معلومة

هل يجب معرفة جميع الأشكال الإسوية للـ microRNA وتسلسلها للحصول على تعبير microRNA؟

هل يجب معرفة جميع الأشكال الإسوية للـ microRNA وتسلسلها للحصول على تعبير microRNA؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

مما أفهمه ، فإن microRNA عبارة عن بنى قصيرة على شكل "منعطف حاد". عند تسلسل عد الميرنا ، يتم "العثور" على شكل إسوي ميرنا وهي أقسام فرعية متفاوتة الطول وربما مع بعض الطفرات أو الاختلافات الأخرى في الرنا الميكروي "الكنسي". إجمالي التهم الخاصة بـ miRNA هي مجموع أعداد الأشكال الإسوية التي تتعلق بالميرنا. [الرجاء تصحيح لي إذا كان كل هذا خطأ]

فيما يتعلق بتسلسل الجيل التالي ، يجب إضافة "مكتبة" تخبرها بما يجب تسلسله. هل يعني هذا أن الأشكال الإسوية "المعروفة" فقط يمكن قراءتها وحسابها أم أنه يمكن أيضًا قراءة وحساب التسلسلات "الجديدة" (أي الطفرات) التي لم تكن معروفة قبل بدء التسلسل؟

فيما يتعلق بـ qPCR - هل تبحث هذه التقنية فقط عن الأشكال الإسوية الفردية؟ في هذه الحالة ، إذا أردت أن أعرف شيئًا عن تعبير microRNA معين ، فسوف أحتاج إلى إجراء qPCR لكل شكل إسوي معروف متعلق بهذا microRNA. أو ، هل من الأسهل في الواقع تسلسل تعبير microRNA باستخدام qPCR حيث يمكن مطابقة التسلسلات مع بنية دبوس الشعر الرئيسية باحتمالية أعلى. (بواسطة أسهل أعني مقارنة بالقول الرغبة في الحصول على تعبير لشكل إسوي معين لأنه يحتاج إلى مطابقته تمامًا).


لقد عملت على مشكلة مماثلة وأنا أخبر تجربتي.

أولاً ، عليك أن تضع في اعتبارك حقيقة أن الجيرنا الناضج يمكن أن ينشأ من مواقع جينية متعددة ، أي أن العديد من ما قبل ميرنا يمكن أن تؤدي إلى نفس الميرنا الناضج.

كما قلت ، هناك منتجات انقسام ما قبل ميرنا مع عدم تجانس في نهاياتها ، أي أن هناك متواليات لا تتطابق تمامًا مع المنطقة الناضجة المشروحة. في حين أن المنتجات التي تحتوي على 3 أشكال من عدم التجانس يمكن أن تسمى الأشكال الإسوية ، فمن المحتمل أن يكون للمنتجات ذات التغاير 5 أهداف مختلفة نظرًا لتعطل تسلسل البذور ، وبالتالي فهي مختلفة من الناحية الفنية miRNAs (حسب التعريف).

الآن ، أفضل تقنية لتحليل الأشكال الإسوية هي تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير (NGS). لن تكون qPCR تقنية جيدة لأن البادئات لا يمكنها دائمًا التمييز بين التسلسلات المتشابهة للغاية (يزداد سوءًا بسبب حقيقة أن miRNAs صغيرة جدًا). مكتبة NGS هي مجموعة من تسلسلات الحمض النووي التي تحصل عليها من قص الحمض النووي الريبي / الحمض النووي متبوعًا بربط المحول (النسخ العكسي لـ RNA). نظرًا لأن تسلسل المحول معروف ، فإن تفاعل التسلسل لا يتطلب منك معرفة تسلسل المنتجات. ومع ذلك ، قد تحتاج إلى معرفة الجينوم المرجعي للعثور على miRNAs جديدة. هذا يرجع في المقام الأول إلى حقيقة أنه من الصعب للغاية تسلسل ما قبل ميرنا (وفرة منخفضة وبنية دبوس الشعر). يمكنك تحديد جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة الجديدة بسهولة شديدة ولكن لا يمكنك القول بأنها جزيئات جزيئية صغيرة إلا إذا كان بإمكانك تعيينها إلى سلائف الحلقة الجذعية (pre-miRNA).

يمكنك اكتشاف قراءات جديدة جيدًا وقد اكتشف الناس الكثير من الجزيئات المجهرية الجديدة باستخدام NGS. يمكنني إخبارك بالمنهجية التي اتبعتها للعثور على منتجات غير نمطية لنفس ما قبل ميرنا. أنا من أجل البساطة أسمي 5 'منتجات غير متجانسة كـ بذور سيئة (لأنها عطلت تسلسل البذور) و 3 منتجات غير متجانسة مثل isomiRs. لقد استخدمت منهجية مشابهة لمنهجية برنامج معروف - miRdeep.

  1. احصل على تسلسلات pre-miRNA من miRbase
  2. احصل على تسلسلات miRNA ناضجة من miRbase
  3. استخدم bowtie-1 لبناء فهرس من تسلسلات pre-miRNA
  4. قم بإزالة المحول من قراءات fastq الخاصة بك وإزالة القراءات منخفضة الجودة. هناك العديد من الأدوات للقيام بذلك. يمكنك تجربة Trimmomatic.
  5. قم بتعيين متواليات miRNA الناضجة إلى فهرس pre-miRNA باستخدام ربطة العنق للعثور على الموقع الدقيق لـ miRNA الناضج في pre-miRNA
  6. تقرأ الخريطة لمنطقة pre-miRNA. يقرأ عامل التصفية الذي لا يتم تعيينه في نافذة محددة مسبقًا حول المنطقة الناضجة.
  7. تصنيف ما يقرأ على النحو البذور أو isomiR

الآن ، يمكن اعتبار isomiRs ويقرأ تلك الخريطة تمامًا لتنضج منطقة miRNA كمساهمين في إجمالي تعبير miRNA. لكن، بذور سيئة لا ينبغي اعتباره شكل إسوي. يمكنك أيضًا السماح بمستوى معين من عدم التطابق وإحصاء هذه القراءات. سيكون التسلسل مع عدم تطابق في منطقة البذور مرة أخرى بذور سيئة. يمكنك أيضًا الحصول على مخططات تسجيل لقراءاتك.

لا توجد العديد من الدراسات حول هذا التحليل. لم أحصل على أي نتيجة قابلة للنشر مع بياناتنا ولكن المنهجية صحيحة بشكل معقول. يمكنك المضي قدمًا في تطبيقه لدراستك.


حتى الآن ، لم يكن هناك تحكم إيجابي معروف لـ miRNA مع تأثيرات وظيفية قوية ومؤكدة على التعبير الجيني في خلايا الثدييات المستزرعة. لتلبية هذه الحاجة ، صمم علماء Ambion سليفة Pre-miR hsa-miR-1 miRNA ، وهي أليغنوكليوتيد RNA مزدوج الشريطة ، والتي يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابي في التجارب جنبًا إلى جنب مع سلائف Pre-miR miRNA الأخرى.

