معلومة

12.18: الريبوسومات - علم الأحياء

12.18: الريبوسومات - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يستهلك تخليق البروتينات طاقة الخلية أكثر من أي عملية استقلابية أخرى. يحتوي كل حمض أميني فردي على مجموعة أمينية (NH2) ومجموعة الكربوكسيل (COOH). يتم تحفيز هذا التفاعل بواسطة الريبوسومات ويولد جزيء ماء واحد.

ماكينات تصنيع البروتين

بالإضافة إلى نموذج mRNA ، تساهم العديد من الجزيئات والجزيئات الكبيرة في عملية الترجمة. قد يختلف تكوين كل مكون عبر الأنواع ؛ على سبيل المثال ، قد تتكون الريبوسومات من أعداد مختلفة من الرنا الريباسي وعديد الببتيدات اعتمادًا على الكائن الحي. ومع ذلك ، فإن الهياكل والوظائف العامة لآلية تخليق البروتين قابلة للمقارنة من البكتيريا إلى الخلايا البشرية. تتطلب الترجمة إدخال نموذج mRNA وريبوسومات و tRNAs وعوامل إنزيمية مختلفة.

Polysomes

حتى قبل أن تتم ترجمة mRNA ، يجب على الخلية أن تستثمر الطاقة لبناء كل من الريبوسومات الخاصة بها. في بكتريا قولونية، هناك ما بين 10000 و 70000 ريبوسوم موجودة في كل خلية في أي وقت. الريبوسوم عبارة عن جزيء ضخم معقد يتألف من جزيئات الحمض النووي الريبي الهيكلية والحافزة ، والعديد من عديد الببتيدات المتميزة. النواة في حقيقيات النوى متخصصة تمامًا في تركيب وتجميع الرنا الريباسي.

توجد الريبوسومات في السيتوبلازم في بدائيات النوى وفي السيتوبلازم والشبكة الإندوبلازمية الخشنة في حقيقيات النوى. تمتلك الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء أيضًا ريبوسومات خاصة بها في المصفوفة والسدى ، والتي تبدو أكثر تشابهًا مع الريبوسومات بدائية النواة (ولها حساسيات دوائية مماثلة) من الريبوسومات الموجودة خارج أغشيتها الخارجية في السيتوبلازم. تنفصل الريبوسومات إلى وحدات فرعية كبيرة وصغيرة عندما لا تقوم بتركيب البروتينات وإعادة الارتباط أثناء بدء الترجمة. القولونية، يتم وصف الوحدة الفرعية الصغيرة على أنها 30S ، والوحدة الفرعية الكبيرة هي 50S ، بإجمالي 70S (تذكر أن وحدات Svedberg ليست مضافة). تحتوي ريبوسومات الثدييات على وحدة فرعية صغيرة 40 ثانية ووحدة فرعية كبيرة 60 ثانية ، بإجمالي 80 ثانية. الوحدة الفرعية الصغيرة مسؤولة عن ربط قالب mRNA ، في حين أن الوحدة الفرعية الكبيرة تربط بالتسلسل الحمض الريبي النووي النقال. يتم ترجمة كل جزيء mRNA في وقت واحد بواسطة العديد من الريبوسومات ، وجميعها تقوم بتوليف البروتين في نفس الاتجاه: قراءة mRNA من 5 ′ إلى 3 وتوليف polypeptide من الطرف N إلى الطرف C. يسمى هيكل mRNA / poly-ribosome الكامل a متعدد الروح.

الحمض الريبي النووي النقال

الحمض النووي الريبي (tRNAs) عبارة عن جزيئات هيكلية من الحمض النووي الريبي تم نسخها من الجينات بواسطة RNA polymerase III. اعتمادًا على الأنواع ، يوجد 40 إلى 60 نوعًا من الحمض الريبي النووي النقال في السيتوبلازم. تعمل كمحولات ، ترتبط tRNAs محددة بالتسلسلات الموجودة في قالب mRNA وتضيف الحمض الأميني المقابل إلى سلسلة polypeptide. لذلك ، الحمض النووي الريبي هو الجزيئات التي "تترجم" لغة RNA إلى لغة البروتينات.

من بين 64 كودون mRNA ممكن - أو مجموعات ثلاثية من A و U و G و C - تحدد ثلاثة منها إنهاء تخليق البروتين و 61 تحدد إضافة الأحماض الأمينية إلى سلسلة البولي ببتيد. من بين هؤلاء الـ 61 ، يشفر كودون واحد (AUG) أيضًا بدء الترجمة. يمكن لكل مضاد tRNA anticodon أن يقترن بأحد أكواد mRNA وإضافة حمض أميني أو إنهاء الترجمة ، وفقًا للشفرة الجينية. على سبيل المثال ، إذا حدث التسلسل CUA على قالب mRNA في إطار القراءة المناسب ، فسيؤدي ذلك إلى ربط الحمض الريبي النووي النقال الذي يعبر عن التسلسل التكميلي ، GAU ، والذي سيتم ربطه مع ليسين الأحماض الأمينية.

وباعتبارها جزيئات مهايئة للترجمة ، فمن المدهش أن الحمض الريبي النووي النقال يمكن أن يلائم الكثير من الخصوصية في مثل هذه الحزمة الصغيرة. ضع في اعتبارك أن الحمض الريبي النووي النقال بحاجة إلى التفاعل مع ثلاثة عوامل:

  1. يجب التعرف عليها من خلال مركب الأمينو أسيل المناسب.
  2. يجب التعرف عليها بواسطة الريبوسومات.
  3. يجب أن ترتبط بالتسلسل الصحيح في mRNA.

Aminoacyl tRNA Synthetases

عملية التوليف قبل tRNA بواسطة RNA polymerase III تخلق فقط جزء RNA من جزيء المحول. يجب إضافة الحمض الأميني المقابل لاحقًا ، بمجرد معالجة الحمض النووي الريبي (tRNA) وتصديره إلى السيتوبلازم. من خلال عملية "شحن" tRNA ، يرتبط كل جزيء tRNA بحمضه الأميني الصحيح من خلال مجموعة من الإنزيمات تسمى aminoacyl tRNA synthetases. نوع واحد على الأقل من aminoacyl tRNA synthetase يوجد لكل من الأحماض الأمينية العشرين ؛ يختلف العدد الدقيق لمركبات aminoacyl tRNA باختلاف الأنواع. ترتبط هذه الإنزيمات أولاً وتحلل ATP لتحفيز رابطة عالية الطاقة بين الأحماض الأمينية والأدينوزين أحادي الفوسفات (AMP) ؛ يتم طرد جزيء بيروفوسفات في هذا التفاعل. ثم يتم نقل الحمض الأميني المنشط إلى الحمض النووي الريبي ، ويتم تحرير AMP.


يتطلب استمرار فيروسات النارنا الغامضة ترجمة إطار القراءة العكسي المفتوح

فيروسات نارنا هي فيروسات الحمض النووي الريبي التي يتم اكتشافها في الفطريات والنباتات والطلائعيات ومفصليات الأرجل والديدان الخيطية المتنوعة. على الرغم من وصفها في البداية بأنها فيروسات بسيطة أحادية الجين غير مجزأة تقوم بتشفير بوليميراز RNA المعتمد على الحمض النووي الريبي (RdRp) ، فإن مجموعة فرعية من فيروسات نارنا يشار إليها باسم "غامضة" تضم تكوينًا جينيًا فريدًا يتكون من إطارات قراءة مفتوحة متداخلة (ORFs) مشفرة على خيوط متقابلة . يدعم التحليل الوراثي الانتقاء للحفاظ على هذا التنظيم الجينومي غير العادي ، لكن التحقيقات الوظيفية غير متوفرة. هنا ، أنشأنا Culex narnavirus 1 (CxNV1) الذي يصيب البعوض كنموذج للتحقيق في الدور الوظيفي لتداخل ORFs في تكرار فيروس Narnavirus. في CxNV1 ، يغطي ORF العكسي بدون تماثل للبروتينات المعروفة تقريبًا كامل المقطع 3.2 كيلو بايت الذي يشفر RdRp. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على اثنين من ORFs الجديدة المتعارضة والمتداخلة تقريبًا في الجزء الثاني المفترض CxNV1 ، 0.8 كيلو بايت "Robin" RNA. لقد طورنا نظامًا لإطلاق CxNV1 في خط خلية بعوض ساذج ، ثم أوضحنا أن RdRp الوظيفي مطلوب لاستمرار كلا الجزأين ، ويلزم وجود ORF عكسي سليم في مقطع RdRp من أجل الثبات. قدم مطياف الكتلة للخلايا المصابة بـ CxNV1 باستمرار دليلاً على ترجمة ORF العكسي هذا. أخيرًا ، أسفر التنميط عن الريبوسوم عن نمط مذهل من آثار الأقدام لجميع خيوط CxNV1 RNA الأربعة التي كانت متميزة عن الترجمة النشطة للريبوسومات على mRNA المضيف أو المشاركة في إصابة فيروسات RNA. مجتمعة ، تثير هذه البيانات احتمال أن تكون عملية الترجمة نفسها مهمة لاستمرار فيروسات نارنا الغامضة ، ربما عن طريق حماية الحمض النووي الريبي الفيروسي بالريبوسومات ، مما يشير إلى تكتيك فيروسي غير موصوف حتى الآن للتكرار والانتقال.

أهمية من الأمور الأساسية لفهمنا لفيروسات الحمض النووي الريبي وصف خيوط (خيوط) الحمض النووي الريبي التي تنتقل على أنها الجينوم الفيروسي ، الذي يشفر البروتينات الفيروسية. فيروسات نارنا الغامضة تكسر العفن. تتمتع هذه الفيروسات ، الموجودة على نطاق واسع في الفطريات والنباتات والحشرات ، بميزة فريدة تتمثل في اثنين من الجينات المتداخلة المشفرة على خيوط متقابلة ، وتشتمل تقريبًا على الطول الكامل للجينوم الفيروسي. مثل هذا التداخل الواسع لا يُرى في فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى ، ويأتي على حساب انخفاض المرونة التطورية في التسلسل. الدافع وراء الدراسة الحالية هو التحقيق في الفوائد التي توازن تلك التكلفة. نعرض لأول مرة متطلبًا وظيفيًا لتكوين الجينوم الغامض في Culex narnavirus 1 ، مما يشير إلى نموذج لكيفية ترجمة كلا السلاسل يمكن أن تفيد هذا الفيروس. يسلط عملنا الضوء على مخطط جديد لمثابرة الفيروس ، متميزًا عن الاستراتيجيات التي تحددها التعريفات الكنسية لخيط الترميز.


روابط Ubiquitin تم تنعيمها إلى النقل داخل السجيل لتنظيم إشارات القنفذ

في حالة عدم وجود ligand القنفذ ، يتم توطين Patched-1 (Ptch1) إلى الأهداب ويمنع التراكم الهدبي وتفعيل السلس (Smo). عند الارتباط بالرابط ، يتم إزالة Ptch1 من الأهداب ، ويتم إلغاء ضغط Smo ويتراكم في الأهداب حيث ينشط الإشارة. الآليات التي تنظم هذه الحركات الديناميكية ليست مفهومة جيدًا ولكن العيوب في مكونات النقل داخل السوطية بما في ذلك Ift27 و BBS يتسبب بعضها في تراكم Smo في الأهداب دون تنشيط المسار. نجد أنه في غياب تنشيط المسار الناجم عن الترابط ، يتم انتشار Smo وإزالته من الأهداب ، وتعتمد هذه العملية على مكونات Ift27 و BBS. يؤدي تنشيط إشارات القنفذ إلى تقليل الانتشار السلس وإزالة الهدبية ، مما يؤدي إلى تراكمه. يؤدي منع انتشار Smo عن طريق مثبط E1 ligase أو عن طريق تحور اثنين من بقايا اللايسين في الحلقة داخل الخلايا الثلاثة إلى تراكم Smo بشكل شاذ في الأهداب دون تنشيط المسار. توفر هذه البيانات آلية للتحكم في المستوى الهدبي Smo أثناء إشارات القنفذ من خلال تنظيم حالة انتشار المستقبل.

ملخص تتضمن إشارات القنفذ الحركة الديناميكية للمستقبلات والمؤثرات داخل وخارج الأهداب. نجد أن ديناميكيات Smo ينظمها التواجد في كل مكان ، والذي ينظم تفاعله مع نظام النقل داخل الأسطح للتحكم في المستويات الهدبية لهذا المستقبل.


12.18: الريبوسومات - علم الأحياء

لكم الذين لا يفهمون:
اقرأ التعليمات ، كل ذلك قيل هناك!

تسجيل الدخول / الاشتراك للتصويت ومراجعة أمبير!

حسابات Newgrounds مجانية ويشاهد المستخدمون المسجلون إعلانات أقل!

كانت جيدة ، لكنها سهلة للغاية. أعتقد أنه يجب عليك إظهار التعليمات عندما ينقر اللاعب على "تشغيل" ، كما تعلم ، تظهر التعليمات وزر تشغيل اللعبة أدناه.

ولا يجب أن تعطي نقاطًا لتناول الجزيئات مع باك مان

أحبها! طريقة لجعل التعليم ممتعا! هل كان هذا لمشروع أم مجرد شيء قمت به من أجل المتعة؟ لأنه سيكون مشروعًا بيولوجيًا قاتلًا!

كلا المشروع والمتعة في الواقع. لقد حصلت على درجة جيدة أيضًا!
جميل أنه أعجبك! شكرا لك!

اعتقدت أنه على ما يرام وليس الأمر معقدًا إذا قرأت للتو جميع التعليمات.

مفهوم جيد ولكنك تجعل الأمر صعبًا للغاية مع الحد من الرموز المضادة التي يمكنك الحصول عليها حتى عندما تملأ الشاشة بها ، فهي لا تتطابق مع الكودون الصحيح الذي على وشك قتلك. فكرة جيدة ، تحتاج فقط إلى بعض الإصلاح.

يبدو أن الأمر استغرق الكثير من العمل ، لكنني لم أتمكن من معرفة كيفية تشغيله. يبدو أنك بحاجة إلى معرفة عملية بـ rna لتلعب هذه اللعبة.

هل تعرف حتى ما هو الحمض النووي الريبي؟
اقرأ التعليمات من فضلك. إنها لعبة ، تلعبها وفقًا للتعليمات.
آمل أن أكون قد أزعجتك :)


