معلومة

العلاقة بين الاستجابة المناعية للحلمات المحددة للجلوتين واختبار الأجسام المضادة السريرية

العلاقة بين الاستجابة المناعية للحلمات المحددة للجلوتين واختبار الأجسام المضادة السريرية


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

من المفهوم أن الداء البطني هو استجابة مناعية لبعض البروتينات التي تحدث في مجموعة من الحبوب. الأكثر شيوعًا هم الجلوتينات (القمح) والسيكالين (الجاودار) وهوردين (الشعير). يفحص اختبار سريري لمرض الاضطرابات الهضمية مستويات مصل اثنين من الأجسام المضادة المحددة: ببتيد جليادين المخفف Ab IgG و Tissue Transglutaminase Ab IgA.

هل من الممكن إجراء اختبار إيجابي للأجسام المضادة المذكورة أعلاه بينما تكون حساسة (تثير الاستجابة المناعية) فقط للحشود؟

هناك مكونان لهذا السؤال:

  • هل يمكن أن يكون الشخص حساسًا تجاه العشائر بينما لا يتأثر بجلوتين القمح أو الجاودار (سيكالين)؟
  • هل سيؤدي الاختبار أعلاه إلى نتيجة إيجابية عند إعطاء الأجسام المضادة الخاصة بالهلدين فقط؟ بمعنى آخر ، هل الاختبار خاص بالأجسام المضادة لغلوتين القمح أم أن الأجسام المضادة لأي حاتمة جلوتين تعطي نتيجة إيجابية؟

السبب وراء هذا السؤال في تاريخ حالة قصير:

  • يعاني البالغون البالغون من أعراض خفيفة / متقطعة من القولون العصبي ، تمتد بداية غامضة إلى الوراء عدة سنوات. تضمن النظام الغذائي بشكل خاص الاستهلاك المنتظم / اليومي لمنتجات القمح / الجاودار بالإضافة إلى الجعة (الشعير) المتقطع (2-3 / أسبوع).
  • الفحص السريري الأخير للاضطراب الزلاقي (مستويات المصل من ببتيد جليادين المبلل Ab IgG والأنسجة Transglutaminase Ab IgA) الذي تم إجراؤه للتحقيق في سبب هشاشة العظام المشتبه به ؛ تم تقييم كل من مستويات الجسم المضاد على أنها إيجابية.
  • يبدو أن الأعراض خفت في غضون أسبوع تقريبًا بعد التغيير الغذائي الأولي بنجاح لإزالة جلوتين الشعير فقط (البيرة) ، بينما استمر الاستهلاك المنتظم للقمح / الجاودار.

تشير الملاحظات إلى استجابة محددة للشعير فقط ، وتثير التساؤل حول خصوصية اختبار الأجسام المضادة السريرية.


1) هل يمكن أن يكون الشخص حساسًا تجاه جحافل الشعير ، بينما لا يتأثر بجلوتين القمح أو الجاودار؟

ربما ، لكني لم أجد حالة موثقة.

حسب ما هو الغلوتين؟ (مجلة أمراض الجهاز الهضمي والكبد ، 2017):

تم تحديد مجموعة متنوعة من التسلسلات من α و و ω gliadins ، وكذلك من الغلوتينين ، لتنشيط مرض الاضطرابات الهضمية. ومع ذلك ، من المتوقع أن تكون عدة مئات من ببتيدات الغلوتين مولدة للمناعة وتؤدي إلى استجابة الخلية التائية. تم تأكيد الببتيدات المشتقة من الهوردين. بالإضافة إلى ذلك ، يوجد داخل كل حبة تسلسل هرمي متميز لببتيدات الغلوتين المحفزة للمناعة من بين جميع الببتيدات المعروفة لتحفيز استجابة الخلايا التائية في مرض الاضطرابات الهضمية ، قد يتفاعل المريض مع عدد قليل فقط.

ومع ذلك ، وفقًا لمرض الاضطرابات الهضمية: دراسات المناعة من الببتيدات المشتقة من الشعير والجاودار سيكالين (المجلة الدولية لعلم الأمراض التجريبي ، 2016):

في الختام ، يبدو أن شعير الشعير والجاودار سيكالين يحتويان على حواتم سامة للقرص المضغوط توجد في جلوتين القمح ، كما يتضح من الملحوظة عبر ‐ التفاعلية من خطوط الخلايا التائية المعوية الدقيقة الحساسة للغلوتين المستمدة من القرص المضغوط إلى جليادين القمح ، الشعير الشعير والببتيدات المشتقة من الجاودار سيكالين.

2) هل تحاليل الدم خاصة بالأجسام المضادة لغلوتين القمح؟

لا أستطيع أن أقول عن اختبار غليادين الببتيد Ab IgG المخفف ، لكن اختبار الأجسام المضادة لترانسجلوتاميناز الأنسجة IgA (مضاد tTG IgA) ليس خاصًا بجلوتين القمح ؛ يمكن تحفيز الأجسام المضادة عن طريق جليادين القمح ، وحشود الشعير ، وسيكالين الجاودار.

ترتبط ببتيدات الغلوتين (جليادين ، هوردين ، سيكالين) بترانسجلوتاميناز الأنسجة الذي يضعفها. الأفراد المصابون بمرض الاضطرابات الهضمية لديهم خلايا HLA DQ2 / DQ8 المتغصنة ، والتي تقدم الببتيدات المخففة للخلايا التائية ، والتي تحفز الخلايا البائية على إنتاج الأجسام المضادة ضد ترانسجلوتاميناز الأنسجة:

في القرص المضغوط ، يعمل نزع الغلوتين عن طريق ترانسجلوتاميناز الأنسجة (tTG) في صفيحة الأمعاء الدقيقة على تعزيز عرض ببتيدات الغلوتين (غليادين في القمح ، سيكالين في الجاودار والحوردين في الشعير) بواسطة HLA-DQ2 أو HLA-DQ8 الخلايا المتغصنة لخلايا CD4 + T المحلية المسببة للأمراض ... الاختبار المصلي الأكثر استخدامًا هو مكافحة tTG IgA (ميدسكيب)

3) هل يمكن أن يؤثر الشعير على الأمعاء بشكل مختلف عن القمح؟

ربما.

التغذية ومرض الاضطرابات الهضمية (العناصر الغذائية ، 2014):

هناك بيانات محدودة للغاية تبحث في تأثير الشعير أو الشعير سيكالين على نتائج القرص المضغوط في الأدبيات المنشورة (على سبيل المثال ، [66،67]) ، ولكن يوجد دليل على ذلك هذه البرولامينات تسبب تأثيرات مختلفة عن جلوتين القمح ، على الأقل على المستوى المناعي.

4) هل اختبار DGP و TTG الإيجابي يؤكدان مرض الاضطرابات الهضمية؟

تبلغ خصوصية ببتيد جليادين المنزوع الأمين IgG (DGP) 98٪ و IgA أنسجة ترانسجلوتاميناز (TTG) 95٪ (طبيب الأسرة الأمريكية ، 2014) ، لذلك عندما يكون كلا الاختبارين إيجابيين ، فمن المحتمل جدًا الإصابة بمرض الاضطرابات الهضمية. يتم التشخيص النهائي عن طريق الفحص النسيجي لعينة من الأنسجة المأخوذة عن طريق خزعة الاثني عشر.

5) هل من الممكن في مرض الاضطرابات الهضمية أن تختفي الأعراض بعد إزالة الجعة فقط ، ولكن ليس القمح والجاودار من النظام الغذائي؟

قد يكون من الممكن أن يتم تأكيد الإصابة بمرض الاضطرابات الهضمية عن طريق اختبارات الدم دون أي أعراض على الرغم من تناول القمح والشعير والجاودار. يمكن أن تثير البيرة الأعراض عن طريق تهيج الأمعاء ، ليس عن طريق الغلوتين ، ولكن عن طريق الكحول أو المواد الأخرى ، مثل الأشخاص الذين يعانون من متلازمة القولون العصبي (American Journal of Gastroenterology ، 2013).


