معلومة

ماذا سيكون تسلسل التكلفة المقدرة؟

ماذا سيكون تسلسل التكلفة المقدرة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا مبتدئ في عالم NGS ، لكنني اعتقدت أنه قد يكون بديلاً مناسبًا وأرخص تكلفة للقيام بتسلسل Sanger التقليدي لهذا التطبيق المعين. ومع ذلك ، لست متأكدًا من كيفية التعامل مع حساب هذه التكلفة ، لذلك كنت آمل في التواصل ومعرفة ما إذا كان هناك شخص يمكنه المساعدة هنا. هذا لمشروع بحثي في ​​مدرسة الدراسات العليا.

عرض المشكلة

أنا على وشك إنشاء مكتبة عقلانية من حوالي 1000 مجمع بروتيني تنتمي إلى نفس عائلة البروتينات. هناك 4 بلازميدات بروتينية يتم تصنيعها لكل معقد ، ويجب تصنيعها عن طريق مجموعة من طرق الاستنساخ الجينومي التخليقي باستخدام cDNA ، والطفرات الموجهة متعددة المواقع على البلازميدات الموجودة. قبل اختبار وظيفتها كمركب ، أحتاج إلى التحقق من نجاح خطوات الاستنساخ بالتسلسل للتحقق من كل بلازميد.

يمكنني إجراء تسلسل سانجر التقليدي لكل تسلسل بروتين ، ولكن نظرًا لأن كل بروتين يبلغ طوله حوالي 2 كيلو بايت ، فسوف أحتاج إلى 4 تفاعلات تسلسلية أحادية الاتجاه لكل بلازميد لتغطية CDS. في المجموع ، لكل مركب بروتيني ، هذا هو 16 تفاعل تسلسلي. بسعر 5 دولارات أمريكية لكل تفاعل تسلسلي ، سيكلف كل مجمع بروتين 80 دولارًا أمريكيًا للتسلسل. عند 1000 تسلسل ، سيكون ذلك 80000 دولار أمريكي في تسلسل Sanger.

كنت أفكر في القيام بشيء آخر - بعد إنشاء المكتبة ، قل في أجزاء من 384 ، أرسلهم إلى NGS على Illumina MiSeq.

طلب المساعدة

بشرط:

  • أنا لست مرتبطًا بأي بروتوكول NGS معين ،
  • هدفنا الوحيد هنا هو ، بطريقة أو بأخرى ، التحقق من تسلسل البلازميدات المستنسخة.
  • 1000 بروتين هو الملعب المناسب لعدد البروتينات التي تحتاج إلى التحقق من تسلسلها. 4 بلازميدات لكل مركب بروتين.

ما هي استراتيجية التسلسل المناسبة التي يمكن أن تساعدنا في الوصول إلى أقل من 80 ألفًا لتكاليف التسلسل؟


يجب أن تمكّنك معظم أساليب NGS من تسلسل كل تلك البلازميدات بتكلفة منخفضة جدًا لقيم كل قاعدة (يرجى الاطلاع هنا لمزيد من الأسعار). التحدي في تسلسلها جميعًا ، إذا كانت هناك تسلسلات مشتركة بين جميع البلازميدات ، سيكون الحصول على محولات لكل عينة / بلازميد بحيث يمكن إعادة تعيين القراءات إلى البلازميدات الصحيحة.


انخفض سعر تسلسل الحمض النووي من 2.7 مليار دولار إلى 300 دولار في أقل من 20 عامًا

كان تسلسل G enome باهظ التكلفة في يوم من الأيام. استغرق مشروع الجينوم البشري ، وهو جهد دولي لفك تشفير الجينوم البشري بدأ في عام 1990 ، 13 عامًا وما يقدر بنحو 2.7 مليار دولار لإكماله. ثم ، في عام 2007 ، أصبح رائد الحمض النووي جيمس واتسون أول شخص يحصل على تسلسل الجينوم الخاص به بأقل من مليون دولار. منذ ذلك الحين ، كانت تكلفة تسلسل الجينوم تتناقص بمعدل أسرع من قانون مور.

الآن ، تطلق Nebula Genomics ، وهي فرع من جامعة هارفارد شارك في تأسيسها عالم الوراثة جورج تشيرش ، اختبار تسلسل الجينوم الكامل في المنزل بأقل من سعر أحدث ساعة Apple Watch. بسعر 299 دولارًا ، توفر خدمة نيبولا قراءة كاملة للشفرة الجينية للشخص.

يعد تسلسل Nebula اختبارًا أكثر شمولاً من الاختبارات التي تقدمها شركات مثل 23andMe و Ancestry ، والتي تستخدم تقنية مختلفة تسمى التنميط الجيني. ينظر التنميط الجيني إلى جزء صغير فقط من الجينوم. على سبيل المثال ، تبلغ تكلفة اختبار الصحة والنسب الذي أجرته شركة 23andMe مبلغ 199 دولارًا عن عدد قليل من المتغيرات الجينية المرتبطة بعشرات الحالات الصحية. التسلسل يبحث في جميع جينات الشخص ومتغيراتها. إنه الفرق بين قراءة بضع صفحات مقابل كتاب كامل.

يعد تسلسل Nebula اختبارًا أكثر شمولاً من الاختبارات التي تقدمها شركات مثل 23andMe و AncestryDNA.