الجزء 2: مراقبة الرنا المرسال بواسطة الريبوسوم

00: 00: 07.22 مرحبًا. اسمي راشيل جرين
00: 00: 09.14 وأنا في كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز
00: 00: 12.01 وفي معهد هوارد هيوز الطبي.
00: 00: 14.12 ما سأشاركه معك اليوم
00: 00: 15.20 قصة من مختبري الخاص
00: 00: 17.06 مع التركيز على كيفية عمل الريبوسوم ،
00: 00: 18.21 في الخلايا حقيقية النواة ،
00: 00: 19.29 يحدد الحمض النووي الريبي المرسال السيئ
00: 00: 21.24 لتشغيل سلسلة من الأحداث في الخلية
00: 00: 24.15 الذي يؤدي إلى تدهور منتج البروتين غير الكامل ،
00: 00: 27.15 لتلاشي الرنا الرسول ،
00: 00: 29.01 وإعادة تدوير مركب الريبوسوم.
00: 00: 33.02 إذن ، أي عيوب messenger RNA
00: 00: 35.02 في الخلية هل ترغب في مراقبتها؟
00: 00: 36.28 ماذا يمكن أن تكون المشكلة
00: 00: 39.00 مع رسول معين RNA في خلية حقيقية النواة؟
00: 00: 42.03 كما نتذكر من تعلم معالجة الرنا المرسال ،
00: 00: 44.04 نعلم أن رنا رسول حقيقيات النواة
00: 00: 46.06 يخرج من النواة بغطاء
00: 00: 48.01 في نهاية 5 '
00: 00: 49.08 وذيل بولي أ في نهاية 3 ،
00: 00: 51.20 وهذه هي التوقيعات الرئيسية على رسول RNA في الخلايا حقيقية النواة
00: 00: 55.08 التي تخبرنا الريبوسوم
00: 00: 57.02 أن هذه رسالة جيدة
00: 00: 58.13 ويجب ترجمة هذا.
00: 01: 00.12 أيضًا ، نحن نعلم أن الرنا المرسال النموذجي
00: 01: 02.05 لها كود بدء
00: 01: 03.18 يشير إلى بداية إطار قراءة مفتوح
00: 01: 05.21 وكودون التوقف
00: 01: 07.24 تشير إلى نهاية إطار القراءة المفتوح ،
00: 01: 09.26 وما الذي تود الخلية فعله
00: 01: 11.13 تبدأ من البداية وتنتقل إلى النهاية
00: 01: 13.07 وصنع بروتين كامل الطول.
00: 01: 15.03 إذن ، ما الخطأ الذي يمكن أن يحدث؟
00: 01: 16.05 حسنًا ، يمكن أن يكون هناك الكثير من الأحداث التي تحدث
00: 01: 18.24 في معالجة RNA أو مع الطفرات
00: 01: 21.01 الذي سينتج عنه رسول RNA
00: 01: 22.22 قد لا يكون في الواقع هو الأمثل.
00: 01: 24.20 أحد الأمثلة التي ربما سمع عنها الكثير منكم
00: 01: 26.18 ، على سبيل المثال ، إذا كان رسول RNA
00: 01: 28.22 يحتوي على كود إنهاء سابق لأوانه.
00: 01: 30.12 أي بدلاً من
00: 01: 32.10 وجود رمز إيقاف فقط في نهاية إطار القراءة المفتوح ،
00: 01: 34.14 هم ، عن طريق طفرة في بعض العمليات الأخرى
00: 01: 36.22 - ربما عملية تضفير خاطئة -
00: 01: 38.04 لديهم رمز إنهاء يظهر
00: 01: 40.28 في وقت مبكر من إطار القراءة المفتوح.
00: 01: 42.06 بشكل مثير للدهشة ، خلايا حقيقية النواة
00: 01: 43.21 لديها آلية في المكان
00: 01: 45.19 لتحديد ما إذا كان كود الإنهاء
00: 01: 47.01 هو كود الإنهاء الصحيح أو كود الإنهاء الخاطئ.
00: 01: 50.24 ويقومون بتشغيل تسلسل الأحداث هذا
00: 01: 52.08 يؤدي في النهاية إلى اضمحلال الرنا المرسال.
00: 01: 54.27 مثال آخر لمشكلة محتملة
00: 01: 57.12 مع RNA الرسول
00: 01: 58.20 سيكون رنا رسول مشقوق داخليًا.
00: 02: 00.12 إذا التقط RNA الرسول انشقاقا
00: 02: 02.14 في منتصف ،
00: 02: 03.26 الريبوسوم لن يصل أبدًا إلى كودون التوقف في النهاية ،
00: 02: 06.12 وسيعلق الريبوسوم
00: 02: 07.29 في حالة عدم وجود كودون توقف
00: 02: 09.08 والقدرة على تعزيز عملية الإنهاء العادية.
00: 02: 11.27 إذن ، هذا هو رسول RNA
00: 02: 13.08 التي تود الخلية التخلص منها ، وعدم استخدامها مرة أخرى.
00: 02: 15.15 كما ترغب في التخلص من هذا المنتج غير المكتمل متعدد الببتيد.
00: 02: 19.25 قد يحدث مثال أخير يمكنك تخيله
00: 02: 22.27 هو أن الرنا المرسال قد لا يحتوي في الواقع على كودون توقف ،
00: 02: 25.25 من خلال حدث خطأ في الربط أو بعض الطفرات ،
00: 02: 28.02 وفي هذه الحالة يكون الريبوسوم
00: 02: 29.14 قد يتم تحقيقه بالكامل
00: 02: 32.16 المنطقة 3 غير المترجمة لهذا الجين
00: 02: 35.06 وواجه ذيل بولي أ.
00: 02: 37.02 يشفر PolyA ليسين ،
00: 02: 38.16 وماذا يعتقد أنه سيحدث
00: 02: 40.04 هو أن الريبوسوم يستشعر أنه يصنع ليسين - ليسين - ليسين - ليسين ،
00: 02: 42.27 وتبدأ عملية
00: 02: 47.22 الاضمحلال والإنقاذ في الزنزانة
00: 02: 49.08 الذي نشير إليه بالتضاؤل ​​المستمر.
00: 02: 50.21 إذن ، اضمحلال بلا معنى ،
00: 02: 51.27 خاصية No-Go Decay ،
00: 02: 53.00 و Non-Stop Decay
00: 02: 54.14 ربما تكون ثلاث عمليات ذات صلة
00: 02: 56.01 كلها موجهة
00: 02: 57.26 تحت السيطرة في الخلية u
00: 02: 59.12 رسول إنتاج RNAs ،
00: 03: 01.04 التخلص من الرنا المرسال ،
00: 03: 02.19 تدهور منتج البروتين ،
00: 03: 04.02 وإنقاذ الريبوسومات
00: 03: 05.20 لأحداث الترجمة اللاحقة ،
00: 03: 07.04 وهذا هو محور محاضرة اليوم.
00: 03: 10.06 إذن ، كيف أصبحنا مهتمين
00: 03: 11.18 في عمليات الانحلال هذه ،
00: 03: 13.20 لترصد الرنا المرسال؟
00: 03: 14.27 أصبحنا مهتمين
00: 03: 16.27 لأننا لاحظنا في الأدب
00: 03: 18.16 ملاحظة مثيرة للاهتمام.
00: 03: 19.28 لعدد من السنوات ،
00: 03: 21.11 درسنا عملية الإنهاء
00: 03: 24.25 في الأنظمة حقيقية النواة ،
00: 03: 26.17 حيث يتم التعرف على كودون التوقف
00: 03: 28.20 بواسطة عوامل الإنهاء في الخلايا حقيقية النواة
00: 03: 31.02 لتحرير سلسلة البولي ببتيد المتنامية.
00: 03: 32.27 ولقد درسنا هذه العوامل
00: 03: 34.04 وكيف تعمل كيميائيا
00: 03: 35.16 لعدد من السنوات.
00: 03: 37.20 كان هناك منشور خرج من مختبر روي باركر ، ومع ذلك ،
00: 03: 40.06 حيث وضع مختبر روي في مرسال RNA في الخميرة
00: 03: 43.06 هيكل ذو حلقة جذعية طويلة
00: 03: 44.26 - كان طوله 34 زوجًا أساسيًا ، وهذا الجذع -
00: 03: 48.08 وفي الحقيقة كان مثل هذا الهيكل الكبير
00: 03: 49.28 أنه لا يوجد ريبوسوم يمكن أن يدفع من خلاله بسهولة.
00: 03: 53.10 وما لاحظه مختبر روي
00: 03: 55.08 كان هذا الرسول RNA
00: 03: 58.00 تم استهدافه للتحلل في الخلية حقيقية النواة
00: 03: 59.22 في عملية سماها No-Go-Decay ،
00: 04: 01.12 لأن الريبوسوم لا يستطيع المرور من خلاله ،
00: 04: 03.19 لكن الملاحظة الرئيسية في هذه الدراسة
00: 04: 06.06 أن هذه العملية من اضمحلال الرنا المرسال
00: 04: 07.21 كان يعتمد على نوعين من البروتينات ،
00: 04: 09.05 Dom34 و Hbs1 ،
00: 04: 11.24 والتي تبين أنها متجانسة
00: 04: 13.26 من عوامل إنهاء حقيقية النواة
00: 04: 16.06 eRF1 و eRF3.0
00: 04: 17.24 الذي كنا ندرسه ،
00: 04: 19.08 وكنا ندرسها بطريقة كيميائية حيوية.
00: 04: 21.08 لذلك ، بدا هذا وكأنه فكرة رئيسية ،
00: 04: 22.16 لأن ما اقترحته
00: 04: 24.06 كان هذا الاعتراف بالرسول السيئ RNA
00: 04: 26.10 في الواقع يحركه الريبوسوم ، كما قد تشك ،
00: 04: 28.09 لأن الريبوسوم يجب أن يكون الإنزيم ،
00: 04: 31.15 أو المحفز ، أو الجزيء الكبير ،
00: 04: 34.10 يقرر ما إذا كانت الرسالة جيدة أم لا.
00: 04: 36.00 بدت فكرة منطقية للغاية
00: 04: 37.12 أن الريبوسوم هو ما يحدد
00: 04: 39.08 سواء كان الرنا الرسول جيدًا أم سيئًا.
00: 04: 40.22 هل يجب أن أترجمها أم لا؟
00: 04: 43.16 وهنا بدأ عملنا.
00: 04: 46.12 علمنا أن Dom34 هو نظير لـ eRF1
00: 04: 48.10 وهذا ما أبرزته هذه النظرة الهيكلية هنا.
00: 04: 50.18 كانت هناك هياكل معروفة لـ eRF1 و Dom34.
00: 04: 53.24 eRF1 ، في التعرف على أكواد الإيقاف ،
00: 04: 55.16 له فكرة التعرف على الكودون بالأسفل هنا
00: 04: 57.21 يسمى مجال NIKS ،
00: 04: 59.21 وفي الجزء العلوي ، يتفاعل مع الوحدة الفرعية الكبيرة للريبوسوم ،
00: 05: 02.17 شكل ثلاثي الأحماض الأمينية ، شكل GGQ ،
00: 05: 06.01 المسؤول عن تحفيز إطلاق الببتيد.
00: 05: 09.17 نرى أن Dom34 له نفس المجالات.
00: 05: 12.08 يرتبط هذا المجال بوضوح بهذا المجال
00: 05: 14.16 - يمكنك أن ترى ذلك من حيث أوراق بيتا
00: 05: 16.01 وحلقات ألفا.
00: 05: 18.02 ومع ذلك ، فإنه يفتقد هذا المجال الذي يحمل فكرة GGQ
00: 05: 20.18 سيكون مسؤولاً عن إطلاق سلسلة البولي ببتيد المتنامية.
00: 05: 24.06 نرى أن هناك أيضًا
00: 05: 25.29 لا يوجد موضوع للتعرف على الكودون ،
00: 05: 27.10 لكن الميزة الأخرى المشتركة بينهما
00: 05: 29.10 هل لديهم هذا المجال ، هنا ،
00: 05: 30.29 المعروف أنه يتفاعل مع قواعد GTPases
00: 05: 33.05 ضرورية لخطوة الإنهاء.
00: 05: 35.08 كانت هذه نقطة البداية.
00: 05: 36.29 كان لدينا بروتين يشبه
00: 05: 38.26 كان مرتبطًا بعامل إنهاء ،
00: 05: 40.08 ونعتقد أنه يجب إشراك الريبوسوم ،
00: 05: 42.08 وكان لدينا الأدوات البيوكيميائية
00: 05: 44.00 الذي أردنا استخدامه لطرح الأسئلة
00: 05: 46.00 حول ما قد يفعله Dom34
00: 05: 47.20 لإحداث اضمحلال الرنا الرسول
00: 05: 49.20 لاحظها مختبر روي باركر.
00: 05: 52.20 لذلك ، مع وضع هذه الأفكار في الاعتبار ،
00: 05: 53.28 ما فعلناه هو أننا دمجنا Dom34 و Hbs1 ،
00: 05: 57.20 هذه المتجانسات لعوامل الإنهاء ،
00: 05: 59.19 فيما كان موجودًا في مختبرنا ،
00: 06: 02.08 وهو نظام ترجمة معاد تكوينه في المختبر
00: 06: 05.07 من الخميرة Saccharomyces cerevisiae.
00: 06: 09.15 في معملنا ، في الفريزر ،
00: 06: 11.00 لدينا مكونات نقية من الريبوسوم ،
00: 06: 12.24 الوحدات الصغيرة والكبيرة للريبوسوم.
00: 06: 14.17 كان لدينا tRNAs و messenger RNAs
00: 06: 17.11 كان لدينا خمسة عوامل بدء رئيسية
00: 06: 19.04 أن مختبر جون لوريشر أظهر أنه ضروري
00: 06: 21.07 لبدء المعالجة في المختبر
00: 06: 23.17 في كودون AUG
00: 06: 24.26 وإدخال ذلك البادئ tRNA في الريبوسوم ،
00: 06: 27.17 لدينا عوامل استطالة ،
00: 06: 28.20 كان لدينا عوامل إنهاء ،
00: 06: 29.28 وإلى تلك القائمة أضفنا Dom34 و Hbs1.
00: 06: 33.19 ما يسمح لنا هذا النظام المعاد تكوينه بالقيام به
00: 06: 35.28 هو تكوين مجمعات ريبوسوم
00: 06: 38.02 مع رنا مرسال مختلف
00: 06: 39.18 تحديد الببتيدات المختلفة
00: 06: 44.24 وخطوات أخرى في نظام الترجمة.
00: 06: 46.12 يمكننا أن نضع ، على سبيل المثال ،
00: 06: 47.21 كودون توقف في موقع aminoacyl للريبوسوم
00: 06: 49.15 يتم التعرف عليها بواسطة عامل ،
00: 06: 50.16 أو يمكننا وضع كود معني ،
00: 06: 52.05 ويمكننا متابعة نشاط هذه المجمعات.
00: 06: 55.07 تظهر هنا كرة زرقاء
00: 06: 56.28 لسلسلة البولي ببتيد المتنامية ،
00: 06: 58.02 مما يدل على أنه يمكننا تسمية
00: 07: 00.08 ركائز الحمض النووي الريبي ،
00: 07: 01.14 يمكننا تسمية الحمض النووي الريبي ،
00: 07: 02.20 يمكننا تسمية الأحماض الأمينية ،
00: 07: 04.03 يمكننا تسمية الرنا المرسال ،
00: 07: 05.10 يمكننا تسمية الريبوسومات ،
00: 07: 07.03 ويمكننا متابعة مصير مختلف المكونات في النظام
00: 07: 09.29 للسؤال عن التفاعلات الكيميائية الحيوية.
00: 07: 12.22 وهذا ما فعلناه ،
00: 07: 14.24 وسأريكم مثالًا واحدًا
00: 07: 16.08 من تفاعل كيميائي حيوي أجريناه
00: 07: 18.04 لتتعلم شيئًا ما
00: 07: 19.26 حول وظيفة Dom34 و Hbs1 ،
00: 07: 22.06 فهم هذه العوامل
00: 07: 23.23 كان بالفعل متورطًا في تحلل الرنا المرسال
00: 07: 25.17 وفي الحقيقة لم يكن معروفًا
00: 07: 27.15 ما الذي يمكن أن يفعلوه على الريبوسوم.
00: 07: 28.28 إذن ، ما فعلناه في هذه الحالة
00: 07: 30.16 استخدمنا نظامنا البيوكيميائي
00: 07: 31.28 لإعادة تكوين مجمعين ريبوسوم مختلفين.
00: 07: 34.08 للشخص الموجود على اليسار ،
00: 07: 37.00 ما فعلناه هو أننا شكلنا مركبًا ،
00: 07: 38.20 ثنائي ببتيد - ترنا ،
00: 07: 39.21 حيث لدينا نوعان من الأحماض الأمينية على الحمض الريبي النووي النقال في موقع P.
00: 07: 42.06 - لقد وصلنا إلى هناك بالبدء والاستطالة
00: 07: 44.28 لجولة واحدة من تخليق البروتين -
00: 07: 46.18 وفي الموقع A وضعنا رمز إيقاف ،
00: 07: 48.03 لكن الأمر لا يهم.
00: 07: 49.15 وفي هذا المجمع
00: 07: 51.14 نرى أن الحمض الأميني موصوف.
00: 07: 52.24 لذلك ، على methionyl-tRNA ،
00: 07: 54.02 يحمل الميثيونين ملصق إشعاعي.
00: 07: 56.17 شكلنا مجمعًا مشابهًا على الجانب الآخر ، هنا ،
00: 07: 59.05 ولكن في هذه الحالة الحمض النووي الريبي نفسه
00: 08: 01.01 ملصق إشعاعي
00: 08: 02.08 ويمكننا متابعة الحمض النووي الريبي
00: 08: 03.24 بدلاً من الأحماض الأمينية.
00: 08: 06.20 في هذه الحالة ،
00: 08: 07.28 ما فعلناه هو أننا أخذنا هذه المجمعات ،
00: 08: 09.06 هذه المجمعات الكبيرة التي تحمل علامات الريبوسومات
00: 08: 10.22 مع تسميات في أماكن مختلفة ،
00: 08: 12.24 وقمنا بتشغيلها على هلام أصلي.
00: 08: 14.16 هلام أصلي يسمح لهم بالتشغيل
00: 08: 16.10 سليمة أكثر أو أقل
00: 08: 17.12 مع كل مكوناتها هناك.
00: 08: 18.28 وسألنا أين ذهبت التسمية.
00: 08: 21.02 في الجزء العلوي من الجل ،
00: 08: 22.12 يعمل مركب الريبوسوم السليم
00: 08: 23.26 هنا في موقع 80S.
00: 08: 26.10 وما نراه هو ذلك في غياب أي عوامل
00: 08: 28.19 يعمل كمجمع 80S كبير.
00: 08: 30.27 ومع ذلك ، عندما نضيف eRF1 و eRF3
00: 08: 32.20 - عوامل الإنهاء المعروفة -
00: 08: 34.08 بالضبط ما نتوقعه يحدث ،
00: 08: 36.13 ، في الحالة هنا
00: 08: 38.27 حيث نتبع الببتيد ،
00: 08: 40.06 نطلق الببتيد ،
00: 08: 41.24 ثنائي الببتيد Met-Phe.
00: 08: 44.08 حيث على اليمين هنا ،
00: 08: 45.15 حيث لدينا الحمض النووي الريبي المسمى tRNA ،
00: 08: 46.28 ما يحدث هو أن الحمض الريبي النووي النقال يتم إنشاؤه هنا
00: 08: 50.01 - هذا هو الحمض النووي الريبي المنزوع الآفات
00: 08: 51.12 تفتقر إلى الأحماض الأمينية.
00: 08: 53.14 إذن ، هذا هو المنتج الصادر مع عوامل الإنهاء.
00: 08: 56.04 سألنا بعد ذلك عما حدث
00: 08: 57.23 عندما نضيف Dom34 و Hbs1 ،
00: 08: 59.04 هذه العوامل التي يبدو أنها تلعب دورًا
00: 09: 00.26 في مراقبة mRNA ،
00: 09: 02.03 لكننا لا نعرف ماذا يفعلون على الريبوسوم ،
00: 09: 03.19 ورأينا ظهور فرقة مختلفة ،
00: 09: 05.21 هنا - ليست فرقة ببتيد -
00: 09: 07.23 وفرقة مختلفة ، هنا
00: 09: 09.10 - ليس نطاقًا من الحمض الريبي النووي الريبي المنزوع الآفات.
00: 09: 11.28 وما فكرناه في ذلك الوقت
00: 09: 14.16 عندما رأينا فرقة كانت شائعة
00: 09: 15.26 لهذين المجمعين المختلفين ،
00: 09: 18.06 لكنها تختلف عن أي من النتيجتين
00: 09: 20.14 من التفاعل مع eRF1 و eRF3
00: 09: 22.28 هل رأينا أن هذا قد يكون peptidyl-tRNA.
00: 09: 25.04 هذا في الحقيقة ما كان يحدث
00: 09: 26.26 كان ذلك Dom34 و Hbs1 ،
00: 09: 28.05 عند التفاعل مع مجمعات الريبوسوم هذه ،
00: 09: 29.27 أدى في الواقع إلى الإصدار
00: 09: 32.07 من مجمع peptidyl-tRNA بأكمله ،
00: 09: 34.12 وتمكنا من تأكيد ذلك
00: 09: 36.04 عن طريق إضافة كاشف مختلف يعرف باسم peptidyl hydrolase ،
00: 09: 38.12 الذي يطلق ، إذن ، الببتيد الحر
00: 09: 40.12 أو tRNA مجاني.
00: 09: 41.22 لذلك كان هذا تفاعلًا كيميائيًا حيويًا رئيسيًا
00: 09: 43.28 الذي اعتدنا تحديده
00: 09: 46.10 نشاط جديد لبروتينات Dom34 و Hbs1 ،
00: 09: 49.22 وهذا النشاط مقترح
00: 09: 52.22 ذلك الجزء مما كانت تفعله هذه البروتينات
00: 09: 54.08 هل كانوا يتعرفون على الريبوسومات
00: 09: 55.16 وكانوا يسهلون بعض الأحداث المزعزعة للاستقرار
00: 09: 58.24 الذي أدى إلى الإصدار
00: 10: 00.12 من peptidyl-tRNA من الريبوسوم.
00: 10: 03.01 إذن ، كانت هذه بداية قصة بيوكيميائية
00: 10: 05.05 وهذا نوع من ملخص تلك القصة.
00: 10: 07.21 ما وجدناه بمرور الوقت
00: 10: 09.03 كان ذلك مجمع الريبوسوم ،
00: 10: 11.04 عند تقديمه مع Dom34 و Hbs1.
00: 10: 13.18 ما فعله Dom34 و Hbs1 بالفعل
00: 10: 16.10 تم فصل الوحدات الفرعية الريبوسومية بشكل فعال.
00: 10: 19.00 يميل peptidyl-tRNA إلى التقسيم مع الوحدة الفرعية الكبيرة ،
00: 10: 22.06 اعتمادًا على طول سلسلة البولي ببتيد.
00: 10: 25.06 ما وجدناه هو أن رد الفعل هذا بواسطة Dom34 و Hbs1
00: 10: 27.26 كان كودون مستقلًا.
00: 10: 29.12 كان ذلك متسقًا مع الهيكل
00: 10: 31.08 التي عرضتها عليك قبل عدة شرائح
00: 10: 33.04 حيث لا يوجد مجال للتعرف على الكودون على هذا البروتين ، Dom34.
00: 10: 36.25 رأينا أن الببتيد لم يتحرر من الحمض الريبي النووي النقال.
00: 10: 39.02 وهذا يتفق مع حقيقة أن بروتين Dom34
00: 10: 42.12 يفتقر إلى فكرة GGQ المسؤولة عن هذا النشاط
00: 10: 45.24 في عوامل الإنهاء.
00: 10: 48.04 وبغض النظر عن هذه البروتينات
00: 10: 50.10 يفضل تقسيم الوحدات الفرعية
00: 10: 52.18 عندما يميل قالب RNA الرسول ، هنا ، إلى أن يكون قصيرًا.
00: 10: 55.08 إذا كان الرسول RNA قصيرًا
00: 10: 56.26 من نهاية 3
00: 10: 58.24 الدخول إلى جدار الريبوسوم ،
00: 11: 00.16 وجدنا أنه في الواقع كان هذا هو الركيزة البيوكيميائية المفضلة
00: 11: 03.02 لهذه البروتينات.
00: 11: 05.03 إذن ، كيف يكون كل هذا منطقيًا
00: 11: 06.19 نظرًا لما نعرفه عن Dom34 و Hbs1
00: 11: 08.19 في عملية ما يسمى بـ No-Go-Decay؟
00: 11: 11.08 حسنًا ، خلال نفس الفترة الزمنية
00: 11: 13.06 أننا نجري تفاعلات كيميائية حيوية
00: 11: 14.26 كان هناك عدد من المعامل تدرس هذا في الجسم الحي ،
00: 11: 17.02 وقد توصلوا إلى عدد من الأفكار المهمة ،
00: 11: 19.02 على وجه الخصوص ، معمل توشي إينادا.
00: 11: 20.27 وتتناسب مع النماذج التي قدمها ،
00: 11: 22.16 وهي الفكرة أن الريبوسوم يعلق
00: 11: 24.22 في مكان معين في رسول RNA ،
00: 11: 27.08 ربما ، على سبيل المثال ، بنية حلقة جذعية كبيرة.
00: 11: 30.18 يوجد انقسام حال للنواة يحدث بالفعل
00: 11: 32.26 خلف الريبوسوم ،
00: 11: 34.06 وتم توثيق ذلك في معمل توشي ،
00: 11: 36.14 يؤدي إلى الحمض النووي الريبي الرسول المشقوق داخليًا.
00: 11: 39.24 وبالنظر إلى وجود العديد من الريبوسومات
00: 11: 42.22 على أي رسول معين RNA ،
00: 11: 43.29 ما يعنيه ذلك هو كل الريبوسومات
00: 11: 45.16 التي تأتي خلف موقع الانقسام حال النواة
00: 11: 48.02 تواجه تلك النهاية المشقوقة داخل النواة ،
00: 11: 51.18 وأن هذه ستكون أهدافًا مثالية لهذه البروتينات ،
00: 11: 53.17 Dom34 و Hbs1.
00: 11: 55.02 في غياب هذه العوامل ،
00: 11: 56.25 الريبوسوم عالق بالرسالة
00: 11: 58.22 بدون أي وسيلة للنزول.
00: 12: 00.06 وما قد تسمح به هذه العوامل
00: 12: 03.02 لإعادة تدوير مركبات الريبوسوم هذه
00: 12: 04.24 على رنا الرسول المعيب ،
00: 12: 06.12 تؤدي إلى تفاعل إعادة التدوير
00: 12: 08.04 وإعادة استخدام هذه الريبوسومات.
00: 12: 11.08 إذن ، بياناتنا البيوكيميائية تتلاءم بشكل جيد
00: 12: 14.07 مع نتائج أخرى في الميدان
00: 12: 15.20 التي كانت تحدث في خلايا سليمة.
00: 12: 17.25 وهكذا كانت هذه أفكارنا ،