الغولتين

يمكن تصنيع المنتجات الخالية من الغلوتين من الحبوب الطبيعية الخالية من الغلوتين مثل الذرة والأرز والذرة الرفيعة والدخن وكذلك الحبوب الكاذبة مثل الحنطة السوداء والقطيفة والكينوا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن جعل المواد الخام المحتوية على الغلوتين من القمح أو الجاودار أو الشعير خالية من الغلوتين من خلال معالجة متخصصة مثل الغسيل المكثف للنشا أو معالجة الببتيداز للمشروبات أو استخدام السلالات التي تعاني من نقص الغلوتين. لا يزال تحسين الخصائص التركيبية والنكهة ، خاصةً الخبز والبيرة ، يمثل تحديًا ، على الرغم من إحراز تقدم كبير أيضًا في تحسين القيمة الغذائية. وفقًا لمعيار الدستور الغذائي 118-1979 ، يجب ألا يتجاوز مستوى الغلوتين في المنتجات الخالية من الغلوتين 20 مجم / كجم. باستثناء أستراليا ونيوزيلندا ، فإن تشريعات الملصقات الغذائية في الاتحاد الأوروبي وكندا والولايات المتحدة تتبع إلى حد كبير الدستور الغذائي. رمز الحبوب المتقاطعة معترف به دوليًا لتحديد منتجات مرضى الداء البطني (CD). لضمان سلامة المنتجات الخالية من الغلوتين ، تم تطوير العديد من الطرق التحليلية لتحديد كمية الغلوتين. بعد الاستخراج المناسب لبروتينات الغلوتين من مصفوفة الغذاء ، تُستخدم مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) بناءً على أجسام مضادة محددة على نطاق واسع لتقدير الغلوتين. تعتبر الطرق غير المناعية الكيميائية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، كروماتوجرافيا العمود ، أو قياس الطيف الكتلي لببتيدات الغلوتين كواسمات محددة ، بدائل واعدة. ومع ذلك ، لا يزال التقدير الدقيق للجلوتين في مجموعة متنوعة من مصفوفات الطعام يمثل تحديًا بسبب تعقيد الغلوتين باعتباره التحليل المستهدف ، وهناك حاجة ماسة إلى مواد مرجعية مناسبة لمعايرة الطرق التحليلية.


مراجعة المادة

  • Grupo de Inmunolog & # x000EDa Celular e Inmunogen & # x000E9tica، Facultad de Medicina، Sede de Investigaci & # x000F3n Universitaria، Universidad de Antioquia، Medell & # x000EDn، Colombia

بدأ جائحة COVID-19 الحالي في ديسمبر 2019 في ووهان (الصين) وانتشر بسرعة ليصبح حالة طوارئ صحية واقتصادية عالمية. العامل المسبب للمرض هو فيروس كورونا SARS-CoV-2. يقدم COVID-19 مجموعة واسعة من المظاهر السريرية ، والتي تتراوح من عدوى بدون أعراض إلى التهاب رئوي حاد مصحوب بفشل متعدد الأنظمة يمكن أن يؤدي إلى وفاة المريض. من المعروف أن الاستجابة المناعية لـ SARS-CoV-2 تشمل جميع مكونات الجهاز المناعي التي تبدو معًا مسؤولة عن القضاء على الفيروس والتعافي من العدوى. ومع ذلك ، فإن مثل هذه الاستجابات المناعية متورطة في تطور المرض إلى عملية أكثر خطورة وقاتلة. تصف هذه المراجعة الجوانب العامة لكل من COVID-19 وعامله المسبب للمرض SARS-CoV-2 ، مع التأكيد على أوجه التشابه مع عدوى الفيروس التاجي الحادة الأخرى ، مثل السارس ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية ، ولكن الأهم من ذلك ، الإشارة إلى الأدلة التي تدعم الفرضية السريرية. طيف COVID-19 هو نتيجة الطيف المتغير المقابل للاستجابات المناعية للفيروس. يبدو أن النقطة الحرجة التي يترتب عليها تطور المرض تتمحور حول فقدان التنظيم المناعي بين الاستجابات الوقائية والمتغيرة بسبب تفاقم المكونات الالتهابية. أخيرًا ، يبدو أنه من الممكن تحديد بعض التحديات الرئيسية التي تستحق إجراء تحقيق شامل لفهم التسبب في المرض المناعي لـ COVID-19 ، وبالتالي المساعدة في تصميم استراتيجيات تشخيصية وعلاجية ووقائية أكثر فعالية.


مرض الاضطرابات الهضمية

تعريفات

تم استخدام العديد من تصنيفات القرص المضغوط في الماضي ، والأهم من ذلك مع التمييز بين القرص المضغوط المصحوب بأعراض ، وبدون أعراض ، والكامن والمحتمل. يتم مناقشة العروض التقديمية المعدية المعوية والأمعاء الأكثر شيوعًا في وقت لاحق. قرص مضغوط صامت يُعرّف بأنه وجود أجسام مضادة موجبة خاصة بالقرص المضغوط ونتائج HLA من النمط الفرداني وخزعة الأمعاء الدقيقة المتوافقة مع القرص المضغوط ، ولكن بدون أعراض وعلامات كافية لتبرير الاشتباه السريري في الإصابة بالقرص المضغوط. مع التعرف على أشكال القرص المضغوط التي تتميز باعتلال معوي منخفض الدرجة ، تم اقتراح مصطلحات أخرى. القرص المضغوط الكامن يعرّف حالة يكون فيها الأشخاص غير مصابين باعتلال معوي ولكن لديهم اعتلال معوي معتمد على الغلوتين في وقت ما خلال حياتهم [5]. قد يكون لدى المرضى أعراض وقد لا تظهر عليهم. قرص مضغوط محتمل يتم تعريفه من خلال وجود أجسام مضادة محددة للقرص المضغوط وأنماط HLA متوافقة ، ولكن مع عدم وجود تشوهات نسيجية في خزعات الاثني عشر [5]. قد يعاني المرضى أو لا تظهر عليهم أعراض وقد يصابون أو لا يصابون باعتلال معوي معتمد على الغلوتين في وقت لاحق. سيتم مناقشة هذا الشرط بالتفصيل في القسم التالي.

الملامح العامة

يحدث مرض الاضطرابات الهضمية عن طريق تناول جلوتين القمح وما يرتبط به من البرولامين من الجاودار والشعير [2]. أظهرت معظم الدراسات أن الشوفان ليس ضارًا ، ومع ذلك ، فإن عددًا قليلاً من المرضى لديهم خلايا تي المخاطية المتفاعلة مع البرولامين والتي يمكن أن تسبب التهاب الغشاء المخاطي [6]. يعد القرص المضغوط شائعًا نسبيًا (انتشار 1 ٪ لأمراض مثبتة بالخزعة) في السكان المنحدرين بشكل أساسي من أصل قوقازي [2]. قد تؤثر العوامل البيئية على مخاطر تطوير القرص المضغوط أو توقيت عرضه. قد تساهم أنماط التغذية في السنة الأولى من العمر [7] وربما العدوى الفيروسية [8] في تطور المرض.