في عام 2016 ، كانت شركة Veritas Genetics ومقرها بوسطن ، والتي شارك في تأسيسها أيضًا تشيرش ، أول شركة تكسر عتبة 1000 دولار لتسلسل الجينوم. في العام الماضي ، خفضت شركة فيريتاس هذا السعر إلى 599 دولارًا ، مما أدى إلى التشغيل الآلي للانخفاض. ولكن في نهاية عام 2019 ، أغلقت الشركة فجأة عملياتها في الولايات المتحدة بعد ما وصفته الشركة الناشئة "بحالة تمويل غير متوقعة".

اليوم ، تقدم نيبولا تسلسلًا أرخص للجينوم - وتحاول تجربة نموذج عمل جديد. تعتمد معظم شركات اختبار الحمض النووي الأخرى في المنزل على الشراء لمرة واحدة. ليس لدى العملاء سبب وجيه لمواصلة علاقتهم بهذه الشركات بعد مراجعة نتائج الحمض النووي الخاصة بهم. للحفاظ على عودة الناس ، تطلق Nebula خدمة اشتراك توفر تحديثات أسبوعية حول دراسات الجينات الجديدة وتشرح للمستخدمين كيفية ارتباط هذه النتائج بالحمض النووي الخاص بهم. للحصول على هذه الأفكار الإضافية ، يمكن للعملاء دفع رسوم شهرية قدرها 9.99 دولارًا أمريكيًا شهريًا للاشتراك السنوي أو 19.99 دولارًا للاشتراك الشهري بالإضافة إلى 299 دولارًا أمريكيًا لتسلسل الجينوم. يحصل عملاء نيبولا أيضًا على تحليل أسلاف متعمق.

"أعتقد أن الاتجاه الذي يسير فيه السوق بأكمله هو توفير اختبارات أكثر شمولاً تتجاوز الأصول" ، كما يقول دينيس جريشين ، المؤسس المشارك والرئيس التنفيذي لشركة نيبولا ، مشيرًا إلى الاختبارات الجينية المباشرة للمستهلكين بشكل عام.

في الواقع ، تتبع شركة الأنساب Ancestry نهجًا مشابهًا. في أكتوبر ، أعلنت عن اختبار فحص صحي جديد مقابل 199 دولارًا والتي ستبلغ مبدئيًا عن حفنة من الحالات الطبية. تمنح رسوم الاشتراك نصف السنوية البالغة 49 دولارًا للمستخدمين تحديثات حول معلوماتهم الجينية كل بضعة أشهر. الاختبار غير متاح حتى الآن ، لكن Ancestry تقول إنه سيتم إطلاقه في وقت ما في عام 2020. في الوقت الذي وصل فيه جنون الاختبارات الجينية في المنزل إلى فترة هدوء ، قد تثير هذه الخدمات الموسعة اهتمامًا جديدًا.

تأمل Nebula في تمييز نفسها بشكل أكبر من خلال اتخاذ مسار مختلف عندما يتعلق الأمر بالخصوصية. مثل شركات اختبار الحمض النووي الأخرى ، تشارك Nebula بيانات المستخدمين مع شركاء البحث ، مثل شركات الأدوية. لكنه يوفر للعملاء مزيدًا من التحكم في بياناتهم الجينية أكثر من المعتاد. لدى Ancestry و 23andMe خياران لمشاركة بياناتك للبحث: موافقة شاملة تسمح للشركات بمشاركة بياناتك الجينية غير المحددة الهوية مع أي شريك بحث يريد استخدامها وخيار عدم مشاركة بياناتك على الإطلاق. تقدم Nebula هذه الخيارات أيضًا ، بالإضافة إلى خيار ثالث: يمكن للمستخدمين اختيار تلقي طلب موافقة منفصل في كل مرة يريد فيها شريك البحث استخدام بياناته.

في الوقت الذي وصل فيه جنون الاختبارات الجينية في المنزل إلى حالة من الهدوء ، يمكن أن تثير هذه الخدمات اهتمامًا جديدًا.

يقول Grishin: "نحاول التأكد من أن كل شيء شفاف للغاية ، وأن يعرف الناس ما يحدث لبياناتهم ، ومن يستخدمها ولأي غرض". يستخدم Nebula blockchain لحماية بيانات العملاء ويقدم تسلسلًا مجهولاً للجينوم.

يبقى أن نرى ما إذا كان هناك سوق شامل لتسلسل الجينوم الكامل. تقول جيليان هوكر ، رئيسة الجمعية الوطنية للمستشارين الوراثيين ، إن إحدى العقبات هي أن العديد من الأشخاص لم يسمعوا للتو بتسلسل الجينوم الكامل أو يشككون في مدى فائدة النتائج في إدارة صحتهم. بعد كل شيء ، لا يزال العلماء يتعلمون كيفية تفسير الجينوم ، ومعظم الأطباء لا يعرفون حتى الآن ماذا يفعلون بنتائج اختبارات تسلسل الجينوم الكامل.

يقول هوكر: "هناك نسبة صغيرة من الأشخاص الذين حصلوا على تسلسل الجينوم والذين يتعلمون شيئًا سيغير رعايتهم الصحية". على سبيل المثال ، قد يتعلم الشخص أن لديه متغيرًا جينيًا يزيد من خطر الإصابة بالسرطان أو أمراض القلب ، لذلك قد يوصي الطبيب بإجراء فحص أكثر تكرارًا لهذه الحالات. في الوقت الحالي ، لا يبتعد معظم الناس بمعلومات عملية ، كما تقول. لكن من المرجح أن يتغير هذا مع تطور فهم العلماء لعلم الوراثة.