تم إثبات أن Pre-miR hsa-miR-1 miRNA Precursor ، الذي يحاكي miR-1 الناضج ، يقلل من تنظيم جين البروتين Tyrosine Kinase 9 (PTK9 twinfillin) على مستوى mRNA [1]. ينخفض ​​التعبير عن PTK9 mRNA بنسبة 60-95٪ بعد ترنسفكأيشن سلائف Pre-miR hsa-miR-1 miRNA ، مقارنةً بترنسفكأيشن مع Pre-miR miRNA السلائف - التحكم السلبي # 1 ، باستخدام PCR في الوقت الحقيقي و TaqMan® مقايسات التعبير الجيني [معرف الفحص # s Hs00702289_s1 (بشري) وبيانات Mm01598980_g1 (الماوس) غير معروضة]. لذلك ، يوفر Pre-miR hsa-miR-1 miRNA تحكمًا إيجابيًا مناسبًا لإسكات الجين بوساطة miRNA لـ PTK9 ، عند مراقبته باستخدام مقايسات التعبير الجيني TaqMan المناسبة و PCR في الوقت الحقيقي. يمكن استخدام التحكم الإيجابي قبل مير لتأكيد أن إجراء تعداء الخلايا في مزارع الخلايا يدعم إسكات الجينات بوساطة ميرنا.


خلفية

إن الرنا الميكروي عبارة عن رنا صغير داخلي المنشأ أحادي الجديلة ، يبلغ طوله حوالي 22 نيوكليوتيد ، والذي يشارك في تنظيم الجينات بعد النسخ في مجموعة متنوعة من الأنواع [1-4]. تعمل miRNAs كعنصر من مكونات مجمع الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) من خلال توجيهه إلى أهداف محددة من خلال تفاعل الاقتران الأساسي بين منطقة بذرة miRNA وتسلسل تكميلي في 3'-UTR لنسخة مستهدفة [5،6] . في البشر والحيوانات الأخرى ، تمتد منطقة البذرة عادة من المركز الثاني إلى الثامن لميرنا الناضج [7].

تنشأ جميع الجزيئات الدقيقة المعروفة من سلائف الحمض النووي الريبي أحادية الشريطة على شكل بنية حلقة دبوس الشعر [8،9]. في الحيوانات ، يتم استئصال دبوس الشعر من سلائف أطول بواسطة Drosha ثم يتم قصه بواسطة Dicer ، والذي ينتج RNA مزدوجًا مع 3 نهايات متدلية ، كل 2 نيوكليوتيدات طويلة [8،10-13]. تتم مشاركة هذا الهيكل المزدوج بين ميرنا ومسارات معالجة الرنا الصغير المتداخل (سيرنا) [14 ، 15]. لكل من miRNAs و siRNAs ، يتم بعد ذلك دمج أحد خيوط الطباعة المزدوجة في RISC ويتم التخلص من الآخر. نظرًا لأن الخيط المحدد يحدد الخصوصية الوظيفية لـ RISC ، فهذه خطوة حاسمة في مسار تداخل RNA (RNAi).

بشكل عام ، يتم دمج هذين الجدولين في RISC باحتمالات مختلفة [16]. في siRNAs ، يعتمد احتمال اختيار الخصلة على الثبات الديناميكي الحراري النسبي لنهايات السليفة المزدوجة: يتم اختيار حبلا مع ثبات مزدوج أقل عند الطرف 5'بشكل تفضيلي [14،16]. إن عدم التطابق الفردي داخل النيوكليوتيدات الأربعة الأولى من مزدوج سيرنا مزدوج كافٍ لتحديد خصوصية اختيار الخيط. علاوة على ذلك ، فإن استبدال النوكليوتيدات الفردي عند الطرف 5'من siRNA الذي يغير عدم التناسق الديناميكي الحراري للزاوجين يكون كافيًا لعكسه تمامًا [14]. في الذباب ، يتم التعرف على عدم التناسق الديناميكي الحراري لمزدوج سيرنا المزدوج من خلال الارتباط التفضيلي لمغير متغاير البروتين Dcr-2 / R2D2 بنهايته الأكثر استقرارًا ، وبالتالي تعزيز تحميل الخيط غير المتماثل في مجمع Ago2-RISC ([17]. يتم تحميل معظم جزيئات الحمض النووي الريبوزي المتطايرة في مجمع إسكات مختلف ، Ago1-RISC ، بواسطة آلية غير معروفة مستقلة عن Dcr-2 / R2D2 [18] ، وبالتالي ، قد تختلف محددات اختيار الخيط المستخدمة في مسارات miRNA و siRNA المتطايرة.

تحليل تسلسل 16 ذبابة (ذبابة الفاكهة سوداء البطن)، 96 دودة (أنواع معينة انيقة) ، 73 فأرًا ، و 87 ميرنا بشريًا أن سلائفها من الرنا المرسال تظهر تحيزًا للثبات الديناميكي الحراري مشابهًا لتحيز siRNAs ، بمعنى آخر. يتم تمثيل الخصلة ذات الطرف الأقل استقرارًا 5'بشكل تفضيلي [16]. بناءً على هذه الملاحظة ، تم اقتراح أن miRNAs و siRNAs قد تشترك في نفس محددات اختيار الخيط [16]. ومع ذلك ، فقد أظهر التحليل الأخير لمحات التعبير ميرنا للإنسان والفأر أن مستويات التعبير النسبي للخيطين تختلف بشكل كبير بين الأنسجة [19]. والجدير بالذكر أنه في بعض الأنسجة التي تم اختبارها ، توجد الجزيئات الجزيئية التي تنشأ من حبلا غير موات للديناميكا الحرارية بمستويات مماثلة أو أعلى من نظيراتها المفضلة من الناحية الديناميكية الحرارية.

في هذه الدراسة ، نحدد عناصر التسلسل المرتبطة باختيار حبلا miRNA التفضيلي و / أو الرفض من خلال تحليل تكوين التسلسل ومستويات التعبير النسبي لأزواج miRNA الناشئة من خيطين من نفس السلائف المزدوجة في بيانات التسلسل عالية الإنتاجية من البشر والذباب.


مناقشة

تشير الكثير من الأدلة إلى أن PKM1 يتم التعبير عنه في الأنسجة الطبيعية المتمايزة ، بينما يتم التعبير عن PKM2 في تكاثر الخلايا السرطانية 18 ، 21. ومع ذلك ، هناك القليل من البيانات التي توضح بشكل منهجي التعبير عن الأشكال الإسوية PKM في الأنسجة الطبيعية. باستخدام مطياف الكتلة ، بلوملين وآخرون. ذكرت أن PKM2 بدلاً من PKM1 يتم التعبير عنه بشكل تفضيلي في العديد من الأنسجة المتمايزة الطبيعية 22. أيضًا ، باستخدام مجموعات بيانات TCGA RNA-Seq ، Desai et al. تم كتابة تقرير بذلك PKM2 يوجد بشكل رئيسي في الأنسجة الطبيعية باستثناء العضلات والدماغ 23. في دراستنا المنهجية باستخدام 19 نوعًا من الأنسجة الطبيعية من أعضاء مختلفة ، يتم التعبير عن الدماغ والعضلات الهيكلية والقلب فقط بشكل أساسي PKM1 بدلا من PKM2. تم تأكيد هذه النتائج أيضًا من خلال ملف تعريف تعبير البروتين الموجود لعينات أنسجة الفئران. وهكذا كانت نتائجنا مماثلة لتلك التي أبلغت عنها Bluemlein وآخرون وديساي وآخرون. تتطلب هذه الأعضاء المهيمنة على PKM1 مثل الدماغ والعضلات طاقة عالية لأداء وظائفها ، أي أنها تعبر بشكل أساسي عن PKM1 لاستخدامها في دورة TCA وبالتالي تكتسب الطاقة بكفاءة. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي هذه الأعضاء المهيمنة على PKM1 على آلات للتحول من PKM1 إلى PKM2 أثناء تطور السرطان. هذه حالات خاصة إلى حد ما. من ناحية أخرى ، فإن الأعضاء التي تحتوي فيها الأنسجة على دورة خلوية قصيرة ، مثل الجهاز الهضمي 37 ، تعبر بشكل رئيسي عن PKM2 بدلاً من PKM1 حتى في الأنسجة الطبيعية. أظهرت IHC لأنسجة القولون والمستقيم الطبيعية أن تعبير PKM1 كان سائدًا في طبقة العضلات والعضلات الوعائية الملساء و Auerbach-Plexus. ومع ذلك ، فإن PKM2 سيطر على الخلايا الظهارية ، والتي هي أصل تطور السرطان (البيانات غير معروضة) ، مما يعكس نتائج تعبير PKM2 في عينات الورم من المرضى. في الدراسة الحالية ، أظهرنا أن هذه الأعضاء المهيمنة على PKM2 خضعت لمزيد من الارتفاع PKM2 / PKM1 النسبة خلال تطور السرطان عن طريق التحليلات البيوكيميائية والكيميائية النسيجية (الشكل 4).