تختلف السمات السريرية للقرص المضغوط بشكل كبير [2]. الأعراض المعوية شائعة خاصة عند الأطفال الذين تم تشخيصهم خلال العامين الأولين من فشل النمو في الحياة ، والإسهال المزمن والقيء وانتفاخ البطن وهزال العضلات وفقدان الشهية والتهيج موجودة في معظم الحالات. أكثر مظاهر الأمعاء شيوعًا للقرص المضغوط هو فقر الدم الناجم عن نقص الحديد الذي لا يستجيب للعلاج بالحديد. قد تكون هشاشة العظام موجودة. تشمل المظاهر الأخرى خارج الأمعاء قصر القامة ، واعتلال الغدد الصماء ، والتهاب المفاصل وآلام المفاصل ، والصرع مع التكلسات القذالية الثنائية ، واعتلال الأعصاب المحيطية ، واعتلال عضلة القلب ، وارتفاع مستويات الترانساميناز ، ونقص تنسج مينا الأسنان ، والتهاب الفم القلاعي ، والثعلبة. تظل الآليات المسؤولة عن شدة وتنوع العروض السريرية غامضة. تمت الدعوة إلى نقص التغذية أو استجابة مناعية مختلة (ربما المناعة الذاتية). يتم التعرف على القرص المضغوط الصامت بشكل متزايد ، خاصة في أقارب الدرجة الأولى بدون أعراض للمرضى الذين يعانون من القرص المضغوط الذي تم فحصه أثناء دراسات الفحص. تم العثور على بعض الأمراض ، والعديد من أمراض المناعة الذاتية ، بتردد أعلى من الطبيعي في المرضى الذين يعانون قرص مضغوط [2]. من بين هذه الحالات مرض السكري من النوع 1 ، وأمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية ، ومرض أديسون ، ومتلازمة سجوجرن ، والتهاب الأقنية الصفراوية المناعي الذاتي ، والتهاب الكبد المناعي الذاتي ، والتليف الصفراوي الأولي. تشمل الحالات الأخرى المصاحبة نقص IgA الانتقائي ومتلازمة داون ومتلازمة تيرنر ومتلازمة ويليامز.

الجوانب المناعية

يقترح الاستعداد الوراثي عن طريق التجميع العائلي للقرص المضغوط وأكثر من 70 ٪ من التوافق في التوائم أحادية الزيجوت. [9]. أكثر من 90٪ من المرضى الذين لديهم قرص مضغوط يعبرون عن HLA-DQ2.5 heterodimer ، وتقريباً جميع المرضى الآخرين يعبرون عن HLA-DQ8 [10]. على النقيض من ذلك ، فإن 30-40٪ فقط من مرضى الشواهد يعبرون عن جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية المرتبطة بالقرص المضغوط. القرص المضغوط هو اضطراب التهابي مزمن بوساطة الخلايا التائية مع أحد مكونات المناعة الذاتية (للمراجعة ، انظر [1 ، 2]). المعالجة المتغيرة عن طريق الإنزيمات داخل اللمعة ، والتغيرات في نفاذية الأمعاء وتفعيل آليات المناعة الفطرية تسبق تنشيط الاستجابة المناعية التكيفية. الحاتمات المناعية من الجليادين شديدة المقاومة للهضم داخل اللمعة والغشاء المخاطي غير الكامل ويفضل التأثيرات المناعية والسامة لهذه التسلسلات. بعض ببتيدات جليادين (p31–43) التي لا تتعرف عليها الخلايا التائية قادرة على تنشيط المناعة الفطرية في الخلايا العارضة للمستضد والخلايا الظهارية المعوية على وجه الخصوص ، فهي تحفز الإنترلوكين (IL) -15. يقوم البعض الآخر بتنشيط الخلايا التائية الصفيحية التي تقدمها جزيئات HLA-DQ2 أو DQ8 [11 ، 12]. تم العثور على استجابات الخلايا التائية الخاصة بـ Gliadin تتعزز بفعل TG الأنسجة [13 ، 14] يحول الإنزيم بقايا الجلوتامين المعينة إلى حمض الجلوتاميك ، مما يؤدي إلى تقارب أعلى لببتيدات الغليادين مع HLA-DQ2 أو DQ8. من الواضح أن نمط السيتوكينات التي تنتجها الخلايا التائية الخاصة بالجلوتين بعد تنشيط الغليادين يهيمن عليه الإنترفيرون (IFN) γ (Th1 منحرف) [15] و IL-21 [16]. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضًا إنتاج السيتوكينات الفطرية IFNα [17] و IL-15 [18] و IL-18 [19]. يحدث إعادة تشكيل معقدة للغشاء المخاطي في اتجاه مجرى تنشيط الخلايا التائية ، بما في ذلك مستويات متزايدة من البروتينات المعدنية وعوامل النمو ، مما يؤدي إلى "الغشاء المخاطي المسطح" الكلاسيكي للقرص المضغوط. زيادة كثافة الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة السامة للخلايا CD8 + هي السمة المميزة للقرص المضغوط [20]. يشارك IL-15 في التعبير عن المستقبلات القاتلة الطبيعية CD94 [21] و NKG2D [22 ، 23] ، وكذلك في التعبير الظهاري لجزيئات الإجهاد [24] ، وبالتالي تعزيز السمية الخلوية وموت الخلايا المبرمج وضمور الزغابات. التعبير الأكثر وضوحًا عن المناعة الذاتية هو وجود الأجسام المضادة في الدم للأنسجة TG [25]. ومع ذلك ، فإن الآليات التي تؤدي إلى المناعة الذاتية غير معروفة إلى حد كبير ، وكذلك أهميتها الممرضة.

قرص مضغوط HLA مضاد للجلوتين أب مكافحة TG2 أب مظاهر مناعية أخرى الخلايا التائية المضادة للغلوتين تعديلات IEC ضمور الزغب أعراض خارج الأمعاء
حساسية القمح عامل + الخلايا البدينة الحمضات +? أعراض الحساسية
قرص مضغوط نشيط + + + + + + عامل
علم الأمراض المعتمد على الغلوتين مع مضادات TG2 قرص مضغوط محتمل + + + +
DH + + + (TG3) العدلات + عامل عامل جلد
ترنح الغلوتين 80٪ + أ + + (TG6) ? + عامل العصبية
حساسية الغلوتين القولون العصبي عامل عامل استجابة IEC الفطرية؟ ضغط عصبي؟ IL-15؟
خارج الأوعية عامل + ? +? +
المناعة الذاتية (T1D) عامل علامات خلل في استجابة الجهاز المناعي المخاطي للجلوتين ضغط عصبي؟ IL-15؟ المناعة الذاتية

مناقشة

COVID-19 هو جائحة عالمي مستمر يسببه SARS-CoV-2. من أجل السيطرة على الفيروس في مجال الصحة العامة ، سيكون من الضروري أن يكون لديك استراتيجية لتصنيف الأفراد بناءً على استجابتهم المناعية للفيروس. يمكن أن يساعد التوصيف الشامل للاستجابة المناعية لعدوى SARS-CoV-2 في تقليل انتشاره ، والتأكد من الانتشار المصلي ، والاستراتيجيات العلاجية المباشرة (Kellam and Barclay ، 2020 Krammer ، 2020 Sette and Crotty ، 2020). لم يتم بعد تحديد الكثير فيما يتعلق باختبار الأجسام المضادة المصلية ، بما في ذلك حركية استجابة الجسم المضاد ، وطول عمر الأجسام المضادة ، وقدرة الأجسام المضادة على الحماية من العدوى المتكررة ، والعيار الوقائي للجسم المضاد المعادل ، وعلاقة عيار الأجسام المضادة الملزمة بقدرة التحييد ( Klasse and Moore، 2020 Netea et & # x000a0al.، 2020). اختبار الأجسام المضادة للسكان هو مفتاح الحصول على مثل هذه البيانات. بدأنا وأسسنا برنامجًا واسع النطاق لاختبار الأجسام المضادة وأجرينا أكثر من 60 ألف اختبار للأجسام المضادة لتحديد الأجسام المضادة IgG مقابل بروتين S في عينات مصل المجتمع.