مع انخفاض السعر بشكل متزايد ، يمكن أن يحل تسلسل الجينوم الكامل قريبًا محل الاختبارات الجينية الأكثر محدودية التي تهيمن على السوق اليوم.


ما هي تكلفة تسلسل الجينوم البشري؟ (مع الصور)

ربطت مجموعتان في تسلسل الجينوم البشري الأول - مشروع الجينوم البشري ، بتمويل من وزارة الطاقة الأمريكية ، وشركة سيليرا جينوميكس ، وهي شركة خاصة. استغرق مشروع الجينوم البشري 10 سنوات وبلغت تكلفته 3 مليارات دولار أمريكي (دولار أمريكي) ، بينما استغرق مشروع تسلسل جينوم سيليرا عامين وتكلف 300 مليون دولار أمريكي فقط. انتهى المشروعان في عام 2000 أو 2001 ، اعتمادًا على ما يعتبر تسلسلًا "كاملًا" للجينوم البشري.

كانت علامة تسلسل الجينوم البشري مهمة للغاية لأنها أعطتنا وصفًا مباشرًا للشفرة الكامنة وراء خلق الإنسان ، حتى لو فهمنا أجزاء صغيرة منه فقط. تم العثور على عدد الجينات في الجينوم البشري ما بين 20000 و 25000 ، وهو أقل مما كان متوقعا. مع استمرار تسلسل المزيد من الجينومات ، تزداد معرفتنا بمحتوياتها ، وكذلك قدرتنا على تطبيق هذه النتائج بشكل مفيد على الطب الشخصي.

تم تخفيض تكاليف التسلسل الجيني بشكل كبير منذ تسلسل الجينوم البشري في عام 2000. في عام 2001 ، تم الانتهاء من تسلسل الجينوم لجيمس واتسون ، وهو مكتشف مشارك لبنية الحمض النووي ، بتكلفة 2 مليون دولار أمريكي. في عام 2008 ، تم بيع أول خدمات تسلسل الجينوم الكامل تجاريًا للعملاء بتكلفة 100000 دولار أمريكي. بحلول آذار (مارس) 2008 ، أكملت شركة أبلايد بايوسستمز (Applied Biosystems) تسلسل الجينوم البشري في غضون أسبوعين مقابل 60 ألف دولار أمريكي ، وهي أفضل تكلفة حتى الآن. طورت شركة أخرى ، هي Intelligent Bio-Systems ، نظامًا يمكنه تسلسل جينوم بشري كامل في غضون 24 ساعة مقابل 5000 دولار أمريكي.

تم تقديم سعر لأول 100 جينوم بشري مقابل 10000 دولار أمريكي لكل منها في عشرة أيام أو أقل. جائزة 10 ملايين دولار أمريكي ، التي تبرع بها المنقب عن الماس ستيوارد بلوسون ، ستستمر حتى الموعد النهائي في 4 أكتوبر 2013. يعتقد العديد من العلماء حول العالم أنه من المحتمل جدًا أن يتم المطالبة بالجائزة قبل الموعد النهائي ، وربما قبل ذلك بكثير.

إذا كانت تكلفة تسلسل الجينوم أقل من 1000 دولار أمريكي ، أو أفضل من 500 دولار أمريكي ، فإن العديد من المستقبليين توقعوا تغييرات نوعية في الطريقة التي نستخدم بها الطب. إذا تم تسلسل ملايين الجينوم وإتاحتها للجمهور ، فإن المعرفة المحتملة التي سيتم اكتسابها لعلم الوراثة ستكون هائلة.

مايكل هو مساهم قديم متخصص في الموضوعات المتعلقة بعلم الحفريات والفيزياء وعلم الأحياء وعلم الفلك والكيمياء والمستقبل. بالإضافة إلى كونه مدونًا شغوفًا ، فإن مايكل متحمس بشكل خاص لأبحاث الخلايا الجذعية والطب التجديدي وعلاجات إطالة الحياة. وقد عمل أيضًا في مؤسسة Methuselah ومعهد التفرد للذكاء الاصطناعي ومؤسسة Lifeboat.

مايكل هو مساهم قديم متخصص في الموضوعات المتعلقة بعلم الحفريات والفيزياء وعلم الأحياء وعلم الفلك والكيمياء والمستقبل. بالإضافة إلى كونه مدونًا شغوفًا ، فإن مايكل متحمس بشكل خاص لأبحاث الخلايا الجذعية والطب التجديدي وعلاجات إطالة الحياة. وقد عمل أيضًا في مؤسسة Methuselah ومعهد التفرد للذكاء الاصطناعي ومؤسسة Lifeboat.