00: 12: 19.19 ولذا أردنا طرح سؤال أكثر عمومية بعد ذلك.
00: 12: 22.02 معرفة النشاط الكيميائي الحيوي لهذه البروتينات ،
00: 12: 24.18 ومعرفة القليل عن كيفية عمل هذه البروتينات
00: 12: 26.15 تصرف مع المراسلين في خلايا مختلفة ،
00: 12: 29.29 أردنا طرح أسئلة حول
00: 12: 32.04 الأهمية البيولوجية العامة
00: 12: 33.21 استجابة إنقاذ.
00: 12: 35.04 ما هي الحمض النووي الريبي الرسولي المستهدف عادةً في الخلية؟
00: 12: 37.07 هو نفسه في ظروف النوع البري
00: 12: 39.20 أم في ظروف إجهاد؟
00: 12: 41.04 وكيف يمكننا التفكير في ذلك؟
00: 12: 43.08 علمنا منذ البداية أن Dom34
00: 12: 45.02 هو جين غير أساسي في الخميرة ،
00: 12: 47.14 لكننا نعلم أنه ضروري في حقيقيات النوى الأعلى.
00: 12: 49.26 يسمى الجين بيلوتا في حقيقيات النوى الأعلى
00: 12: 52.01 وهو جنيني مميت في الفئران.
00: 12: 55.14 لذا ، فهو جين مهم في حقيقيات النوى الأعلى.
00: 12: 58.08 ومع ذلك ، علمنا أن Dom34 حذف في الخميرة
00: 13: 01.19 كانت اصطناعية مع مجموعة متنوعة من الأشياء المختلفة
00: 13: 04.06 بما في ذلك ، على سبيل المثال ،
00: 13: 05.26 حذف جين البروتين الريبوسومي.
00: 13: 07.12 ومن المعروف أنه عند حذف جين البروتين الريبوسومي ،
00: 13: 10.01 على سبيل المثال ، نسخة واحدة من جين بروتين الريبوسوم ،
00: 13: 12.24 أن هناك قصورًا في الريبوسوم في الخلية ،
00: 13: 15.22 لأن التكاثر الحيوي غير قادر حقًا على مواكبة ذلك
00: 13: 17.24 مع ما يلزم القيام به.
00: 13: 19.06 ولذا قد تكون الفكرة كذلك
00: 13: 21.02 إذا حذفت عامل إنقاذ للريبوزومات ،
00: 13: 23.06 ووضعها مع عيب تكوين حيوي الريبوسوم ،
00: 13: 26.27 هذا هو الوقت الذي تمرض فيه الخلايا حقًا ،
00: 13: 28.17 وهذا من شأنه أن يفسر سبب الوفاة الاصطناعية.
00: 13: 31.02 ولذا فإن السؤال الذي أردنا طرحه حقًا بعد ذلك
00: 13: 33.04 كان ، "ماذا يمكن للأهداف الخلوية
00: 13: 35.23 لوظيفة Dom34 وإنقاذ Dom34؟ "
00: 13: 38.10 كنا محظوظين لأنه في ذلك الوقت
00: 13: 40.16 كنا نفكر في هذه الأفكار
00: 13: 41.29 كان هناك طريقة جديدة ظهرت للتو عبر الإنترنت
00: 13: 43.23 من معمل جوناثان ويسمان
00: 13: 45.07 وتم تطويره بواسطة Nick Ingolia ،
00: 13: 46.23 باحث ما بعد الدكتوراة في معمله.
00: 13: 48.05 كانت طريقة تعرف باسم التنميط الريبوسوم
00: 13: 49.22 يسمح للشخص بالبحث بشكل منهجي
00: 13: 52.03 عند إشغال جميع الريبوسومات في الخلية
00: 13: 54.19 على قوالب الرنا المرسال المختلفة الخاصة بهم.
00: 13: 56.26 وفكرنا في ذلك
00: 13: 58.22 إذا كان Dom34 بروتينًا يؤدي وظيفة ،
00: 14: 01.04 في خلايا الخميرة على سبيل المثال ،
00: 14: 02.26 إذا كان لدينا سلالة من النوع البري وسلالة بالضربة القاضية ،
00: 14: 04.29 قد نتمكن من طرح السؤال
00: 14: 06.27 ما هو دور Dom34 في خلايا الخميرة
00: 14: 08.12 بسؤال أين تتراكم الريبوسومات
00: 14: 10.21 في السلالات التي تفتقر إلى هذا البروتين.
00: 14: 13.11 إذن ، الفكرة الأساسية وراء التنميط الريبوسومي
00: 14: 15.19 هل يمكنك أن تأخذ كل الريبوسومات
00: 14: 17.13 الموجودة على الرنا المرسال في الخلية ،
00: 14: 18.28 ويمكنك عزل RNAs الرسول
00: 14: 20.14 مع الريبوسومات مرتبطة بهم.
00: 14: 21.29 باستخدام نوكلياز ،
00: 14: 23.19 يمكنك استيعاب كل الحمض النووي الريبي المرسال المجاني ،
00: 14: 25.22 مع ترك القليل من الحمض النووي الريبي الرسول
00: 14: 27.29 محمي بواسطة الريبوسوم ،
00: 14: 29.24 وذلك بتة mRNA المحمية
00: 14: 31.26 يبلغ طولها حوالي 30 نيوكليوتيد.
00: 14: 34.18 يمكنك بعد ذلك عزل هذا الحمض النووي الريبي المرسال البالغ 30 أو نحو ذلك من النوكليوتيدات
00: 14: 38.19 من جميع الريبوسومات في الخلية ،
00: 14: 40.10 يمكنك إرسالها للتسلسل عالي الجودة.
00: 14: 43.20 تحصل على مئات الملايين من القراءات
00: 14: 45.14 آثار أقدام الريبوسوم من الخلية
00: 14: 47.01 ويمكنك أن تسأل ما الإشغال
00: 14: 48.22 - الإشغال العالمي للريبوزومات في الرسائل -
00: 14: 51.08 في خلية.
00: 14: 53.20 عادة ما تقترن هذه التجربة
00: 14: 54.19 بتجربة mRNA seq ،
00: 14: 56.08 حيث تقوم بشكل عشوائي بتفتيت جميع الرناوات المرسال في الخلية
00: 14: 59.08 فقط للتأكد من أنه يمكنك حساب تحيزات الاستنساخ
00: 15: 01.14 والتحف المحتملة الأخرى من الخلية ،
00: 15: 03.16 وبعد ذلك يمكنك أيضًا أن تسأل
00: 15: 05.11 مدى كفاءة الريبوسوم في احتلال RNA معين
00: 15: 07.20 لأنك تعرف مقدار وجود كل رسول RNA
00: 15: 10.12 وأنت تعرف عدد آثار أقدام الريبوسوم لديك.
00: 15: 13.24 إذن ، كانت تلك هي التجربة التي تصورنا استخدامها
00: 15: 16.10 للسؤال عن دور الجسم الحي
00: 15: 18.12 لعوامل الإنقاذ.
00: 15: 20.02 بدأنا مثل أي شخص آخر ،
00:15: 21.18 تقديم بعض العينات والسؤال عن مدى جودة عمل النظام ،
00: 15: 24.08 وهذا يعطيني فرصة
00: 15: 25.24 لتظهر لك كيف يبدو هذا النوع من البيانات.
00: 15: 27.26 ما فعلناه هو أننا تعرضنا ،
00: 15: 30.16 من الخميرة البرية ومن الخميرة الطافرة Dom34
00: 15: 32.19 - مفقود Dom34 -
00: 15: 34.06 آثار أقدام الريبوسومات وبيانات mRNA-seq.
00: 15: 36.26 أول شيء يمكنك فعله بهذه البيانات
00: 15: 38.24 يمكنك أن تسأل كيف تتماشى مع إطارات القراءة.
00: 15: 41.14 ويمكنك أن ترى ، بكل بساطة ،
00: 15: 42.29 في هذه اللوحة بالأعلى ،
00: 15: 45.07 إذا أخذت آثار أقدام الريبوسوم
00: 15: 46.29 يتم تعيينهم في الغالب لإطار قراءة واحد
00: 15: 50.05 داخل جميع إطارات القراءة المفتوحة ،
00: 15: 52.22 مما يوحي بأن الريبوسومات
00: 15: 54.11 تتحرك ثلاثة نيوكليوتيدات في وقت واحد
00: 15: 56.22 أسفل قالب RNA messenger ،
00: 15: 58.08 وأن هذه المنهجية قادرة على التقاط
00: 16: 00.22 أن حركة النوكليوتيدات الثلاثة.
00: 16: 02.04 هناك دورية لتوقيع البصمة.
00: 16: 05.20 على النقيض من ذلك ، يمكنك إلقاء نظرة على بيانات mRNA-seq
00: 16: 07.28 وانظر إلى توزيع القراءات على الإطارات الثلاثة ،
00: 16: 11.12 لأن الريبوسوم لا يفرض أي دورية
00: 16: 13.02 على تلك الإطارات
00: 16: 14.20 وبالتالي يتم توزيعها بالتساوي على جميع إطارات القراءة.
00: 16: 16.10 لذلك يشير ذلك إلى أننا كنا نلتقط
00: 16: 18.04 شيء متعلق بالترجمة
00:16: 20.14 وحركة ثلاثة نيوكليوتيدات على طول قالب RNA رسول.
00: 16: 23.12 يمكنك أن ترى أن هذا صحيح على طول إطارات القراءة المفتوحة أيضًا
00: 16: 26.18 إذا قمت بمحاذاة كافة أكواد البداية ،
00: 16: 28.22 هنا ، إلى بداية الجين ،
00: 16: 31.16 وتقوم بمحاذاة جميع رموز الإيقاف
00: 16: 33.04 وأنت تفعل ما نسميه متوسط ​​تحليل الجين أو الميتاجين.
00: 16: 36.14 أولاً ، ما يمكنك رؤيته هو أن mRNA-seq يقرأ ،
00: 16: 39.04 باللون الأخضر ،
00: 16: 40.22 وزع على طول إطار القراءة المفتوح ،
00: 16: 42.11 وكذلك في المناطق غير المترجمة من الجين ، هنا ،
00: 16: 45.06 وفي 3 'نهاية الجين.
00: 16: 47.04 إذن ، توزع هذه المناطق على طول الرسالة.
00: 16: 49.07 على النقيض من ذلك ، آثار أقدام الريبوسوم
00: 16: 51.05 وزع على طول إطار القراءة المفتوح ،
00: 16: 53.07 يبدأ عند "البداية" وينتهي عند "توقف".
00: 16: 56.03 وفي الواقع في هذه البيانات هنا ،
00: 16: 57.23 يمكنك أن ترى ظهور ثلاثة دورية للنيوكليوتيدات.
00: 16: 59.23 لذلك ، شعرنا بثقة كبيرة
00: 17: 01.14 أن هذه طريقة قد تعطينا بعض التوقيع على نشاط الريبوسوم
00: 17: 04.14 في الخلية
00: 17: 06.01 قد يخبرنا بشيء جديد عن الوظيفة
00: 17: 08.01 من عوامل الإنقاذ هذه.
00: 17: 10.04 سأخبرك أننا أضفنا لمسة صغيرة أخرى
00: 17: 12.14 لهذه الدراسات لتوسيع هذا النوع من التحليل
00: 17: 15.14 أن آثار أقدام الريبوسوم كاملة الطول
00: 17: 17.28 قد تسمح لنا بالتفكير فيه.
00: 17: 19.23 ما فكرنا به هو أن ،
00: 17: 21.25 إذا كانت هناك عوائق كبيرة في الخلية تمنع الريبوسومات
00: 17: 23.29 من العبور ،
00: 17: 25.22 قد لا يكون هناك ريبوسوم واحد فقط مكدس على RNA رسول ،
00: 17: 27.20 لكن اثنين.
00: 17: 29.02 لذلك ، نسمي هذه الاضطرابات ، ويمكنك فعلًا.
00: 17: 30.26 بعد علاج RNAse ، نرى هذا الأثر الأسود هنا.
00: 17: 33.04 يمكننا في الواقع رؤية القليل من ذروة disome المتبقية
00: 17: 35.00 ولذا عزلنا ذروة disome أيضًا ،
00: 17: 36.24 التفكير في أن الأكشاك الكبيرة في الخلية
00: 17: 40.04 كانت هذه مشكلة وقد تكون عرضة للإنقاذ
00: 17: 42.02 قد يتم إثرائها في تلك الذروة.
00: 17: 43.23 لقد كنا أيضًا كرماء في قطع شظايا mRNA من مادة هلامية
00: 17: 47.21 لأننا علمنا أنه يمكننا ذلك.
00: 17: 49.05 بناءً على النشاط الكيميائي الحيوي لـ Dom34 و Hbs1 ،
00: 17: 52.08 استنتجنا أن آثار أقدام الرنا المرسال القصيرة
00: 17: 55.17 قد يكون متحيزًا أيضًا
00: 17: 58.28 حسب تفضيلهم بواسطة إنزيم Dom34 ،
00: 18: 00.28 لأننا نعلم أن Dom34 يحب قوالب الرسائل القصيرة RNA.
00: 18: 03.15 لذلك ، عزلنا أيضًا آثار أقدام أقصر وأطول ،
00: 18: 06.02 لذلك كنا كرماء في تقطيع شظايانا من مادة هلامية.
00: 18: 08.27 إذن ، كيف تبدو هذه البيانات؟
00: 18: 11.08 إذا أخذنا ، من سلالة من النوع البري
00: 18: 13.11 أو سلالة دلتا Dom34.
00: 18: 14.19 إذا أخذنا آثار الأقدام تلك ،
00: 18: 16.12 نرسلها للتسلسل عالي الإنتاجية ،
00: 18: 18.08 واسأل عن متوسط ​​الطول
00: 18: 20.25 من الأجزاء التي تحصل عليها ، على سبيل المثال ،
00: 18: 22.27 من ريبوسوم واحد ، من قمة أحادية ،
00: 18: 25.26 كيف تبدو هذه الأجزاء؟
00: 18: 27.11 يمكننا أن نرى التوزيع هنا ،
00: 18: 28.25 حيث ننظر إلى طول القراءة على المحور x
00: 18: 31.02 وننظر إلى جزء القراءات الذي يحتوي على طول القراءة هذا على المحور y ،
00: 18: 36.07 ما نراه هو أن غالبية قراءاتنا
00: 18: 39.01 في هذا النطاق من 28-30 نيوكليوتيدات في الطول.
00: 18: 40.23 هذا هو طول الجزء الأصلي الذي تمت دراسته بواسطة مختبر وايزمان ،
00: 18: 43.14 وهذا ما نعتقد أنه ريبوسوم كامل
00: 18: 45.06 مع مرسال كامل الطول مرتبط به.
00: 18: 48.04 نرى بالفعل قمة صغيرة هنا ،
00: 18: 49.26 بطول 21 نيوكليوتيد.
00: 18: 51.08 هذا جزء تم تمييزه
00: 18: 53.01 بواسطة Liana Lareau ،
00: 18: 54.28 وما وصفته بهذا
00: 18: 56.20 ربما يمثل حالة استدارة أو مصقولة للريبوسوم
00: 18: 59.08 في عملية النقل على طول RNA الرسول ،
00: 19: 03.05 وهذا لن يكون محور أي نقاش إضافي هنا.
00: 19: 05.20 أخيرًا ، الأجزاء التي كنا مهتمين بها أكثر
00: 19: 08.08 هي هذه الأجزاء المقطوعة هنا
00:19: 10.20 يبلغ طول الذروة حوالي 16 نيوكليوتيدًا ،
00: 19: 12.12 ونعتقد ،
00: 19: 14.08 وسأعرض عليكم أدلة تدعم ذلك ،
00: 19: 15.28 أن هذه أجزاء قصيرة من الحمض النووي الريبي الرسولي
00: 19: 17.20 مرتبطًا بالريبوسومات التي وصلت إلى نهاية قالب RNA الرسول ،
00: 19: 20.28 وبالتالي هناك 16 نيوكليوتيد فقط هناك ،
00: 19: 22.26 لكن هذه أهداف رئيسية
00: 19: 25.04 إجراء Dom34 في الخلية.
00: 19: 27.24 إذن ، كيف تبدو البيانات؟
00: 19: 29.09 تحصل على 100 مليون قراءة تسلسلية
00: 19: 30.20 من نوع بري وسلالة متحولة
00: 19: 32.08 وأنت تسأل ، كيف يتم توزيعها على النسخة الخاصة بك؟
00: 19: 34.13 كيف يتوزعون على طول الرنا الرسول؟
00: 19: 36.02 إذن ، يمكننا أن ننظر إلى جين وفير ،
00: 19: 37.27 هنا ، PGK1.
00: 19: 39.04 إنه مجرد جين متنوع في الحديقة.
00: 19: 40.29 يمكننا أن نرى أن الريبوسوم يقرأ
00: 19: 43.09 توزع على طولها ،
00: 19: 44.27 من بداية إطار القراءة المفتوح حتى النهاية ،
00: 19: 47.14 وما نراه هو ذلك في سلالة Dom34 بالضربة القاضية (KO)
00: 19: 51.02 النمط مكافئ جدًا حقًا.
00: 19: 52.24 هذا ما تبدو عليه بيانات التنميط الريبوسوم النموذجية.
00: 19: 55.02 إنه نطاط.
00: 19: 56.18 مضمن في هذا الارتداد
00: 19: 58.08 ربما يكون بعض التوقف الطبيعي عن طريق الريبوسومات ،
00: 19: 59.18 وكذلك تسلسل التحيزات ،
00: 20: 01.06 وتحيزات الاستنساخ ،
00: 20: 02.26 وتحيزات التضخيم.
00: 20: 04.12 لكن ما يمكنك رؤيته هو فيما يتعلق بما كنا مهتمين بمعرفته
00: 20: 07.19 موجود في هذا الجين بالذات
00: 20: 09.15 لم يكن هناك اضطراب واضح.
00: 20: 10.29 لم يكن هناك توقف واضح في هذا الجين ،
00: 20: 12.29 أو المشكلات التي أدت إلى إجراء Dom34.
00: 20: 15.09 لم تكن هناك أكوام من الريبوسومات
00: 20: 16.26 في حالة عدم وجود Dom34 التي تراكمت.
00: 20: 19.24 كما رأينا هذه البيانات ،
00: 20: 21.00 بدأنا في القلق بشأن ما إذا كانت لدينا الأدوات بالفعل أم لا ،
00: 20: 23.20 لملاحظة توقف كبير ،
00: 20: 25.29 وهكذا قمنا بعمل خدعة لطيفة.
00: 20: 27.07 وضعنا نظير الهيستيدين في الخميرة
00: 20: 29.18 يُعرف باسم 3-AT - 3-aminotriazole -
00: 20: 31.05 الذي يمنع فعليًا التخليق الحيوي للهيستيدين
00: 20: 34.09 ويسمح لك بالفعل.
00: 20: 36.18 تعاني من نقص في الهيستيدين في الخلية
00: 20: 38.20 ولذا توقعنا أن تكون هناك فترات توقف مؤقت ،
00: 20: 40.06 تتراكم الريبوسومات في أكواد الهيستيدين
00: 20: 42.26 في جميع أنحاء الجينوم.
00: 20: 44.16 وفي الحقيقة هذا بالضبط ما رأيناه.
00: 20: 46.08 في النوع البري أو في سلالة خروج المغلوب Dom34 ،
00: 20: 47.22 فجأة ترى أكوامًا من الريبوسومات
00: 20: 50.14 بالضبط حيث توجد أكواد الهيستيدين
00: 20: 52.04 في كل جين في الجينوم.
00: 20: 54.12 لذلك ، كان هذا مؤشرًا رائعًا حقًا بالنسبة لنا
00: 20: 56.15 أننا فهمنا شيئًا عن وظائف الريبوسوم
00: 20: 59.23 - يجب أن تتوقف الريبوسومات عند كودونات الهيستيدين في غياب الهيستيدين -
00: 21: 02.29 وفي الحقيقة ، كما توقعنا ،
00: 21: 05.00 Dom34 لا يستجيب لتجويع الأحماض الأمينية العامة ،
00: 21: 08.19 ولم نتوقع ذلك ،
00: 21: 09.29 لكنها أعطتنا إحساسًا بنوع النتيجة
00: 21: 11.28 أن هذه البيانات يمكن أن تسفر
00: 21: 13.28 - أننا يمكن أن نفهم شيئًا عن الإيقاف المؤقت
00: 21: 15.22 وقد نتمكن من فك تشفير شيء ما
00:21: 17.21 حول وظيفة Dom34.
00: 21: 19.29 إذًا ، بهذه الأدوات في متناول اليد ،
00: 21: 21.10 بدأنا في النظر عالميًا إلى النسخة الخاصة بنا
00: 21: 23.01 واسأل ، هل كان هناك أي جينات
00: 21: 25.02 حيث كان هناك عدد متزايد من القراءات
00: 21: 26.24 في سلالة حذف Dom34 نسبة إلى سلالة من النوع البري.
00: 21: 30.01 الطريقة التي يمكنك بها إجراء هذه التجربة
00: 21: 31.22 يمكنك أن تأخذ كل القراءات على جين معين
00: 21: 33.23 ويمكنك رسمها
00: 21: 36.00 - عدد القراءات بواسطة mRNA-seq
00: 21: 38.16 في الضربة القاضية مقابل سلالة wildtype ،
00: 21: 40.14 وضعها على المحور س ،
00: 21: 42.04 أو الاختلاف في عدد آثار أقدام الريبوسوم
00: 21: 44.04 على جين معين في سلالة خروج المغلوب مقابل سلالة النوع البري -
00: 21: 48.01 وما يمكنك رؤيته هو نمط غير ممتع للغاية
00: 21: 50.02 من منظور تجربة عالية الإنتاجية ،
00: 21: 51.19 حيث تقريبًا كل جيناتنا
00: 21: 53.21 ليس لديهم اختلافات مثيرة للاهتمام في الأنماط.
00: 21: 55.09 جميعهم يخرجون حول واحد ،
00: 21: 56.26 مما يعني في النوع البري وسلالة خروج المغلوب
00: 21: 59.11 لدينا نفس عدد القراءات تقريبًا.
00: 22: 01.18 كلاهما بواسطة mRNA-seq ،
00: 22: 03.07 لذا ربما لا يكون Dom34 عامل اضمحلال ،
00: 22: 05.26 وهو أيضًا في إشغال الريبوسومات.
00: 22: 09.06 يوجد استثناء واحد ،
00: 22: 10.26 سأعود إليه.
00: 22: 12.02 إنه جين يعرف باسم Hac1.
00: 22: 13.26 إنه عامل نسخ مثير جدًا للاهتمام حقًا
00: 22: 15.14 وانتهى الأمر بأن نكون إيجابيين للغاية
00: 22: 17.05 أخبرنا ، على ما نعتقد ،
00: 22: 19.02 كيف يعمل Dom34 في الخلية.
00: 22: 21.07 سأريكم حبكة أخرى مماثلة ، مع ذلك ،
00: 22: 24.01 أظهر لنا شيئًا جديدًا ومثيرًا
00: 22: 25.25 حول وظيفة Dom34 في الخلية ،
00: 22: 27.28 وكان له علاقة بتلك القراءات القصيرة.
00: 22: 30.13 في الحقيقة ، في الشريحة السابقة
00: 22: 32.01 ما كنت أركز عليه كان قراءات كاملة
00: 22: 33.27 التي تم إنشاؤها في متحولة حذف Dom34 ،
00: 22: 35.18 يقرأ الريبوسوم القياسي الطويل 30 نيوكليوتيد.
00: 22: 40.18 وفي الحقيقة هذا ما يظهر هنا على المحور س ،
00: 22: 42.21 أي إذا نظرنا إلى نوع بري
00: 22: 44.18 أو ضربة قاضية Dom34 مقابل سلالة من النوع البري ،
00: 22: 46.16 أن الطول الكامل يقرأ
00: 22: 48.21 متشابهة إلى حد كبير في جميع الجينات في الجينوم.
00: 22: 51.04 لا توجد فروق في توزيعها.
00: 22: 56.02 ومع ذلك ، إذا نظرنا تحديدًا إلى القراءات القصيرة ،
00: 22: 57.22 يقرأ النيوكليوتيدات 15-18
00: 22: 59.16 في Dom34 مقابل سلالة النوع البري ،
00: 23: 01.28 هذا التوزيع منحرف بشكل كبير ،
00: 23: 03.24 مما يشير إلى أنه في سلالة خروج المغلوب Dom34
00: 23: 06.18 إشغال الريبوسوم على تلك الأجزاء القصيرة مير
00: 23: 10.06 مخصب بشكل كبير ،
00: 23: 12.18 يتفق مع فكرة أن Dom34
00: 23: 14.22 مسؤول بشكل خاص
00: 23: 16.18 لإزالة تلك الريبوسومات في ظل الظروف العادية ،
00: 23: 18.14 وذلك عندما يكون Dom34 مفقودًا
00: 23: 20.25 أنت في الواقع غني بهذه القراءات القصيرة
00: 23: 22.26 في سلالة خروج المغلوب Dom34.
00: 23: 24.23 كانت تلك فكرة مثيرة
00: 23: 26.08 وكانت متوافقة مع الكيمياء الحيوية لدينا
00: 23: 27.26 والأفكار التي طرحناها في هذا المشروع.
00: 23: 30.12 إذن ، نحن في الواقع التالي.
00: 23: 33.08 ما أريد أن أعرضه لكم بعد ذلك
00: 23: 34.22 هو ما تعلمناه عن جين HAC1
00: 23: 36.26 وزيادة إشغال الريبوسوم لدينا
00: 23: 38.14 في سلالة خروج المغلوب Dom34 ،
00: 23: 40.02 لأنه انتهى به الأمر إلى أن يكون واضحًا جدًا ،
00: 23: 42.26 تأثير إيجابي للدوم 34 في الخميرة ،
00: 23: 44.18 ويخبرنا شيئًا عن وظيفة Dom34.
00: 23: 47.03 لكن أولاً ، أريد أن أخبركم قليلاً عن جين HAC1.
00: 23: 50.08 جين HAC1.
00: 23: 54.16 يشفر عامل النسخ الذي يشارك في استجابة البروتين غير المطوية
00: 23: 56.20 تمت دراستها على نطاق واسع بواسطة مختبر بيتر والتر ،
00: 23: 59.17 وفي الخميرة اتضح أنها الجين الوحيد
00: 24: 02.19 أنه في خلايا الخميرة يتم تصديرها من النواة
00: 24: 05.16 مع intron سليم - لا يتم تقطيعه بواسطة spliceosome في النواة.
00: 24: 08.29 في الواقع ، إنه مقسم في السيتوبلازم
00: 24: 11.25 بواسطة نوكلياز داخلي ، مسار غير متعارف عليه ،
00: 24: 15.03 المعروف باسم IRE1 ،
00: 24: 16.23 تحديدًا عند نوكلياز IRE1
00: 24: 18.25 يتم تنشيطه بواسطة البروتينات غير المطوية
00: 24: 21.03 في الشبكة الإندوبلازمية.