تُظهر بياناتنا 2.63 ٪ إيجابية مصلية في المجتمع ، كما لاحظنا أن الأفراد الذين تبلغ أعمارهم 30 عامًا أو أقل أظهروا أعلى استجابة للأجسام المضادة مقارنة بالآخرين. أظهر المزيد من التحليل على أساس المجموعات العرقية أن إيجابية الأجسام المضادة كانت أعلى لدى الأمريكيين من أصل أفريقي. تتوافق هذه النتائج مع التقارير المنشورة سابقًا والتي تشير إلى أن حالات COVID-19 مرتفعة بشكل غير متناسب لدى الشباب والأمريكيين الأفارقة في الولايات الجنوبية الشرقية من SC و NC و GA. سيساعد تحديد المجموعات ذات الانتشار العالي للمرض قادة الصحة العامة على استهداف التدخلات وتحديد أولويات الموارد.

من المعروف أن وقت أخذ العينات قد يؤثر على الملامح الخلطية ، ويمكن أن يقارن الاستجابات المناعية غير الناضجة مقابل الاستجابات المناعية الناضجة. على الرغم من اختلافات أخذ العينات للمجموعة ، لوحظت عيارات قابلة للمقارنة عبر النقاهة والأفراد الذين لا يعانون من أعراض في واسطة أو عالي الفوج. لاحظنا أن IgG و IgM و IgA كانوا جميعًا موجودين عند التتر العالي بدون أعراض عالي المستجيبين وعينات مرضى النقاهة. كان تفسير أنماط استجابة الجسم المضاد أمرًا صعبًا بسبب الغموض الذي يكتنف وقت تطور الأجسام المضادة وتلاشيها أثناء العدوى.

أظهرت دراسة طولية حديثة لمرضى COVID-19 أن ثلاثة أنماط للتحول المصلي حدثت بتردد متساوٍ تقريبًا: IgM قبل التحويل المصلي IgG ، IgG قبل التحويل المصلي IgM ، والانقلاب المصلي IgM و IgG المتزامن (Long et & # x000a0al.، 2020 Ma et & # x000a0al. ، 2020). النتائج التي توصلنا إليها أن جميع الأجسام المضادة الثلاثة موجودة في عيارات مماثلة في المرضى الذين يعانون من أعراض وبدون أعراض عالي يقترح المستجيبون أن عدم التزامن بين مظهر النوع الفرعي للجسم المضاد ضئيل. يتطور IgA أيضًا في الأفراد المصابين بـ SARS-CoV-2 (Guo et & # x000a0al. ، 2020) وهو ضروري لمناعة الغشاء المخاطي. يتمثل أحد قيود دراستنا في عدم وجود متابعة لأخذ العينات من مجموعاتنا السريرية أو غير المصحوبة بأعراض. تم الإبلاغ عن استجابات الأجسام المضادة لـ Spike و RBD (IgG و IgM و IgA) والأجسام المضادة المعادلة للانخفاض بسرعة بعد دقة SARS-Cov-2 (Beaudoin-Bussi & # x000e8res et & # x000a0al.، 2020 Gaebler et & # x000a0al.، 2020 Muecksch et & # x000a0al.، 2021 Pr & # x000e9vost et & # x000a0al.، 2020). نظرًا لأن حجرة الخلايا البائية تتشكل بشكل كبير من خلال عدوى SARS-CoV-2 ، فإن فهم الاختلاف في ديناميكيات الأجسام المضادة الواقية في المجموعات اللاعرضية والسريرية قد يحدد الآليات الأساسية لمنع ظهور الأعراض (Gaebler et & # x000a0al. ، 2020). أظهرت دراسة طولية حديثة لتقييم الأفراد الذين تعافوا من COVID-19 الخفيف أن تطوير الأجسام المضادة الخاصة بـ SARS-CoV-2 (IgG) ، والبلازما المعادلة ، والذاكرة B والذاكرة T & # x000a0 الخلايا لم تستمر فقط لمدة 3 و # x000a0 شهرًا على الأقل ولكنها زادت أيضًا بمرور الوقت (Rodda et & # x000a0al. ، 2021). وبالمثل ، أظهرت دراسة أخرى أن IgG لبروتين Spike كان مستقرًا نسبيًا على مدى 6 و # x000a0 شهرًا وأن خلايا الذاكرة B الخاصة بـ Spike كانت أكثر وفرة في 6 و # x000a0 شهرًا منها في 1 & # x000a0 شهر ظهور الأعراض (Dan et & # x000a0al. ، 2021) .

اكتشفنا أيضًا تفاعلًا متصالبًا كبيرًا لاستجابة الجسم المضاد في الأفراد غير المصحوبين بأعراض مقارنة بالمرضى الناقدين ، على غرار التقارير الأخيرة (Beaudoin-Bussi & # x000e8res et & # x000a0al.، 2020 Lv et & # x000a0al.، 2020 Pr & # x000e9vost et & # x000a0al. ، 2020). على الرغم من أن حالات تفشي فيروس كورونا السابقة كانت أقل انتشارًا جغرافيًا ، إلا أن اكتشاف الأجسام المضادة المتفاعلة مع بروتينات سبايك لتلك الفيروسات قد يكون قد ساهم في تقليل الشدة لدى الأفراد الذين لا يعانون من أعراض. تفسير آخر لزيادة التفاعل التبادلي يرجع إلى الحفظ العالي لـ S2 بين MERS-CoV و SARS-CoV و hCoV-HKU1 و hCoV-OC43 ، والتي ترتبط بفيروسات بيتاكورونا ذات الصلة (Huang et & # x000a0al.، 2021 Jaimes et & # x000a0al ، 2020). يمكن أن تؤدي زيادة إنتاج الأجسام المضادة ضد SARS-CoV-2 إلى تفاعل تبادلي في عالي و واسطة الأفواج التي لديها أعلى مستويات الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2.

على عكس الدراسات التي أجراها Beaudoin-Bussi & # x000e8res et & # x000a0al. و Pr & # x000e9vost et & # x000a0al. ، لدينا واسطة و عالي كان لدى مجموعات المستجيبين أجسام مضادة IgG قابلة للاكتشاف ولكنها انخفضت تجاه hCoV-NL63 مقارنة مع مرضى النقاهة. لم يكن لهذه الدراسات استجابة يمكن اكتشافها من الجسم المضاد NL63. قد يشير انخفاض الأجسام المضادة لـ hCoV-NL63 إلى أن الاستجابات المناعية لمثل هذه المستضدات السابقة ربما أدت إلى & # x0201cimmune-Enhancement & # x0201d (Arvin et & # x000a0al.، 2020) وزيادة شدة المرض. يجب إجراء تحليل شامل إضافي لتحديد ما إذا كانت شدة المرض لـ SARS-CoV2 موجودة بسبب ظاهرة لوحظت في العديد من الإصابات الأخرى التي تسببها فيروسات وثيقة الصلة تسمى & # x0201coriginal antigenic sin & # x0201d (Fierz and Walz ، 2020).

