجيني في الحصين النامي في دماغ الفأر ، أثناء تمايز الخلايا الجذعية المعوية وغير ذلك. تشير مجموعة الأمثلة هذه إلى أن الطريقة سيكون لها قيمة كبيرة. كان من بين أهم إنجازات المجموعة تحليل الأنسجة الجنينية البشرية ، حيث سيكون من الصعب للغاية ، أو حتى المستحيل ، إجراء أشكال أخرى من القياس الديناميكي بسبب المشكلات الفنية والأخلاقية المرتبطة بدراسة الأجنة البشرية الحية.

يعد تطوير تحليل سرعة الحمض النووي الريبي للخلايا المفردة إنجازًا كبيرًا. لكن ، بالطبع ، لها حدود. بطبيعتها ، لا تستطيع سرعة الحمض النووي الريبي تتبع خلية معينة بمرور الوقت ، فهي تقتصر على دراسة الرنا المرسال ، ولا توفر معلومات حول التنظيم المكاني للخلايا. يمكن أن تكون هذه القيود مقيدة عند استكشاف الظواهر في بيولوجيا الخلايا الجذعية أو التطور الجنيني أو بداية المرض ، والتي من المحتمل أن تعتمد على نسب الخلايا وترتيبها ، والتي يمكن أن تكون مدفوعة بآليات أخرى غير النسخ ، بما في ذلك فسفرة البروتين. تعطي الطريقة فقط وصفًا احتماليًا لديناميات الخلية ، والتي يتم تجميعها معًا من السرعات اللحظية. نتيجة لهذه القيود ، ليس هناك شك في أن ديناميات التعبير المكاني والزماني للجينات ستستمر في الدراسة باستخدام طرق تكميلية مثل التصوير الحي.

ومع ذلك ، فإن القدرة على استنتاج سرعات RNA حقيقية وفورية في الخلايا المفردة هي قفزة إلى الأمام لدراسات ديناميكيات التعبير الجيني على نطاق الجينوم بأكمله. في الواقع ، تم تطبيق نهج المؤلفين بالفعل من قبل باحثين آخرين 6. في المستقبل القريب ، يمكنني أن أتوقع أن تصبح سرعة الحمض النووي الريبي بسهولة أداة أساسية لمحللي الخلية الواحدة.


الاستنتاجات

نود التأكيد على وجود اتجاهات مختلفة في البيانات الرقمية عالية الأبعاد ، وتبرز مقاييس المسافة المختلفة بشكل مختلف بعض هذه الاتجاهات. في الحالة الحالية ، أبرزت ثلاثة أنواع من المسافات بشكل جيد نسبيًا خاصية ملفات تعريف التعبير الجيني لتكون أكثر تشابهًا بالنسبة للأنسجة المتجانسة بين الأنواع مقارنة بالأنسجة غير المتجانسة داخل الأنواع. على النقيض من ذلك ، عند الإجابة على سؤال حول التباعد بين الجينات المتعامدة ، تم اختيار جينات من ثلاث مسافات (إقليدية) بشكل موحد في جميع الأنسجة بالقرب من خلفية التعبير ، في حين أن المسافات القائمة على الارتباط ومسافة GA المختارة مع تغييرات منسقة بين الأنسجة المتماثلة. وبالتالي ، لدراسة اختلاف التعبير في الأنواع المختلفة ، يجب أن يسترشد اختيار مقياس المسافة بنوع أنماط التعبير التي يرغب المرء في تحديدها.


استخدام التباين في التعبير الجيني كأداة لدراسة تنظيم الجينات

تضارب المصالح: يتلقى الواقع المعزز الإتاوات من براءات الاختراع المتعلقة بأساليب RNA FISH الموضحة في المقالة ، بالإضافة إلى الدخل الاستشاري.