00: 24: 23.01 إذن ، ما يعنيه ذلك هو أنه في سيتوبلازم خلايا الخميرة
00: 24: 25.24 يوجد جين غير مقسم
00: 24: 27.26 الذي يبدو هكذا ، جين HAC1 ،
00: 24: 29.16 مع كودون البدء وكود الإيقاف.
00: 24: 31.01 وهي في انتظار التوقيع
00: 24: 32.24 ليتم شقها بواسطة مسار التضفير غير المعتاد هذا.
00: 24: 36.29 لكن ما نعرفه هو في الحقيقة
00: 24: 39.19 أن هناك بعض التضفير التأسيسي
00: 24: 41.09 يحدث في موقع لصق 5 بوصات ،
00: 24: 42.22 ونحن نعلم أنه غير منتج لأنه تم توثيق ذلك ،
00: 24: 44.28 ونعلم أن هناك قدرًا من هذا النوع
00: 24: 47.15 مرسال RNA مبتور جالس في الزنزانة
00: 24: 49.05 حتى في الخلايا الطبيعية.
00: 24: 51.04 وبدا هذا الأمر وكأنه ركيزة غير مناسبة.
00: 24: 54.04 إطار قراءة مفتوح
00: 24: 55.22 الذي ينتهي بدون رمز التوقف
00: 24: 57.08 وقد تحتاج إلى إنقاذ بواسطة Dom34.
00: 24: 59.14 وهذا صحيح في الواقع.
00: 25: 01.17 يمكننا إلقاء نظرة على بيانات التنميط الريبوسوم الخاصة بنا
00: 25: 03.18 محاذاة بشكل خاص على طول جين HAC1 ،
00: 25: 05.22 ونرى في أسفل كل مجموعة من اثنين ،
00: 25: 08.18 هنا ، النوع البري يقرأ
00: 25: 10.20 وآثار أقدام الريبوسوم من النوع البري ،
00: 25: 12.14 وما فوقها آثار أقدام Dom34 بالضربة القاضية ،
00: 25: 14.26 وما تراه هو ذلك
00: 25: 17.05 كلاهما لقراءة disome
00: 25: 18.18 - إذن تلك القمم التي عزلناها لريبوزومين على التوالي -
00: 25: 20.29 بالإضافة إلى القراءات القصيرة
00: 25: 24.10 - قراءة 16 مير لقمة أحادية أحادية ،
00: 25: 26.28 لذا ريبوسوم واحد فقط -
00: 25: 29.08 نرى أننا أثرينا بشكل كبير في سلالة حذف Dom34
00: 25: 32.12 بالنسبة إلى سلالة النوع البري ،
00: 25: 34.20 تتفق مع الفكرة
00: 25: 36.16 أن الريبوسومات بالفعل
00: 25: 38.15 مكدسة عند هذا التقاطع المشقوق داخليًا ،
00: 25: 40.04 لذلك نحن نفتقد intron ، الآن ،
00: 25: 41.21 لأن هذا مشقوق داخليًا.
00: 25: 43.09 الريبوسومات عالقة.
00: 25: 45.03 في ظل الظروف العادية ،
00: 25: 47.02 تم تطهيرهم من قبل Dom34 ،
00: 25: 49.06 وفي سلالة دلتا دوم 34
00: 25: 51.19 تتراكم الريبوسومات في هذه المواضع.
00: 25: 53.22 إذن ، كان هذا توقيعًا جميلًا
00: 25: 55.26 لوظيفة هذا البروتين في الخلية.
00: 25: 57.28 علاوة على ذلك ، عندما نظرنا ، في الواقع ،
00: 25: 59.20 منبع تلك المجموعة المتوقفة مؤقتًا من الريبوسومات ،
00: 26: 01.02 رأينا توقيعًا آخر لنشاط Dom34 في الخلية
00: 26: 04.20 التي بدت متشابهة جدًا:
00: 26: 06.10 مجموعة من القراءات القصيرة في دلتا Dom34
00: 26: 09.05 ويقرأ مجموعة من ذروة disome في دلتا Dom34 ،
00: 26: 12.21 يتفق مع فكرة أنه في الواقع
00: 26: 15.05 عندما يتوقف الريبوسوم مؤقتًا عند هذا الموضع الأول ،
00: 26: 17.01 من خلال انشقاق طبيعي للنووية بواسطة IRE1 ،
00: 26: 20.12 هناك انقسام آخر ،
00: 26: 22.20 يفترض عن طريق نوكلياز داخلي
00: 26: 24.14 التي تشارك عادةً في هذه العملية المسماة No-Go-Decay ،
00: 26: 27.02 إنه انشقاق ثانٍ لتحلل النواة
00: 26: 30.04 يؤدي إلى مجموعة أخرى من الريبوسومات
00: 26: 32.16 مكدسة يتم تطهيرها بواسطة هذا النظام.
00: 26: 35.16 لذلك ، كان هذا بالنسبة لنا ،
00: 26: 37.06 مثال جميل لما يفعله Dom34 في الخلية
00: 26: 39.13 على هذا الجين الفردي ،
00: 26: 41.07 وفي وقت لاحق
00: 26: 43.10 نعتقد أن هذا قد يكون متسقًا
00: 26: 45.02 بفكرة أنه في الخلايا الطبيعية
00: 26: 46.27 هناك عدد قليل جدًا من أهداف Dom34
00: 26: 48.19 تمثل أزمة ،
00: 26: 50.08 وهي أهداف كبيرة وكبيرة يحتاج Dom34 للعمل عليها.
00: 26: 52.27 لكنها قدمت دليلًا على النموذج ،
00: 26: 54.16 وهو ذلك عندما تتوقف الريبوسومات ،
00: 26: 57.01 تحدث الانشقاقات المحللة للنووية ،
00: 26: 59.00 وعندما تحدث تلك الانقسامات المحللة للنواة
00: 27: 00.24 يأتي هذا النظام وينقذ الريبوسومات ،
00: 27: 03.19 وفي حالة عدم وجود هذا النظام
00: 27: 05.05 تتراكم أكوام الريبوسومات.
00: 27: 07.01 لقد كانت مجموعة متسقة جدًا من البيانات
00: 27: 09.08 لطراز No-Go-Decay ،
00: 27: 11.12 ولماذا تفعل الريبوسومات في الأزمات.
00: 27: 13.19 لم تزودنا بالعديد من الأهداف.
00: 27: 16.28 حسنًا ، سأخبرك قصة أخرى ، الآن ،
00: 27: 18.28 ذات الصلة
00: 27: 20.26 ويتعلق بدور Dom34.
00: 27: 22.11 كان Dom34 متورطًا أيضًا
00: 27: 24.10 في مسار Non-Stop-Decay هذا
00: 27: 26.13 التي وصفتها في أول شريحتين.
00: 27: 28.29 بدون توقف ، كما ذكرت ،
00: 27: 30.26 هو ما يحدث عندما يصادف الريبوسوم
00: 27: 33.16 ذيل بولي أ ويترجم بولي ليسين.
00: 27: 36.00 والفكرة هي أن بولي ليسين يتحدث مع الريبوسوم ،
00: 27: 38.19 عبر نفق الخروج ،
00: 27: 40.07 ويقول ، "هذه مشكلة.
00: 27: 41.19 علينا التوقف هنا وإنقاذ هذه الريبوسومات ،
00: 27: 43.18 تحط من قدر الرسالة ،
00: 27: 45.06 ويحلل منتج البروتين ،
00: 27: 46.20 لأن البولي ليسين ليس له معنى ".
00: 27: 48.14 ولذا فإن النموذج مشابه تمامًا ،
00: 27: 49.28 بدلاً من الدخول في حلقة جذعية هنا ،
00: 27: 51.20 كما في دراسة روي باركر ،
00: 27: 53.08 تصطدم الريبوسومات بذيل بولي أ ،
00: 27: 55.24 يحدث انقسام حال النواة الداخلية ،
00: 27: 57.10 وقد تم توثيق ذلك ،
00: 27: 59.00 لذا مرة أخرى سيتم مسح الريبوسومات اللاحقة
00: 28: 02.00 بواسطة هذين البروتينين Dom34 و Hbs1 ،
00: 28: 04.11 ولسنا متأكدين تمامًا مما قد يحدث لهذه الريبوسومات.
00: 28: 07.01 ولكن ما أردنا معرفته هو:
00: 28: 08.23 هل كان هناك أي دليل على هذا النوع من النشاط
00: 28: 11.00 في خلايا الخميرة لدينا
00: 28: 12.09 يمكننا فك تشفير بيانات Dom34 الموجودة.
00: 28: 15.29 ما سأخبرك به أولاً هو ذلك
00: 28: 18.03 يمكننا في الواقع أن نشعر ببعض ما تفعله اللايسينات المتكررة في الخلية
00: 28: 22.08 للريبوزومات التي تصادفهم ،
00: 28: 24.02 ويمكننا فعل ذلك بالنظر إلى كل الريبوسومات في جينوم الخميرة ،
00: 28: 27.08 أو في نسخة الخميرة ،
00: 28: 28.22 ويمكننا بالفعل عمل نوع من الجين المتوسط
00: 28: 30.20 أو تحليلات الميتاجين
00: 28: 32.08 حيث نأخذ ليسينات مفردة ونصطفها معًا ،
00: 28: 35.01 أو الجينات التي تحتوي على نوعين من اللايسين على التوالي
00: 28: 37.01 وصطفهم معًا ،
00: 28: 39.02 أو ثلاثة ، أو ، أو خمسة ، وهكذا.
00: 28: 42.02 ويمكنك أن ترى على الفور
00: 28: 44.02 ما تم وصفه على مستوى تحليل الجينوم ،
00: 28: 46.08 وهو هذا العدد من اللايسينات المتتالية
00: 28: 48.24 في الواقع يتسبب في تلعثم الريبوسوم قليلاً
00: 28: 51.10 - لديك قمم أكبر هنا ،
00: 28: 52.24 الريبوسومات عالقة -
00: 28: 54.09 وهذا النوع ينتشر بطول الطول
00: 28: 56.18 من السبيل البولي ليسين.
00: 28: 58.05 إذن ، هذا هو استخدام بيانات تنميط الريبوسومات
00: 29: 01.14 لطرح أسئلة حول إشغال الريبوسوم ،
00: 29: 03.16 والتي تتفق مع الفكرة
00: 29: 05.10 أن البولي ليسين يمثل مشكلة.
00: 29: 06.26 يجب أن أقول ، رغم ذلك ،
00: 29: 08.14 أن هذه البولي ليسين في منتصف الجينات
00: 29: 09.28 - إنها ليست سوى ليسينات ترميز عادية.
00: 29: 12.20 إذن ، كانت لدينا طريقة أخرى اعتقدنا أنه يمكننا البحث عنها
00: 29: 16.12 ماذا يحدث عندما تواجه الريبوسومات بولي ليسين ،
00: 29: 18.15 وكان ذلك عن طريق التلاعب بخلايا الخميرة
00: 29: 20.09 بطريقة خاصة ،
00: 29: 22.17 وسأخبركم عن ذلك في هذه التجربة ، هنا.
00: 29: 24.23 إذن ، ما يمكنك رؤيته ، على سبيل المثال ،
00: 29: 26.13 إذا أخذنا جينًا فرديًا -
00: 29: 28.23 يُعرف هذا الجين باسم ENT5 ،
00: 29: 30.15 إنه مجرد جين خميرة متوسط ​​-
00: 29: 31.28 ويمكننا أن نرى في النوع البري وسلالة خروج المغلوب Dom34.
00: 29: 34.14 متوسط ​​طول القراءات ،
00: 29: 35.28 هذه هي 30 مير التي يقرأها مختبر جوناثان وايزمان
00: 29: 37.26 مميزة أصلاً ،
00: 29: 39.08 وما نراه هو ما نتوقعه ،
00: 29: 40.24 وهو ريبوسوم يقرأ في إطار القراءة المفتوح ،
00: 29: 43.06 لكن ليس في 3'UTR
00: 29: 44.28 وليس عند ذيل بولي أ ،
00: 29: 46.09 وهذا منطقي لأن هذا جين طبيعي
00: 29: 48.10 مع كودون إيقاف عادي
00: 29: 49.27 وتتعرف الريبوسومات على كودون الإيقاف.
00: 29: 51.18 لكن التجربة التي قمنا بها
00: 29: 53.01 تم إدخالنا بالفعل في سلالة الخميرة
00: 29: 55.03 حمض الحمض الريبي النووي النقال القامع ،
00: 29: 56.22 وماذا تفعل tRNAs القامع
00: 29: 58.12 هل يسيئون التعرف على أكواد الإيقاف
00: 30: 00.14 وقرأوا من خلال أكواد الإيقاف ،
00: 30: 02.24 السماح بتجاوز أكواد الإيقاف
00: 30: 04.20 على مستوى ما ،
00:30: 06.08 وبالتالي الترجمة إلى 3'UTR
00: 30: 08.16 وفي الجينات التي تفتقر إلى كودون توقف آخر في 3'UTR ،
00:30: 10.29 في ذيل بولي أ.
00: 30: 13.18 وهكذا ما نراه هنا.
00: 30: 15.02 هذه قراءات كاملة نراجعها الآن.
00: 30: 16.25 إذا وضعنا مثبطًا للـ tRNA
00: 30: 18.19 في سلالة الخميرة وانظر إلى نفس الجين ،
00: 30: 22.02 نقرأ من خلال كود التوقف ، هنا ،
00: 30: 24.15 نقوم بتجميع قراءات الريبوسوم في 3'UTR ،
00: 30: 28.13 لكننا عززنا قراءات الريبوسوم
00: 30: 30.21 في Dom34 متحولة.
00: 30: 32.14 إذن ، هذا دليل على أن
00: 30: 34.10 عند قراءة كود التوقف
00: 30: 35.28 واقرأ في 3'UTR
00:30: 37.16 وفي ذيل بولي أ ،
00: 30: 39.02 هذه الريبوسومات ، في ظل الظروف العادية.
00: 30: 40.29 هذا موجود فوق بولي أ.
00: 30: 42.18 سيتم تطهيره بواسطة Dom34.
00: 30: 44.28 وفي غيابها لدينا كومة كبيرة ،
00: 30: 47.13 لذلك هذا شيء يفعله Dom34 بالتأكيد في الخلايا.
00: 30: 51.05 كنا أكثر سعادة ، مع ذلك ،
00: 30: 52.28 عندما نظرنا إلى mer القصير
00: 30: 54.14 لرؤية علامات هذا الانقسام حال النواة
00: 30: 56.10 التي تم اقتراحها للقراءة في بولي ليسين.
00: 30: 59.11 نرى ذلك هنا عندما ننظر ، مرة أخرى ،
00: 31: 01.10 في نفس السلالة مع tRNA الكابت الهراء
00: 31: 03.18 ويقرأ الريبوسوم كامل الطول
00: 31: 05.20 جالسًا هنا عند تقاطع ذيل بولي أ.
00: 31: 09.11 نرى وراء ذلك التوقيع.
00: 31: 11.02 نرى قراءات صفراء
00: 31: 12.15 - هذه قراءات قصيرة. هذه هي الرنا المرسال التي تم اقتطاعها
00: 31: 16.10 وقد وصل الريبوسوم إلى نهاية ذلك الرسول RNA ،
00: 31: 18.28 وهم يتتبعون ، في الواقع ،
00: 31: 20.21 هذه الذروة الرمادية بسبب انشقاق النواة الداخلية ،
00: 31: 23.19 نعتقد ، وقد تم عرضه ،
00: 31: 24.27 يحدث خلف الريبوسوم الموجود في المقدمة.
00: 31: 27.06 إذن ، يواجه هذا الريبوسوم ذيل بولي أ ،
00: 31: 30.00 أنها تكافح معها بطريقة ما ،
00: 31: 31.18 يقرأ الريبوسوم ذلك على أنه مشكلة ،
00: 31: 33.08 يحدث انقسام حال النواة خلف ذلك ،
00: 31: 36.06 وتحصل على مجموعة من القراءات.
00: 31: 38.12 مرة أخرى ، تحديد دور واضح لـ Dom34
00: 31: 41.20 عندما تقرأ في ذيل بولي أ.
00: 31: 44.02 هل يحدث هذا نوعًا ما.
00: 31: 46.16 ماذا لو نظرنا إلى هذا بطريقة أكثر عالمية؟
00: 31: 48.04 حسنًا ، يمكننا أن نأخذ هذا النوع من التوقيع
00: 31: 50.01 ويمكننا القيام بذلك بطريقة أكثر عالمية أو تحليل ميتاجيني ،
00: 31: 54.00 حيث نصطف ، هنا ، عند 0 ،
00: 31: 55.25 تقاطع مع ذيل بولي أ.
00: 31: 58.08 وها هم ،
00: 32: 00.02 هذه هي القراءة الطويلة للرمادية المكونة من 30 نيوكليوتيد.
00: 32: 01.12 لقد قمنا بمحاذاة كل ذيول polyA معًا
00: 32: 03.01 على جميع الجينات
00: 32: 04.16 التي تحتوي على أكواد غير منطقية تم قمعها
00: 32: 06.04 بواسطة الكابت tRNA.
00: 32: 07.18 ما نراه هو كومة الرمادية التي تقرأ هنا
00: 32: 10.04 - هذه هي قراءة الريبوسومات في ذيل بولي أ -
00: 32: 12.22 وهنا كومة الريبوسومات
00: 32: 15.01 متخلفًا عن الرنا المرسال المقتطع
00: 32: 17.00 التي هي نتيجة الريبوسوم
00: 32: 19.19 قراءة ذيل بولي أ.
00: 32: 20.27 إنه تأخر 29 نيوكليوتيد
00: 32: 23.05 وهذا يتفق مع التباعد
00: 32: 24.24 نتوقع أن يكون الريبوسوم عالقًا في المقدمة
00: 32: 26.22 ويظهر نوكلياز داخلي.
00: 32: 28.20 إذن ، هذه نظرة عالمية لما
00: 32: 31.12 يبدو ما يسمى بـ Non-Stop-Decay.
00: 32: 33.14 الريبوسومات هي توقيع لنا
00: 32: 35.24 تحديد Non-Stop-Decay
00: 32: 37.14 في سلالة Dom34-delta هذه.
00: 32: 40.06 لذلك ، ربما تجادل ،
00: 32: 41.19 أن هذا ليس واسعًا بشكل خاص
00: 32: 43.14 بعيدة المدى
00: 32: 45.25 لأننا وضعنا tRNA مثبطًا هراءًا
00: 32: 47.19 في سلالة الخميرة هذه ،
00: 32: 49.04 وربما لا تكون هذه ظاهرة عامة.
00: 32: 50.19 لكن ما سأناقشه
00: 32: 52.03 هو أنه في الواقع مادة البولي أدينيل السابقة لأوانها
00: 32: 55.02 حدث وفير ومنتظم في الخلايا حقيقية النواة ،
00: 32: 58.26 وتوقيع هذا الحدث
00: 33: 00.28 يتم محوها إلى حد كبير من خلال مجموعة متنوعة من مسارات مراقبة الجودة
00: 33: 04.18 التي تحدث دائمًا ،
00: 33: 06.10 إجراء التوقيع على مادة البولي أدينيل قبل الأوان
00: 33: 08.22 غير مرئي بالتجارب العادية.
00: 33: 11.04 وهذان مثالان على ذلك.
00: 33: 12.22 RNA14 هو جين في الخميرة ،
00: 33: 14.14 و YAP1 ،
00: 33: 16.14 المعروف أنه تم معالجة عديد الأدينيلات قبل الأوان.
00: 33: 18.20 النتائج السابقة من Pelechano et al في عام 2013 ،
00: 33: 22.14 في الواقع باستخدام طرق تسلسل الحمض النووي الريبي ،
00: 33: 24.01 تم تحديد مواقع البولي أدينيل المبكرة
00: 33: 26.11 في هذين الجينين.
00: 33: 27.21 وما نراه هو
00: 33: 29.12 باستخدام سلالة Dom34-delta الخاصة بنا
00: 33: 31.20 ويبحث عن قراءات رمادية وصفراء
00: 33: 33.20 - القراءات الطويلة والقراءات القصيرة -
00: 33: 36.21 نرى توقيعًا واضحًا
00: 33: 38.22 أن الريبوسومات عالقة في هذا الجين
00: 33: 40.28 على RNAs الرسول المشقوق داخليًا
00: 33: 43.08 يجب أن تكون النتيجة
00: 33: 46.00 قراءة الريبوسوم إلى بولي ليسين.
00: 33: 47.26 ما يمكنني قوله هو أننا إذا نظرنا بشكل واسع إلى الخميرة ،
00: 33: 50.14 في هذه السلالات - سلالة Dom34-delta -
00: 33: 53.06 واستخدم مظهر مثل هذه القراءات
00: 33: 55.20 في منتصف إطارات القراءة المفتوحة
00: 33: 57.06 كتوقيع على هذه العملية
00: 33: 59.23 حدوث Non-Stop-Decay ،
00: 34: 01.13 ما يمكنني قوله هو أنه واسع بشكل لا يصدق.
00: 34: 03.17 العديد والعديد والعديد من الجينات التي ننظر إليها ،
00: 34: 06.10 ما يصل إلى 50٪ من الجينات التي ننظر إليها ،
00: 34: 08.02 يوجد في منتصفها أكوام من الريبوسومات
00: 34: 10.22 إذا تم إخراج Dom34 من الخلية ،
00: 34: 12.26 يشير إلى أن هذا في الواقع
00: 34: 15.10 حدث منتظم جدًا يحدث في خلايا الخميرة
00: 34: 17.26 وأظن أنه سيحدث في حقيقيات النوى الأعلى.
00: 34: 20.10 لذا ، سأعود إلى هذه الشريحة ،
00: 34: 22.08 حيث تحدثت عن توزيع أحجام الشظايا ،
00: 34: 24.10 كطريقة للنهاية وإخبارك
00: 34: 26.10 ما مدى أهمية وجود Dom34 في الخلية.
00: 34: 28.29 إذن ، لقد عرضت عليك في البداية
00: 34: 31.00 أنه إذا كنا ، بطريقة غير منحازة ،
00: 34: 32.22 قطع شريحة كبيرة من الجل
00: 34: 34.18 واسأل عن عدد الريبوسومات الموجودة على قراءات الريبوسوم كاملة الطول
00: 34: 37.22 مقابل القراءات القصيرة ،
00: 34: 39.08 ما يمكنك رؤيته هنا هو أنه كان هناك حوالي 5٪ من القراءات ،
00: 34: 42.23 ربما كان ذلك في هذه المنطقة بالأسفل هنا ،
00: 34: 44.13 إذا جمعناها على عدة أطوال.
00: 34: 46.16 لذلك ، قد تقول ، تلك هي أهداف Dom34 النموذجية.
00: 34: 48.24 إنها قراءات قصيرة
00: 34: 50.16 وقد يتم استهدافهم عادةً بواسطة نظام Dom34.
00: 34: 53.15 وما يمكنني أن أخبرك به هو أننا إذا ضربنا Dom34.
00: 34: 55.29 هذه في الواقع سلالة من النوع البري
00: 34: 57.18 الذي ننظر إليه هنا.
00: 34: 59.01 إذا ضربنا Dom34 ، فإن حجم الذروة هذا يتضاعف.
00: 35: 01.13 إذن ، 5٪ على الأقل من القراءات في هذه الحالة ،
00: 35: 04.02 يمكننا أن نقول بثقة نوعًا ما ،
00: 35: 06.01 قد يكون نتيجة إجراء Dom34 في الخلية ،
00: 35: 08.26 مما يشير إلى ذلك في الواقع
00: 35: 10.16 يوجد الكثير من القراءات القصيرة في الخلية
00: 35: 12.16 ويمكنك أن تتخيل أن هناك أقصر مدة
00: 35: 14.08 الناتجة عن العمليات الوسيطة
00: 35: 16.01 من الاضمحلال الخارجي للرسول RNAs ،
00: 35: 19.20 ولذا فإننا نجادل بأن هذا يساعدنا على الفهم
00: 35: 22.07 لماذا هذا الجين ضروري في حقيقيات النوى الأعلى ،
00: 35: 24.17 وأظن أننا سنتعلم المزيد عن ذلك قريبًا ،
00: 35: 27.09 وغير ضروري في الخميرة ،
00: 35: 29.02 ولكنه يصبح ضروريًا في الحالة التي تكون فيها الريبوسومات محدودة.
00: 35: 31.29 لذا ، أعتقد أنه يساعدنا على الفهم
00: 35: 33.25 دور Dom34 في الجسم الحي.
00: 35: 35.14 يلعب دورًا مهمًا ،
00: 35: 37.00 هذا هو سبب كونها قاتلة جنينية في حقيقيات النوى الأعلى ،
00: 35: 38.26 ولقد كشفنا عن هذا الدور
00: 35: 40.16 من خلال العمل في نظام يمكن التحكم فيه وراثيًا
00: 35: 42.08 حيث يمكننا بالفعل حذف الجين
00: 35: 44.06 وادرس العملية في الوقت الفعلي.
00: 35: 47.05 لذلك سأتوقف وأختتم
00: 35: 53.14 بإخبارك أنني أتمنى أن تفهم
00: 35: 55.11 شيئًا عن مراقبة mRNA بشكل عام ،
00: 35: 57.04 وأعتقد أن الرسالة المنزلية
00: 35: 59.16 هو هذا في المركز حقًا
00: 36: 01.12 لأي عملية مراقبة mRNA
00: 36: 03.02 هو الريبوسوم.
00: 36: 04.17 يقرأ الريبوسوم الرنا المرسال
00: 36: 06.12 وخصائص الريبوسوم
00: 36: 08.06 وآلات الريبوسوم
00: 36: 09.23 المسؤولة عن التعرف على العوامل والتوظيف
00: 36: 12.07 لفهم ذلك
00: 36: 14.20 عندما تكون RNAs معيبة بطريقة ما
00: 36: 16.01 وتحتاج إلى استهدافها من أجل الاضمحلال
00: 36: 19.14 بالمسارات العادية ،
00: 36: 20.26 أن منتج البروتين غير المكتمل يحتاج إلى استهداف للتحلل ،
00: 36: 23.27 وأن الريبوسومات نفسها
00: 36: 25.20 تحتاج إلى الإنقاذ من خلال مسار مستقل عن عملية الإنهاء العادية ،
00: 36: 29.08 لكي يتم إعادتهم إلى حوض السباحة من أجل التوازن الريبوسومي.
00: 36: 33.14 وبهذا سأذكر اللاعبين الأساسيين في مختبري
00: 36: 35.26 من قام بهذا العمل.
00: 36: 37.06 أقدم عمل كيميائي حيوي في المختبر
00: 36: 39.10 قام به كريس شوميكر ،
00: 36: 41.07 وجميع أعمال التنميط الريبوسوم
00: 36: 42.20 تم إنجازه بالفعل بواسطة نيك جويدوش ،
00: 36: 44.22 باحث ما بعد الدكتوراة حديثًا في المختبر.
00: 36: 47.03 وأود أيضًا أن أشكر مصادر التمويل الخاصة بي
00: 36: 49.01 من المعاهد الوطنية للصحة ومعهد هوارد هيوز الطبي.
00: 36: 51.13 شكرًا لك.