يعد تحليل الأجسام المضادة المعادلة في جميع المرضى المصابين أو الأفراد الذين لا تظهر عليهم أعراض أمرًا صعبًا من الناحية اللوجستية. استنادًا إلى بياناتنا ، نعتقد أن وجود مضاد S IgG باستخدام الاختبارات الروتينية المستندة إلى ELISA يمكن أن يساعد في التأكد من إمكانية تحييد الأجسام المضادة في أي فرد. أظهرت التقارير الأخيرة أن شدة الأعراض ترتبط ارتباطًا إيجابيًا بالأجسام المضادة المحايدة المحسنة ومستويات مضادات Spike و RBD IgG و IgM و IgA (Chen et & # x000a0al.، 2020b Gaebler et & # x000a0al.، 2020 Garcia-Beltran et & # x000a0al.، 2021 Seow et & # x000a0al.، 2020). نظهر ذلك عالي الأفراد الذين لا يعانون من أعراض لديهم تثبيط أعلى للارتباط بـ ACE2 والاستجابات المضادة لـ Spike و Anti-RBD من مجموعة المرضى في المستشفى. هذه الملاحظة مثيرة للاهتمام حيث أظهرت العديد من الدراسات الحد الأدنى من الاستجابات في الضوابط الصحية بدون أعراض. تسلط هذه النتائج الضوء على إمكانية وجود قدرة فطرية للجهاز المناعي عديم الأعراض على التحكم في الأحمال الفيروسية العالية وتكوين مناعة تكيفية قوية دون ظهور أعراض.

لقد تم إثباته بأناقة في وقت سابق (Buchholz et & # x000a0al. ، 2004) أن بروتين Spike glycoprotein هو البروتين الهيكلي الوحيد لـ SARS-CoV ، وهو أمر ضروري وكافٍ للحث على تحييد استجابة الجسم المضاد والحماية من التحدي (Buchholz et & # x000a0al ، 2004). أظهرت الدراسات الحديثة أيضًا أن مستويات IgG المضادة لـ S كانت أعلى في المرضى الذين تعافوا من أولئك الذين ماتوا (Chandrashekar et & # x000a0al. ، 2020). ومع ذلك ، تم العثور أيضًا على الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 المضادة لـ RBD ذات النشاط المعادل القوي لدى الأفراد الذين لديهم نشاط معتدل لتحييد البلازما (Duan et & # x000a0al. ، 2020). تم أيضًا إبراز الدور المحتمل للمناعة المستهدفة S في السيطرة على الفيروس في دراسات جديدة أجريت على الرئيسيات غير البشرية ، مما يدل على استجابات مناعية خلطية وظيفية مرتفعة وقوية لـ S ، بدلاً من RBD و N ، بعد الإصابة الأولية التي ارتبطت بالحماية عند إعادة - التعرض للفيروس (Chandrashekar et & # x000a0al. ، 2020). أظهرت دراسة حديثة أخرى أن عيارات نقطة النهاية Spike ELISA مرتبطة بالتعادل الفيروسي (Salazar et & # x000a0al. ، 2020). وبالتالي ، فإن الارتباط القوي بين مضاد S IgG وتثبيط ارتباط ACE2 ، كما لوحظ في هذه الدراسة ، يشير إلى أن اللقاحات التي تحفز الأجسام المضادة لبروتين S الكامل أو RBD لـ SARS-CoV-2 قد تتحكم بشكل فعال في شدة المرض.

يتمثل أحد الجوانب الأساسية للبيانات المقدمة هنا في أنه عند الفصل بناءً على مستويات IgG المضادة لـ S ، وجدنا أن تثبيط المصل لربط ACE2 كان أعلى في المجموعة بقيم OD أكثر من 4 أضعاف القطع. انخفض الاتجاه مع انخفاض قيم OD (أي ، واسطة إلى قليل، ولا شيء في العينات السلبية). نظرًا لأن عينات المرضى COVID-19 كانت تحتوي على مستويات أقل من تثبيط ارتباط ACE2 مقارنةً بـ عالي المجموعة وأكثر تشابهًا مع واسطة يبدو أنه حتى الأفراد الذين لا يعانون من أعراض يمكنهم تطوير مناعة قوية. ومع ذلك ، مع التقارير الأخيرة التي تظهر انخفاضًا في عيار الأجسام المضادة خلال 2 & # x022123 & # x000a0 شهرًا (Seow et & # x000a0al. ، 2020) ، سيكون من الضروري إجراء متابعة طولية للأفراد الذين لا يعانون من أعراض لإنشاء انخفاض كمي مماثل في استجابة الجسم المضاد كما ورد مع مرضى COVID-19. مع إعطاء العديد من لقاحات COVID-19 ، يمكن أن يكون الغرض من الفحص المصلي لدينا هو متابعة الاستجابات المناعية الطولية للقاح. بالإضافة إلى اتباع الأجسام المضادة المعادلة لقياس فعالية اللقاح ، يمكن أن يقارن اختبارنا كيف يستجيب الأفراد لنفس اللقاح الذي يقيس تنوع استجابات الأجسام المضادة. بمجرد توضيح العلاقة بين اكتشاف الأجسام المضادة والمناعة الواقية ، يمكن أيضًا استخدام نتائجنا لتصنيف الأفراد إلى طبقات حسب مخاطر الإصابة ، وتحديد الأفراد الذين يحتاجون إلى معززات لقاح ، وتحديد المتبرعين المحتملين الذين لديهم مضادات عالية IgG (وبالتالي القدرة على تثبيط الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2). ملزمة) لبلازما النقاهة ، والتي ثبت أنها تحسن النتائج في مرضى COVID-19 ذوي الحالات الحرجة (Chen et & # x000a0al. ، 2020a). إلى جانب الطب السريري ، يمكن أن يكون للاختبارات المصلية أدوار أساسية في الصحة العامة من خلال توصيف عبء مرض COVID-19 ، وانتشار العدوى بدون أعراض ، ووفيات الحالات ، ومستوى مناعة القطيع.

حدود الدراسة

في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم أكثر من 60.000 فرد بدون أعراض قدموا عينات من خلال وصلة الدم ومجموعة صغيرة من المرضى في MUSC لاستجابات الأجسام المضادة لـ Spike و RBD. كانت هذه الدراسة محدودة بسبب عدم وجود متابعة طولية للعينات من مجموعات الأعراض أو المرضى بمرور الوقت واستخدام مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة لتحييد cPass. بمرور الوقت ، قد يكون تقييم هذه المجموعات قد قدم اختلافات في ديناميكيات الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 بين الأفراد الذين لا تظهر عليهم الأعراض والمرضى. ومع ذلك ، يمكننا تقسيم نتائجنا إلى طبقات على مجموعة المرضى لدينا بناءً على معلومات شدة المرض والعمر والجنس والعرق فيما يتعلق بالوقت منذ بداية ظهور الأعراض لم يكن متاحًا لنا. نظرًا لانخفاض استجابات الجسم المضاد لـ SARS-CoV-2 مع الدقة والوقت الفيروسيين ، فقد كان هذا عاملاً مقيدًا لبياناتنا (Beaudoin-Bussi & # x000e8res et & # x000a0al.، 2020 Gaebler et & # x000a0al.، 2020 Muecksch et & # x000a0al .، 2021 Pr & # x000e9vost et & # x000a0al.، 2020). بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة لتحييد cPass تقيس التثبيط التنافسي لربط ACE2 بدلاً من نشاط التعادل المباشر ، لم نتمكن من إثبات نشاط التعادل لعينات المصل.