على الرغم من أنه ثبت بالفعل أن تبديل PKM أثناء تطور السرطان يحدث في حالات خاصة فقط ، إلا أن الآلية التي تنظم تعبير PKM ظلت غير معروفة إلى حد كبير. أيضًا ، على مستوى الخلية الواحدة ، لم يتم ملاحظة تبديل الأشكال الإسوية من PKM حتى الآن. Desai et al. ذكرت أن تعبير PKM2 يرتبط بحالة intron1 لجين PKM 23 ، لكن هذا الارتباط ليس محددًا على مستوى النسخ. في السابق ، تم الإبلاغ عن أن بروتينات hnRNP بما في ذلك PTB1 تنظم تعبير PKM 21. يرتبط PTB1 بشكل قمعي بالمنطقة المحيطة بـ exon 9 في جين PKM ، مما يؤدي إلى إدراج exon 10 في mRNA والتنظيم الأعلى لتعبير PKM2 في الخلايا السرطانية 6 ، 7. في السابق ، وجدنا أن الالتهام الذاتي الناجم عن miR-124 في خلايا سرطان القولون (البيانات غير معروضة). لذلك ، اعتبرنا أن miR-124 قد ينظم الجزيئات المرتبطة باستقلاب الطاقة ، ووجدنا أخيرًا أن miR-124 يستهدف بشكل أساسي PTB1. كانت توزيعات أنسجة miR-124 مرتفعة بشكل تفضيلي في الدماغ والعضلات الهيكلية والقلب ، ولكنها منخفضة نسبيًا في الجهاز الهضمي مثل المعدة والقولون. لذلك ، افترضنا أن miRNAs مثل miR-124 ساهمت في الضبط الدقيق لتعبير PKM1 و PKM2 من خلال تنظيم جهاز الربط PKM PTB1. علاوة على ذلك ، وجدنا أن miRNAs التي تستهدف PTB1 تتكون من miRNAs الخاصة بالعضلات ، مثل miR-1 و miR-133 أو miRNAs الخاصة بالدماغ مثل miR-9 و miR-124 و miR-137. لقد ثبت أن miRNAs تنظم الاستجابات الفسيولوجية ، وبالتالي فإن هذه الآلية التي تنظم التعبير عن PKM PTB1يمكن اعتبار miRNAs المرتبطة ذات أهمية بيولوجية في التسرطن. بالإضافة إلى ذلك ، فمن المعقول جدا أن هؤلاء PTB1- سيتم تنظيم miRNAs المصاحبة لأسفل وأن هذا التنظيم السفلي سيكون مرتبطًا بتبديل PKM1 إلى PKM2 ، مما يزيد من ارتفاع نسبة PKM2 / PKM1 أثناء تطور الورم.

نتائجنا تشير بقوة إلى ذلك PTB1يمكن أن تكون miRNAs و PTB1 المرتبطة جزيئات مستهدفة محتملة لتطوير عقاقير جديدة مضادة للسرطان أو علامات علاجية أو تشخيصية في المستقبل القريب.


مناقشة

يعد تحرير الحمض النووي الريبي A-to-I منتشرًا في النسخ البشرية ويؤثر على طبقات متعددة من تنظيم الجينات [3 ، 46]. استخدمت الدراسات الحديثة بيانات RNA-seq على نطاق السكان لمسح الاختلاف الجيني لتحرير الحمض النووي الريبي في أنواع أو أنسجة من الخلايا المختارة [27 ، 47 ، 48]. في هذا العمل ، باستخدام البيانات الجينية والنسخية المتطابقة في 49 نسيجًا عبر 437 فردًا بشريًا ، سعينا إلى تحديد المشهد الشامل والتحقيق في خصوصية الأنسجة لأحداث تحرير الحمض النووي الريبي المنظمة وراثيًا. باستخدام طريقتين تحليليتين تكميليتين ، حددنا 3117 موقع تحرير edQTL RNA و 1986 مواقع تحرير RNA الخاصة بالأليل عبر 49 نسيجًا بشريًا ، بما في ذلك 756 موقعًا تم تحديدها بواسطة كلا النهجين. وجدنا أيضًا أن إشارات edQTL لمواقع معينة لتحرير الحمض النووي الريبي يمكن أن تختلف عبر الأنسجة. على سبيل المثال ، وجدنا مجموعة من مواقع edQTL الخاصة بالأنسجة ، والتي يرتبط تباينها في أحجام تأثير edQTL عبر الأنسجة بمستوى تعبير ADARB1 (الشكل 3f ، ملف إضافي 5: الجدول S4). لاحظنا أيضًا ضعف إشارات edQTL بشكل عام في العضلات الهيكلية ، بما يتوافق مع مستوى تعبير ADAR المنخفض في هذا النسيج [49]. قد تُعزى هذه الاختلافات الخاصة بالأنسجة في إشارات edQTL إلى الاختلافات في مستويات تحرير الحمض النووي الريبي الأساسي ، اعتمادًا على تركيزات إنزيمات تحرير الحمض النووي الريبي (ADAR أو ADARB1) في نسيج معين. لقد قمنا بتجميع نتائجنا في خادم ويب سهل الاستخدام للقراء لاستكشاف البيانات (https://xingshiny.research.chop.edu/edqtl/).