تفاعلات البروتين والبروتين: نظرة عامة

محاذاة التسلسل المتعدد (MSA) - التنبؤ بالتفاعل القائم على التسلسل

مع شعبية متسلسلات الحمض النووي ، تم تنفيذ العديد من مشاريع الجينوم ، وتم تسلسل الجينوم للكائنات المختلفة وتوضيحها. تتوفر العديد من الجينومات كتسلسل الأحماض الأمينية أو النوكليوتيدات في العديد من قواعد البيانات العامة ، وتعد GenBank و EMBL و DDBJ أكبر مستودعات لهذه المعلومات. على عكس العدد المنخفض للهياكل ثلاثية الأبعاد ، فإن عدد التسلسلات في قواعد البيانات العامة أعلى للغاية ، ويفضل المجتمع العلمي الذي يستخدم هذه التسلسلات في أبحاثهم ، بما في ذلك التنبؤ بالتفاعل. تستخدم فئة من الأساليب محاذاة تسلسل متعدد (MSA) للتنبؤ بالتفاعل بين البروتين والبروتين ، ويستند كل منها إلى فرضية بيولوجية تهدف عمومًا إلى تحديد الحفظ بين تسلسل الكائنات الحية باستخدام برنامج المحاذاة. هم انهم:

التنبؤ المستند إلى الملف الشخصي الوراثي (التواجد المشترك): تعتمد الطريقة على فرضية بيولوجية مفادها أنه في حالة بقاء جينين محفوظين عند مقارنة العديد من الكائنات الحية ، سيتفاعل البروتين المعني المترجم من هذه الجينات. يصبح هذا الافتراض أقوى عندما لا يكون كلا الجينين المحفوظين موجودين في كائن واحد أو أكثر مقارنةً ، مما يدل على الضغط الانتقائي لكليهما يبقى أو يُزال معًا من الجينوم. يتمثل عدم اليقين في استخدام هذه الطريقة في تحديد مدى بُعد الكائنات الحية من الناحية التطورية ، وبالتالي ، من خلال اختيار الكائنات القريبة يجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت البروتينات محفوظة لأنها تحت ضغط تطوري أو ببساطة لأنه لم يكن هناك وقت كافٍ للتباعد. كلما كانت الكائنات الحية أكثر بعدًا ، كان التنبؤ أكثر موثوقية ، ولكن سيتم تحديد تفاعلات أقل (فالنسيا وبازوس ، 2002).

التنبؤ القائم على جينات الحي: هذه الطريقة هي تطور للطريقة السابقة ، وتعتبر نفس الفرضية وتقدم نفس الشك ، ولكنها تعتبر أن الجينات ، بالإضافة إلى كونها محفوظة ، يجب أن تكون جيران. تعطي هذه الطريقة الأولوية لتحديد حفظ الجينات الأقرب مع الأخذ في الاعتبار أنها تميل إلى التطور في فترات مماثلة ، مثل الأوبرايت التي يتم نسخها وترجمتها في نفس الوقت ، وربما تولد هياكل بروتينية تتفاعل في نفس الوظيفة أو المسار الأيضي (فالنسيا وبازوس ، 2002).

التنبؤ المستند إلى شجرة النشوء والتطور (Mirrortree): تعتمد الطريقة على فرضية بيولوجية مفادها أنه في حالة تفاعل بروتينين ، فإنهما يخضعان لضغوط تطورية مماثلة ويتطوران معًا في كائن حي (Zhou and Jakobsson ، 2013). وهكذا ، عند مقارنة نفس البروتين في العديد من الكائنات الحية ، فإن البروتينات المتفاعلة ذات الصلة ، ستقدم شجرة نسالة مماثلة ، واحدة معكوسة في الأخرى ، تمثل تطورًا مشابهًا في الكائنات الحية المختلفة. ومع ذلك ، قد تتفاعل البروتينات التي تتطور بشكل مختلف أيضًا ويتم تجاهلها بهذه الطريقة. لتحديد تفاعل سلالات البروتينات المختلفة ، وكشفت أشجار النشوء والتطور التي تقدم طوبولوجيا مماثلة عن البروتينات المشاركة في التفاعل (Pellegrini وآخرون.، 1999). يمكن جعل ذلك ممكنًا عن طريق تحويل أزواج من أشجار النشوء والتطور إلى مصفوفة مسافة وحساب معامل الارتباط. تشير المصفوفات ذات معامل الارتباط العالي إلى شجرة نسج مع طوبولوجيا مماثلة.

طريقة الانصهار الجيني: الفرضية البيولوجية التي تقوم عليها هذه الطريقة هي وجود جينين (ga، gb) في كائن حي له مجالات وظيفية متماثلة مع جين واحد في كائن آخر قريب نسبيًا (gc) ، وربما البروتينات المشفرة بواسطة الجينين الفرديين (pa و pb ) تتفاعل جسديًا لتلعب دورها ، وذلك من خلال عملية تطورية أدت إلى اندماج الجينات وترجمة بروتين واحد إلى كائن حي آخر (الكمبيوتر). يمكن تحديد التماثل بين الجينات من خلال محاذاة التسلسل ويصبح هذا الافتراض أقوى عندما يدرك المرء في محاذاة متعددة مجموعة من الكائنات الحية تقدم الجينين الفرديين ومجموعة أخرى تقدم الجينات المندمجة (ظاهري) وآخرون., 2013 ).


تسلسل الجيل القادم

منذ عام 2005 ، أصبحت تقنيات التسلسل الآلي التي تستخدمها المختبرات تحت مظلة الجيل التالي من التسلسل ، وهو عبارة عن مجموعة من التقنيات الآلية المستخدمة لتسلسل الحمض النووي السريع. يمكن أن تولد أجهزة التسلسل الآلية منخفضة التكلفة هذه تسلسلات من مئات الآلاف أو ملايين الأجزاء القصيرة (من 25 إلى 500 زوج أساسي) في غضون يوم واحد. تستخدم أجهزة التسلسل هذه برامج متطورة لتجاوز العملية المرهقة المتمثلة في ترتيب جميع الأجزاء.