أساليب

أتراب الدراسة

قمنا بتجنيد ما مجموعه 79 فردًا من MSCHONY و NYP / CUIMC يمثلون مظاهرًا سريرية مميزة لعدوى SARS-CoV-2 ومجموعات عمرية مختلفة مقسمة إلى أربع مجموعات: (1) أفراد (ن = 19) التبرع بالدم كجزء من تجربة بلازما النقاهة في مؤسستنا (CPDs) بعد تاريخ مرض حديث يتوافق مع COVID-19 ولكن لا يتطلب دخول المستشفى وتم تحديده لاحقًا على أنه إيجابي للأجسام المضادة المضادة لـ SARS-CoV-2 (2) المرضى المصابين COVID-19 الشديد و ARDS (ن = 13) الذين ثبتت إصابتهم بـ SARS-CoV-2 بواسطة PCR من مسحات البلعوم الأنفي (3) مرضى الأطفال الذين يعانون من MIS-C (ن = 16) وتأكيد الأمصال الإيجابية للأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 و (4) مرضى الأطفال دون MIS-C (ن = 31) تلقي عناية طبية في NYP / CUIMC وتأكدت إصابتها بعدوى سارس- CoV-2 نشطة أو سابقة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل من مسحات البلعوم الأنفي أو الأمصال الإيجابية للأجسام المضادة. تم تعريف متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) من خلال معايير الإجماع السريري ، بما في ذلك التسلل في صورة شعاعية للصدر و PaO2/ FiO2 نسبة أقل من 300 أو ما يعادلها من معايير طب الأطفال 39،40. تم تعريف MIS-C باستخدام تعريف مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها: & lt21 سنة من الحمى & gt38 درجة مئوية لـ & gt24 h دليل مختبري على وجود التهاب متعدد أنظمة دخول المستشفى ، لا يوجد تشخيص بديل معقول ومصل إيجابي لـ SARS-Cov-2 41. تم حساب درجات تقييم فشل الأعضاء المتسلسل (SOFA) على جميع الأفراد في المستشفى باستخدام أدوات درجة البالغين والأطفال التي تم التحقق من صحتها مسبقًا لتوفير رؤية سريرية إضافية حول شدة مرض المريض 42،43،44. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في CUIMC. تم الحصول على موافقة خطية من الأفراد CPD. نظرًا للقيود المفروضة على الاتصال المباشر بالأفراد المصابين والحاجة إلى الحفاظ على معدات الحماية الشخصية ، تم الحصول على الموافقة المستنيرة اللفظية من بدائل مرضى COVID-ARDS المصابين بأمراض خطيرة وتم الحصول على موافقة الوالدين اللفظية لأفراد MIS-C. تم الحصول على العينات الحيوية والبيانات من مرضى الأطفال غير الحاصلين على MIS-C من البنك الحيوي بجامعة كولومبيا.

معالجة العينة

تم الحصول على عينات الدم في وقت التبرع بالمرضى الخارجيين لأفراد CPD ، في وقت قبول أفراد MIS-C ، وأثناء الرعاية السريرية للأطفال من غير MIS-C ، وبعد تشخيص متلازمة الضائقة التنفسية الحادة لمرضى COVID-ARDS. تم عزل البلازما من الدم الكامل عن طريق الطرد المركزي. تم تجميد قسامات عند درجة حرارة -80 درجة مئوية قبل التحليل.

تنقية البروتينات الفيروسية SARS-CoV-2

تم استنساخ النطاق الخارجي لأداة تقليم سبايك SARS-CoV-2 45 في ناقل تعبير الثدييات pCAGGS (Addgene) بعلامة قابلة للطي متبوعة بـ 6 × علامته وعلامة Strep-tag II في الطرف C. تم نقل ناقل التعبير هذا بشكل عابر إلى خلايا HEK293F وتمت تنقية أداة القطع المسننة التي تم إفرازها في المادة الطافية بعد 3-5 أيام من ترنسفكأيشن بواسطة كروماتوجرافيا تقارب المعادن باستخدام عمود Ni-NTA (QIAGEN). تم استنساخ بروتين SARS-CoV-2 N في ناقل pET28a (+) (Merck Millipore) باستخدام رابط AAALE و 6 × علامته في الطرف C. ثم تم استخدام بنية الجسيمات النانوية للتحول إلى الإشريكية القولونية تم إنتاج خلايا سلالة BL21 (DE3) pLysS والبروتين المستهدف وتنقيته من المحللة البكتيرية بواسطة كروماتوجرافيا تقارب المعادن باستخدام عمود Ni-NTA ، متبوعًا باستبعاد الحجم اللوني على عمود Superdex 200 10/300 GL.

ELISA لاكتشاف الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس

تم طلاء أداة تقليم السنبلة SARS-CoV-2 و N على ألواح ELISA ذات 96 بئر عند 4 درجات مئوية طوال الليل ثم تمت إزالة البروتينات غير المقيدة عن طريق الغسل باستخدام PBS ، متبوعًا بالحجب باستخدام PBS / 3 ٪ حليب جاف خالي من الدسم. تم تخفيف عينات البلازما بشكل متسلسل في PBS باستخدام Tween 20 (PBST 0.1 ٪ Tween-20 في PBS) + 10 ٪ FCS بدءًا من 1: 100 و 5 تخفيفات متتالية بأربعة أضعاف في كل بئر من اللوحة المطلية ، والتي تم تحضينها عند 37 درجة مئوية من أجل ساعة واحدة ، متبوعة بالغسيل 6 مرات باستخدام PBST. الجسم المضاد IgG (H + L) المضاد للبروكسيداز AffiniPure الماعز (التخفيف 1: 3000) ، الجسم المضاد IgM المضاد للإنسان (التخفيف 1: 10000) (Jackson ImmunoResearch) أو الجسم المضاد IgA المضاد للإنسان (1: 5000 التخفيف) (Thermo Fisher علمي) لاحقًا إلى كل بئر وحضنت لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، وغسلها وأضيف ركيزة رباعي ميثيل بنزيدين (Sigma-Aldrich) وتوقف التفاعل باستخدام 1 مولار من حامض الكبريتيك. تم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر وتم التعبير عنها في صورة كثافة بصرية أو OD450 القيمة. تم إجراء تخفيفات متسلسلة متطابقة لجميع العينات مع عدم فقدان المعايرة. بالنسبة إلى ELISA المستندة إلى الخلايا ، تم نقل خلايا HEK293T باستخدام بروتين S كامل الطول ومُحسّن للشفرة من متغير SARS-CoV-2 أو SARS-CoV-2 D614G أو MERS أو SARS-CoV-1 أو ناقل تحكم pCAGGS الفارغ (الحقبة) علم الحياة). Transfected cells were seeded onto 96-well plates (40,000 cells per well) and cultured at 37 °C, 5% CO2 overnight, then heat-inactivated plasma samples were added for 30 min on ice, followed by washing with cold PBS and fixation in 4% paraformaldehyde. The fixed cells were stained with protein G Alexa Fluor 488 (ThermoFisher) and 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), and fluorescence images were acquired using the IN Cell Analyzer 2500HS high content analysis imaging system (Cytiva).

Pseudovirus neutralization assay

We adapted a pseudovirus-based neutralization strategy we previously developed to measure the inhibition of infection by high biocontainment enveloped viruses in a large number of samples under low-level biocontainment 20,21 . For this assay, SARS-CoV-2 S protein was pseudotyped onto recombinant VSV that expresses RFP but does not express the VSV attachment protein, G (VSV-ΔG-RFP). Initially, VSV-ΔG-RFP pseudotyped with VSV G was used to infect 293T (human kidney epithelial) cells that were cotransfected with full-length codon-optimized SARS-CoV-2 S protein (Epoch Life Science), the viral entry receptor ACE2 (Epoch Life Science) and green fluorescent protein (GFP). Infected HEK293T cells were then mixed at a 2:1 ratio with Vero (African green monkey kidney) cells, which have high endogenous expression of ACE2 (ref. 46 ). Cells were then combined with diluted serum or plasma in 96-well plates. During the assay, infected S protein–expressing HEK293T cells generated VSV-ΔG-RFP viruses bearing S protein, which subsequently infected and drove RFP expression in Vero cells and underwent multiple cycles of entry and budding in HEK293T cells due to the coexpression of S protein with ACE2. The GFP and RFP signals were measured 24–48 h after plating (Infinite M1000 PRO Microplate Reader Tecan), resulting in robust amplification of the S protein pseudovirus-driven RFP signal between 24 and 48 h. Inhibition of RFP signal amplification indicated S protein neutralizing activity in patient plasma (Extended Data Fig. 1). Identical, fivefold serial dilutions were performed for all samples and there were no missing titration data points for any of the samples.