أصبح تحليل التلوين نهجًا مستخدمًا على نطاق واسع لإيجاد ارتباطات بين الصفات الجزيئية و / أو الصفات المظهرية من خلال مقارنة التداخل بين إشارات الارتباط الخاصة بهم [30 ، 32]. وجدنا 443 موقعًا من مواقع edQTL تتجمع فيها إشارات edQTL مع إشارات eQTL الخاصة بجيناتها في نسيج واحد على الأقل. يجب أن نلاحظ أن تحليل التلوين لا يعتمد على المسافة الجينية بين إشارتين من QTL (على سبيل المثال ، edQTL و eQTL). بدلاً من ذلك ، نظرًا لخاصيتين مهمتين (مستوى تحرير الحمض النووي الريبي ومستوى التعبير الجيني) ، يفحص تحليل كولوكيشن التوزيع العام للارتباط ويقارنه ص القيم لجميع النيوكلوتايد في نافذة جينومية كبيرة. حدسيًا ، يتم الوصول إلى احتمال خلفي مرتفع للتلؤم إذا كانت مجموعتا ص توزيعات القيمة تتبع بعضها البعض. أبرزنا FADS1 كمثال على إشارة edQTL التي تتحد مع إشارة eQTL الخاصة بها بالإضافة إلى سمات GWAS المتعددة (الشكل 5 أ ، ب). من خلال تحليل تحرير الحمض النووي الريبي التفاضلي لمجموعات بيانات RNA-seq لاضطراب ميرنا ، تمكنا من ربط miRNAs بالنصوص المستهدفة المحتملة بطريقة خاصة بالتحرير. على سبيل المثال ، حددنا النسخة المحررة من TYK2 كهدف محتمل لـ miR-138-5p. يشارك TYK2 في مسار إشارات JAK-STAT ويلعب دورًا مهمًا في الجهاز المناعي للثدييات [50]. عندما تم إسقاط miR-138-5p ، لاحظنا زيادة في تحرير RNA في chr19: 10462087 في TYK2 (الشكل 6 ج). تشير نتائجنا إلى أنه يتم إنشاء إشارة eQTL لـ TYK2 من التفاعل بين edQTL في chr19: 10462087 و miR-138-5p. قد يؤدي هذا eQTL إلى ظهور العديد من سمات GWAS المرتبطة بالمناعة. تتلاقى كل من إشارات eQTL و edQTL مع سمات GWAS للذئبة الحمامية الجهازية ونسبة العدلات في خلايا الدم البيضاء (الشكل 6 هـ). وتجدر الإشارة إلى أن تغييرات تحرير RNA التي تم اكتشافها بواسطة RNA-seq استجابةً لاضطراب ميرنا يمكن أن تكون بسبب التأثيرات المباشرة لـ miRNA على تدهور النصوص المحررة مقابل غير المحررة ، أو من خلال التأثيرات الثانوية التي تقع في اتجاه مسار المسارات التنظيمية الأخرى. على سبيل المثال ، قد يؤثر تنظيم miRNA لبروتين ربط RNA بدوره على استقرار النسخ بطريقة خاصة بالتحرير.

نقترح نموذجًا يمكن فيه لأحداث تحرير الحمض النووي الريبي الخاضعة للتنظيم من قبل رابطة الدول المستقلة تعديل مستويات نسخة الحالة المستقرة والسمات المعقدة (الشكل 8). في ظل وجود ميرنا الذي يستهدف بشكل تفضيلي النسخة المحررة أو غير المحررة من النص ، يمكن أن تنشأ إشارة eQTL من إشارة edQTL من خلال تدهور النص بوساطة miRNA الخاص بالتحرير. يمكن أن ينتج التباين في السمات المظهرية عن مستويات نسخ الحالة المستقرة المتغيرة. تم توضيح ذلك في مثال DHFR حيث يربط miR-125a-3p edQTL في chr5: 79923430 مع eQTL لـ DHFR عن طريق تقليل استقرار النصوص غير المحررة. تم ربط تعبير DHFR العالي في سرطان الثدي بتعزيز الانتشار الخلوي ومقاومة الميثوتريكسات ، وهو عامل علاجي كيميائي [36]. يجب أن نلاحظ أنه على الرغم من أن الاستهداف التفاضلي لموقع DHFR غير المحرر مقابل موقع DHFR المحرر بواسطة miR-125a-3p كان معروفًا [36] ، فقد أبلغت دراستنا عن العديد من النتائج الجديدة. لقد أظهرنا أن (1) حدث تحرير الحمض النووي الريبي في DHFR يتم التحكم فيه وراثيًا ، (2) يتم تحديد موقع إشارة edQTL مع إشارة eQTL لـ DHFR ، و (3) يحدث تحديد موقع eQTL بطريقة تعتمد على تركيز ميرنا. علاوة على ذلك ، نظهر أن هذه المكونات يمكن أن تتحد في جين واحد لإنشاء eQTL.

نموذج تخطيطي يربط edQTLs بـ eQTLs والسمات المعقدة. نموذج تخطيطي للآلية التنظيمية حيث يمكن للتفاعلات بين تحرير RNA وتدهور النص بوساطة miRNA تغيير مستويات نص الحالة المستقرة ، وبالتالي ربط المتغيرات الجينومية بالسمات المعقدة

للتوسع في مثال DHFR ، أجرينا تحليلات حسابية وتجريبية لتحديد أحداث edQTL إضافية خاصة بالأنسجة: تفاعلات موقع edQTL بوساطة تفاعلات edQTL-miRNA المباشرة. من خلال الاستفادة من مجموعة بيانات edQTL الشاملة متعددة الأنسجة ، تمكنا من (1) تحديد أحداث edQTL الخاصة بالأنسجة: eQTL ، (2) نسب بعض أحداث الترابط الخاصة بالأنسجة إلى مستويات miRNA الخاصة بالأنسجة ، و (3) تأكيد تجريبياً تنظيم miRNA-mRNA الخاص بالتحرير باستخدام فحوصات مراسل لوسيفيراز 3′-UTR. توضح هذه النتائج أن مثال DHFR يعمم على الجينات الأخرى ومواقع تحرير الحمض النووي الريبي.

يجب أن نلاحظ أنه من المتوقع أن تكون قائمة أحداث edQTL التي قد تولد أحداث eQTL أكبر بكثير من الأحداث المرشحة المحددة في الشكل 7. وفي تحليلنا ، من أجل الصقل في miRNAs المحتملة من الناحية الحسابية ، استخدمنا معايير صارمة لتحديد الأنسجة - EDQTL محدد: تحديد موقع eQTL ومطابقة هذه الإشارات مع miRNAs الخاصة بالأنسجة المحددة من بيانات GTEx. نتوقع أن العديد من miRNAs يمكنها أيضًا إنشاء eQTLs من edQTLs بطريقة غير خاصة بالأنسجة ، على الرغم من صعوبة التعرف على هؤلاء المرشحين من الناحية الحسابية. في الواقع ، لا يمكن تحديد مثال DHFR باستخدام الإستراتيجية الحسابية والمعايير الصارمة الموضحة في الشكل 7 ، لأن جميع الأنسجة الثلاثة ذات إشارات edQTL المهمة لها إشارات eQTL عالية أو متوسطة.

ركزت دراستنا على miRNAs كمنظمين متعددي المفعول يولد eQTLs من edQTL ، ومع ذلك ، نتوقع أن يحدث سيناريو مشابه لبروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RNA) التي تنظم استقرار الحمض النووي الريبي (RNA) عبر تفاعلات البروتين مع الحمض النووي الريبي (RNA) الخاصة بالتسلسل. في الواقع ، تحتوي 14٪ من مواقع edQTL (443 من 3117) على نسيج واحد على الأقل تتجمع فيه إشارة edQTL مع إشارة eQTL ، مما يشير إلى أن منظمًا عبر المفعول (بروتين ربط miRNA أو RNA) قد يغير استقرار RNA في بطريقة خاصة بالتحرير. من الناحية النظرية ، يمكن أن يؤدي التحكم في استقرار النص الخاص بالتحرير بواسطة بروتينات ربط الحمض النووي الريبي أيضًا إلى إنشاء eQTL من edQTL موجود. لقد ثبت أن ELAV1 / HuR يعمل على تثبيت النسخة المحررة من نصوص CTSS [51]. إذا ربطت ELAV1 / HuR بشكل تفضيلي النسخة المحررة أو غير المحررة من موقع edQTL واستقرت عليه ، يجب أن تظهر إشارة eQTL. بشكل جماعي ، تكشف دراستنا أن تحرير الحمض النووي الريبي يكمن وراء آلية غير معترف بها سابقًا لتوليد eQTLs في النسخ البشرية ، ونحن نقدم أدلة حسابية وتجريبية لدور miRNAs في إنشاء eQTLs من edQTLs.