الملخص

مع ظهور الأدوات الكمية لقياس التعبير الجيني في الخلايا المفردة ، توصل الباحثون إلى اكتشاف أنه في العديد من السياقات ، يمكن أن تختلف مستويات الحمض النووي الريبي المرسال ومستويات البروتين بشكل كبير من خلية إلى أخرى ، غالبًا بسبب الأحداث العشوائية المتأصلة المرتبطة بالتعبير الجيني. أصبحت دراسة هذه الفردية الخلوية مجالًا للدراسة في حد ذاتها ، يتميز بمزيج من التطور التكنولوجي ، والتحليل النظري ، ومؤخراً ، تطبيقات للظواهر البيولوجية. في هذه المراجعة ، نركز على استخدام التباين المتأصل في التعبير الجيني كأداة لفهم تنظيم الجينات. نناقش استخدام التباين باعتباره اضطرابًا على مستوى الأنظمة الطبيعية ، واستخدامه في التوصيف الكمي للعمليات البيولوجية الكامنة وراء النسخ ، وتطبيقه على اكتشاف تفاعلات تنظيمية جديدة للجينات. نعتقد أن استخدام التباين يمكن أن يوفر رؤى بيولوجية جديدة في جوانب مختلفة من التحكم في النسخ ويمكن أن يوفر نهجًا تكميليًا قويًا لتلك التقنيات الحالية. وايرز سيست بيول ميد 2013 ، 5: 751-759. دوى: 10.1002 / wsbm.1243


الملخص

غالبًا ما تكون العمليات البيولوجية ديناميكية ، لذلك يجب على الباحثين مراقبة نشاطهم في نقاط زمنية متعددة. المصدر الأكثر وفرة للمعلومات المتعلقة بهذا النشاط الديناميكي هو بيانات التعبير الجيني للسلاسل الزمنية. تُستخدم هذه البيانات لتحديد المجموعة الكاملة من الجينات المنشطة في عملية بيولوجية ، لاستنتاج معدلات تغيرها وترتيبها وتأثيراتها السببية ونمذجة الأنظمة الديناميكية في الخلية. في هذه المراجعة ، نناقش الأنماط الأساسية التي لوحظت في تجارب السلاسل الزمنية ، وكيف يتم دمج هذه الأنماط لتشكيل برامج التعبير ، والتحليل الحسابي ، والتصور والتكامل لهذه البيانات لاستنتاج نماذج للأنظمة البيولوجية الديناميكية.


نتائج

الانتشار والتمايز الشحمي في ASCs البشرية

قمنا بتقييم الجينات المرجعية المرشحة لدراسات التعبير الجيني الكمي المستندة إلى RT-PCR لتكاثر وتمييز ASCs البشرية. أولاً ، قمنا بعزل ASCs من عينات sWAT الجديدة في البطن التي تم الحصول عليها عن طريق شق من أربع متبرعات يخضعن لعملية جراحية بلاستيكية اختيارية في البطن (ملف إضافي 1: الجدول S1). تم تخزين الخلايا في النيتروجين السائل. لتحديد نقاء مجموعة ASC ، تم إذابة الخلايا وتنميتها لتمرير 3. بعد ذلك تم نفاذية الخلايا وإخضاعها لتحليل FACS للكشف متعدد المعلمات باستخدام الأجسام المضادة ضد بروتينات علامة ASC المحددة [6 ، 25]. أظهرت الغالبية العظمى من الخلايا النمط المناعي ASC المميز ، DLK1 + / CD34 + / CD90 + / CD105 + / CD45 - / CD31 - (الشكل 1 أ) ، والذي يُتوقع للممر المنفصل 3 ASC [6 ، 25].