تسلسل الحمض النووي الريبي الخلوي عالي الإنتاجية (HiCAR-Seq): طريقة فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية 3 ′ mRNA-Seq تمكن من التحكم في جودة العينة الفردية

يعد الفحص عالي الإنتاجية أحد ركائز تطوير الأدوية. يتم الآن استخدام التنميط غير المتحيز للنسخة على نطاق واسع من أجل فهم أعمق لآليات عمل الدواء ، والتأثيرات البعيدة عن الهدف ، والسمية الخلوية. على الرغم من أن طرق RNA-Seq (HT RNA-Seq) عالية الإنتاجية المتوفرة حاليًا مثل PLATE-Seq و DRUG-Seq و BRB-Seq تخدم هذه الأغراض ، إلا أن الطبيعة المتأصلة لهذه الأساليب لا تسمح بمراقبة جودة مكتبة التسلسل حسب العينة . هنا ، نصف طريقة HTR تسمى تسلسل CellulAr RNA عالي الإنتاجية (HiCAR-Seq). تم تحسين HiCAR-Seq للعمل مباشرة على الخلايا المستنبتة (أقل من 1000 خلية) أو 10 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. يتضمن HiCAR-Seq النسخ العكسي من الخلايا المستنبتة أو الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام بادئات oligo-dT متبوعة بتضخيم PCR لـ cDNAs كامل الطول باستخدام بادئات الباركود الخاصة بالعينة في آبار اللوحة الفردية. يمكن التحقق من تضخيم (كدنا) من كل عينة باستخدام Bioanalyzer. لا تكشف هذه الخطوة عن تضخيم (كدنا) فحسب ، بل توفر أيضًا دقة أكبر لتجميع تركيزات متساوية من (كدنا) من عينات مختلفة. تم تصميم مكتبة cDNA مجمعة واحدة مناسبة للتسلسل على أجهزة تسلسل Illumina باستخدام مجموعة علامات. نظرًا لأن HiCAR-Seq يستهدف منطقة صغيرة عند 3 من mRNAs ، فإن ما لا يقل عن 3 إلى 4 ملايين قراءة / عينة كافية لاستنتاج التغييرات في التعبير الجيني في خلايا الإنسان أو الفئران. نعتقد أن HiCAR-Seq يمثل إضافة قوية وتنافسية إلى المجموعة الحالية من طرق الفرز عالية الإنتاجية القائمة على النسخ. © 2020 وايلي الدوريات ذ.

البروتوكول الأساسي 1: التوليف (كدنا) والتشفير الشريطي / التخصيب PCR

البروتوكول الأساسي 2: توصيف / تضخيم Nextera ، القياس الكمي ، والتسلسل


تسلسل الحمض النووي

تسلسل الحمض النووي هو عملية قراءة قواعد النوكليوتيدات في جزيء الحمض النووي. افتح الجينوم وأجب عن الأسئلة الأكثر تحديًا في علم الأحياء من خلال حلول التسلسل المبتكرة التي يمكن الوصول إليها.

لأكثر من 25 عامًا ، ساهمت أدوات التسلسل لدينا في تحقيق اختراقات علمية مهمة ، بما في ذلك تسلسل الجينوم البشري الأول واكتشاف الجينات المتورطة في أمراض مثل التليف الكيسي. يستمر ابتكارنا المستمر في تقنيات التسلسل في دفع الاكتشافات الجديدة.

من تسلسل الجينوم الكامل إلى التسلسل المستهدف لمناطق جينومية معينة ، تدعم محفظة التسلسل لدينا مجموعة واسعة من الإنتاجية واحتياجات تطبيقات البحث لتسلسل الحمض النووي.


تقنيات التسلسل من الجيل التالي

على الرغم من أن تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي له تاريخ يمتد لخمسة عقود ، إلا أن التسلسل المتوازي على نطاق واسع ، أو تسلسل الجيل التالي (NGS) ، لم يكن متاحًا تجاريًا إلا لمدة 10 سنوات تقريبًا. ومع ذلك ، فإن الزيادة النيزكية في إنتاج التسلسل باستخدام NGS قد غيرت بشكل كبير فهمنا لجينومنا وأنفسنا. استغرق تسلسل أول جينوم بشري كمرجع أحادي الصبغية ما يقرب من 10 سنوات ، ولكن الآن يمكن إنجاز تسلسل جينوم بشري ثنائي الصبغة كامل في غضون أيام قليلة. قللت NGS أيضًا من تكلفة إنشاء بيانات التسلسل وظهرت عدد كبير من الأساليب القائمة على التسلسل لفحص الجينوم باستخدام NGS كقراءة وتم تطبيقها على العديد من الأنواع. دخلت طرق NGS أيضًا المجال الطبي وستشهد استخدامًا متزايدًا في التشخيص والعلاج. كانت NGS مدفوعة إلى حد كبير بتوليد القراءة القصيرة (150 نقطة أساس) ولكن ظهرت منصات جديدة وهي الآن قادرة على توليد قراءات طويلة متعددة القواعد. تتيح هذه الأنظمة الأساسية الأخيرة تجميعات الجينوم المستقلة المرجعية وتوليد النمط الفرداني بعيد المدى. أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي السريع والحمض النووي الريبي سائدًا الآن وسيستمر تأثيره المتزايد على البيولوجيا والطب.