يوسع هذا العمل المعرفة السابقة حول أحداث تحرير الحمض النووي الريبي الخاضعة للتنظيم الوراثي بعدة طرق رئيسية. قامت الدراسات السابقة بمسح أحداث تحرير الحمض النووي الريبي المنظمة وراثيًا عبر عدد محدود من أنواع الخلايا والأنسجة. في عملنا السابق [27] ، استخدمنا بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي لخطوط الخلايا الأرومية اللمفاوية لإيجاد ارتباطات بين الاختلاف الجيني ومستويات تحرير الحمض النووي الريبي. لقد وجدنا دليلاً يدعم نموذجًا أن التباين الجيني لرابطة الدول المستقلة يعدل مستويات تحرير الحمض النووي الريبي من خلال التأثير على البنية الثانوية للحمض النووي الريبي. علاوة على ذلك ، وجدنا أن بعض أحداث تحرير الحمض النووي الريبي الخاضعة للتنظيم الوراثي ترتبط أيضًا بإشارات GWAS ، مما يشير إلى عواقب النمط الظاهري المحتملة لتباين تحرير الحمض النووي الريبي على السمات والأمراض المعقدة. ومع ذلك ، في وقت الدراسة ، لم نتمكن من تقديم أدلة أو اقتراح آليات جزيئية ملموسة تؤثر من خلالها أحداث تحرير الحمض النووي الريبي المنظمة وراثيًا على منتجات الجينات والأنماط الظاهرية. استخدم فرانزين وزملاؤه بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من دراسة ستوكهولم-تارتو لتصلب الشرايين العكسي لشبكة هندسة الشبكة (STARNET) لتحديد أحداث تحرير الحمض النووي الريبي المنظمة وراثيًا داخل الأفراد المصابين بمرض الشريان التاجي عبر سبعة أنسجة وخطين خلويين [47]. وبالمثل ، قام اتحاد CommonMind بتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المأخوذة من أفراد مصابين بالفصام عبر منطقتين من مناطق الدماغ لتحديد أحداث تحرير الحمض النووي الريبي المنظمة وراثيًا والمرتبطة بالفصام [48]. في هذا العمل ، قمنا بتحليل بيانات RNA-seq على نطاق السكان من 7989 عينة عبر 49 أنسجة لتوسيع بشكل كبير كتالوج أحداث تحرير RNA المنظمة وراثياً في النسخ البشرية. باستخدام مجموعة البيانات الشاملة المكونة من 49 نسيجًا ، تمكنا من تحديد edQTLs الخاصة بالأنسجة وإسناد خصوصية الأنسجة الملحوظة إلى مستويات التعبير الخاصة بالأنسجة لإنزيمات تحرير الحمض النووي الريبي (ADAR و ADARB1). للتحقيق في التفاعل بين تباين تحرير الحمض النووي الريبي وتباين التعبير الجيني ، أجرينا تحليلًا مشتركًا لإشارات edQTL و eQTL ووجدنا دليلًا على أن المتغيرات الجينية رابطة الدول المستقلة يمكن أن تؤثر سببيًا على مستويات تحرير الحمض النووي الريبي ومستويات التعبير الجيني في وقت واحد. أخيرًا ، من خلال الجمع بين التحليل الحسابي والتحقق التجريبي ، وجدنا دليلًا على أن miRNAs يمكن أن تولد إشارة eQTL من موقع edQTL ، عبر تدهور النسخ بوساطة miRNA بطريقة خاصة بالتحرير (الشكلان 7 و 8). مجتمعة ، تعمل هذه النتائج على تعزيز فهمنا المفاهيمي للنتائج الوظيفية لتحرير RNA وتقترح أن تقلب تحرير RNA يمكن أن يؤثر على السمات والأمراض المعقدة عن طريق تغيير الاستقرار ومستوى الحالة المستقرة لجزيئات الحمض النووي الريبي الحرجة.


نتائج ومناقشة

مع زيادة معدل الإصابة بالربو والسمنة المرضية ، فإن تحديد الآليات التي تؤثر بها السمنة على الربو أمر بالغ الأهمية. أفادت مجموعتنا أن الخلايا الشحمية الحشوية البدينة تفرز exosomes تحتوي على جزيئات الحمض النووي الريبوزي (miRNA) التي يمكنها أن تزيد من تنظيم التعبير عن جينات الإشارات الاحترافية في الرئة [24]. كانت الخطوة التالية المهمة في تحليلاتنا هي تحديد مجموعة استجابات الرنا المرسال للرئة لهذه الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الشحمية. كان من الممكن أن تتضمن الأساليب القياسية السابقة إنشاء قائمة من mRNAs المستهدفة المحتملة وتحديد أولوياتها للتحقق من صحتها. قدمت لنا miRTarVis فرصة جديدة لتحديد مجموعة التحقق من صحة الهدف من mRNAs بشكل موضوعي باستخدام تحليلات متعددة في silico.


لماذا أهمية isomiRs في العينات المخصبة بالمركبات الكهربائية؟

نظرًا لأن قطر المركبات الكهربائية يقل عادةً عن 1 ميكرومتر ، فإن حمولتها القصوى تكون في حدها الأدنى. Exosomes ، على سبيل المثال ، تتراوح في

قطرها 30-120 نانومتر ، لذلك يمكن فقط تجميع عدد قليل من جزيئات الرنا الميكروي في جسيم واحد. في طريقة العرض هذه ، قد لا تتوافق جميعها مع نفس اسم microRNA ، ولكن معظمها قد يكون فارغًا من microRNA. المتوسط ​​المقدر لعدد جزيئات الرنا الميكروي لكل جسيم حويصلة في نطاق حجم الإكسوسومات هو 1: 100 [[15]]. في مثل هذه الندرة ، ليس من المستغرب أن يكون RT-qPCR هو النظام الأساسي المفضل للتحقق من صحة الكشف عن microRNAs المحمولة بالكهرباء - فقد تم إثبات أنه يمكن اكتشاف ما يصل إلى 10 جزيئات لكل عينة باستخدام هذه المنصة [[68]]. بشكل ملحوظ ، بالنسبة لتجارب الحمض النووي الريبي المتسلسل ، يجب أن تكون كمية المواد الأولية أعلى بكثير (1-5 نانوغرام من الحمض النووي الريبي الصغير المخصب). يمكن استخدام كميات أقل لبناء المكتبة ، ولكن يجب تخطي اختبارات الجودة وقياسات التركيز. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة لدورات تضخيم PCR أعلى أثناء إنشاء المكتبة ، ولكن من المعروف أن هذا ينشأ تحيزات تضخيم حادة [[5] ، [64] ، [69]].

على الرغم من النقص الحالي في التسميات التي تصف بدقة طبيعة كل فئة من الحويصلات الحاملة للـ microRNA [[6] ، [70]] ، فإن نسب isomiRs المكتشفة في الخلايا الأبوية المستزرعة يتم إعادة تلخيصها عمومًا في العينات المخصبة بالمركبات الكهربائية. ومع ذلك ، فقد ذكرت دراسات قليلة أنه قد يتم إثراء isomiRs معينة في EVs مقارنة بالخلايا الأبوية ، مما يشير إلى أن نسبة EV / الخلية الأبوية قد تختلف في ظل ظروف معينة. كوبرز لاليك وآخرون. ذكرت أن 3′-NTAs (أي 3′-uridylated isoforms) ممثلة بشكل مفرط في ذخيرة microRNAs من exosomes مقارنة بخلايا B الأبوية (التي هي بالأحرى 3′-adenylated) [[71]] نفس المجموعة لاحقًا لاحظ هذا في عينات البول المخصب EV من مرضى سرطان البروستاتا [[72]]. لي وآخرون. أبلغت عن تخصيب في الأشكال الإسوية 3′-uridylated لـ miR-214-3p في EVs ناقضات العظم [[73]]. في حين أن مثل NTA 3′-uridylation لم يتم ملاحظته في الخلايا الكبدية [[74]] ، فقد أبلغت دراسات أخرى عن وجود اختلافات في مواضع نوكليوتيد معينة داخل الرنا الميكروي في العينات المخصبة بـ EV [[75] - [78]] ، مما يدعم فكرة أن التسلسل قد يؤثر عدم التجانس على تعبئة جزيئات جزيئية محددة في EVs ، أو أيضًا تعزيز الاحتفاظ الخلوي بها [[67]]. مطلوب مزيد من البحث لتوضيح الشروط التي قد تعزز ارتباط isomiR محدد مع EVs.