توصيف وانتشار وتمايز ASCs. أ - توصيف ASCs عبر تحليل FACS. تم إصلاح 100000 خلية ونفاذها وتحليلها من أجل تعبيرات بروتينات العلامات CD45 و CD31 و CD90 و CD105 و CD34 و DLK1. يتم عرض الرسوم البيانية للمرور 3 ASCs. الرسوم البيانية السوداء: تحكم غير ملوث. الرسوم البيانية الحمراء: الخلايا مع تلطيخ الأجسام المضادة المحددة. تمثل الرسوم البيانية 3 تحليلات قياس التدفق الخلوي المستقلة باستخدام ASCs من مانحين مختلفين. ب و ج - الصور المجهرية (ب) ومنحنيات النمو (ج) من تكاثر ASCs المزروعة في وسط PM4 يحتوي على 2.5 ٪ FCS أو 10 ٪ FCS. تمثل كل نقطة بيانات متوسط ​​عدد الخلايا لثلاث آبار مختلفة. يتم تقديم القيم كوسائل +/− SEM. **ص & لتر 0.01. د - التمايز الشحمي للخلايا الجذعية. تم تحفيز تكوين الشحم في اليوم 0 (d 0) وتم توثيق مورفولوجيا الخلايا باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع في الأيام المحددة. ه - تمت مراقبة تكوين القطرات الدهنية باستخدام تلطيخ Oil-Red-O في اليومين 9 و 14 بعد تحريض تكون الشحوم. F - تمت مراقبة مستوى بروتين بيريليبين عن طريق تحليل لطخة غربية في خوادم ذاتية الدفع غير متمايزة (د 0) ومتباينة (د 9). يتم عرض النتائج التمثيلية من ثلاث تجارب مستقلة أجريت في ASCs المستمدة من ثلاث جهات مانحة مختلفة

تم بعد ذلك استزراع ASCs في وسط ميتوجيني منخفض (وسط PM4 يحتوي على 2.5 ٪ FCS) وفي وسط ميتوجيني عالي (وسط PM4 يحتوي على 10 ٪ FCS). تمت مراقبة الانتشار عن طريق حساب أرقام ASC في الأيام المشار إليها (الشكل 1 ب وج). كما هو متوقع ، أظهرت ASCs المزروعة في وسط ميتوجيني عالي معدل انتشار أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بالخلايا التي نمت في وسط منخفض الانقسام.

من أجل التمايز الشحمي ، نمت ASCs لتوقف الكثافة وتم تجويعها في وسط خالٍ من المصل. أدى تحريض تكوين الشحوم بواسطة كوكتيل هرموني إلى التحول المورفولوجي المميز للخلايا الجذعية السرطانية من مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية إلى خلايا مستديرة خلال أول 72 ساعة بعد الاستقراء (الشكل 1 د). هذه هي السمة المميزة لتكوين الشحم [26]. تم تأكيد التمايز عن طريق الكشف عن قطرات الدهون داخل الخلايا (الشكل 1 هـ) وبروتين بيريليبين النوعي للخلايا الشحمية (الشكل 1 و). يظهر تحليل اللطخة الغربية الكاملة في ملف إضافي 2: الشكل S1.

مستويات اختيار الجينات المرجعية والتعبير عنها

لتحليل RT-PCR الكمي ، تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من تكاثر ASCs (3 مانحين) ومن ASCs 0 ، 1 ، 2 ، 3 ، 6 و 10 أيام بعد تحريض التكوُّن الشحمي (4 متبرعين). تراوح المحصول من 2 إلى 10 ميكروغرام بمتوسط ​​نسبة نقاء (A260 / A280) يبلغ 2.0.

اخترنا العديد من الجينات المرجعية المرشحة (ملف إضافي 1: الجدول S2) للعثور على الجينات الأكثر موثوقية لتحليل تعبير RNA في تكاثر ASCs وتمييزها. تمت معالجة المنحنيات القياسية للجينات المرجعية بناءً على تكاثر ASCs بينما تم تنفيذ معايير جينات العلامة الدهنية على ASCs بعد ثلاثة أيام من تحريض التكوُّن الشحمي (ملف إضافي 3: الشكل S2 وملف إضافي 4: الشكل S3).

تم إجراء RT-PCR الكمي للمعايير باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الكلاسيكية 10 أضعاف. كان لكفاءة (E) مجموعات التمهيدي للجينات المرجعية والمستهدفة قيمًا متوسطة تبلغ 101.9 + / 2.81٪ و 103.9 + / 3.80٪ ، على التوالي (ملف إضافي 4: الجدول S3). لتأكيد تضخيم PCR محدد ، تم إجراء الرحلان الكهربائي للهلام. أظهر منتج PCR واحد فقط بالحجم المتوقع (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل منحنى الذوبان قمة واضحة واحدة لكل زوج من التمهيدي (البيانات غير معروضة).