حقوق النشر © 2019 Cold Spring Harbour Laboratory Press جميع الحقوق محفوظة.


تجزئة الحمض النووي الريبي وتسلسله (RF-Seq): بناء مكتبة تسلسل 3 ′ mRNA فعال من حيث التكلفة وموفر للوقت وعالي الإنتاجية في أنبوب واحد

على مدى العقد الماضي ، ساهمت دراسات النسخ باستخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) من الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) بشكل كبير في توصيف التغيرات الكيميائية الحيوية والفسيولوجية في الخلايا والأنسجة عبر الكائنات الحية والظروف التجريبية. تشمل الخطوات الحاسمة في RNA-Seq إعداد مكتبة التسلسل من الحمض النووي الريبي المستخرج. حاليًا ، تتوفر مجموعة كبيرة من مجموعات RNA-Seq تجارياً. في هذه المجموعات ، يتضمن تحويل RNA إلى مكتبة تسلسل خطوات متعددة ، والتي تتطلب عمالة مكثفة ، وقد تحد التكلفة لكل عينة لإعداد المكتبة من الاستخدام الروتيني لـ RNA-Seq. نحن هنا نصف طريقة بسيطة لبناء مكتبة RNA-Seq ، يشار إليها باسم Ragmentation R NA F و Seq uencing (RF-Seq). يتطلب RF-Seq أقل من 10 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي ويسهل تسلسل 3 ′ نهاية mRNAs. يتضمن RF-Seq تجزئة إجمالي الحمض النووي الريبي متبوعًا بنسخ عكسي في وجود قليل النوكليوتيد التمهيدي / النموذجي وعينة تشفير / تخصيب داخل أنبوب / بئر PCR واحد. توفر خطوة الترميز الشريطي / الإثراء للعينة مزيدًا من المرونة للتعامل مع العينة الفردية. إن استخدام عشرين من البادئات المتعامدة من نوع Illumina TruSeq HT الباركود يسهل إعداد 96 مكتبة RF-Seq ذات العلامات الفريدة في لوحة PCR واحدة بها 96 بئر. يمكن إعداد اثنتي عشرة مكتبة RF-Seq في غضون 4 ساعات ، بتكلفة تقريبية تبلغ 10 دولارات للعينة. نقدم مثالاً على استخدام RF-Seq لقياس التعبير الجيني عند تنشيط مسار مناعي فطري باستخدام منشط STING في خلايا الدم البشرية ، مع إبراز الفائدة المحتملة للطريقة المقترحة في تطبيقات النسخ الروتينية مثل فحص الأدوية عالي الإنتاجية و / أو فحوصات السمية قبل السريرية. © 2019 بواسطة John Wiley & Sons، Inc.

البروتوكول الأساسي: تجزئة الحمض النووي الريبي وتسلسله (RF-Seq): بناء مكتبة تسلسل 3 ′ mRNA فعال من حيث التكلفة وموفر للوقت وعالي الإنتاجية في أنبوب واحد


كشف الدرجات

سايمون إريكسون ، المستشار الرئيسي في Motley Fool Explorer: مرحبا جميعا. أنا سايمون إريكسون ، مستشار Motley Fool Explorer الرئيسي ، وأنا هنا في مؤتمر التكنولوجيا الحيوية الصناعية في فيلادلفيا ، بنسلفانيا. انضم إليّ مات ماكنايت ، وهو المدير التجاري لشركة Ginkgo Bioworks.

مات ، شكرا مرة أخرى لانضمامك لي هذا الصباح.

مات ماكنايت ، المدير التجاري لشركة Ginkgo Bioworks: سعيدا أن أكون هنا.

سيمون: نحن نتحدث عن البيولوجيا التركيبية ، وهو مصطلح ربما لا يعرفه الكثير من جمهورنا. ماذا تعني البيولوجيا التركيبية حتى؟

غير لامع: على أعلى مستوى ، إنها واحدة من أكثر التقنيات المدهشة التي لم نستغلها بعد في التصنيع. لذلك إذا كنت تفكر في تعليمك في المدرسة الثانوية. لقد أخذت الفيزياء. اكتشف شخص ما تحويل الفيزياء إلى مبانٍ لا تسقط بعد الآن.

لقد تناولت الكيمياء ، وأخذ شخص ما الكيمياء وقال إننا سنقوم بإنشاء هندسة كيميائية ، وسنحولها إلى عملية قابلة للتكرار.

اليوم ، نحن على أعتاب أخذ آخر تخصص في المدرسة الثانوية ، علم الأحياء ، وهذا - على أعلى مستوى (وكان جميع زملائي ينظرون إلي ويقولون ، "الأمر أكثر تعقيدًا من ذلك بكثير ، يا مات . ") - لكننا على وشك أخذ علم الأحياء ونقول أن هذا يمكن أن يكون تخصصًا هندسيًا يمكن التنبؤ به ويمكننا استخدامه لتصنيع كل شيء من حولنا.