نلاحظ أن التغييرات المتكافئة التي لوحظت بالنسبة إلى isomiRs محددة في عينات EV المخصبة المذكورة أعلاه حيث يمكن تمييزها فقط بعد تحليلات المعلومات الحيوية لبيانات sRNA-seq ، مثل تلك الخاصة بـ Nejad وآخرون. وبيلمان وآخرون. المشار إليها في وقت سابق. نظرًا لأنه من غير الواضح في هذه المرحلة مستوى الحساسية الذي تميز فيه المصفوفات الدقيقة أو مجسات RT-qPCR بين isomiRs الفردية ، فقد يتم تجاهل الرؤى المهمة عن غير قصد في الأدبيات ، وهو الموقف الذي قد يزداد سوءًا بالنسبة للعينات ذات الكميات الدقيقة من الحمض النووي الريبي الصغير.


خلفية

قبل عقدين من الزمن ، أدت إثباتات اكتشاف الرنا الميكروي (ميرنا) إلى ساحة جديدة في البيولوجيا الجزيئية. في البشر ، تم اكتشاف أكثر من 2000 miRNAs وهي تنظم أكثر من 25٪ من الجينات. غالبًا ما تكون مرتبطة جيدًا بأمراض مختلفة ، وبالتالي فهي مفيدة للتشخيص [1]. إن الجزيئات المجهرية ، الرنا غير المشفر ، قصيرة الطول بما يقرب من اثنين وعشرين نيوكليوتيد. توجد في حقيقيات النوى وهي جزء من جميع المسارات في نظامنا البيولوجي [2]. يتحكم في العملية الخلوية مثل دورة الخلية والالتهاب وتمايز الخلايا وموت الخلايا ، من خلال تثبيط استقرار mRNAs وترجمتها. ومن ثم ، فإن هذه الجزيئات الدقيقة أمر لا مفر منه في جميع العمليات البيولوجية والإشارات في الخلية. غالبًا ما يؤدي خلل التنظيم إلى نشأة السرطان [3].

تم اكتشاف أول ميرنا في عام 1993 وكان نتيجة دراستين مختلفتين ذكرت أن Lin-4 هو RNA صغير غير مشفر من Ceanorhabditis ايليجانس الجين غير المتجانسة lin-4 [4]. في ذلك الوقت ، تم اعتبار هذا الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر كأداة محددة تستخدمها الديدان لإدارة تعبيراتها الجينية غير المتجانسة. بعد 7 سنوات ، راينهارت وآخرون. [5] ncRNAs صغيرة أخرى في ج.أناقة يمثل Let-7 ، الجين غير المتجانسة. لقد بدأوا مع lin-4 RNA سلسلة من تنظيم الجينات غير المتجانسة عبر تفاعل RNA-RNA في منطقة 3 ′ غير متداخلة من الهدف الجيني [5]. إنه يؤدي إلى تتبع ncRNA الصغير الآخر وكشف النقاب عن وجود ncRNAs في الكائنات الحية المختلفة التي تلعب فيها كعنصر تحكم تنظيمي محتمل ثم سميت باسم microRNAs [6،7،8]. في وقت لاحق تم التعرف على أنهم جميعًا يعيشون في النباتات والحيوانات ، والآن كشفت قاعدة بيانات ميرنا عن إجمالي 2042 و 1281 من الحمض النووي الريبي الناضج في الإنسان والفأر على التوالي [9]. في الثدييات ، جينات miRNAs لها نظير ، أي أشكال إسوية مختلفة بينما يتم حفظها جيدًا في الحيوانات. كانت هناك 8 أشكال متساوية موجودة في 11 موقعًا جينوميًا. ومن المثير للاهتمام ، في C. ايليجانس تم العثور على ما يقرب من 55 ٪ من miRNAs مشابهة للبشر. تشغل غالبية جين ميرنا مناطق بعيدة عن الجين المشروح غالبًا بسبب وحدة نسخ واحدة. يتم تجميع أكثر من 50 ٪ من جينات ميرنا ويتم نسخها عادةً على أنها نسخة من الحمض النووي الريبي متعدد الأطوار. في الحيوانات ، يشكل جزيءًا منظمًا للجينات وله تأثير على التعبير الجيني ، وبالتالي يمارس دورًا فريدًا في النمط الظاهري للمرض في السرطان [3]. في السرطان ، تلعب ميرنا دورًا في بدء المرض ، وحركة الخلية من موقع المنشأ ، والتنبؤ بالمرض والاستجابة له أثناء العلاج [10].


نتائج

التحقق من صحة RISCtrap الفحص.

أنشأنا في البداية واختبرنا الإصدارات السلبية السائدة لجميع نظائر GW182 البشرية الثلاثة - hTNRC6A 1-1213 ، و hTNRC6B 1-1223 ، و hTNRC6C 1-1215 - ووجدنا أن كل منها يتصرف بشكل مشابه بطريقة تعتمد على الجرعة ومهيمنة مع عدم وجود تأثيرات مضافة . في النهاية ، تم اختيار hTNRC6A 1-1213 (dnGW182) للاستخدام اللاحق. بدون مجال إسكات الطرفي C الخاص به ، تم التفكير في أن hTNRC6A 1-1213 تعمل كسلبية سائدة من خلال ربط Argonaute ولكن غير قادر على تجنيد المؤثرات الضرورية لإسكات النسخ وزعزعة الاستقرار (11 ، 13 ، 15 ، 24 ، 27).

لتأكيد أن dnGW182 مدمج بشكل صحيح في RISC ، قمنا بفحص قدرته على الارتباط بوحدات RISC الفرعية الأخرى ، وخاصة بروتينات Argonaute المتكاملة. تم تحصين العلم- dnGW182 من خلايا HEK293T وتم اختبار البروتينات المرتبطة بها بواسطة لطخة غربية (الشكل 1).أ). تم الكشف عن تفاعل محدد مع كل من بروتينات الأرجونوت الذاتية 1 و 2 (Ago1 و Ago2 ، الشكل 1).أ) ، مما يشير إلى أن نهج RISCtrap يمكنه التقاط أهداف من هذه الإصدارات المختلفة من RISC (41 ⇓ –43). علاوة على ذلك ، يرتبط dnGW182 بـ Ago2 بكفاءات مماثلة في وجود جزيئات microRNAs مختلفة (الشكل 1).ب).

microRNA targets were stabilized by dnGW182, facilitating their enrichment by immunoprecipitation. (أ و ب) Flag–dnGW182 associated with endogenous Argonaute family members, and this association was similar with different microRNAs. Flag–PTBP2 is an unrelated control. (ج, العلوي) Schematic of the cassette encoding synthetic targets to monitor miR-132–RISC. (أدنى) Relative abundance of transcripts in the presence of miR-132 and dnGW182, assessed by qPCR (2 -∆Ct , normalized to Gapdh). (د) Ratiometic analysis using flow cytometry revealed that dnGW182 stabilized GFP target transcripts and increased expression in individual cells. (ه) Endogenous miR-124 targets (Plod3, Vamp3, and Ctdsp1) were specifically copurified with Flag–dnGW182 and miR-124. Similarly, the mRNA for GFP–132MRE was specifically enriched with Flag–dnGW182 in the miR-132 IP condition. In contrast, transcripts for negative control DsRed (Red) were not enriched. qPCR was used to analyze relative enrichment and abundance of transcripts in both IP and input samples, normalized to Gapdh.