  • الجزء 1: تخليق البروتين: حدث جزيئي عالي الدقة

الاكتشاف في البيولوجيا التركيبية يقترب خطوة من ثورة صناعية جديدة

أفاد العلماء أنهم طوروا طريقة تقلل الوقت المستغرق لصنع أجزاء جديدة للمصانع البيولوجية المجهرية.

تقلل هذه الطريقة الوقت من يومين إلى 6 ساعات فقط ، ويقول العلماء من إمبريال كوليدج لندن ، إن أبحاثهم تقربهم خطوة أخرى من نوع جديد من الثورة الصناعية ، حيث يمكن إنتاج أجزاء من هذه المصانع البيولوجية بكميات كبيرة. تمتلك هذه المصانع ثروة من التطبيقات بما في ذلك علاجات توصيل الأدوية الأفضل للمرضى ، والتعزيزات في طريقة استخراج المعادن من أعماق الأرض ، والتقدم في إنتاج الوقود الحيوي.

يمكن إعادة هندسة البكتيريا غير الضارة في مصانع مجهرية يمكنها تحسين الرعاية الصحية للمرضى

يقول البروفيسور بول فريمونت ، المدير المشارك لمركز البيولوجيا الاصطناعية والابتكار في إمبريال كوليدج لندن والباحث المشارك الرئيسي في الدراسة ، التي نُشرت اليوم في مجلة Nucleic Acids Research:

& ldquo قبل الثورة الصناعية كانت معظم الأصناف تُصنع يدويًا ، مما يعني أنها كانت أبطأ في التصنيع ، وأكثر تكلفة في الإنتاج ومحدودة العدد. نحن في منعطف مماثل في البيولوجيا التركيبية ، حيث يتعين علينا اختبار وبناء كل جزء من نقطة الصفر ، وهي عملية طويلة وبطيئة. لقد أظهرنا في دراستنا طريقة جديدة يمكن أن تساعد في زيادة إنتاج واختبار الأجزاء البيولوجية بسرعة. & rdquo

يتم إعادة هندسة الأجزاء المكونة من الحمض النووي من قبل العلماء ووضعها في الخلايا لصنع مصانع بيولوجية. ومع ذلك ، فإن العقبة الرئيسية في البيولوجيا التركيبية هي نقص الأجزاء التي يمكن من خلالها بناء أنواع جديدة من المصانع. لبناء أجزاء باستخدام الطريقة الحالية التي تستغرق وقتًا طويلاً ، يتعين على العلماء إعادة هندسة الحمض النووي في الخلية ومراقبة كيفية عملها.إذا كان يعمل وفقًا لمواصفاتهم ، يقوم العلماء بتخزين مواصفات القطعة في كتالوج.

الآن ، ابتكر علماء من إمبريال كوليدج لندن طريقة أسرع بكثير تلغي الحاجة إلى إعادة هندسة الخلية في كل مرة يريدون فيها صنع جزء جديد. يقول الفريق إن عملهم يمكن أن يؤدي إلى مكتبات جديدة واسعة من المكونات الجاهزة التي يمكن استخدامها لبناء مصانع بيولوجية أكثر تطوراً.

يقول جيمس تشابيل ، المؤلف المشارك للدراسة من مركز البيولوجيا الاصطناعية والابتكار في إمبريال كوليدج لندن:

& ldquo يتمثل أحد الأهداف الرئيسية في البيولوجيا التركيبية في إيجاد طريقة لتصنيع عملياتنا حتى نتمكن من إنتاج هذه المصانع البيولوجية بكميات كبيرة بالطريقة نفسها التي تنتج بها صناعات مثل مصنعي السيارات المركبات في خط المصنع. هذا يمكن أن يطلق العنان لإمكانات هذا المجال العلمي ويمكننا من تطوير أجهزة أكثر تعقيدًا يمكن استخدامها لتحسين العديد من جوانب المجتمع. المثير في الأمر أن بحثنا يأخذنا خطوة أقرب إلى هذا الواقع ، حيث يوفر طريقة سريعة لتطوير أجزاء جديدة. & rdquo

عندما يتم إعادة هندسة الخلية ، يقوم الحمض النووي المعاد برمجته في الخلية بترميز رسالة يتم نقلها بواسطة جزيئات تسمى حمض الريبونوكليكي الرسول (mRNA) إلى مصانع إنتاج الخلايا و rsquos تسمى الريبوسومات. تقوم الريبوسومات بترجمة المعلومات الجينية إلى أمر يوجه الخلية لأداء الوظائف. على سبيل المثال ، يمكن للعلماء بالفعل إعادة هندسة خلية إلى مصنع للكشف عن العدوى ، والذي ينتج بروتينًا يكتشف الإشارات الكيميائية من البكتيريا المسببة للأمراض البشرية ويغير لونها للإشارة إلى وجودها.

في الدراسة ، أظهر الباحثون الإمبراطوريون لأول مرة أنه يمكن تحقيق نفس الطريقة في أنبوب اختبار خارج الخلية. يتضمن ذلك استخراج الآلية من الخلايا التي تنتج الرنا المرسال والبروتينات وتوفير الطاقة ولبنات البناء لمساعدتها على البقاء على قيد الحياة في أنابيب الاختبار. ثم يضيف الفريق الحمض النووي المعاد برمجته إلى المحلول ويلاحظ كيف يعمل.

ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن للعلماء تطوير لترات من هذه البيئة الشبيهة بالخلية بحيث يمكن اختبار الحمض النووي المعاد برمجته المتعددة في وقت واحد ، مما يسرع عملية إنتاج الأجزاء.

تتمثل المرحلة التالية من البحث في توسيع أنواع الأجزاء والأجهزة التي يمكن تطويرها باستخدام هذه الطريقة. كما أنهم يهدفون إلى تطوير طريقة باستخدام الروبوتات لتسريع العملية برمتها وجعلها آلية.

يقول البروفيسور ريتشارد كيتني ، المدير المشارك لمركز البيولوجيا التركيبية والابتكار في إمبريال كوليدج لندن: & ldquo تنظر الحكومة البريطانية إلى البيولوجيا التركيبية على أنها تمتلك القدرة على خلق صناعات ووظائف جديدة لصالح اقتصاد المملكة المتحدة. هذا العمل هو جزء من برنامج بحث رئيسي أوسع داخل المركز لتطوير التكنولوجيا التي يمكن استخدامها عبر مجموعة من التطبيقات الصناعية. & rdquo


12.18: الريبوسومات - علم الأحياء

كيف يؤثر الاختلاف الجيني على السمات المظهرية ، سواء على المستوى العضوي أو الخلوي (بما في ذلك التركيز على تنظيم الجينات)؟ ما هي المسارات الجزيئية من التباين الجيني إلى الأنماط الظاهرية الخلوية والكائن؟ لماذا يساهم الكثير من الجينوم في الأساس الجيني للسمات المعقدة؟

يتضمن مختبرنا أشخاصًا مدربين في مجموعة متنوعة من المجالات المختلفة باستخدام مناهج حسابية وتجريبية لمعالجة هذه المشكلات. غالبًا ما نعمل على حل المشكلات التي لا توجد بها طرق إحصائية جاهزة. وبالتالي ، فإن جزءًا مهمًا من عملنا يكمن في تطوير مناهج إحصائية وحسابية مناسبة يمكن أن تسفر عن رؤى جديدة في البيانات البيولوجية.

روابط مفيدة

أخبار المعمل

ومرحبًا بكم في طلاب الدكتوراه الجدد أليسا فورتيير و روشني باتل ومُحرر ما بعد الدكتوراة الجدد: شاهين نقفي, جيف سبنس, هخامانيش مصطفوي و كليمنس فايس!

قد: تتضمن الأوراق الجديدة أحدث أعمالنا حول فهم العمارة الجينية للسمات المعقدة (ورقة "Omnigenic 2") Xuanyao ليو و يانغ Li: [رابط] وورقتنا البحثية مع مختبرات Criswell و Marson و Greenleaf حول بنية الكروماتين للخلايا المناعية (بقيادة دييغو في مختبرنا ، مع ميشيل نغوين وآنجا ميزغر): [رابط] تهانينا لدييغو ، وشواناو ، ويانغ وبقية الفرق!

كانون الثاني: مرحبا بك في شيلا مشروف من سينضم إلينا هذا الشهر!

ديسمبر: وداع ل ديفيد و إميلي! كلاهما سيفتقد كثيرا. سيبدأ ديفيد مختبره الخاص في مركز الجينوم في نيويورك ، وتنقل إميلي خبرتها في علم الجينوم إلى عالم الاستشارات.

9/18/2018. تقرير إخباري:

مجيء وذهاب:
شهر اغسطس: مرحبا بكم في محققو ما بعد الدكتوراة الجدد جيك فريمر و يوفال سيمونز!

ايلون حصل على وظيفة كأحد العلماء الأوائل في شركة Insitro الجديدة ، التي أسستها دافني كولر. رحلة سعيدة إلى إيلون!

إميلي دافعت عن أطروحتها! مبروك إميلي! ستبقى في المختبر حتى نهاية العام لإنهاء الأوراق.

مبروك ل ناتالي و بن، كلاهما من خريجي المختبر ، في حفل زفافهما الجميل.

تموز: معمل الخريجة معركة الكسيس حصل على منصب مبكر في الهندسة الطبية الحيوية في جامعة جونز هوبكنز. اخبار رائعة!

يونيو: هانا م حصل على جائزة روبرت باينارد تيكستور من قسم الأنثروبولوجيا عن "الإبداع في الأنثروبولوجيا". أحسنت ، وتستحق ، هانا!

قد: أربيل تخرج وانتقل إلى منصب ما بعد الدكتوراة في مختبر مولي برزيورسكي في كولومبيا. في أغسطس رحب هو وزوجته مايا بتوأم طفلين! تهانينا! هذا هو الزوج التوأم الثالث في المختبر في آخر 7 سنوات. هل هذا إثراء كبير؟

جوناثانالحديث العام لـ PEQG حول نموذج Omnigenic (مع Evan و Yang و Xuanyao) موجود هنا عبر الإنترنت.

مارس: ناتالي تخرج وانتقل إلى منصب عالم فريق في Ancestry. مبروك ناتالي! إننا نفتقدك!

كانون الثاني: كيلي انتقلت لبدء مختبرها الخاص في قسم علوم الجينوم بجامعة واشنطن. نحن متحمسون لمتابعة تقدمها في واشنطن!

10/25/2017. تقرير إخباري:

اكتوبر: ASHG: ناتالي ألقت محاضرة عامة استقبلت جيدًا 7000 شخص في مشروعها الجانبي حول ديناميكيات النوع الاجتماعي في المؤتمر و ناسا ويانغ وإميلي وديفيد قدم أيضًا عروض تقديمية رائعة للمنصة. عمل جيد جميعا!

تحديث: ناسا فاز في ASHG احلى كلام طالب (للعمل مع ميلينا كلاوسنيتسر). أحسنت!!

لدينا العديد من الأوراق البحثية أو على وشك الخروج في المجلات: ايلون على استخدام cfDNA لقياس رفض الزرع يانغ وديفيد على LeafCutter (الربط) دييغو في تقدير أنواع الخلايا التي تقود الصفات المعقدة أربيل على NAGC في التكرارات الجينية جيسيكا على التريكلوسان والميكروبيوم (العمل مع مختبر أمي).

مبروك ل زييو في زفافها!

سبتمبر: يانغ و شون انتقلوا لبدء مختبراتهم الخاصة. رحلة سعيدة!!

مبروك ل هارولد الذي حصل على زمالة هانا جراي المرموقة لما بعد الدكتوراة من معهد HHMI.

يونيو: أهلا بك ناسا وهانا ومارجريت الى المختبر!

6/22/2017. تقرير إخباري للأشهر القليلة الماضية:

يونيو: الإفراج عن قطعة منظورنا على "كلي الوجودنموذج الصفات المعقدة ، مع المؤلفين الرئيسيين ايفان بويل و يانغ لي [رابط PDF]. حفزت ورقتنا الكثير من النقاش على وسائل التواصل الاجتماعي وأماكن أخرى ، بما في ذلك مقال إد يونغ في المحيط الأطلسي وفي أخبار ستانفورد.

قد: تهانينا لثلاثة من طلاب ما بعد الدكتوراة الذين قبلوا مناصب أستاذ مساعد بالكلية للعام الدراسي القادم: كيلي هاريس (يو واشنطن ، علوم الجينوم) ، يانغ لي (يو شيكاغو ، الطب الوراثي) ، و شون لان (Tsinghua U ، العلوم الطبية الأساسية).

و كيلي حصل أيضًا على جائزة مرموقة في انتقال أعضاء هيئة التدريس من خلال برنامج CASI في صندوق Burroughs Wellcome Fund.

ناتالي و أربيل حصل على زمالات الدراسات العليا من CEHG. أحسنت! و جوناثان سيصبح مديرًا مشاركًا لـ CEHG بدءًا من يونيو.

دييغوالورقة حول استنتاج أنواع الخلايا التي تسبب المرض موجودة في bioRxiv.

أبريل: كيلي كان لها بناء ورقي جميل للغاية بناءً على نتائج مذهلة من عملها في الدكتوراه: التطور السريع لطيف الطفرات البشرية، من هذا الشهر في eLife [رابط].

هارولد, إيفان و ديفيد كل منهم لديه أوراق جديدة حول عمله مع مختبرات أخرى: سليوث [هارولد] وكاس 9 بيندينغ [إيفان] و ASE لاكتشاف GxE [ديفيد].

مارس: انتقل أناند إلى منصب عالم البيانات في Facebook. سنفتقد خبرته الفنية المذهلة ومساهماته غير الرسمية في العديد من المشاريع في المختبر! رحلة سعيدة ، أناند!

كانون الأول (ديسمبر) 2016. أربيل و أناندعمل على كيفية تغيير الطفرة المتكررة طيف تردد الموقع في عينات كبيرة أصبح الآن خارج PLOS Genetics: [رابط]. تهانينا!

ناتالي لديها مقال ممتع طبقت فيه الأساليب الحسابية لدراسة تاريخ المجلة علم الوراثة منذ عام 1917 [رابط]. [مخطط زمني لمواقع المؤلفين]

شهر نوفمبر. يائير, إيفان، و ناتاليالورقة الخاصة بـ SDS والتكيف متعدد الجينات: الكشف عن التكيف البشري خلال 2000 سنة الماضية خارج الآن في Science [Link]. تهانينا!

9/20/2016. مرحبا بك في هارولد بيمينتيل من انضم إلى المختبر الشهر الماضي!

أيضا، ايلون لديه ورقة في Nature Genetics تظهر التفاعلات العابرة (أي عبر eQTLs) بين أليلات بروتين MHC والتعبير عن جينات مستقبلات الخلايا التائية. بمساعدة ليا سيبنر وكريس جارسيا ، تمكنا من تفسير ذلك من حيث التفاعلات الفيزيائية في بنية البروتين [رابط]

6/1/2016. الكثير من الأخبار المثيرة للإبلاغ عنها من أبريل ومايو:

أنيل على الورق باستخدام بيانات التنميط الريبوسوم لاكتشاف إطارات القراءة المفتوحة الجديدة متصل الآن على eLife [Link].

شون ورقة على تطور التكرارات الجينية تم نشره في Science [Link]. حظي هذا ببعض الاهتمام اللطيف ، بما في ذلك في منشور مدونة بقلم فرانسيس كولينز.

يائير وإيفان وناتالي على الورق تكيف متعدد الجينات حديث جدًا الآن خارج على bioRxiv [رابط]. حصل هذا على الكثير من الاهتمام ، بما في ذلك المقالات الإخبارية في الطبيعة والعلوم.

يائير و يانغ ألقى كلاهما محادثات في اجتماع بيولوجيا الجينوم في كولد سبرينغ. كان من الرائع أيضًا رؤية محادثات من خريجي المختبرات معركة الكسيس, جو بيكريل و دان جافني، وللتقاء مع العديد من الزملاء والأصدقاء وخريجي المختبرات الآخرين.

هنا يمكنك رؤية زوج من الرسومات الرائعة ليانغ ويئير ، رسمها أليكس كاجان.

4/28/2016. أحسنت يانغالذي ورقته ربط الحمض النووي الريبي (RNA) هو رابط أساسي بين الاختلاف الجيني والمرض هو خارج اليوم [رابط]. تستخدم هذه الورقة بيانات من 7 سنوات من المشاريع المشتركة بين مختبرنا ومختبر يوآف لتقديم حساب تفصيلي للروابط بين التباين الجيني والتباين في تنظيم الجينات والمرض.

3/29/2016. مبروك ل إيفان (NSF predoc!). وكذلك ل يانغ و ديفيد ك على ورقة Leafcutter الخاصة بهم حول القياس الكمي لتضفير الحمض النووي الريبي ، متوفر الآن على bioRxiv.

1/4/2016. الوداع وأطيب التمنيات بريس (ما بعد الدكتوراة ، مختبر Alkes Price ، هارفارد) و جراهام و كايل، وبدءوا مختبراتهم الخاصة في معهد Salk و UCSD ، على التوالي.

11/20/2015. مبروك ل بريس لدفاعه عن درجة الدكتوراه البارعة في شيكاغو. كانت مناسبة حلوة ومرة ​​، إيذانا بنهاية حقبة U Chicago.

9/14/2015. ورقة Bryce and Graham's WASP (رسم خرائط QTL بقراءات خاصة بالأليل) متوفرة اليوم في طرق الطبيعة.

8/18/2015. استمتعنا بعشاء وداع في العداد يوم الجمعة من أجل أودري و توفيق (بدء مختبراتهم الخاصة في U of Idaho و Mt Sinai ، على التوالي). رحلة سعيدة!

ترحيب كبير كيلي هاريس و زييو جاو الذين ينضمون إلينا كباحثين جدد لما بعد الدكتوراة من معامل راسموس نيلسن ومولي برزيورسكي!

مرحبًا بكم في الزائر قصير المدى Dan Lawson وأيضًا Alexis Battle الذي عاد لزيارتنا لفترة وجيزة هذا الشهر.

تهانينا لإيلون وميشال بمناسبة ولادة ابنهما يوفال!

في قسم المنح ، أحسنت كيلي (NRSA) ، ديفيد جي (EMBO / LLHF) ، يانغ (CEHG) ، جيسيكا (NSF predoc)! وحصلت ناتالي وإيفان على زوج من المنح البحثية الداخلية ، أحدهما من علم الوراثة والآخر من علم الأحياء. مجد.

5/22/2015. أوشك JKP على الانتهاء من التدريس. متابعة الأخبار: مبروك جراهام من يأخذ وظيفة هيئة التدريس في معهد سالك!!

ومبروك ل توفيق من يأخذ وظيفة هيئة التدريس في جبل سيناء.

ومزيد من الف مبروك ل يانغ الذي حصل على زمالة ما بعد الدكتوراة من CEHG للعام القادم!

و ورقة شون على تطور ازدواج الجينات خارج على bioRxiv.

4/2/2015. مبروك ل ديفيد ج. من حصل على منحة جائزة دان ديفيد!

3/31/2015. تهانينا لعضو المختبر السابق ميليسا Hubisz ، الموجود الآن في جامعة كورنيل ، لفوزه ب NSF بريدوك جائزة! أحسنت أيضًا مع جيسيكا وإميلي وإيفان على الإشارات الشرفية.

12/18/2014. إن ورقة Alexis و Zia و Sidney حول العلاقة بين التباين الجيني والاختلاف الظاهري في RNA والريبوسومات والبروتينات قد خرجت اليوم. تهاني!

12/16/2014. مبروك ل كريستينا من أكملت مناقشة الدكتوراه في علوم الحاسب بالأمس !!

12/04/2014. ورقة Anil و Heejung حول استخدام مناهج متعددة المقاييس لنمذجة بيانات DNase في مواقع ربط TF خارج على bioRxiv.

11/11/2014. موقعنا الجديد SciReader للتوصيات العلمية في إصدار بيتا. يمكنك التحقق من ذلك هنا: SciReader.org. أحسنت بريا ، ناتالي ، يونغجان!

11/11/2014. تم تشغيل الورق والبرمجيات الخاصة ببرايس وغراهام تخطيط قراءة خاص بأليل غير متحيز ورسم خرائط قوي لـ QTL خارج على bioRxiv وبرنامج WASP المقابل موجود على GitHub.

9/22/2014. الكثير من الوافدين الجدد هذا الشهر: ديفيد ويانغ وأناند وإميلي العلماء الزائرون: أودري وتوفيك وكايل. أهلا بك!

8/07/2014. ننتقل هذا الأسبوع إلى مساحة معملنا طويل الأمد في مركز كلارك! نحن سعداء جدًا لوجودنا في الفضاء الجديد. في اخبار اخرى، أناند حصل على زمالة CEHG للعام المقبل. أحسنت يا أناند!

6/24/2014. ستبدأ أليكسيس مختبرها الخاص الشهر المقبل في Johns Hopkins في أقسام CS و Biostats [رابط]. نتمنى لها كل التوفيق في منصبها الجديد !!

6/24/2014. أحسنت ايلون على الفوز بزمالة EMBO المرموقة! ديفيد حصل جولان ، الذي سينضم في سبتمبر ، على زمالة روتشيلد وفولبرايت. مبروك لكليهما !!

6/24/2014. ورقة Xun و Nick على التأثيرات الجينية على مثيلة الحمض النووي خارج على bioRxiv [رابط].

4/29/2014. أنيل بنية سريعة تم نشر الورقة الآن في علم الوراثة: الرابط.

سيتحدث Alexis الأسبوع المقبل في بيولوجيا الجينوم حول عملها مع Zia و Sydney في فهم آثار التباين الجيني على mRNA والترجمة والبروتينات.

4/2/2014. ورقة دارين كوسانوفيتش على ضربة قاضية من TFs في LCLs (مع مختبر Yoav) متاح الآن في PLOS Genetics: Link. على ورقة تشونج وون جيونج التقديم التكيفي للتكيفات على ارتفاعات عالية من شيربا إلى التبتيين (بالتعاون مع مختبر Anna Di Rienzo) ، متوفر الآن في Nature Communications: Link.

4/1/2014. رحلة سعيدة إلى Heejung Kim قضت فصل الشتاء في زيارتنا من مختبر ماثيو في شيكاغو.

3/1/2014. مرحبًا بكم في يائير الذي وصل الآن من شيكاغو مع عائلته!

2/10/2014. ورقتنا على الحمل الجيني في البشربالاشتراك مع مختبر جاي سيلا ، متاح الآن في Nature Genetics. أحسنت صنعا ليوفال سيمونز (في مختبر جايز) ومايكل تورتشين (الآن في مختبر ماثيو ستيفنز)! وصلة.

2/10/2014. مرحبًا بكم في باحث ما بعد الدكتوراة الجديد إيلون شارون ، الذي انتقل إلى هنا من مختبر عيران سيغال. ستشترك شركة Eilon مع مختبر Hunter Fraser. مرحبًا بكم أيضًا في طلاب التناوب لهذا المصطلح: بيتون جرينسايد وناتالي تيليس ودييجو كالديرون وأربيل هارباك وإميلي جلاسبيرغ!

12/6/2013. كتب جو ديفيس منشورًا رائعًا على المدونة حول ورقة Graham and Bryce الأخيرة حول التباين الجيني وتعديل الهيستون.

12/4/2013. FastSTRUCTURE خارج! توجد هنا روابط لمخطوطة Anil وبرنامج إصدار بيتا.

12/4/2013. بفضل كريستين فوجل لوجهة نظرها حول تطور Zia لورقة mRNA / البروتين.

11/12/2013. مرحبًا بكم في Yonggan و Priya الذين سينضمون إلى المختبر هذا الشهر!

11/12/2013. تهانينا لجاك / أثما / روجر الذي تم اختيار ورقته البحثية عن DNase QTLs كأحد أهم الأوراق البحثية لعام 2012 في علم الجينوم التنظيمي والأنظمة في اجتماع RECOMB / ISCB.

11/1/2013. هناك منظور لطيف في NRG من قبل هانا ستوري في 4 أوراق بحثية حديثة - بما في ذلك واحدة من قبل Graham and Bryce - والتي درست آثار التباين الجيني على تعديلات هيستون.

10/30/2013. مجد ل شيام لحصوله على جائزة Charles Epstein Trainee Research المرموقة (قسم ما بعد الدكتوراة) عن حديثه في ASHG حول الاستدلال التاريخي للسكان الأفارقة. Graham Coop هو الفائز السابق من مختبرنا (في عام 2007).

10/22/2013. مبروك لمختبر الشب جو بيكريل الذي قبل للتو منصبًا كواحد من أوائل أعضاء هيئة التدريس في مركز جينوم نيويورك. بالإضافة الى، ضياء خان ينتقل الآن إلى أول منصب له في هيئة التدريس - في علوم الكمبيوتر في يو ميريلاند. حظا سعيدا لكليهما!

10/22/2013. ورقة دارين حول تجارب الضربة القاضية التي تستهدف 59 TFs معروضة على ArXiv.

10/17/2013. Zia و Graham / Bryce لديهما زوجان من الأوراق البحثية في Science اليوم: تطور التعبير البروتيني في الرئيسيات وتأثيرات التباين الجيني على تعديلات الهيستون. تهانينا لزيا وغراهام وبريس!