SARS-CoV-2 viral stock production

SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA_WA1/2020) was kindly provided to B.H. by the World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses. To generate virus stocks, Vero E6 cells (kindly provided by F. Cosset, International Center for Research in Infectious Diseases, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) were inoculated with virus at a multiplicity of infection of 0.01. The virus-containing medium was collected at 72 h post infection, clarified by low-speed centrifugation, aliquoted and stored at −80 °C. Virus stock was quantified by limiting the dilution plaque assay on Vero E6 cells as described elsewhere 47,48 .

Live virus neutralization assay

Twofold dilutions of plasma in 50 μl of DMEM were incubated with 200 plaque-forming units of SARS-CoV-2 in 50 μl of DMEM for 30 min at 4 °C. Then, 100 μl of DMEM and 4% FCS containing 4 × 10 4 Vero E6 cells were added on top of the former mix to have final dilution of sera from 1:50 to 1:6,400 (4 wells per dilution). Cells were then incubated for 3 d at 37 °C and 5% CO2. The cytopathic effect was revealed by crystal violet staining and scored by an observer blinded to study design and sample identity. Neutralization end point titers were expressed as the value of the last serum dilution that completely inhibited the virus-induced cytopathic effect.

Quantitation of neutralization titers in the pseudovirus assay

For the quantitation of neutralization titers in the pseudovirus assay, the RFP signal driven by the pseudovirus normalized to the GFP signal derived from the SARS-CoV-2 S protein and ACE2 transfected cells was measured at 24 and 48 h the ratio of normalized RFP at 48 h (RFP48) to normalized RFP at 24 h (RFP24) was calculated. This ratio provides a readout of multicycle infection of the S protein/ACE2-transfected cell monolayer by S protein–bearing pseudoviruses. Neutralizing activity for each sample was calculated by taking the sum of the reciprocal of the RFP48/RFP24 ratio at all 6 plasma dilutions for each sample, as described by Hartman et al. 49 , and also by percentage inhibition of multicycle replication at each dilution calculated based on the RFP48/RFP24 ratio of the sample, control wells of maximal multicycle replication without inhibition (MAX) and control wells with 100% inhibition of multicycle replication using a lipidated SARS-CoV-2-derived peptide (MIN) 50,51 . The equation for percentage inhibition of multicycle replication is 100 × (1 − (sample − MIN)/(MAX – MIN)).

تحليل احصائي

All statistical analysis was performed using Prism v.8.4.3 (GraphPad Software). Comparisons of clinical data between groups was performed using the Mann–Whitney يو-test, one-way analysis of variance (ANOVA) and Dunn’s multiple comparisons test. Comparisons of antibody levels and neutralization activity were performed using a one-way ANOVA and Tukey’s multiple comparisons test. Pairwise correlation analysis was performed using simple linear regression. Multiple linear regression analysis was performed on the combined adult and pediatric data and the adult and pediatric cohorts individually. For all analyses, the outcome variables included the abundance of anti-S IgG, anti-S IgM, anti-N IgG and SARS-CoV-2 neutralizing activity. For the combined adult and pediatric datasets, the independent variable was pediatric age group (‘pediatric’) and covariates included sex, clinical syndrome and time post-symptom onset (days). For the adult and pediatric subgroup analyses, the independent variables were clinical syndrome and age (years) and the covariates included sex and time post-symptom onset (days). For each variable, ص values were calculated using the ر statistic with two-sided hypothesis testing.

Reporting Summary

يتوفر مزيد من المعلومات حول تصميم البحث في Nature Research Reporting Summary المرتبط بهذه المقالة.


المواد والأساليب

Phase 1 Nexvax2 clinical trials

The clinical procedures, outcomes, and associated laboratory methods for the 3- and 16-dose randomized, double-blind, placebo-controlled, ascending dose phase 1 studies have been described in detail elsewhere (6). All participants provided written informed consent. Ethics committees gave approval for the three-dose study [Liberty Institutional Review Board (IRB) tracking number 12.07.0012, The University of Oklahoma Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects IRB number 1370, Bellberry Human Research Ethics Committee application number 2013-10-553, and Southern Health and Disability Ethics Committee 13/STH/168] and for the 16-dose study (The Alfred Hospital Ethics Committee approval number 118/12, Bellberry Human Research Ethics Committee application number 2012-04-735-AA, Southern Health and Disability Ethics Committees ethics ref. NTY/12/06/049/AM05).

Stored plasma samples and clinical data were analyzed after the trials were completed and unblinding of data. Briefly, adult HLA-DQ2.5 + CeD patients on GFD were recruited at 12 sites in Australia, New Zealand, and the United States. During the screening period, patients evaluated for ascending dose cohorts had a 3-day gluten food challenge. Blood collected before and 6 days after commencing the gluten challenge were assessed in a whole-blood IFN-γ release assay, described in detail elsewhere (6). The last cohort in each study had a gastroscopy instead of a food challenge and was excluded if villous atrophy was present. Fixed doses of investigational product were administered by intradermal injection. Dose levels assessed were 60, 90, and 150 μg in the three-dose study and 150 and 300 μg in the 16-dose study. The matched placebo was 0.1 ml of sterile 0.9% sodium chloride. Timing and severity of adverse events were recorded. Gastrointestinal symptoms of pain, hunger pains, nausea, rumbling, bloating, and diarrhea were assessed daily by patients using a seven-point graded Likert scale, where one represented the most positive option, and seven represented the most negative one in the format of the Gastrointestinal Symptom Rating Scale. Blood for plasma cytokine assessment was collected into K2 EDTA Vacutainer tubes (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), which were centrifuged within 10 min of collection at 1100 to 1300 RCF (relative centrifugal force) for 10 min, and then, plasma was stored at or below −60°C. Cytokines were assessed in plasma from blood collected within 30 min before (baseline) and at 10, 20, 30, and 45 min and 1, 1.5, 2, 4, and 6 hours after dosing on the first day. Plasma over the same time course was also assessed in patients after their last dose for those in cohorts receiving the maximum tolerated dose of Nexvax2 (150 μg).

Food challenge studies with gluten

Participants provided written informed consent. The Human Research Ethics Committee Melbourne Health (2003.009) and The Walter and Eliza Hall Institute Human Research Ethics Committee (03/04) approved the study. Male and female patients aged 18 to 70 years with biopsy-confirmed CeD following GFD for at least 8 weeks were eligible. Patients were excluded if their score was over 12 in the Celiac Dietary Adherence Test (33), serum TG2 immunoglobulin A (IgA) and deamidated gliadin peptide IgG were both elevated, immunomodulators or immunosuppressive medications were used during the previous 2 months, oral or parenteral corticosteroids were used within the previous 6 weeks, or females were pregnant, lactating, or breastfeeding. A double-blind food challenge consisting of either 5 g of vital wheat gluten flour (Bob’s Red Mill Natural Foods Inc., Milwaukie, OR), which was estimated to contain 3 g of gluten protein according to the Osborne equation, or gluten-free fine-ground white rice flour (“McKenzie’s Rice Flour,” Ward McKenzie’s Pty Ltd., Australia) was added to one serve of (7 g) gluten-free “Vitafresh Low Calorie Lime” or “Vitafresh Low Calorie Sweet Navel Orange” (Hansells Food Group, New Zealand) mixed together in 100 ml of water consumed over 2 min. Adverse events were recorded hourly and graded according to “The Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) version 4.0” (U.S. Food and Drugs Administration Guidance for Industry: Toxicity Grading Scale). Each hour, a modified version of the CeD patient reported outcome questionnaire (CeD PRO) was completed by participants to grade their worst experience for 11 symptoms over the previous 1-hour graded on a whole-number scale from 0 (none) to 10 (worst possible) (34). Blood was collected before and hourly up to 8 hours in the first six patients, and for later patients, only at baseline and at 4 and 6 hours. Blood for plasma was collected and processed as described for phase 1 clinical studies. Blood for serum was collected into Vacutainer Plus plastic serum tubes (BD 367986). Serum was separated from blood after 2 hours at room temperature by centrifuging at 2000ز for 20 min.