خصوصية التمهيدي ومتوسط ​​عتبات الدورة الخام. أ - خصوصية التضخيم لجميع مجموعات التمهيدي للجينات المرجعية المرشحة. تم عزل (كدنا) من ASCs البشرية غير المتمايزة. الممرات 1-10: GAPDH و TBP و EF1A و LMNA و RPS18 و PSMD5 و MRPL19 و TCRF و CCNA2 و GUSB. B و C - الخام الكمي PCR Cتي قيم الجينات المرجعية المرشحة أثناء الانتشار (ب) وتكوين الشحوم (ج). تم تضخيم كل جين في 15 (تكاثر) أو 24 (تكوين شحم) عينة بيولوجية مختلفة في نسختين. يتم تقديم القيم كوسائل +/− SEM

أظهرت الجينات المرجعية المختبرة مستويات تعبير مختلفة (الشكل 2 ب وج). لتقييم ما إذا كانت SDs المتزايدة داخل هذه المجموعات الأربع تشير إلى القيم المتطرفة المهمة التي أجريناها في اختبار Grubbs ، والذي يكتشف القيم المتطرفة في مجموعة بيانات معينة ويحدد أهميتها. لم يتم الكشف عن شاذة كبيرة مع العتبة عند ص ≤ 0.05. لذلك ، تم تضمين جميع العينات لمزيد من التحليل.

تقييم الجينات المرجعية المناسبة لتكاثر ASC والتمايز

تقوم الجينات المرجعية المرشحة التي تم اختيارها في هذه الدراسة بتشفير البروتينات في فئات وظيفية مختلفة لذا فإن فرصة تنظيم الجينات بشكل مشترك تكون منخفضة [18]. لتحديد الجينات المرجعية المثلى لتكاثر وتمايز ASC ، تم استخدام ثلاث طرق رياضية مختلفة (GeNorm و NormFinder و BestKeeper):

يصنف تحليل GeNorm الجينات المرجعية المرشحة بأقل قيمة لاستقرار التعبير (قيمة M) حتى عتبة 0.5. تعتبر الجينات ذات القيم التي تتجاوز 0.5 غير مستقرة [27] ، على الرغم من أنه في مجموعات الخلايا غير المتجانسة ، يمكن أيضًا قبول قيمة M 1.0 [27]. لا يمكن اعتبار ASCs التي تخضع لعملية التمايز على أنها مجموعة خلايا متجانسة مقارنةً بركوب الدراجات ASCs. لذلك ، تم ضبط العتبة على 0.5 للخلايا المتكاثرة و 1.0 للتمييز بين الخلايا. يتم عرض القيم M التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج GeNorm في الشكل 3 أ و ب.

تحليل وترتيب التعبير الجيني المرشح لتحديد الجينات المرجعية الأكثر استقرارًا في الانتشار وتكوين الدهون. أ و ب - يوضح تحليل GeNorm قيمة الاستقرار M للجينات المرجعية المرشحة في التكاثر (أ) والتمييز (ب) ASCs. تشير القيم الأقل إلى جينات أكثر استقرارًا ، بينما تشير القيم الأعلى إلى جينات أقل استقرارًا. ج و د - تحليل NormFinder يظهر الجينات المرجعية الأكثر استقرارًا في التكاثر (ج) والتمييز (د) ASCs. تشير القيم الأقل إلى جينات أكثر استقرارًا ، بينما تشير القيم الأعلى إلى جينات أقل استقرارًا. ه و F - يوضح تحليل BestKeeper الجينات المرجعية الأكثر استقرارًا (بناءً على معامل ارتباط بيرسون) للتكاثر (ه) والتمايز (F). تشير القيم الأعلى إلى جينات أكثر استقرارًا ، بينما تشير القيم الأقل إلى جينات أقل استقرارًا. ص & lt 0.001 (استثناءات: الانتشار: RPS18 ص = 0.002 تكوّن الشحم: GUSB ص = 0.03 ، MRPL19 ص = 0.003). ز - تظهر تأثيرات الجينات المرجعية المناسبة (الخضراء) وغير الملائمة (الحمراء) على التعبيرات النسبية لجينات الواسمات الدهنية في سياق تكون الشحم.