10/17/2013. تم تسليط الضوء على ورقة Ben Voight لعام 2006 حول الاختيار في مقالة مدونة لطيفة بقلم Emma Ganley كجزء من احتفالات الذكرى السنوية العاشرة في PLOS Biology.

10/11/2013. مرحبًا بكم في أول طالبين متناوبين في جامعة ستانفورد: إيلانا أربيسر من قسم الأحياء ومايكل سيكورا من علم الوراثة!

8/1/2013. يسعدنا الانتقال إلى جامعة ستانفورد. ستكون هذه بيئة أكاديمية رائعة ومكانًا رائعًا للعيش فيه. بعد قولي هذا ، سنفتقد العديد من أصدقائنا في جامعة شيكاغو ، حيث تم إنشاء المختبر لمدة 12 عامًا.

8/1/2013. مرحبًا بكم في أحدث معركة أليكسيس لما بعد الدكتوراة! إنه لأمر رائع أن تكون على متنها.

8/1/2013. مرحبًا بكم في Anil و Stoyan و Xun ، الذين سيصلون إلى ستانفورد هذا الشهر. سيتابع باقي المختبر قريبًا أو سيعمل من شيكاغو خلال الفترة الانتقالية.

مرحبا بالعالم. ينتقل المعمل إلى ستانفورد في 8/1/2013 بعد 12 عامًا في جامعة شيكاغو.


قياس التحولات في الانتقاء الطبيعي على استخدام الكودون بين مناطق البروتين: نهج علم الوراثة السكانية

يحدث تحيز استخدام الكودون (CUB) ، وهو الاستخدام غير الموحد للكودونات المترادفة ، في جميع مجالات الحياة. يُفترض أن CUB التكيفي ناتج عن الاختيار لحركة الريبوسوم الفعالة و / أو الترجمة الدقيقة. تشير الأدلة التجريبية والحاسوبية إلى أن التغييرات في معدل الخطأ الخطأ وسرعة الترجمة يمكن أن تؤثر على قدرة البروتين على الوصول إلى حالته الأصلية. نظرًا للعلاقة الحاسمة بين الطي والوظيفة ، فقد حللت العديد من الدراسات العلاقة بين استخدام الكودون وهيكل البروتين. غالبًا ما كانت النتائج متناقضة بسبب الطرق المختلفة لقياس الاختلافات في استخدام الكودون وعدم التحكم بشكل مناسب في العوامل المربكة (مثل تحيزات الأحماض الأمينية). لتجنب أوجه القصور هذه ، نتبع نهجًا صريحًا لعلم الوراثة السكانية لتحديد التحولات الخاصة بالشفرة في الانتقاء الطبيعي المرتبط بهيكل البروتين. تكشف نتائجنا عن وجود علاقة ضعيفة بين استخدام الكودون وبنية البروتين ، مما يشير إلى أن الاختلافات في الاختيار بين الهياكل دقيقة للغاية و / أو تحدث بشكل متقطع. بينما يبدو حجم الاختلافات في الاختيار طفيفًا ، تشير نتائجنا إلى أن العلاقة بين استخدام الكودون وهيكل البروتين أكثر تعقيدًا مما كان يُعتقد سابقًا.يوضح عملنا القوة الإحصائية وفوائد دراسة التحولات الانتقائية في استخدام الكودون أو الميزات الجينية الأخرى من نهج تطوري واضح.

بيان المصالح المتنافسة

وقد أعلن الكتاب لا تضارب المصالح.


نتائج ومناقشة

تحليل العروة المغلقة المناعية ومجمعات 4E-BP

يمثل نموذج الحلقة المغلقة تفسيرًا واسع الانتشار لاختيار mRNA لبدء الترجمة [12 ، 18 ، 19]. لقد قمنا بتقييم ملف تعريف ارتباط mRNA العالمي لمكونات مجمع الحلقة المغلقة في S. cerevisiae (الشكل 1 أ). استخدمنا سلالات تحمل علامات تنقية التقارب الترادفي (TAP) المتكاملة جينوميًا على كل من الجينات الذاتية التي تشفر مكونات مجمع الحلقة المغلقة ، وقمنا بتطويرها في ظل ظروف النمو الأسي القياسية في ثقافة الدُفعات. لتوفير تحليل منهجي لعملية اختيار mRNA والآليات التنظيمية التي قد تكون متورطة ، قمنا أيضًا بفحص ملف تعريف ارتباط mRNA لكل بروتين من بروتينات ربط الخميرة eIF4E (4E-BPs) و Caf20p و Eap1p ، والتي تعتبر مثبطات للترجمة (الشكل 1 أ) [40].

عند إعداد النظام التجريبي للتحصين المناعي (IP) من الرنا المرسال المرتبط بكل من هذه المكونات ، تم إيلاء اهتمام خاص لعدد من العوامل. أولاً ، تم تقييم تأثير علامات TAP على مستويات كل عامل. نتيجة لذلك ، لاحظنا ذلك في CDC33-TAP سلالة ، يتم التعبير عن بروتين eIF4E-TAP بشكل مفرط ، لذلك قمنا بإعادة بناء هذه السلالة لإزالة العلامة القابلة للتحديد واستعادة مستويات eIF4E إلى النوع البري (البيانات غير معروضة). ثانيًا ، تم تقييم جميع السلالات الموسومة بـ TAP المستخدمة في هذه الدراسة من حيث النمو (البيانات غير معروضة) وترجمة mRNA العالمية عبر التنميط متعدد السلالات (ملف إضافي 1A). تحمل السلالات الأليل الموسوم TAP كنسخة وحيدة من جينات عامل بدء الترجمة الأساسي هذه ، ومن ثم فإن حقيقة أن النمو والتشكيلات الجانبية المتعددة السلالات لا يمكن تمييزها عن السلالة الأم توحي بأن البروتينات الموسومة تعمل بكامل طاقتها. ثالثًا ، قمنا بتطوير بروتوكول حبة مغناطيسية لـ IP السريع للبروتينات ذات الأهمية بحيث يكتمل IP الخاص بنا في غضون 20 دقيقة لتقليل التأثير على مجمعات البروتين النووي. تم أيضًا الاهتمام بشكل خاص بتحسين التنقية بحيث تمت تنقية غالبية كل بروتين تم وضع علامة عليه وبالتالي استنفاد من المستخلص (مقارنة المدخلات والتدفقات والعلامات في الشكل 1 ب). في الواقع ، كان عنوان IP الوحيد الذي كان يمكن اكتشاف أي بروتين عليه علامة TAP في التدفق في عينة Pab1p. نتيجة لذلك ، على الرغم من أن Pab1p هو أحد أكثر بروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RNA) وفرة في الخلية [38] ، إلا أننا ما زلنا نقوم بتحصين أكثر من 80٪ من هذا البروتين من مستخلصات الخلية الكاملة (الشكل 1 ب).

من أجل التأكد من احتواء IPs على بروتينات متوافقة مع تكوين كل من مجمع الحلقة المغلقة ومجمعات قمع 4E-BP ، تم فحص العينات المناعية بأجسام مضادة مختلفة على البقع الغربية (الشكل 1C ، D). في هذه البقع ، يتأخر ترحيل كل بروتين يحمل علامة TAP بالنسبة إلى البروتين غير الموسوم (على سبيل المثال ، Pab1p-TAP و eIF4E-TAP و Caf20p-TAP في الشكل 1C ، D). بالنسبة إلى eIF4G1-TAP و eIF4G2-TAP ، يتم الكشف عن البروتين A في حلق TAP بواسطة الجسم المضاد الثانوي ، ومن ثم لوحظ وجود نطاق بروتين eIF4G2-TAP على الرغم من استخدام جسم مضاد أولي محدد eIF4G1 (الشكل 1C). ومع ذلك ، لتلخيص هذا التحليل ، كانت جميع المكونات ذات الصلة لمجمع الحلقة المغلقة ، eIF4E و eIF4G1 و Pab1p ، موجودة في عناوين IP المناسبة لـ eIF4E و eIF4G1 و eIF4G2 و Pab1p (الشكل 1C). بالمثل ، من حيث مجمعات القمع 4E-BP ، تحتوي كل من Eap1p و Caf20p IPs على eIF4E ولكن ليس eIF4G1 (الشكل 1D) ، بما يتوافق مع النموذج التنافسي المقبول عمومًا للقمع بوساطة 4E-BP الموضح في الشكل 1 أ [41]. أخيرًا ، تم تقييم قدرة البروتينات الموسومة بـ TAP على التفاعل بشكل مناسب مع غطاء mRNA باستخدام كروماتوغرافيا تقارب Cap (ملف إضافي 1B). تم عزل كل مكون من مكونات TAP على الراتينج بطريقة مماثلة للبروتين غير المميز ذي الصلة ، مما يشير إلى أن علامات TAP في السلالات لا تؤثر بشكل غير ملائم على قدرة البروتينات الموسومة على التفاعل مع RNA أو البروتينات المرتبطة بـ RNA.

المخصب mRNAs والأهمية الوظيفية لارتباطهم

تم تحديد كمية mRNAs المرتبطة بعناوين IP لـ eIF4E و eIF4G1 و eIF4G2 و Pab1p و Caf20p و Eap1p عبر ثلاثة مكررات بيولوجية بواسطة RNA-seq (انظر المواد والأساليب للحصول على التفاصيل ، والملف الإضافي 2 لرسم الخرائط والإحصاءات). تمت معالجة البيانات لتوليد نسبة لكل نوع من أنواع الرنا المرسال بالنسبة لعينة إجمالي الحمض النووي الريبي من نفس السلالة ذات العلامات TAP. تم تسلسل المكتبات بمتوسط ​​عمق 7.8 ± 5.8 مليون قراءة فريدة ومعينة ، واستخدمت البيانات لإنشاء قوائم إحصائية (معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) & lt0.05) المخصب في العينة المناعية باستخدام نموذج GLM المقترن لـ EdgeR (قوائم كاملة متوفرة في ملف إضافي 2). يتم عرض تحليل إثراء وظيفي تم إنشاؤه من بيانات RIP-seq في الشكل 2A ، والذي يتضح منه عدد من الاتجاهات. يحتوي كل من بروتينات ربط eIF4E ، Caf20p و Eap1p ، على نصوص مخصبة بـ IP تشارك منتجاتها البروتينية في مجموعة كاملة من الوظائف النووية (على سبيل المثال ، معالجة RNA ونسخها) ، مما قد يكشف عن وجود صلة بين التنظيم الترجمي وتنظيم الأحداث الأولية في مسار التعبير الجيني. في دراسة سابقة ، قمنا بتقييم الأهمية الوظيفية لـ Caf20p و Eap1p من خلال استخدام المصفوفات الدقيقة لقياس أي تغيير في ارتباط mRNAs عبر التدرجات المتعددة في النوع البري مقابل 20Δ و eap1Δ سلالات متحولة [40]. كشف هذا أن أكثر من ألف نسخة من المحتمل أن يتم تنظيمها على المستوى الترجمي بواسطة الخميرة 4E-BPs. هنا ، يمكننا تقييم كيفية ارتباط mRNAs بـ Caf20p و Eap1p من خلال تغيير RIP-seq من حيث الارتباط متعدد العناصر في سلالات خروج المغلوب. يتم تحويل النصوص التي ترتبط بشكل تفضيلي بـ Caf20p و Eap1p بمهارة ، ولكن بشكل ملحوظ (باستخدام مجموعة من عمليات قطع FDR) ، حتى الكسور المتعددة في 20Δ سلالة بالنسبة للنوع البري (ملف إضافي 3). بالنسبة إلى eap1Δ سلالة متحولة نسبة إلى النوع البري لوحظت اتجاهات مماثلة عبر eap1Δ المؤامرات ، على الرغم من أن مقياس التأثير أقل وضوحًا بشكل ملحوظ من 20Δ البيانات (البيانات غير معروضة) ، ربما بسبب انخفاض وفرتها في الخلية فيما يتعلق Caf20p [38]. بشكل عام ، تتوافق هذه المقارنة بين بيانات RIP-seq مع دراسات المصفوفة الدقيقة السابقة على المسوخ مع الدور الموصوف لـ 4E-BPs كمثبطات لبدء الترجمة.

ترتبط خصائص النصوص بشكل تفضيلي بمكونات الحلقة المغلقة و 4E-BPs. (أ) مصطلحات علم الوجود الجيني التي يتم تمثيلها بشكل كبير (أحمر) أو تمثيلها ناقص (أخضر) لكل مجموعة من مجموعات النسخ المخصبة في تقارب البروتينات الستة الموضحة في الأعلى. (قبل الميلاد) مخططات الصندوق والشعر التي توضح بالتفصيل التباين في شغل الريبوسوم [42] وطول الذيل المتعدد (A) [43] للنصوص المخصبة بمكونات الحلقة المغلقة و 4E-BPs. كشف اختبار إحصائي لرتبة ويلكوكسون بين مجموعات النصوص عن وجود ارتباط كبير لكل من الميزات مع النصوص المخصبة بـ Pab1p. في هذه المخططات ، تصور المربعات الملونة مدى الربعين العلوي والسفلي حيث تمثل الشق الوسيط. توضح الخطوط الرأسية المنقطة الأطراف العلوية والسفلية بينما الدوائر هي القيم البعيدة.

لتقييم الارتباطات الأخرى لقوائم الجينات الفردية ، تمت مقارنتها مع مجموعة من المعلمات المختلفة ، بما في ذلك بولي (أ) طول الذيل [43] وشغل الريبوسوم [42] (الشكل 2 ب ، ج). من المثير للدهشة أن mRNAs المرتبطة بـ Caf20p و Eap1p لها إشغال ريبوسوم مرتفع مثل mRNAs المرتبطة إما بـ eIF4G1 أو eIF4G2. يمكن أن يكون هناك عدد من الأسباب لذلك: قد لا يكون التفاعل مع eIF4E هو الطريقة الوحيدة التي يمكن من خلالها ربط Caf20p و Eap1p مع mRNAs ، أو قد تؤدي الخميرة 4E-BPs ببساطة إلى تثبيط ترجمة mRNAs المترجمة بشكل كبير بحيث ، في المتوسط ، لا يزال بإمكان mRNAs المرتبطة بـ 4E-BP أن تحتوي على نسبة عالية من إشغال الريبوسوم. ربما تكون النتيجة الأكثر لفتًا للانتباه من هذه المقارنات هي أن النصوص المخصبة بـ Pab1p لا ترتبط فقط بذيول أطول بولي (A) ، كما هو متوقع ، ولكن أيضًا مع المستويات العالية من إشغال الريبوسوم (الشكل 2 ب ، ج). لوحظ المستوى العالي من الارتباط بين طول ذيل بولي (A) وترابط الريبوسوم قبل [43] ، ولكننا هنا نوضح أن مستوى إشغال الريبوسوم للنصوص المخصبة بـ Pab1p كان أعلى بكثير من النسخ المرتبطة بالمكونات الأخرى لـ مجمع الحلقة المغلقة (الشكل 2C). تسلط هذه النتائج الضوء على Pab1p كلاعب مهم في mRNAs حيث تكون الترجمة فعالة وقوية بشكل خاص.

يختلف ملف تعريف ربط Pab1p RNA عن مكونات الحلقة المغلقة الأخرى

من أجل تقديم تقييم كمي للاختلاف بين مجموعات بيانات RIP-seq المختلفة بطريقة زوجية ، استخدمنا نموذج تفاعل مشتق من وظيفة النموذج الخطي المعمم (GLM) ضمن حزمة برامج EdgeR (موصل حيوي) [44،45] . وبشكل أكثر تحديدًا ، قارنا نسبة مستويات الرنا المرسال في عينات IP بالنسبة إلى المستوى في عينة إجمالي الحمض النووي الريبي (السجل2(IP / Total)) لكل جين في كل من تجارب الهطول المناعي الست ، وفحص الارتباطات الزوجية بينهما (الشكل 3 أ). هنا يتم تقديم الملف الشخصي الكامل لقيم تخصيب mRNA ، بدلاً من تلك المحددة بواسطة قطع إحصائي. يتم تقديم هذه البيانات على شكل مخططات مبعثرة تقارن مجموعات البيانات ، وتسليط الضوء باللون الأحمر على النصوص التي وجدت أنها مختلفة اختلافًا كبيرًا بين التجارب وفقًا لـ GLM. اللافت للنظر أن هذه المخططات تؤكد على الارتباط العالي الملاحظ في ملفات التعريف الملزمة للأعضاء الثلاثة لمجمع eIF4F (ارتباطات بيرسون تبلغ 0.755 و 0.753 و 0.812). وبالمثل ، فإن ملفي الربط 4E-BP ، لـ Caf20p و Eap1p ، يعرضان أيضًا ارتباطًا عاليًا مماثلًا مع بعضهما البعض. والجدير بالذكر أنه بينما يُظهر Pab1p ارتباطات موجبة مع مكونات مجمع eIF4F ، إلا أنه العامل الوحيد الذي تم تقييمه والذي يظهر ارتباطًا سلبيًا مع الملفات الشخصية من المكثفات الترجمية Caf20p و Eap1p.

مقارنات زوجية مباشرة بين تجارب RIP-seq لكل من مكونات الحلقة المغلقة و 4E-BPs. (أ) عرض Scatterplots التغيير في السجل2 تغيرات الطية المتوسطة (IP / الإجمالي) لكل من البروتينات الستة مقارنة ببعضها البعض. تم تمييز تلك النصوص التي تم تحديدها على أنها تختلف اختلافًا كبيرًا بين التجربتين وفقًا لنموذج GLM للتفاعل الخاص بـ edgeR في FDR & lt0.05. (ب) جدول يوضح العدد الإجمالي للنصوص التي تختلف اختلافًا كبيرًا عبر المقارنات الزوجية في (أ). تمثل الأرقام النصوص التي يتم تمثيلها بشكل مفرط في عناوين IP للبروتينات المدرجة في الأعمدة المتعلقة بالبروتينات المدرجة في كل صف.

يتم عرض أرقام النصوص المتباينة مع نموذج التفاعل في الشكل 3 ب (بالتفصيل في ملف إضافي 4). يوضح هذا عدد النصوص التفاضلية المخصبة أو الممثلة تمثيلاً ناقصًا لكل مقارنة زوجية وفقًا لـ GLM (نقاط البيانات الحمراء) ، ويدعم الاتجاهات العامة التي لوحظت في مخططات التشتت (الشكل 3 أ). على سبيل المثال ، لم يتم تحديد أي نصوص على أنها مختلفة اختلافًا كبيرًا في ارتباطها مع اثنين من الأشكال الإسوية eIF4G ، eIF4G1 و eIF4G2. تتوافق هذه الملاحظة مع البيانات الحديثة التي تشير إلى أن هذين الشكلين الإسفيني من المحتمل أن يكونا زائدين عن الحاجة وظيفيًا [17]. تشير هذه النتائج ، جنبًا إلى جنب مع البيانات أعلاه ، إلى أن مجمع eIF4F يشرح الغالبية العظمى من تفاعلات eIF4E و eIF4G1 و eIF4G2 مع mRNA. هذا مثير للفضول بشكل خاص نظرًا لأن المثبطين متعددي الترجمات Caf20p و Eap1p يمنعان الترجمة عبر التفاعل مع eIF4E ، ومع ذلك فإن ملف التعريف الملزم الخاص بهما يُظهر ارتباطًا ضئيلًا مع ذلك الخاص بـ eIF4E. التفسيرات المحتملة لذلك هي أن 4E-BPs قد تتفاعل مع mRNAs بطرق مستقلة عن eIF4E أو أن مجمع 4E-BP-eIF4E قد يكون مرتبطًا بشكل أقل استقرارًا مع mRNA.

من الواضح أيضًا أنه إذا كان Pab1p متكافئًا مع مجمع eIF4F على كل mRNA ، فمن المتوقع أن يكون ملف تعريف ربط mRNA لـ Pab1p مشابهًا لملف eIF4E و eIF4G1 و eIF4G2. ومع ذلك ، من الواضح أن هذا ليس هو الحال. وتجدر الإشارة إلى أن Pab1p يربط الطرف 3 من mRNA ومكونات eIF4F المرتبطة بالطرف 5. من الممكن أن يفسر هذا الاختلاف بعض الاختلافات الواضحة بين مجموعات بيانات RIP-seq هذه. بدلاً من ذلك ، قد تبرز هذه البيانات أن مجمع الحلقة المغلقة مناسب فقط لترجمة مجموعة فرعية من mRNAs. ومن المثير للاهتمام ، أن ملف تعريف Pab1p يرتبط عكسياً بملفات المثبطات الترجمية Caf20p و Eap1p (في الواقع ، بدلاً من ملفات تعريف eIF4G هي إلى حد بعيد أقوى مضاد للارتباط مع ملفات تعريف 4E-BP) ، كما أن النصوص المخصبة بـ Pab1p تحتوي أيضًا على ريبوسوم أعلى شغل (الشكل 2 ب) ، مع التأكيد على وجود علاقة قوية بين جمعية Pab1p والترجمة النشطة.

يكشف تجميع ملفات تعريف إثراء RIP-seq عن الاتجاهات العالمية في التحكم الترجمي عبر مجمع الحلقة المغلقة و Pab1p

في حين أن المقارنة الزوجية لمجموعات بيانات RIP-seq قد قدمت رؤى مهمة ، يمكن تصور مقارنة ملفات تعريف ربط RNA عبر جميع مجموعات بيانات RIP-seq في وقت واحد باستخدام طريقة التجميع الهرمي. لذلك تم التعبير عن بيانات RIP-seq في شكل خريطة حرارية ، تعرض التكرارات البيولوجية الثلاثة المرتبطة بشدة لكل عضو حلقة مغلقة كأعمدة ، والنصوص الفردية كصفوف (الشكل 4). من أجل ضمان الحد الأدنى من الإيجابيات الخاطئة ، تم استخدام حد إحصائي أكثر تحفظًا مقترنًا بمرشح قائم على العد لتحليل المجموعات. بشكل أكثر تحديدًا ، تقتصر الخريطة الحرارية على تلك النصوص التي تعرض إثراءًا كبيرًا (FDR & lt0.01) أو تمثيلًا ناقصًا وفقًا لنموذج GLM الخاص بـ EdgeR في واحد على الأقل من عناوين IP ، بالإضافة إلى النصوص التي تحتوي على أكثر من 20 قراءة في كل من مجموع عينات الاستخراج ذات الصلة. في المجموع ، تفي 3173 من الجينات المشروحة في جينوم الخميرة بهذه المعايير. ومن ثم ، فإن نسبة كبيرة من نسخة الخميرة تظهر القليل من الإثراء الملحوظ أو المهم إحصائيًا أو التمثيل الناقص فيما يتعلق بإجمالي الرنا المرسال ، وتركز خريطة الحرارة على تلك التي تفعل ذلك.

تظهر أربع مجموعات رئيسية عبر مجموعات بيانات RIP-seq. خريطة الحرارة المشتقة من المجموعات الهرمية لملفات تعريف ربط الرنا المرسال (سجل2 أضعاف التغييرات IP / الإجمالي) للبروتينات الستة في الدراسة ، يمثل اللون الأحمر والأزرق mRNAs ممثلة بشكل زائد أو ناقص ، على التوالي. اقتصر التحليل على 3173 نسخة تم تحديدها على أنها ممثلة تمثيلية زائدة أو ناقصة التمثيل في أي من مجموعات البيانات الست وتم إجراء التجميع الهرمي كما هو موضح في قسم المواد والأساليب. تحتوي الخريطة الحرارية المقدمة على 2767 نسخة مفصولة عبر 7 مجموعات تم تجميعها في مجموعات من الأول إلى الرابع بناءً على تشابه أنماط الارتباط.