We next tested the ability of dnGW182 to stabilize synthetic transcripts that represented ideal positive and negative control targets for miR-132. A stable HEK293T cell line was created that constitutively expressed two synthetic transcripts cotranscribed from a bidirectional promoter (Fig. 1ج). As the positive control target for miR-132, one transcript encoded green fluorescent protein (GFP) with three reiterated bulged MREs in its 3′ untranslated region (3′UTR). The other transcript encoded DsRedExpress1 but lacked any MREs in its 3′UTR. Coexpression of these two transcripts allowed the use of quantitative measurements, such as flow cytometry analysis, to obtain ratiometric values in individual cells that reflected miR-132 activity (44). Expression of miR-132 decreased levels of the GFP transcript compared with a scrambled microRNA (miR-Scrm), without changing the abundance of the red transcript (Fig. 1ج). Introduction of dnGW182 stabilized the GFP transcript in the presence of miR-132. We also observed an increase in basal GFP transcript levels upon addition of dnGW182, likely due to a block of endogenous miR-132 activity in these cells (Fig. S1). To confirm that the stabilized GFP transcript correlated with increased GFP expression in individual cells, we analyzed 10,000 cells from each condition with flow cytometry and plotted the cumulative frequency of the green/red ratio (Fig. 1د). Ectopic expression of miR-132 caused a leftward shift of the plot compared with miR-Scrm, representing a decrease of green fluorescence compared with red. Introduction of dnGW182 partially rescued the ratio to control levels. Together, the data demonstrated that dnGW182 could stabilize targeted transcripts.

To determine whether dnGW182 could facilitate the enrichment of targets, we expressed Flag–dnGW182 with either miR-132 or miR-124 in the cell line that constitutively expressed GFP–132MRE and red transcripts. Following a Flag immunoprecipitation (IP), co-enriched mRNAs were examined with qPCR. We observed a robust enrichment of GFP transcript specifically in the miR-132 IP sample and not in the miR-124 IP sample (Fig. 1ه). Moreover, we saw a specific enrichment of previously reported endogenous miR-124 targets in the miR-124 IP sample. The red and Gapdh transcripts, neither of which were expected to be targets of either microRNA, were not enriched in either miR-132 or miR-124 IP conditions. Most notably, the fold enrichment we observed using RISCtrap was easily discernible over background by simply comparing the IP samples without having to normalize to input levels or identify canonical MREs.

Unbiased Screen for miR-124, miR-132, and miR-181 Targets.

To develop the RISCtrap assay into an unbiased screen for targets, we coupled it with deep sequencing (Fig. 2). The screen was performed as biological triplicates in HEK293T cells. We hypothesized that this cell line expressed many neuronal microRNA targets (45, 46). Illumina TruSeq libraries were prepared from enriched mRNAs and sequenced using a HiSeq v3 platform. We obtained ∼40–50 million reads per sample on average, 75% uniquely mapped to the RefSeq annotation and >90% of those to exonic regions (Fig. S2). Our RISCtrap datasets were composed of unique and variably sized datasets, so we developed a normalization strategy that would ensure retention of these distinct properties that likely reflected the specific targeting of each miRNA, while still allowing application of statistical methods for cross-comparison of current and future datasets (Figs. S3–S5 and مواد وطرق SI). This would allow us to compare datasets from different experiments (i.e., replicates and different miRNAs) and even incorporate future RISCtrap datasets with previously obtained datasets. Significantly enriched transcripts for each microRNA were determined with pairwise comparisons among the triplicates using ANOVA (FDR < 0.15) and combined with an experimentally determined twofold enrichment cutoff. Our high confidence lists of targets for each miRNA (Dataset S1) were finalized by requiring more than one pairwise comparison indicating enrichment for the target (e.g., for miR-124: miR-124 vs. miR-181 and miR-124 vs. miR-132). Ultimately, some of the filtered candidates may be actual targets however, candidates that demonstrated enrichment in only a single pairwise comparison validated at ∼50%, which was not sufficiently rigorous for us to include in our high-confidence list but they are included in Dataset S2.

Use of RISCtrap as an unbiased screen for microRNA targets. This workflow depicts steps associated with the RISCtrap screen, including preparation of RISCtrap samples (اليسار) and our bioinformatic methodology to analyze differentially enriched targets (حق).

Among our high-confidence miRNA targets, we found many published and also unknown hits (Fig. 3). Overall, we obtained 281 miR-124 targets, 262 miR-181 targets, and 94 miR-132 targets. Analysis of miR-124 targets revealed substantial overlap between our dataset and previously published miR-124 datasets, despite the assays being performed in different cell types using different strategies. Comparison with related Ago2-immunoprecipitation approaches (9, 10) revealed 86 and 99 overlapping targets, respectively, and comparison with high-throughput sequencing (HITS)-CLIP biological complexity (BC) 4 (8) revealed 53. The latter is particularly notable considering that the HITS-CLIP dataset was obtained from murine brain. Moreover, many targets also overlapped with microarray (6) and proteomic datasets (2) from HeLa cells (45 and 64 targets, respectively). This further supported the ability of RISCtrap to enrich targets that are actively down-regulated. Of particular interest was our miR-181 dataset in which we observed that almost half of the targets (125/262) were C2H2 class zinc-finger proteins. Moreover, 95 of these 125 targets shared the specific domain architecture of having an N-terminal KRAB domain followed by multiple tandem C2H2 motifs. Data from several recent papers using microarray and luciferase assays to study miR-181 similarly reported the regulation of this unusual cohort of targets (2, 38, 40).

RISCtrap screens in HEK293T cells for miR-124, mir-132, and miR-181 identified known and unique targets. All targets identified from the RISCtrap screens with miR-124, miR-132, and miR-181 are organized in a heatmap by biological replicates. (FDR < 0.15, fold enrichment ≥2.) Selected known miRNA targets are labeled and examples of previously unknown miR-132 targets are highlighted in yellow.

Examination of the target datasets revealed several interesting features (Fig. 3). First, grouping of targets by biological replicates produced an enrichment profile for each transcript that was extremely reproducible (Fig. S4) and the cohorts of candidate targets clearly segregated depending on the particular microRNA. Second, the number of targets for each microRNA depended on the identity of the microRNA, ranging from ∼100–300. Third, we found surprisingly minimal overlap among the target sets, suggesting that each miRNA may have its own characteristic set of targets (Fig. 3).

We selected candidate targets from the top, middle, and bottom of each microRNA target list, sorted by fold enrichment—representing highly, moderately, and modestly enriched candidates—for validation of binding using qPCR from an independent RISCtrap experiment (Fig. 4). Overall, we examined 149 targets and the validation rate was 96%, i.e., 143 targets ≥twofold enrichment. In particular, the observed fold enrichment of a target correlated with that detected by the RISCtrap screens (note different scales of the ذ axes). Analysis of RISCtrap miR-124 candidate targets with available microarray data from HeLa cells (6) suggested a trend where fold enrichment generally correlated with fold repression however, it was not statistically significant. Importantly, we additionally examined three transcripts that did not enrich in any of our RISCtrap screens to test as negative controls, Gapdh, Asp-His-His-Cys (DHHC)9, and DHHC17 none of these transcripts showed any enrichment in the miR-181, mir-124, or miR-132 RISCtrap screens (Fig. 4).