تحسب خوارزمية NormFinder قيمة الاستقرار لكل جين. بناءً على هذا التحليل ، يوصى باستخدام اثنين من الجينات المرشحة بأقل استقرار (عتبة 0.15) [18]. كما هو مبين في الشكل 3 ج ، الجينات المرشحة (MRPL19, TBP, EF1A, بمسد 5 و جابده) تفي بالمعايير المحددة بواسطة عامل التطبيع بقطع القيمة 0.15 لتكاثر خوادم الخدمة الذاتية. كشف تحليل NormFinder MRPL19 و TBP ليكون أفضل مزيج من الجينات المرجعية لتكاثر ASCs (قيمة الاستقرار 0.075). ومع ذلك ، فشلت قيم استقرار الجينات المرشحة التي تم اختبارها في التفريق بين ASCs في البقاء دون عتبة 0.15 (الشكل ثلاثي الأبعاد). كما ذكر أعلاه ، قد تكون هذه القيم الأعلى بسبب عدم تجانس الخلايا المتمايزة. ومع ذلك ، فإن الجمع بين PSMD5 و TBP تم تغيير قيمة الاستقرار إلى رقم مقبول 0.122.

يستبعد تحليل BestKeeper التدريجي بحكمة الجينات المرجعية للمرشح غير المناسب. بعد التحليل الإحصائي الوصفي لكل جين مرجعي ، يتم على الفور استبعاد المرشحين الذين لديهم انحراف معياري أعلى من 1.0. بعد ذلك ، يتم إجراء تحليل الارتباط الزوجي لحساب ارتباط بيرسون بكفاءة R لكل جين مرجعي. تعتبر قيم R العالية للإشارة إلى نمط التعبير الجيني المستقر [24]. تحليل Cتي كشفت قيم جميع الجينات المرشحة في ASCs المتكاثرة SD (الانحراف المعياري) أقل من 1.0 (البيانات غير معروضة). CCNA2 تم استبعاده من الحسابات الأخرى نظرًا لارتفاع SD (0.89). أظهر المزيد من التحليل ارتباطًا قويًا لجميع الجينات المرشحة (0.977 & lt R & lt 0.741 شكل 3 هـ). عندما كررنا تحليل BestKeeper مع الجينات الثلاثة الأكثر ملاءمة ، MRPL19, GUSB و EF1A، ازداد الارتباط (0.985 & lt R & lt 0.987 ، ملف إضافي 1: الجدول S4). بعد استبعاد CCNA2 (SD = 1.5) ، أظهرت الجينات المرجعية المرشحة في ASCs الشحمية ارتباطًا ضعيفًا إلى حد ما (0.920 & lt R & lt 0.437 ، الشكل 3f). ومع ذلك ، فحص أفضل ثلاثة مرشحين (PSMD5, EF1A و TFRC) عن وجود علاقة قوية بين هذه الجينات (0.969 & lt R & lt 0.935 ، ملف إضافي 1: الجدول S4).

تم تقييم تأثير الجينات المرجعية المختلفة على تعبيرات الجينات ذات الأهمية (GOIs) في التمييز بين خوادم الإنقاذ. تجارب الدورة الزمنية التمثيلية باستخدام التوليفات EF1A + PSMD5, CCNA2 + LMNA و فقط CCNA2 as the reference gene(s) are shown in Fig. 3g. It is clear that the selection of the reference gene(s) has considerable influence on the measurement of GOI expression.


مناقشة

Using a repeated sampling study design, we investigated PBMC transcript expression in patients undergoing stent implantation, using a novel time-course analysis method. We identified a set of 42 genes with differential temporal expression among patients with and without ISR at one year follow-up in a discovery analysis of the CardioGene Study. Independent replication testing in an Icelandic sample confirmed differential expression of 36 probesets mapped to 32 genes. The gene expression patterns over time may be of interest as well, with consistently expressed genes representing gene expression data that may be able to predict ISR and differentially expressed genes over the time course representing genes with possible direct functional roles in the development of ISR, both of which require further investigation to explore more fully.