باستخدام التجميع الهرمي القياسي (انظر المواد والأساليب للحصول على التفاصيل) لملفات التعريف الخاصة بإثراء RIP-seq ، يمكن تحديد أربع مجموعات عريضة (من الأول إلى الرابع) والتي تشمل 2767 نسخة (الشكل 4 ملف إضافي 5). تُظهر هذه المجموعات الأربع المتميزة بصريًا أنماطًا مثيرة للاهتمام من الارتباط مع مكونات الحلقة المغلقة والمثبطات الترجمية Caf20p و Eap1p ، والتي تظهر إلى حد كبير ككتل من الإثراء / التمثيل الناقص فيما يتعلق بـ eIF4E / 4G1 / 4G2 / Pab1p و Caf20p / Eap1p. تحتوي المجموعة الأولى على mRNAs التي غالبًا ما تكون ممثلة تمثيلاً ناقصًا في عناوين IP من جميع المكونات التي تم اختبارها باستثناء Pab1p. تحتوي المجموعة الثانية على mRNAs المخصب في IPs لمثبطات الترجمة Caf20p و Eap1p. تتكون المجموعة الثالثة من مجموعتين تحتويان على mRNAs التي يتم إثرائها في IPs المكونة للحلقة المغلقة ولكن تمثيلها ناقص في عينات Caf20p و Eap1p: ملف تعريف الارتباط الذي قد يكون متوقعًا للـ mRNAs حيث تكون الترجمة نشطة للغاية وتبدأ بقوة عبر الحلقة المغلقة مركب. أخيرًا ، المجموعة الرابعة عبارة عن مجموعة كبيرة وواسعة من mRNAs التي يتم إثرائها عبر مجموعات بيانات eIF4F و 4E-BP ، مع ثلاث مجموعات فرعية محددة حسب مستوى التخصيب باستخدام Pab1p أو مكونات eIF4F هنا قد يكون هناك منافسة معقدة بين تفاعل تفاعل مكونات الحلقة المغلقة ومثبطات الترجمة. من المثير للاهتمام بشكل خاص أن ما يقرب من نصف الرنا المرسال في المجموعة الرابعة أقل تخصيبًا لـ Pab1p على الرغم من أن هذه mRNAs نفسها مخصبة بـ eIF4F. يبدو من المعقول ، بالنسبة لهذه الرنا المرسال ، أن ذيل بولي (A) يمكن أن يتفاعل مع بروتينات ربط أخرى للحمض النووي الريبي مثل Nab2p أو Sgn1p ، والتي تم اقتراحها للتنافس مع Pab1p سابقًا [46]. بشكل عام ، تسلط هذه المجموعات الضوء على احتمال أن يكون بدء الترجمة عبر مجمع الحلقة المغلقة أكثر أهمية لبعض الرنا المرسال أكثر من غيرها. على وجه الخصوص ، تحدد المجموعة الثالثة mRNAs التي يبدو أنها تتفاعل بشكل تفضيلي مع مجمع الحلقة المغلقة ، والمجموعة الثانية mRNAs التي تتفاعل بشكل تفضيلي مع 4E-BPs.

قبل النظر في هذه المجموعات الترجمية العالمية من mRNAs بمزيد من التفصيل ، من المثير للاهتمام ملاحظة أنه ، كما وجد سابقًا ، باستخدام نموذج GLM و scatterplots (الشكل 3) ، هناك مراسلات عالية بين ملفات تعريف eIF4E و eIF4G1 و eIF4G2 IP بينما يظهر نمط Pab1p مختلفًا (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن ملفات تعريف الخميرة 4E-BPs و Caf20p و Eap1p متشابهة جدًا ، إلا أنها تختلف عن الأنماط التي لوحظت في عناوين IP الأخرى. يتضح هذا بشكل خاص في مخطط الشجرة العنقودي المعروض على الأعمدة في الشكل 4. وبالفعل فإن ملفات تعريف eIF4G1 و eIF4G2 متشابهة جدًا بحيث لا يمكن تمييزها عبر مخطط الشجرة. حقيقة أن مكونات eIF4F eIF4E و eIF4G تظهر ملف تعريف تفاعل mRNA مشابه بينما يظهر ذلك بالنسبة لـ Pab1p مختلفًا مرة أخرى نحو نموذج يكون فيه مجمع الحلقة المغلقة الكامل مناسبًا فقط لترجمة مجموعة فرعية من mRNAs. علاوة على ذلك ، نظرًا لأنه في المجموعة الثانية ، يمكن تحديد 4E-BPs على أنها تتفاعل بشكل تفضيلي مع النصوص حيث لا يتم إثراء عوامل الترجمة ، يبدو أن النموذج المباشر لتفاعل eIF4E-4E-BP على mRNAs لقمع الترجمة قد يكون تبسيطًا مفرطًا .

من أجل توفير التحقق المستقل من صحة المجموعات المحددة في الشكل 4 ومجموعات بيانات RIP-seq ككل ، تم إجراء سلسلة من التحليلات الكمية للنسخة العكسية PCR (qRT-PCR) على الحمض النووي الريبي المُعد من IPs للعوامل التي تحمل علامات TAP ومقارنتها بمستويات الحمض النووي الريبي في كسور الإدخال (الشكل 5). تظهر هذه البيانات ارتباطًا ممتازًا مع تحليل RIP-seq. يتم إثراء المجموعة الثالثة mRNAs بـ eIF4E و eIF4G1 و eIF4G2 و Pab1p ولكن ليس 4E-BPs. يتم إثراء المجموعة الثانية mRNAs في الغالب بـ 4E-BPs.يتم إثراء مجموعة الرنا المرسال من المجموعة الرابعة لمعظم المكونات الموسومة بعلامات TAP ، كما أن المجموعة الأولى من الرنا المرسال تكون ناقصة التخصيب لجميع العوامل باستثناء Pab1p. هذه الملاحظة الأخيرة ملفتة للنظر بشكل خاص وتشير إلى أن Pab1p يلعب دورًا رئيسيًا في ترجمة mRNAs عالية الوفرة. تم اقتراح Pab1p لتعزيز المراحل المختلفة في عملية الترجمة ، بما في ذلك انضمام الوحدة الفرعية أثناء البدء [22] وإنهاء الترجمة / إعادة تدوير الريبوسوم [23]. لذلك ، فإن أحد الاحتمالات هو أن Pab1p يعمل على تعزيز هذه الخطوات بشكل مستقل عن البروتينات التي تتفاعل مع الغطاء. بدلاً من ذلك ، يمكن أن يتصرف Pab1p بطريقة غير معروفة حتى الآن.

التحقق من صحة مجموعات النسخ بواسطة RT-PCR الكمي. يوضح الشكل أربع قطع ، واحدة لكل مجموعة من مجموعات النصوص. يتم تحديد كمية mRNAs المشار إليها في عينات IP بالنسبة إلى إجمالي الحمض النووي الريبي للتحكم غير الموسوم والمكونات التنظيمية للحلقة المغلقة / 4E-BP. أشرطة الخطأ هي ± خطأ معياري من ثلاث تجارب مكررة.

جانب آخر من البيانات التي تم تسليط الضوء عليها من خلال تحليل qRT-PCR هو أنه على الرغم من نقص الإثراء للنصوص بمكونات الحلقة المغلقة المختلفة و 4EBPs بالنسبة لعينة RNA الإجمالية ، فإن mRNAs لا تزال موجودة في IPs عند مقارنتها بالمستوى من mRNA التي تم الحصول عليها من سلالة غير معلمة (الشكل 5 قارن BY4741 مع سلالات TAP الموسومة). يتضح هذا أيضًا من بيانات RIP-seq كما تم قياسها بواسطة قيم RPKM (يقرأ لكل كيلو قاعدة من النص لكل مليون قراءة تم تعيينها) في تجارب IP (ملف إضافي 2). وهذا يعني أنه حتى تلك الرنا المرسال التي لا يتم تخصيبها بشكل كافٍ باستخدام eIF4F أو Pab1p أو 4E-BPs لا تزال مقيدة بشكل واضح بهذه المكونات ، وإن كان ذلك بمستوى منخفض بشكل كبير.

التحليل الوظيفي للـ mRNAs المخصب ومجموعات الحلقة المغلقة

لمزيد من فك شفرة الدور الوظيفي لمكونات الحلقة المغلقة في بدء الترجمة في الخميرة ، قمنا بفحص مجموعات mRNAs المشتقة من خريطة الحرارة لمعرفة الاتجاهات والأنماط من حيث وظيفة الجينات. في البداية ركزنا على المجموعة الثالثة ، حيث تعرض هذه المجموعة أوضح نمط من الارتباط بمكونات معقدة الحلقة المغلقة. وجدنا أن المجموعة الثالثة mRNAs تظهر نسبة عالية من إشغال الريبوسوم ومنتجاتها البروتينية ، في المتوسط ​​، وفيرة للغاية (الشكل 6 ب ، ج). هذا يتوافق مع بدء الترجمة المعتمدة على الحلقة المغلقة والتي تعمل كطريق فعال لإنتاج بروتينات مستقرة وفيرة للغاية. يعطي التحليل الوظيفي للـ mRNAs الموجودة داخل هذه المجموعة مزيدًا من الوزن لهذه الفكرة ، حيث إنه يوضح إثراءًا كبيرًا جدًا في mRNAs لبروتينات الريبوسوم (الشكل 6 أ) 115 من 395 جينًا في المجموعة الثالثة ترميز البروتينات الريبوسومية. توفر حقيقة أن mRNAs لبروتينات الريبوسوم غنية بشكل كبير بآلية الحلقة المغلقة توازيًا مثيرًا للاهتمام مع الوضع في خلايا الثدييات حيث تعرض العديد من mRNAs التي تشفر البروتينات الريبوزومية أنماطًا تنظيمية منفصلة بحكم 5 'أوليجوبيريميدين (TOP). عزر [47]. ليس مثل رابطة الدول المستقلة- تسلسل الفعل واضح إما في بروتين الريبوسوم الخميرة mRNAs أو عبر مجموعة الرنا المرسال من المجموعة الثالثة (البيانات غير معروضة) ومع ذلك ، يبدو من المحتمل أن هذه العناصر يجب أن تملي مستوى عالٍ جدًا من الارتباط الذي نلاحظه مع مكونات الحلقة المغلقة المعقدة. إن أوجه التشابه بين خصائص المجموعة الثالثة من الرنا المرسال وخصائص الرنا المرسال للثدييات تعمل بشكل أعمق. على سبيل المثال ، TOP mRNAs حساسة بشكل خاص للتنظيم بواسطة هدف الثدييات من الرابامايسين (mTOR) ، وتشير الأدلة الحديثة إلى أن هذا يحدث عبر مثبط الترجمة 4E-BP1 [48]. يشير التنظيم المحدد لـ TOP mRNAs بهذه الطريقة إلى أن هذه الرنا المرسال حساسة للغاية لتثبيط معقد الغطاء وربما حلقة مغلقة معقدة [48]. لذلك ، فإن التخصيب المحدد للـ mRNAs لبروتين الريبوسوم بمكونات مجمع الحلقة المغلقة للخميرة يسلط الضوء على إمكانية وجود آلية موازية في الخميرة.

التحليل الوظيفي للبروتينات المشفرة بواسطة مجموعات النسخ. (أ) مصطلحات علم الوجود الجيني (GO) التي يتم تمثيلها بشكل كبير (أحمر) أو ممثلة تمثيلا ناقصًا (أزرق) للنصوص الموجودة ضمن المجموعات الأربع المحددة في الشكل 4. فقط مصطلحات GO التي تظهر اختلافات كبيرة (عبر اختبار فيشر يقارن تم تصوير تلك المجموعة مع بقية الجينوم FDR & lt0.01) لمجموعة واحدة على الأقل ولديها أيضًا اختلافات بين المجموعات (اختبار Chi-square FDR & lt0.01). يمثل مقياس اللون الأهمية الإحصائية لإثراء مصطلح GO أو نقص الإثراء كما تم قياسه بواسطة السجل10فرانكلين روزفلت. للراحة ، سجل التخصيب مصطلح GO10تم ضرب قيم FDR بـ -1. (قبل الميلاد) مخططات الصندوق والشعر ، كما في الشكل 2 ، توضح بالتفصيل التباين في إشغال الريبوسوم [42] ووفرة البروتين وفقًا لقاعدة بيانات PaxDb [49] للنصوص المخصبة بمكونات الحلقة المغلقة و 4E-BPs. كشف اختبار رتبة ويلكوكسون بين مجموعات النصوص المزدوجة عن اختلاف كبير (ص & lt 1 × 10 -7) في جميع الحالات لكل من قطع الأرض ، والاستثناء الوحيد هو بين المجموعة الأولى والمجموعة الثالثة لشغل الريبوسوم ، والذي كان مهمًا عند ص & lt 0.03.

على غرار المجموعة الثالثة ، فإن الرنا المرسال من المجموعة الأولى لديها إشغالات عالية من الريبوسوم ومنتجاتها البروتينية وفيرة للغاية (الشكل 6 ب ، ج). ومع ذلك ، فإن نمط الارتباط بمكونات الحلقة المغلقة مختلف تمامًا بالنسبة للمجموعة الأولى بالنسبة للمجموعة الثالثة. عادةً ما تكون المجموعة الأولى mRNAs ممثلة تمثيلاً ناقصًا لـ eIF4E و eIF4G1 و eIF4G2 و Caf20p و Eap1p. في الواقع ، تعد عناوين IP الخاصة بـ Pab1p هي الوحيدة التي لا يتم فيها تمثيل هذه المجموعة من الرنا المرسال تمثيلاً ناقصًا مقارنة بالمجموع (الشكلان 4 و 5). يسلط تحليل وظائف المنتجات البروتينية للـ mRNAs داخل هذه المجموعة الضوء على استقلاب الأحماض الأمينية والنيوكليوتيدات ، والتمثيل الغذائي للكربوهيدرات / توليد الطاقة ، و tRNA-acylation والترجمة (الشكل 6A ملف إضافي 5). اللافت للنظر أن هذه المجموعة تشتمل على mRNAs التي تشفر عوامل تحلل السكر ، مثل ENO2, TDH3 و PGK1، وعوامل الترجمة ، مثل TEF1, TEF2, EFB1, TIF1 و TIF2، والتي تعد من بين البروتينات الأكثر تعبيرًا وبالتالي وفرة في الخلية. يشير التمثيل الناقص لـ mRNAs في هذه المجموعة مع مكونات eIF4F جنبًا إلى جنب مع الوفرة العالية لمنتجات البروتين إلى أن مجمع الحلقة المغلقة أقل صلة ببدء الترجمة عالية الكفاءة لهذه المجموعة من mRNAs مقارنةً بالمجموعة الثالثة mRNAs. لذلك ، من المعقول أن تتطلب هذه الرنا المرسال بديلاً لآلية الحلقة المغلقة لبدء الترجمة بكفاءة عالية. أحد الاحتمالات هو أن Pab1p متورط بطريقة ما في آلية بديلة عالية الكفاءة ، خاصة بالنظر إلى أن المجموعة الأولى mRNAs ممثلة تمثيلاً ناقصًا مع جميع مكونات بروتين الحلقة المغلقة باستثناء Pab1p. ومن المثير للاهتمام ، فيما يتعلق بمثل هذا النموذج ، أن mRNAs التي تم تمثيلها بشكل مفرط إحصائيًا في Pab1p IPs تظهر ، في المتوسط ​​، ذيول بولي أطول (A) وأعلى من متوسط ​​إشغال الريبوسوم (الشكل 2 ب ، ج). تم اقتراح Pab1p مسبقًا للعمل في خطوات متعددة في عملية الترجمة: البدء الداخلي ، وانضمام الوحدة الفرعية الريبوسومية 60S وإنهاء الترجمة. لذلك ، من الممكن أن يشرح أحد هذه الأنشطة ملاحظة أن المجموعة الأولى mRNAs تظهر مترجمة بشكل كبير على الرغم من أنها تتفاعل بشكل أقل مع مكونات eIF4F. تضيف الملاحظات الخاصة بهذه المجموعة من mRNAs جنبًا إلى جنب مع الارتباط العكسي بين Pab1p و 4E-BPs من حيث ملفات تعريف ارتباط mRNA إلى صورة حيث يمثل تفاعل Pab1p مؤشرًا رئيسيًا لكفاءة الترجمة.

تشتمل المجموعة الثانية من mRNAs من خريطة الحرارة على mRNAs التي ترتبط بشكل تفضيلي بـ 4E-BPs ، وبالتالي يجب قمعها متعدية. كما هو مذكور أعلاه ، على الرغم من أن هذه النصوص تبدو ناقصة التخصيب لـ eIF4E ، فمن الواضح أن mRNAs لا تزال موجودة في تجارب IP ولكنها أقل إثراءً بالنسبة للنصوص الأخرى المرتبطة بشدة. يحدد التحليل الوظيفي لـ mRNAs من المجموعة الثانية الإثراء القوي لبعض مسارات التخليق الحيوي للأحماض الأمينية ، بما في ذلك تلك الخاصة بالأحماض الأمينية الكارهة للماء والأحماض الأمينية الأساسية (الشكل 6 أ ، ملف إضافي 5) ، على الرغم من أنه يجب ملاحظة أن العديد من جينات الأحماض الأمينية الاصطناعية موجودة أيضًا في المجموعتين الأولى والرابعة. ومع ذلك ، فقد تم تحديد روابط مثيرة للاهتمام بين مسار Gcn الذي يتحكم في التخليق الحيوي للأحماض الأمينية والخميرة 4E-BPs [50]. بشكل عام ، فإن اكتشاف أن الرنا المرسال يتم إثرائه بـ 4E-BPs يتوافق مع الافتراض بأن مثل هذه الرنا المرسال ليست حاسمة في النمو الأسي غير المحدود ، وبالتالي ، يتم قمع الترجمة بحكم مثبطات 4EBP. يتوافق هذا التحليل أيضًا مع الفرضية القائلة بأن الخميرة 4E-BPs ليست منظمات عالمية لبدء الترجمة ولكنها تعمل بدلاً من ذلك على التنظيم بطريقة خاصة بـ mRNA [40،51،52].

أخيرًا ، تتميز المجموعة الكبيرة التي تمثلها المجموعة الرابعة بتفاعلات قوية مع كل من eIF4F و 4E-BPs القمعية. تعرض البروتينات المشفرة بواسطة هذه المجموعة من mRNAs نطاقًا واسعًا جدًا من الوظائف التي تم إثراء هذه المجموعة بوظائف مرتبطة بالنسخ ، وفسفرة البروتين ، ودورة الخلية ، وهي غير مُخصَّبة بشكل كافٍ للوظائف المرتبطة بالترجمة والريبوسوم. تحتوي هذه المجموعة على 79 من 127 بروتين كينيز ترميز mRNAs ، في حين لا تحتوي أي مجموعة أخرى على أي بروتين كيناز mRNAs. لذلك ، يبدو أن هذه المجموعة تحتوي على mRNAs للعمليات التي يتم تنظيمها بإحكام في الخلية ، بما في ذلك الإشارات وتفعيل المسارات والاستجابات للمحفزات ، تشير بياناتنا إلى أن بعضًا من هذا واضح على المستوى الترجمي. نقترح أن هذه العمليات تخضع لسيطرة محدودة حيث يوجد توازن دقيق في مستوى mRNA الفردي المرتبط بالحلقة المغلقة بالنسبة إلى 4E-BPs. قد يكون صحيحًا أيضًا أن هذه المجموعة مهيأة بحيث يمثل إلغاء قمع الترجمة عبر تخفيف قمع 4E-BP وسيلة لإطلاق "فرملة اليد الجزيئية".

تقدير قياس العناصر المتفاعلة لتفاعلات البروتين مع eIF4E المرتبط بالمرنا

إن اكتشاف أن مجموعة كبيرة من mRNAs ممثلة بشكل كبير في التهابات مناعية لكل من eIF4G و 4E-BPs (الشكل 4 ، المجموعة الرابعة mRNAs) يسلط الضوء على إمكانية التفاعلات التنافسية مع eIF4E على الرنا المرسال بين مختلف بروتينات ربط eIF4E. من خلال افتراض أن مجموع تفاعلات بروتينات ربط eIF4E الأربعة يجب أن يقترب من ملف تعريف ربط RNA لـ eIF4E باعتباره حارس البوابة للشروع (وبالتالي الشكل 7A ، B) ، يمكننا التعبير عن هذا رياضياً عبر مجموعة خطية بسيطة من الملفات الشخصية الأربعة (الشكل 7C).

يبرز نموذج متكافئ لربط eIF4E ملف كاف 20 و EAP1 mRNAs باعتبارها القيم المتطرفة الهامة. (أ) رسم تخطيطي يوضح الأساس النظري لنموذج القياس المتكافئ حيث ترتبط البروتينات الأربعة ، eIF4G1 و eIF4G2 و Caf20p و Eap1p ، ببروتين ربط الغطاء eIF4E ، والذي بدوره يربط mRNAs في توازن معقد. يفترض هذا النموذج أنه يمكن نمذجة ملف تعريف ارتباط eIF4E mRNA عبر مجموعة خطية من ملفات تعريف بروتين الحلقة المغلقة الأخرى. (ب) خرائط الحرارة لتخصيب mRNA لكل من بروتينات ربط eIF4E الأربعة ، وخريطة حرارية لإثراء mRNA متوقعة لـ eIF4E استنادًا إلى أفضل ملاءمة للنموذج لبيانات RIP-seq ، والتي بدورها يمكن مقارنتها بإثراء mRNA المرصود لـ eIF4E. لوحظ وجود ارتباط ممتاز بين ملامح خريطة الحرارة المتوقعة والملاحظة ، حيث R 2 = 0.75. (ج) معادلة توضح بالتفصيل التأكيد على أن ملف التعريف الملزم لـ eIF4E يساوي مجموع ملفات التعريف التي تمت ملاحظتها لجميع بروتينات ربط eIF4E ، مع معاملات β المقابلة التي تمثل مساهمة كل ملف تعريف فردي في النموذج العام (جميعها مهمة ص & لتر 0.002). (د) مخطط يوضح قيم النموذج المجهزة والمخلفات المقابلة من نمذجة الانحدار الخطي. والجدير بالذكر أن كاف 20 و EAP1 تعتبر mRNAs قيمًا متطرفة مهمة من النموذج عند رسم بقاياها من قيم تخصيب eIF4E المتوقعة.

هنا قيم β هي معاملات تمثل المساهمات الاسمية لكل بروتين ربط eIF4E لملف تعريف ارتباط eIF4E ، مع الأخذ في الاعتبار ملف تعريف eIF4E كبديل عام لبدء يعتمد على الغطاء. يمكننا تقدير قيم المعاملات β في المعادلة أعلاه باستخدام الانحدار القياسي متعدد الخطوط لبناء نموذج للسجل2(أضعاف التغييرات (IP / الإجمالي)) لـ eIF4E المبنية من السجل2(أضعاف التغييرات (IP / Total)) للبروتينات الأربعة الأخرى. ينتج عن هذا نموذج جيد مع R 2 = 0.75. يتم عرض معاملات β لشركاء ربط eIF4E المعادلة لملف تعريف ربط mRNA الخاص بـ eIF4E من هذا النموذج في الشكل 7 ج. يقدم كل بروتين مساهمة كبيرة للغاية في النموذج ، مع ص- القيم المقدرة بأقل من 0.002 في جميع الحالات. معاملات β لـ eIF4G1 و eIF4G2 كبيرة وإيجابية ، بينما معامل Caf20p منخفض ومعامل Eap1p سالب. تعكس هذه على نطاق واسع قيم ارتباط GLM الزوجي بين eIF4E والبروتينات الأخرى الموضحة في الشكل 3 ، وأوجه التشابه في خريطة الحرارة في الشكل 4. على سبيل المثال ، ترتبط ملفات تعريف ارتباط RNA لـ eIF4G1 و eIF4G2 ارتباطًا وثيقًا بتلك الموجودة في eIF4E ، في حين أن ملفات تعريف ارتباط الحمض النووي الريبي لـ 4EBPs و Caf20p و Eap1p ، غير مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بـ eIF4E. نود أن نوضح أن معاملات β من النموذج لا يتم تفسيرها ببساطة من خلال الوفرة النسبية لمكونات الحلقة المغلقة: أخذ تقديرات الوفرة النسبية للبروتين من مجموعة البيانات الكمية البروتينية الكمية المتكاملة PaxDb [49] ، مستويات بروتينات الخميرة الأربعة هي: eIF4E = 1،011 جزء في المليون ، eIF4G1 = 444 جزء في المليون ، eIF4G2 = 118 جزء في المليون ، Caf20p = 306 جزء في المليون ، Eap1p = 57 جزء في المليون. تحليل مثل هذا معقد بسبب الدرجة العالية من الخطية المشتركة عند مقارنة ملفات تعريف ربط mRNA من eIF4G1 مع eIF4G2 أو تلك الخاصة بـ Caf20p مع Eap1p. قد يفسر هذا الخطي المشترك المعامل الأكبر لـ eIF4G2 بالنسبة إلى eIF4G1 ، على الرغم من أن وفرة البروتين تشير إلى أن eIF4G1 يجب أن يلعب دورًا أكثر بروزًا. ومع ذلك ، لا يمكن أن يفسر هذا الخطي المشترك المعامل المنخفض نسبيًا لـ Caf20p والمعامل السلبي لـ Eap1p. من المحتمل أن تشير المعاملات المنخفضة والسالبة لـ Caf20p و Eap1p ، على التوالي ، إلى شبكة أكثر تعقيدًا من التفاعلات مع mRNA أو بروتينات ربط الحمض النووي الريبي الأخرى التي لا تعتمد على eIF4E وهيكل غطاء mRNA.