Validation of identified candidate targets confirmed microRNA-specific enrichment. Approximately 150 candidate targets from the three microRNA RISCtrap screens—representing candidates that were classified as highly enriched (أ), moderately enriched (ب), and modestly enriched (ج)—were tested in an independent experiment for their copurification with RISCtrap using qPCR. Overall validation rate was 96%. Also included were three negative controls GAPDH, DHHC9, and DHHC17 (orange box). ص axes represent relative fold enrichment.

Characterization of MREs.

Using directed searches, we examined whether the target datasets obtained by RISCtrap contained expected microRNA binding motifs. Both canonical MREs and the recently described pivot or hinged MREs were examined (47). Approximately 90% of all targets contained an MRE corresponding to the targeting microRNA: 91.5% of miR-124 targets, 87.2% of miR-132 targets, and 92.4% miR-181 targets (Fig. 5أ). The majority of targets contained at least an 8-mer, 7-mer-m8, or 7mer-a1 type motifs fewer had only a 6-mer or pivot MRE (7% miR-124, 20% miR-132, and 2% miR-181). Moreover, the frequency of 7mer-m8 motifs among nontargeted transcript pools was low, suggesting that the appropriate MRE motifs were specifically enriched among targeted transcripts. Appropriately, we also found that 82% of targets predicted to be coregulated by at least two miRNAs examined here contained MRE motifs for both microRNAs (Fig. S6أ). We next examined the distribution of canonical 7mer-m8 sites among the miR-124 and miR-132 targets and discovered that the majority of MREs (60–80%) were located in the 3′UTR, with ∼20–30% in ORFs (Fig. 5ب). In these cases, the relative position of MRE motifs along 3′UTRs appeared evenly dispersed (Fig. S6ب). Conversely, the majority of miR-181 targets contained MREs in the ORFs and, in agreement with previously published reports, were specifically encoded within the C2H2 motif repeats (38, 40). Targets of miR-124 and miR-132 averaged ∼1 MRE per target in contrast, miR-181 targets averaged 5.5 MREs per target (Fig. 5ج). Lastly, we performed de novo multiple expectation maximization for motif elicitation (MEME) analyses to identify overly represented sequences. This identified motifs that corresponded to canonical MREs for both miR-124 and miR-181 in the 3′UTRs of their respective targets, as well as many more in the ORFs of miR-181 targets (Fig. 5د). We did not identify the miR-132 motif with our de novo analysis, despite its high representation when performing a directed search. Most likely, this is due to a relatively higher reliance on 6-mer motifs compared with miR-124 and miR-181 (Fig. 5أ) and this shorter motif is not easily distinguished by de novo analysis.

Identification of microRNA recognition element (MRE) motifs enriched among RISCtrap targets. (أ) Percentages of transcripts in each dataset were classified by inclusion of at least 1 MRE motif and distribution of motif types. Each transcript is counted only once and classified according to inclusion of the following motifs in this order: 8-mer > 7mer-m8 > 7mer-a1 > 6-mer > pivot. (ب) Distribution of candidate MREs is shown for each microRNA target dataset, based on its position in the target’s 5′UTR, ORF, or 3′UTR. (ج) The mean number of 7mer-m8 MRE motifs per target is depicted for each microRNA dataset. (د) De novo MEME analysis using all targets from the miR-124 and miR-181 target datasets revealed canonical MRE motifs in the 3′UTR of miR-124 targets (296 motifs, ص = 2.6 × 10 −108 ), in the 3′UTR of miR-181 targets (151 motifs, ص = 1.3 × 10 −54 ), and in the ORF of miR-181 targets (1,000 motifs, ص = 9.4 × 10 −1488 )

Identification of Previously Unrecognized miR-132 Targets, CRK and TJAP1.

RISCtrap identified many previously known targets. However, our datasets also identified previously unrecognized targets, many of which exhibited fold enrichments exceeding those of known targets. We selected two putative miR-132 targets, CRK and TJAP1, for further investigation. CRK is an adaptor protein for receptor tyrosine kinases and TJAP1 associates with tight junctions. Both candidates validated for specific enrichment in the miR-132 RISCtrap screen (Fig. 4) and available microarray data indicated that both were expressed at high levels in brain (48, 49). Moreover, each has a well-conserved MRE site in their 3′UTR (Fig. 6أ). Incorporation of the 3′UTR sequence for either CRK or TJAP1 downstream of renilla luciferase in a dual luciferase assay conferred miR-132 regulation (WT) and mutation of the putative MRE (mut) caused it to be refractory to this regulation (Fig. 6أ). We next asked whether these targets were stabilized in a miR-132 knockout mouse model. Examination of endogenous protein from whole cell lysates from the forebrain of litter-matched male siblings revealed an accumulation of CRK and TJAP1 in the miR-132 knockout animal (Fig. 6ب). The abundance of negative controls DHHC9 (Fig. 4), α-tubulin, and Gapdh remained equivalent between wild-type and knockout samples. These data demonstrated that RISCtrap analysis of a nonneuronal cell type can identify previously unrecognized targets that are functionally regulated in the brain.

Two previously unknown miR-132 targets are regulated by miR-132 in mouse brain. (أ) Conserved miR-132 MRE sequences were identified in the 3′UTR of both unique candidate targets CRK and TJAP1 (قمة). Luciferase assays in HEK293T cells demonstrated that each of their 3′UTR sequences conferred regulation by miR-132. Mutation of the predicted MRE (mutated sequences are bold and underlined) blocked miR-132 regulation. (ب) Whole cell lysates from forebrains of litter-matched siblings of miR-132( +/+ ) and miR-132( −/− ) mice were probed for endogenous protein levels of previously unknown targets, CRK (isoforms I and II) and TJAP1, as well as known target Hb-EGF, and negative controls DHHC9, α-tubulin, and GAPDH.


Conception and design: I.J. Goossens-Beumer, C.J.H. van de Velde, P.J.K. Kuppen

Development of methodology: I.J. Goossens-Beumer, R.S. Derr, H.P.J. Buermans, P.J.K. Kuppen

Acquisition of data (provided animals, acquired and managed patients, provided facilities, etc.): I.J. Goossens-Beumer, R.S. Derr, H.P.J. Buermans, H. Morreau, U. Nitsche, K.-P. Janssen, C.J.H. van de Velde, P.J.K. Kuppen

Analysis and interpretation of data (e.g., statistical analysis, biostatistics, computational analysis): I.J. Goossens-Beumer, H.P.J. Buermans, J. Goeman, S. Böhringer, U. Nitsche

Writing, review, and/or revision of the manuscript: I.J. Goossens-Beumer, R.S. Derr, H.P.J. Buermans, S. Böhringer, H. Morreau, U. Nitsche, K.-P. Janssen, C.J.H. van de Velde, P.J.K. Kuppen

Administrative, technical, or material support (i.e., reporting or organizing data, constructing databases): I.J. Goossens-Beumer, H. Morreau, P.J.K. Kuppen

Study supervision: C.J.H. van de Velde, P.J.K. Kuppen


شاهد الفيديو: Wim Helsen - Engelse uitdrukkingen (يونيو 2022).