Gene expression profiling with DNA microarray technology is a popular tool to monitor the expression level of thousands of genes simultaneously and has been applied in cardiovascular research, to detect patterns of gene expression indicative of underlying disease states[16–21]. Since the data generated represent the temporal abundance of mRNA levels in the sample, measurements of the change of this abundance over the course of disease progression (or any biological process) is therefore both possible and of great scientific interest using this technology. In fact, Yuan and Kendziorski[22] reported that more than one-third of the experiments catalogued in the Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) are from experiments that measure gene expression over time. Early time-course RNA expression studies have focused on identifying clusters of genes with a similar pattern over time[14, 23, 24]. More recently, detecting a differential gene expression pattern over time between several biological groups has become an interesting goal of time-course gene expression data.

To detect differential gene expression pattern over time, we used a time-varying intercept model which can account for differences in sample intervals between patients. The term "differential gene expression pattern over time" can be interpreted in several ways to form suitable questions and, thus, the hypotheses are dependent on the particular experiment under consideration. We considered two related questions where each can roughly correspond to the main effect of the group, and the interaction between group and time points. Consider, for example, a gene with exactly the same expression pattern over time in both groups, but the first group has a higher expression than the second group, consistently over all time points. This is a gene that shows the main effect of the group. On the other hand, consider another gene with similar expression level at two time points, 1 and 2, but this gene's expression increases from time 1 to 2 in one group but decreases in another group. This group-by-time interaction cannot be examined by methods that only test the main effect of the group. The time-varying intercept model we used can detect both the main effect and group-by-time interaction. This method, however, requires a large number of bootstrap resampling to evaluate the significance level of the difference between groups, which can be computationally challenging especially when a large number of genes are tested.

Of the genes we identified, the most extensive prior literature in vascular disease was found for the NAB2 gene, which is also known as EGR1 binding protein 2. Early growth response (EGR) genes, which are transcription factors that are implicated in a wide variety of proliferative and differentiative processes[15]. Nab proteins are necessary for Schwann cells to exit the cell cycle and generate a myelin-specific gene profile and are key regulators of the myelination process of peripheral nerves[25]. NAB2 is expressed in vascular smooth muscle cells in response to injury[3–12, 26] and EGR1 has been identified in a microarray study of in vitro smooth muscle cell proliferation[27]. ال LAMP2 gene product protects the lysosomal membrane from proteolytic enzymes within lysosomes and also functions as a receptor for proteins to be imported into lysosomes[28]. الطفرات في LAMP2 gene have been identified in patients with hypertrophic cardiomyopathy[29], and the gene product mediates adherence of PBMCs to the vascular endothelium[13]. Cellular adhesion to the vascular endothelium has been well-described in animal models and post-mortem human examinations, in atherogenesis and acute vascular injury[30, 31]. In the latter, the extent of leukocyte adhesion is predictive of the degree of subsequent neointimal hyperplasia, which is the key lesion of ISR.

Some genes identified have no apparent role in vascular biology, such as VPS26, VPS41, SRP54، و RAD23B, and comparison to previously published reports in the literature do not show differential gene expression in other studies of restenosis, although these investigations were conducted primarily on vascular tissues or culture vascular smooth muscle cells rather than peripheral blood[17, 18, 27, 32]. ال VPS26 and VPS4 genes belongs to a group of vacuolar protein sorting genes and may have a role in lysosome maintenance[33], and SRP54 is a protein in the signal recognition particle, which directs secretory proteins to membranes as they emerge from the ribosome [34]. Specific vascular or inflammatory cell function has not been described, but derangement of these basic cellular processes may impact vascular and other physiologic functions adversely. RAD23B has a role in DNA (nucleotide excision) repair, and genetic variants in RAD23B have been associated with several solid tumors[35–38]. The association with cancer would suggest a possible link to excess proliferative mechanisms in vascular wound repair, as has been described for many other cell cycle regulatory genes[39]. Genetic variants in other genes we identified are also associated with human diseases. Several genetic variants in ACADM have been associated with medium-chain acyl-CoA dehydrogenase activity, but there is no known vascular implication of this disorder[40]. Variants in PCMT1 و FOLR2 have been associated with neural tube defects[41–43], with no known vascular phenotype in these cases. Overall the findings of this study are hypothesis-generating and can be used to support the rational for investigating the function of specific genes and pathways in adverse vascular remodeling, which is relevant to both ISR and more general CAD phenotypes.