وإذا فكرت في الأمر ، حقيقة أننا لا نصنع كل شيء من حولنا ، عندما يتم إنشاء العالم من خلال علم الأحياء ، أكبر الأشياء: الغابات. أصغر الأشياء: 30،000 محرك RPM وحجم أصغر شريحة كمبيوتر كلها من صنع علم الأحياء. ومع ذلك ، لا نمتلك الأدوات التي يمكننا من خلالها بشكل متوقع ومع احتمال كبير استخدام علم الأحياء كأداة هندسية للبشرية.

إذن ، ما هي البيولوجيا التركيبية؟ إنها عملية أخذ الحمض النووي ، وهي عبارة عن أصفار وآحاد فقط ، مثل الكمبيوتر ، تصادف أن تكون أربعة منها: A و T و C و G. بإخبار تلك الخلايا ، هذه هي الإرشادات التي نريدك أن تقدمها. نريدك أن تأكل السكر ، نريدك أن تفعل شيئًا وتصنع منتجًا. وهذه هي البيولوجيا التركيبية. إنه الحمض النووي الذي نصنعه تسلسلًا خاصًا بنا من 0 و 1 ، أو A ، و T ، و Cs ، و Gs. ضعهم في الخلايا. وأخبر تلك الخلايا أننا نريد أن نجعلها شيئًا يمكن للبشر استخدامه. وهذه هي النسخة الأساسية التي يمكنني تقديمها لك.

سيمون: لذا على مستوى الأرض ، نحن نقوم بهندسة الأشياء من الألف إلى الياء ، ونصنع منتجات رائعة حقًا للقيام بأشياء رائعة منها.

غير لامع: أشياء لم نتمكن من القيام بها في تاريخ التحكم البشري في أجزاء مختلفة من بيئتنا من حولنا.

سيمون: أحد هذه الأشياء ، رأينا JV التي أنشأتها يا رفاق العام الماضي مع Bayer ، تسمى Joyn Bio ، والتي يتم استخدامها بالفعل في الصناعة الزراعية ، هل يمكنك إخبارنا قليلاً عما يهدف هذا المشروع المشترك إلى تحقيقه؟

غير لامع: نعم ، أعتقد أنه من المهم البدء في سياق البيولوجيا التركيبية: ما الذي تحاول الجنكة فعله؟

إذن ما قلناه هو مهمتنا. والمهمة التي نضعها أمام فريقنا كل شهر ، هي تسهيل هندسة علم الأحياء ، وجعل هندسة علم الأحياء أرخص. حسنا ماذا يعني ذلك؟ حسنًا ، الحقيقة البسيطة هي أننا نهتم بشدة بالأدوات التي يحتاج الناس عبر الصناعات لاستخدامها حتى نتمكن من تطبيق علم الأحياء على العديد من الصناعات الأخرى.

لذلك تسأل نفسك ، "لماذا كانت التكنولوجيا الحيوية شيئًا كبيرًا مثل هذا منذ السبعينيات؟" حسنًا ، لأن التكنولوجيا الحيوية لديها رأس مال كافٍ للقيام بهذه الرهانات المحفوفة بالمخاطر. إذا استطعنا إحضار هيكل التكاليف علم الأحياء الهندسي عن طريق بناء الأدوات التأسيسية - وسأعطيكم مثالًا في ثانية - يمكننا إزالة الأدوات ويمكننا تطبيق ذلك على العديد من الصناعات الأخرى.

لذا تركز Ginkgo على: كيف نجعل هندسة علم الأحياء أسهل ، ونقوم بذلك بطريقتين.

نحن نبني المسابك ، وهي ببساطة عملية أخذ علوم البدلاء ، وسحب عمليات الوحدات المنفصلة ، ولف البرامج حولها ، وأتمتتها على الروبوتات ، بدلاً من استخدام عالم حاصل على درجة الدكتوراه.

وثانيًا ، جمع كل البيانات التي تمر من خلال اختباراتنا لتلك الخلايا التي تحدثت عنها وإعادتها إلى عملية التصميم.

لذا فقد ارتفعت كفاءتنا ، إجمالي إنتاجنا ، بأكثر من 60 مرة في السنوات الثلاث الماضية ، بينما ارتفع عدد رؤوسنا بمقدار 7 مرات.

لذلك نحن نخفض تكلفة القيام بهذه الهندسة المعقدة للخلايا بشكل كبير ، وتقول الشركات الكبرى مثل Bayer Cropscience ، "نريد إنشاء منتجات جديدة مذهلة ، ما هي أفضل طريقة للقيام بذلك؟ يمكننا إنفاق مائة مليون دولار ، أو خمسمائة مليون دولار أو مليار دولار على علماء الحمض النووي. أو يمكننا الذهاب إلى الجنكة ومن أجل ذلك المليار دولار أو 500 مليون دولار ، يمكننا إنفاقها 100 مرة من الكفاءة والحصول على نتيجة احتمالية أعلى بكثير لتحقيق الأهداف ".

إذن ماذا تريد باير أن تفعل؟ سأتحدث نيابة عن Ginkgo لأنها شركة منفصلة--

سيمون: بالتأكيد.

غير لامع: Joyn Bio ، وهي شركة منفصلة ، تركز بشكل كبير على الميكروبات الهندسية للقيام بتثبيت النيتروجين.