إلى حد بعيد ، تظهر الملاحظة الأكثر لفتًا للنظر من النمذجة في مؤامرة بقايا سكين الرافعة مقابل القيم المجهزة (الشكل 7 د). هذه مؤامرة تشخيصية شائعة في الانحدار الخطي ، حيث يجب أن تركز المخلفات المعيارية للنصوص الفردية على متوسط ​​0 لنموذج موصوف جيدًا. لذلك ، كما يتضح من الشكل 7 د ، تتوافق جميع البيانات تقريبًا مع هذا النموذج جيدًا. ومع ذلك ، فإن اثنين من الرنا المرسال الموجودان خارج هذا النموذج إلى أقصى حد هما تلك التي تشفر 4E-BPs و Caf20p و Eap1p. تشير هذه الملاحظة بقوة إلى أنه داخل حدود مجمع الحلقة المغلقة ، فإن بدء ترجمة كاف 20 و EAP1 تقع mRNAs خارج هذا النموذج ويتم تنظيمها بطريقة مختلفة.

يتفاعل Caf20p بشكل تفضيلي مع النسخة الخاصة به وينظمها

تشير المقارنة الزوجية الإحصائية المباشرة بين القوائم المنسدلة للبروتين (الشكل 3) أيضًا إلى السلوك غير النمطي من كاف 20 و EAP1 مرناس. ترتبط ملفات تعريف ارتباط mRNA لـ eIF4E و eIF4G1 ارتباطًا وثيقًا بعدد قليل فقط من النصوص المخصبة بشكل تفضيلي في eIF4E المنسدلة (الشكل 3 ب). بشكل ملحوظ ، مع ذلك ، من بين النصوص الست المثرية إحصائيًا كاف 20, EAP1 و TIF4632 mRNAs ، الذي يشفر 4E-BPs Caf20p و Eap1p و eIF4G2 ، على التوالي (الشكل 8 أ). وبالمثل ، عندما تمت مقارنة القوائم المنسدلة eIF4E و eIF4G2 ، لاحظنا أن هناك 24 نصًا تم تمثيلها بشكل زائد في القائمة المنسدلة eIF4E بالنسبة إلى eIF4G2 المنسدلة (الشكل 3 ب). مرة أخرى mRNAs ل كاف 20 و EAP1، وهذه المرة TIF4631، ترميز eIF4G1 ، كانت مرتبطة بشكل تفضيلي بـ eIF4E (الشكل 8 أ). تظهر هذه البيانات أن ملف كاف 20/EAP1 يتم إثراء mRNAs بـ eIF4E ولكن ليس بـ eIF4G1.

ينظم Caf20p نسخته الخاصة بنفسه. (أ) تم تمثيل النصوص بشكل زائد في القوائم المنسدلة eIF4E بالنسبة إلى eIF4G1 (أزرق فاتح) أو eIF4G2 (وردي). البيانات مأخوذة من نموذج GLM المعروض في الشكل 3B. (ب) مؤامرة سطحية ثلاثية الأبعاد ص- قيم توضح بالتفصيل مستوى الأهمية لإثراء نصوص الحلقة المغلقة الفردية / eIF4E-BP عبر تجارب RIP-seq الست. (ج) التحقق من صحة RT-PCR شبه الكمي لارتباط بروتين Caf20p بنسخة خاصة به باستخدام مواد أولية مصممة للمناطق من 1 إلى 6 الموضحة في الشكل (بالتفصيل في ملف إضافي 6). المستوى من هذه المناطق من كاف 20 تم تحديد النسخة في عينات تقارب TAP المنقى من CAF20-TAP سلالات نسبة إلى سلالات من النوع البري (WT). (د) رسم تخطيطي يصور نموذجين محتملين يمكن بواسطتهما أن يتفاعل Caf20p مع النسخة الخاصة به لتنظيم إنتاج البروتين. (هـ) تنقية تقارب TAP وتحليل اللطخة الغربية من السلالات الموسومة eIF4E-TAP ، والتحقيق في ارتباط eIF4E مع كل من بروتين Caf20p الداخلي و Caf20p من النوع البري الموسوم بالعلم أو Caf20 m2 p (الذي يحتوي على منطقة ربط eIF4E متحولة). (F) التحقق من خصوصية بادئات RT-PCR باستخدام الحمض النووي الريبي الكلي من السلالات الموضحة تحت الرسم البياني الشريطي لأي من الأصناف الداخلية كاف 20 النصوص أو التي تم وضع علامة عليها كاف 20 النصوص (ملف إضافي 6). أشرطة الخطأ هي ± خطأ معياري من ثلاث تجارب مكررة. (ز) qRT-PCR للداخلية والموسومة بالعلامة كاف 20 النصوص من تنقية تقارب eIF4E-TAP باستخدام البادئات التي تم التحقق من صحتها أعلاه. ال كاف 20 أو CAF20-fl يتم تحديد النصوص في عينات IP بالنسبة إلى إجمالي الحمض النووي الريبي للسلالات المدرجة. أشرطة الخطأ هي ± خطأ معياري من ثلاث تجارب مكررة. (ح) تحليل اللطخة الغربية باستخدام مقتطفات من المقهى 20 تحولت سلالات الحذف إما مع البلازميدات المركزية (نسخة منخفضة) التي تحمل إما النوع البري CAF20-fl الجين أو متحولة m2 CAF20-fl. يتم تحليل ثلاثة محولات فردية مختلفة لكل سلالة ويتم فحص البقع باستخدام الأجسام المضادة للعلم للكشف عن Caf20-fl بالنسبة للتحكم في الأجسام المضادة لـ eIF4A.

لمزيد من استكشاف إمكانية مشاركة مكونات البروتين في نظام الحلقة المغلقة في تنظيم mRNAs التي ترميز المكونات الأخرى للنظام ، تحليل إحصائي يعتمد على أهمية أي تخصيب لكل من النسخ التي تشفر البروتينات الستة المناعية عبر RIP أجريت تجارب -seq. يتم تقديم هذه البيانات كمؤامرة سطحية ثلاثية الأبعاد في الشكل 8 ب ، حيث تشير القمم (الأرجواني) إلى أهمية إثراء النص في عناوين IP محددة ، بينما تمثل القيعان (الزرقاء) أهمية أي تمثيل ناقص. إلى حد بعيد ، ترتبط العلاقات الأكثر لفتًا للانتباه في هذه المؤامرة بربط Caf20p و eIF4E الخاص بـ كاف 20 نسخة (الشكل 8 ب). في الواقع، كاف 20 هو إلى حد بعيد النص الأكثر تمثيلاً في الترسيب المناعي Caf20p فيما يتعلق بإجمالي الرنا المرسال من تحليل EdgeR GLM ، مع تصحيح FDR & lt10 -30.

على أساس النتائج أعلاه ، افترضنا أن تفاعل Caf20p و eIF4E مع كاف 20 قد يمثل النص آلية التنظيم التلقائي (الشكل 8 د). من المثير للاهتمام ، في هذا الصدد ، أن الدراسات السابقة لاحظت وجود صعوبة في التعبير الجيني المفرط لـ Caf20p: يؤدي التعبير عن جميع المكونات الأخرى لمركب الحلقة المغلقة من البلازميدات عالية النسخ في الخميرة إلى زيادة بمقدار ضعفين إلى خمسة أضعاف في المستوى. من البروتين ، بينما تحمل البلازميدات عالية النسخ كاف 20 الجين لا يولد مثل هذا التعبير المفرط. ومع ذلك ، فإن مثل هذا البلازميد يولد مستويات من النوع البري من Caf20p في a 20Δ سلالة [52]. من أجل التحقق مباشرة من صحة الملاحظة التي تفيد بأن Caf20p يتفاعل مع النسخة الخاصة به ، تم إجراء تنقية تقارب TAP في سلالات من النوع البري و Caf20p-TAP وتم تجزئة الحمض النووي الريبي المرتبط بواسطة علاج RNase III. تم إجراء اختبار RT-PCR شبه كمي على هذه العينات لتقييم كفاءة إثراء ست مناطق مختلفة من كاف 20 نسخة (الشكل 8C). تم تحديد منتجات RT-PCR من جميع أنحاء كاف 20 mRNA في العينات المناعية ، بينما لم يتم العثور على منتجات في عينات من سلالات تحمل علامات غير مميزة كاف 20. وقد لوحظ تخصيب خاص لأزواج التمهيدي التي تغطي نهاية 3 'من إطار القراءة المفتوح (الشكل 8C). وبالتالي ، من خلال استخدام اختبار مستقل ، تؤكد هذه البيانات أن Caf20p يمكن أن يتفاعل مع كاف 20 مرنا.

على الرغم من أن البيانات أعلاه تسلط الضوء على إمكانية قيام Caf20p بالتنظيم التلقائي لترجمة نصها الخاص ، فمن الممكن أيضًا أن يتفاعل Caf20p الناشئ المترجم جزئيًا عبر مجال ربط eIF4E amino-terminal الخاص به مع eIF4E المرتبط بـ كاف 20 غطاء مرنا 5 '(الشكل 8 د). هذا يمكن أن يفسر إثراء كاف 20 مرنا مع eIF4E و Caf20p. تم وصف مثل هذه التفاعلات الترجمة المشتركة لمجمعات البروتين البروتين سابقًا ، ويمكن أن تفسر التخصيب المشترك لـ mRNAs الذي يشفر وحدة فرعية معينة مع وحدات فرعية بروتينية أخرى من نفس المركب [53].

لاستكشاف هذا الاحتمال بشكل أكبر ، اختبرنا ما إذا كان تخصيب كاف 20 يعتمد mRNA مع eIF4E على ارتباط بروتين Caf20p مع eIF4E. استخدمنا إستراتيجية حيث تم التعبير عن Caf20p بعلامة العلم أو Caf20 m2 p (حيث تم تعطيل منطقة Caf20p التي تتفاعل مع eIF4E من خلال طفرتين خاطئتين) من البلازميدات في سلالة eIF4E-TAP التي تأوي بالفعل النوع البري الجينوم الداخلي كاف 20 أليل. هذا يضع mRNA الموسومة بعلامة في منافسة مع الذاتية كاف 20 mRNA ويسمح بتحليل تأثير طفرة ربط eIF4E على هذه المنافسة. كعنصر تحكم في النظام ، استحوذ النشاف الغربي على تقارب TAP المنقى eIF4E على كل من Caf20p الداخلي و Caf20p الذي يحمل علامة العلم (الشكل 8E) ، بينما عندما تم وضع البروتين المتحول Flag-Caf20 m2 p في منافسة مع Caf20p الداخلي ، تفاعل eIF4E فقط بالبروتين الداخلي (الشكل 8E) ، مما يؤكد أن طفرات m2 تعطل ارتباط eIF4E [52].

تم استخدام qRT-PCR للتمييز الداخلي كاف 20 مرنا من العلامة الموسومة كاف 20 مرنا. أظهرت تفاعلات التحكم qRT-PCR من مجموع عينات الحمض النووي الريبي خصوصية زوج التمهيدي (الشكل 8F). في سلالة من النوع البري فقط الذاتية كاف 20 تم الكشف عن mRNA ، بينما تم تحديد الشكل الموسوم فقط من mRNA في سلالة تحمل فقط العلامة المميزة بعلامة العلم كاف 20 الجين (caf20Δ Flag-CAF20 الشكل 8F). أخيرًا ، في سلالات تحمل كلا من الذاتية كاف 20 وعلامة العلم كاف 20 الجينات ، تم الكشف عن كلا الرنا المرسال (الشكل 8F). لذلك استخدمنا هذا النظام لقياس مستوى كل من العلامة المميزة والداخلية كاف 20 تم الكشف عن mRNAs مع eIF4E المناعي ، وكلاهما من الرنا المرسال في eIF4E المناعية. بشكل حاسم ، تم وضع علامة كاف 20 مرنا المرتبط بـ eIF4E بغض النظر عما إذا كان منتج البروتين لهذا الرنا المرسال يمكن أن يتفاعل مع eIF4E (قارن نتائج السلالات التي تحمل pCAF20 - فلوريدا مقابل صكاف 20 م 2 -فل الشكل 8G). لذلك ، فإن تفاعل eIF4E مع كاف 20 لا يعتمد mRNA على قدرة بروتين Caf20p للتفاعل مع eIF4E. من هذه البيانات ، نفترض أنه من غير المرجح أن يكون السبب الرئيسي للإثراء الانتقائي لـ كاف 20 mRNA مع eIF4E أو بروتين Caf20p هو "التفاعل المشترك" لـ Caf20p الناشئ عبر مجال ربط eIF4E amino-terminal الخاص به. بدلاً من ذلك ، نحن نفضل النموذج الذي يعمل فيه بروتين Caf20p الناضج بشكل انتقائي على إثراء كاف 20 يُفترض أن مرنا عبر تفاعلات Caf20p مع بروتينات ربط الحمض النووي الريبي الأخرى بالإضافة إلى تفاعلها مع eIF4E (الشكل 8 د). في الواقع ، أظهر Caf20p سابقًا تفاعلات مع كل من بروتينات ربط Puf4p و Puf5p RNA [40].

تنبؤ نموذج التنظيم الذاتي Caf20p هو أنه في السلالات التي يكون فيها متحولة ربط eIF4E (Caf20 m2) هي المصدر الوحيد لـ Caf20p ، سيكون التنظيم الذاتي قصير الدائرة وسيتراكم Caf20p إلى مستويات أعلى من السلالات التي تحمل البرية -نوع Caf20p. في الواقع ، في الشكل 8H ، وجد أن هذا التوقع صحيح: in 20Δ المسوخ تحمل صكاف 20 م 2 -فل البلازميد ، يتراكم Caf20p إلى 7.05 (± 1.25) - مستويات أعلى من تلك الموجودة في المتحولة الحاملة للبلازميد من النوع البري. مجتمعة ، تسلط هذه البيانات الضوء على دائرة تنظيم تلقائي تتحكم في تعبير Caf20p في حلقة ردود فعل سلبية ، حيث يتم تطبيق فرامل ذاتية التحديد لتعديل التعبير عن مثبط الترجمات الخلوي العام.


12.3 آليات التطور الأخرى

أهم أربع قوى تطورية ستغير مجموعة من الكائنات الحية بمرور الوقت هي الانتقاء الطبيعي ، والطفرة ، والانحراف الجيني ، والهجرة أو تدفق الجينات إلى أو خارج السكان. يتم وصف الانتقاء الطبيعي بالتفصيل في القسم السابق. سيغطي هذا القسم باقي آليات التطور.

12.3.1 الطفرة: مصدر كل التغييرات الجديدة

الطفرة هي تغيير في تسلسل الحمض النووي. يمكن أن يكون تغييرًا بسيطًا ، مثل تغيير زوج أساسي واحد ، من خلال تغييرات أكثر شمولاً مثل إضافة أو حذف أزواج القاعدة ، على الرغم من التعديلات الكبيرة على مستوى الكروموسومات. حتى التغييرات الصغيرة يمكن أن تحدث اختلافات كبيرة في البروتين الذي يرمز إليه الحمض النووي ، كما يبدو أعلاه في مثال فقر الدم المنجلي.

تحول الطفرة أليلًا واحدًا إلى أليل جديد. هذا الأليل الجديد له تردد صغير جدًا خلال الجيل الأول. على مدى عدة أجيال ، سيزداد تواترها ببطء في عدد السكان إذا لم تكن هناك قوى تطورية أخرى تعمل على الأليل. إذا كان الانتقاء الطبيعي يعمل ضد الأليل ، فسيتم إزالته من السكان. وهذا أحد أسباب بقاء الأمراض الوراثية بين البشر بترددات منخفضة للغاية. إذا تم تفضيل الأليل عن طريق الاختيار ، فسوف يزداد التردد. إذا كانت الطفرة محايدة & # 8211 لا تزيد أو تنقص اللياقة الإنجابية & # 8211 سيظل ترددها ثابتًا في مجموعة سكانية لأجيال.

12.3.2. تدفق الجينات / الهجرة

إذا كان لمجموعتين من النوعين ترددات أليل مختلفة ، فإن هجرة الأفراد من مجموعة إلى أخرى ستؤدي إلى تغيرات في التردد في كلا المجموعتين. ستشهد المجموعة الجديدة زيادة في بعض الأليلات بينما سيشهد السكان السابقون انخفاضًا في بعض الأليلات (الشكل 12.23).

الشكل 12.23 في هذا المثال ، تهاجر حشرة بنية من مجموعة إلى أخرى. تردد الأليل للون البني وبالتالي زاد في السكان على اليسار. الائتمان: & # 8220 الملف: Gene flow.jpg & # 8221 بواسطة Tsaneda مرخص بموجب CC BY 3.0

بعد الهجرة ، يتزاوج الفرد (الأفراد) الجديد مع الأفراد المحليين ويصبح الأليل (الأليل) الجديد جزءًا من مجموعة الجينات السكانية رقم 8217.

في حين أن بعض المجموعات السكانية مستقرة إلى حد ما ، فإن البعض الآخر يعاني من مزيد من التدفق. لا تسافر بعض الحيوانات على نطاق واسع خلال حياتها بينما تكون بعض الأنواع مهاجرة بشكل كبير ويكون تدفق الجينات شائعًا جدًا. قد تبدو الأنواع النباتية ثابتة جدًا في موقعها ، ولكنها أيضًا تعاني من تدفق الجينات. يمكن للعديد من النباتات أن ترسل بذورها بعيدًا وواسعًا عن طريق الرياح أو في أحشاء الحيوانات التي أكلت البذور ثم تودعها في مكان مختلف عندما تتغوط. قد تقدم هذه البذور المنتقلة على نطاق واسع أليلات شائعة في مجتمع المصدر إلى مجموعة جديدة تكون نادرة فيها.

12.3.3 الانجراف الجيني

هناك طريقة أخرى يمكن أن تتغير بها ترددات أليل السكان وهي الانجراف الجيني (الشكل 11.7) ، وهو ببساطة تأثير الصدفة. الانجراف الجيني هو الأكثر أهمية في مجموعات صغيرة. سيكون الانجراف غائبًا تمامًا في مجتمع به عدد لا نهائي من الأفراد ، ولكن ، بالطبع ، لا يوجد عدد كبير بهذا الحجم. يحدث الانجراف الجيني لأن الأليلات في النسل هي عينة عشوائية من الأليلات في الجيل الأب. قد تصل الأليلات أو لا تنتقل إلى الجيل التالي بسبب أحداث الصدفة بما في ذلك وفيات الفرد ، والأحداث التي تؤثر على إيجاد رفيقة ، وحتى الأحداث التي تؤثر على الأمشاج التي ينتهي بها المطاف في الإخصاب. إذا مات فرد من مجموعة مكونة من عشرة أفراد قبل أن يترك أي نسل للجيل التالي ، فإن جميع جيناته - عُشر مجموعة الجينات السكانية - ستفقد فجأة. في مجتمع مكون من 100 شخص ، يمثل هذا الفرد 1 في المائة فقط من إجمالي مجموعة الجينات ، وبالتالي ، فإن تأثيره أقل بكثير على التركيب الجيني للسكان ومن غير المرجح أن يزيل جميع نسخ حتى الأليل النادر نسبيًا.

تخيل أن عدد السكان من عشرة أفراد ، نصفهم مع الأليل A والنصف الآخر مع الأليل a (الأفراد أحادي العدد). في حالة السكان المستقرة ، سيكون للجيل القادم أيضًا عشرة أفراد. اختر هذا الجيل بشكل عشوائي عن طريق قلب عملة معدنية عشر مرات واترك الرؤوس تكون A وذيول تكون a. من غير المحتمل أن يمتلك الجيل القادم نصف كل أليل بالضبط. قد يكون هناك ستة من واحد وأربعة من الآخر ، أو مجموعة مختلفة من الترددات. وهكذا ، تغيرت ترددات الأليل وحدث التطور. لن تعمل العملة المعدنية بعد الآن لاختيار الجيل التالي (لأن الاحتمالات لم تعد نصف لكل أليل). سوف ينجرف التردد في كل جيل لأعلى ولأسفل على ما يعرف بالمشي العشوائي حتى يتم اختيار كل أ أو كل أ عند نقطة واحدة ويتم إصلاح هذا الأليل من تلك النقطة فصاعدًا. قد يستغرق هذا وقتًا طويلاً بالنسبة لعدد كبير من السكان. هذا التبسيط ليس بيولوجيًا للغاية ، ولكن يمكن إظهار أن السكان الحقيقيين يتصرفون بهذه الطريقة. يكون تأثير الانجراف على الترددات أكبر كلما قل عدد السكان. يكون تأثيره أكبر أيضًا على أليل بتردد بعيد عن النصف. سيؤثر الانجراف على كل الأليل ، حتى تلك التي يتم اختيارها بشكل طبيعي.

يمكن أيضًا تضخيم الانجراف الجيني عن طريق الأحداث الطبيعية أو التي يسببها الإنسان ، مثل الكارثة التي تقتل عشوائيًا جزءًا كبيرًا من السكان ، وهو ما يُعرف باسم تأثير عنق الزجاجة الذي ينتج عنه محو جزء كبير من الجينوم فجأة (الشكل). 11.8). في ضربة واحدة ، يصبح التركيب الجيني للناجين هو التركيب الجيني لجميع السكان ، والذي قد يكون مختلفًا تمامًا عن السكان قبل وقوع الكارثة. يجب أن تكون الكارثة كارثة تقتل لأسباب لا علاقة لها بسمات الكائن الحي ، مثل الأعاصير أو تدفق الحمم البركانية. من المحتمل أن يؤثر القتل الجماعي الناجم عن درجات الحرارة الباردة بشكل غير عادي في الليل على الأفراد بشكل مختلف اعتمادًا على الأليلات التي يمتلكونها والتي تضفي صلابة باردة.

سيناريو آخر قد يتعرض فيه السكان لتأثير قوي على الانجراف الجيني هو إذا غادر جزء من السكان لبدء مجموعة جديدة في موقع جديد ، أو إذا تم تقسيم السكان بواسطة حاجز مادي من نوع ما. في هذه الحالة ، من غير المحتمل أن يكون هؤلاء الأفراد ممثلين لجميع السكان مما يؤدي إلى تأثير المؤسس. يحدث تأثير المؤسس عندما تتطابق البنية الجينية مع الآباء والأمهات المؤسسين للسكان الجدد. يُعتقد أن تأثير المؤسس كان عاملاً رئيسياً في التاريخ الجيني للسكان الأفريكانيين للمستوطنين الهولنديين في جنوب إفريقيا ، كما يتضح من الطفرات الشائعة في الأفريكانيين ولكنها نادرة في معظم المجموعات السكانية الأخرى. من المحتمل أن يكون هذا بسبب وجود نسبة أعلى من المعتاد من المستعمرين المؤسسين ، الذين كانوا عينة صغيرة من السكان الأصليين ، الذين حملوا هذه الطفرات. نتيجة لذلك ، يُظهر السكان ارتفاعًا غير معتاد في حالات الإصابة بمرض هنتنغتون (HD) وفقر الدم فانكوني (FA) ، وهو اضطراب وراثي معروف بأنه يسبب نخاع العظام والتشوهات الخلقية ، وحتى السرطان.


شاهد الفيديو: الجزيئات البيولوجية الكبيرة. أحياء أولى ثانوي. 2022 (يونيو 2022).