We compared the results of our study to previously published reports of transcriptome analysis in ISR. Our results were negative for replication of these studies which focused primarily on vascular tissue samples, in relatively small sample sets. In one study, peripheral blood total leukocyte gene expression was studied in 10 patients with ISR and atherectomy specimens [23]. While a high degree of correlation between peripheral blood leukocyte and arterial neointima tissue gene expression was identified in a subset of genes, these findings were based upon single measurements in a small sample size and were not replicated in the original report. These prior reports highlight the major difficulty of studying vascular tissues, since access to these tissues in adequately large sample sizes is limited.

Vascular biopsy and atherectomy are performed infrequently as part of routine clinical care and would not support well-powered studies of vascular tissues. Tissue sampling over a time course is not clinically indicated or possible. Additionally, a large degree of intra-individual variability in gene expression was noted in these prior studies of vascular tissues, making replication testing critical, yet this cannot be done without access to additional tissues samples. In our study, we analyzed peripheral blood leukocytes, specifically focusing on the mononuclear fraction which contains primarily B and T lymphocytes and monocytes. Although the analysis of peripheral blood cells would ideally be complemented by similar studies in vascular tissues, studying gene expression profiles in blood leukocytes is biologically relevant due to well-defined interactions with the arterial wall, particularly in the setting of vascular injury and repair as in the setting of ISR[17]. The overlap between vascular and blood gene expression in one prior transcriptome analysis of ISR was supportive of our rationale to study PBMCs. For these reasons, and with the additional prior knowledge that inflammation plays a significant role in the development of ISR, we undertook a study of PBMCs in several hundred patients, with adequately powered replication testing for our top discovery findings. Additionally, we use a time course analysis method that improved our ability to detect gene expression signals between the two comparison groups, overcoming some of the difficulty of substantial variability in single point microarray gene expression data.

To address the possibility of false positives identified with our statistical methods, we conducted replication analyses in the independent sample of deCODE samples and we conducted bootstrap resampling to assess significance of the findings. Through this sensitivity analysis, we demonstrated that the validation of 36 probe sets is not likely to be due to chance. Additional potential limitations of this study of ISR are the use of a clinical restenosis outcome, rather than an angiographic outcome, in which clinically silent ISR may have been missed, and the choice of tissue analyzed, as discussed. The CardioGene and deCODE cohorts differ in the incidence of ISR (16.7% in the CardioGene Study and 28.8% in deCODE) with the patients in the deCODE sample showing overall lower residual percent stenosis in the treated lesion after stent implantation. Also, the proportions with hyperlipidemia and diabetes differ. However, despite the differences in the cohorts, we find replication of a substantial proportion of the discovery findings.


استشهد بهذا

  • APA
  • مؤلف
  • BIBTEX
  • هارفارد
  • اساسي
  • RIS
  • فانكوفر

Vertebrate Embryogenesis. إد. / Francisco J. Pelegri. New York, NY : Humana Press, 2019. p. 183-218 (Methods in Molecular Biology Vol. 1920).

مخرجات البحث: فصل في إجراء الكتاب / التقرير / المؤتمر ›فصل (كتاب)› أخرى ›مراجعة الأقران

T1 - Detection of gene and protein expression in mouse embryos and tissue sections

N2 - Analysis of gene (mRNA and protein) expression patterns is central to the study of embryonic development. This chapter details methods for detecting mRNA and protein expression in whole-mouse embryos and in tissue sections, including mRNA in situ hybridization, immunohistochemistry, and detection of enzymatic and fluorescent protein reporters. We focus on histological methods molecular methods of measuring gene expression (for example, RNAseq, PCR) are not included here.

AB - Analysis of gene (mRNA and protein) expression patterns is central to the study of embryonic development. This chapter details methods for detecting mRNA and protein expression in whole-mouse embryos and in tissue sections, including mRNA in situ hybridization, immunohistochemistry, and detection of enzymatic and fluorescent protein reporters. We focus on histological methods molecular methods of measuring gene expression (for example, RNAseq, PCR) are not included here.


شاهد الفيديو: Gene Expression (أغسطس 2022).