إذن ، ما هو التطبيق هناك؟ نستخدم اليوم 4٪ من غازات الاحتباس الحراري التي تنتج الأسمدة القائمة على النيتروجين من خلال عملية كيميائية لتغذية الذرة والقمح والأرز ، محاصيلنا الأساسية. إذا كان بإمكانك نسخ البكتيريا التي تعيش على الفول السوداني على سبيل المثال ، فإنها تقوم بهذه العملية بشكل طبيعي ، وكان من المفترض أن تنمو على الذرة ، يمكنك تقليل انبعاثات الكربون هذه. يمكنك قطع الحاجة إلى الأسمدة القائمة على النيتروجين. يمكنك تخيل حجم سوق الأسمدة القائمة على النيتروجين.

سيمون: تسربت.

غير لامع: . أننا سنكون قادرين على القيام بذلك معًا من خلال Joyn Bio.

سيمون: لذلك تساعد محاصيل الصف على تعزيز امتصاص النيتروجين. تبدو فرصة جيدة هناك.

غير لامع: إنها إحدى فرص الكأس المقدسة لكيفية استخدام علم الأحياء لتحسين كمية الطعام الذي ننتجه للعالم ، لدعم عدد متزايد من السكان ، للقيام بذلك بأقل ضرر للبيئة - إنها واحدة من العديد من الفرص العظيمة. هذا هو الأكثر وضوحا.

سيمون: الآن مات ، هذه فرصة كبيرة. ربما يمكننا التوقف عند هذا الحد. لكني سأطلب منك المزيد. ما هي بعض الفرص الأخرى خارج صناعة الزراعة التي تعمل عليها Ginkgo أيضًا الآن؟

غير لامع: لذلك ، نحن ننظر إلى هذا على أنه تحول أساسي في كيفية تصنيع العالم للأشياء.

بصراحة ، يمكنك القول حرفيًا أن كل جزء من الناتج المحلي الإجمالي تقريبًا يحتوي على جزء من سلسلة التوريد الخاصة به والذي يجب أن يتأثر بالبيولوجيا. لذا فإن نهجنا هو تسهيل هندسة علم الأحياء ، وجعل هندسة الأحياء أرخص ثم اكتشاف طرق يمكننا من خلالها الشراكة مع الشركات الكبرى في مجالات التطبيق الرائعة التي تعلم أنها بحاجة إلى إدخال علم الأحياء في نظام التصنيع الخاص بهم. لقد أدخلوا الفيزياء ، وأدخلوا الكيمياء ، وهم يعلمون أنهم بحاجة إلى إدخال علم الأحياء.

لذا يمكنك إلقاء نظرة على التغييرات الكلية في البيئة والقول ، "أين تلك الأماكن؟" من الواضح أنه موجود في الوقود الحيوي ، والذي كان نوعًا من القوس الرئيسي الأول لهذه الصناعة. لكن الآن تنظر فقط إلى الصحافة ، "كيف سنطعم العالم على جانب البروتين؟" هناك الكثير من الأطعمة الجديدة التي سيتم إنتاجها بيولوجيًا من الأطعمة الجديدة التي نهتم بها للغاية. نحن هنا في Industrial Biotech لأن هناك عددًا متزايدًا من التطبيقات الصناعية من كيفية استخدام الإنزيمات وكيفية استخدام علم الأحياء عبر الطيف .

هذه هي فرص السوق الكبيرة. نشعر أن كل الناتج المحلي الإجمالي سيتأثر. لكننا أيضًا مفتونون تمامًا بالقوة ، وبصراحة نتواضع بقوة علم الأحياء كل يوم ، ونشعر أنه من المهم جدًا احترام هذه الأشياء ، لذلك نحن منخرطون جدًا [في] مساعدة المجتمع الحكومي على التأكد من وجود حول التنظيم والحماية المناسبة حول كيفية تنفيذ هذه الأشياء.

جيسون ، الرئيس التنفيذي لدينا ، قام للتو بإعلان كبير عن بعض أعمالنا مع مجتمع الأمن القومي. حقًا حول التأكد من عدم وجود ردود فعل سيئة من الفاعلين في هذه البيئة. الجزء الأكثر متعة هو أننا معجبون بجوراسيك بارك.

سيمون: كما أنا.

غير لامع: . لأنك عندما ترى Jurassic Park ، ترى قوة علم الأحياء ، لذلك حقًا كدليل على ما نقوم به ، ليس بالضرورة كمنتج رئيسي ، قبل بضع سنوات ، ذهب فريقنا إلى Harvard Botany Lab ووجد بعض الزهور المنقرضة. زهرة منقرضة عاشت منذ سنوات عديدة ، وسلسلة الحمض النووي ووجدت جزءًا من الحمض النووي المسؤول عن الرائحة.

نضعها في بعض الخميرة ، هندست تلك الخميرة لإنتاج التربين ، وهي المادة الكيميائية التي تصنع تلك الرائحة ، وصنعنا العطور منها.

سيمون: أحبها.

غير لامع: لذلك لدينا عطر زهرة منقرض. إنها الخطوة الأولى من حديقة جراسيك. لذلك هذا ما نشعر بالحماس تجاهه.

سيمون: حسنًا ، البيولوجيا التركيبية هي بالتأكيد فرصة يجب أن تراقبها هناك. وأعتقد أن شركة Ginkgo Bioworks هي شركة يجب أن تكون على رادارك. لدينا مات ماكنايت هنا ، وهو كبير المسؤولين التجاريين في شركة جينكو بايووركس.


شاهد الفيديو: Dehancer in DaVinci Resolve: Node Tree Order Sequence - Its Not a LUT (يونيو 2022).