The clinical procedures, outcomes, and associated laboratory methods for a second, separate unmasked gluten food challenge have been reported in detail elsewhere (5). Participants were on GFD and in histological and serological remission. Quantitative histology was determined in baseline duodenal biopsies. Participants consumed one 50-g muesli bar daily that contained 7.6 g of gluten flour (5.7 g of gluten protein) and was free of fermentable oligosaccharides, disaccharides, monosaccharides, and polyols. Blood samples were collected at baseline and at 2, 4, and 6 hours after consuming the muesli bar on day 1. Plasma from these blood samples was kept frozen at −80°C and later analyzed for cytokines using a magnetic bead assay, and results have been previously reported (5). For the present study, the ECL assay was used to reassess IL-2, IL-8, and IL-10 in frozen plasma samples from the first study day. Symptoms were recorded by patients on a visual analog scale at baseline and then every 2 hours up to 6 hours after consuming gluten on the first study day. The frequency of effector-memory gut-homing CD4 + cells specific for DQ2.5:glia-α1a, DQ2.5:glia-α2, DQ2.5:glia-ω1 and DQ2.5:glia-ω2, and DQ8:glia-α1 and DQ8:glia-γ1b epitopes was assessed in blood collected at baseline according to previously described methods (35). These data have been previously published (5).

Peripheral blood and intestinal gluten-reactive TCCs

Volunteers provided written informed consent. The Regional Committee for Medical and Health Research Ethics South East Norway (REK 2010/2720) approved the study. Intestinal TCCs were prepared from duodenal biopsies from CeD patients as previously described (36). To obtain peripheral blood TCCs, PBMC from CeD patients were stained with HLA-DQ2.5:gluten peptide tetramers (peptide-loaded major histocompatibility complex molecules, pMHC) labeled with phycoerythrin, sorted, and cloned by limited dilution according to previously reported methods (37). Six gut-derived and six blood-derived TCCs were considered to be clonal as judged by pMHC staining of >99% of cells. TCCs were seeded (1.5 million per well) into 48-well plates precoated with anti-CD3 (5 μg/ml 300414, BioLegend, San Diego, CA) and incubated for 24 hours in 1.5 ml of RPMI 1640 supplemented with 10% heat-inactivated human serum and penicillin-streptomycin containing anti-CD28 (1 μg/ml 302914, BioLegend). Medium (0.1 ml) was removed and centrifuged, and supernatants were frozen. In parallel, eight TCCs were also cultured for 24 hours with cognate peptide and monocyte-derived DCs derived from a HLA-DQ2.5 + donor not affected by CeD. DCs were prepared by incubating positively selected PBMC CD14 + cells (CD14 microbeads Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA) with GM-CSF (1000 U/ml) and IL-4 (500 U/ml). Cell cultures were replenished on alternate days with half the medium replaced with RPMI supplemented with 10% fetal calf serum containing GM-CSF and IL-4. On day 6, lipopolysaccharide (150 ng/ml) was included with GM-CSF and IL-4 in the medium added. On day 7, mature DCs were collected, washed, counted, and resuspended in RPMI + 10% human serum (0.5 million/ml) and incubated overnight with PBS or matched cognate peptide, either 10 μM DQ2·5-glia-γ1 peptide (YQQLPQPEQPQQSFPEQERPF) or 2 μM α-gliadin-33mer peptide (LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF). Peptide-pulsed DCs (0.4 million) and TCCs (1.2 million) were added to each 48 well in a total volume of 1.2 ml. Medium (0.1 ml) was removed and centrifuged, and supernatants were frozen. Six TCCs were incubated in wells coated with immobilized epitope-specific pMHC (38). TCCs (260,000) were incubated with plate-bound pMHC in nine replicate wells (225 μl per well). Thirty microliters of medium was removed from each of three wells and pooled, producing three pooled samples for each time point that were frozen.

Peripheral blood and intestinal T cell lines

Volunteers provided written informed consent. The University of Chicago IRB (12623B) approved the study. PBMC were isolated by Ficoll-Paque density centrifugation. Cells were isolated from duodenal biopsies of patients with CeD on GFD via 1-hour mechanical disruption in RPMI containing 2 mM EDTA (46-034-CI, Corning) and 1.5 mM MgCl2 (BP214-500, Thermo Fisher Scientific) for acquisition of intraepithelial lymphocytes and subsequent 1-hour mechanical disruption in RPMI containing collagenase type IV (C5138-100, Sigma-Aldrich) (39) for acquisition of lamina propria lymphocytes. Cells staining positive for anti-CD3 (PE-Cy7, 300420, UCHT1, BioLegend), TCRαβ (αβ T cell receptor BV421, 306722, IP26, BioLegend), and CD4 (PerCP/Cy5.5, 317428, OKT4, BioLegend) were purified by fluorescence-activated cell sorting (fig. S4). Five to 10,000 sorted cells were expanded with phytohemagglutinin-L (1 μg/ml M5030, Calbiochem/EMD Millipore, Billerica, MA) and a mixture of irradiated heterologous PBMCs and Epstein Barr virus–transformed B lymphoblastoid cell lines in RPMI + 10% human serum AB (S40110, Atlanta Biologicals, Norcross, GA) and maintained with IL-2 (100 U/ml 136, National Institutes of Health AIDS Reagent Program) (40). One round of cell expansion for 29 days was performed. Cells were 98.5 to 99.5% TCRαβ/CD4 double positive. For stimulation with anti-CD3 (555329, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) and anti-CD28 (555726, BD Bioscience), 96-well flat-bottom plates (07-200-656, Thermo Fisher Scientific) were coated overnight (anti-CD3, 1.5 μg/ml anti-CD28, 1 μg/ml) at 4°C. Cells were then plated 200 μl per well in RPMI + 10% human serum AB (S40110, Atlanta Biologicals, Norcross, GA) at a concentration of 1 × 10 6 cells/ml counted using a hemocytometer and incubated 24 hours at 37°C. Supernatants were harvested and frozen at −80°C until evaluation.

Whole-blood cytokine release

Whole-blood cytokine release has been described in detail elsewhere (6). Briefly, 1 ml of blood was collected into Nil Control Tubes (QuantiFERON-TB Gold In-Tube, QIAGEN, Hilden, Germany) that had 0.1 ml of PBS alone or with the mixture of three gluten peptide constituents of Nexvax2 each at 50 μg/ml added. The peptides corresponded to α-gliadin W02-E7, ω-gliadin/C-hordein W03-E7, and hordein B08-E2E7 reported by Tye-Din وآخرون. (7). Peptides were at least 95% pure by high-performance liquid chromatography and liquid chromatography mass spectroscopy (CSBio, Menlo Park, California, USA). Tubes were incubated at 37°C for 24 hours before centrifugation and separation of plasma. Stimulation index was calculated by dividing cytokine concentration for Nexvax2 peptide incubation by the PBS control.

Peripheral blood B cells

PBMC were prepared by Ficoll-Paque density centrifugation. Isolated B cells were prepared from PBMC using the Dynabeads Untouched Human B Cells Kit (11351D, Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer’s recommended protocol. Purity of the B cell suspension was assessed by flow cytometry, indicating a 99% CD19 + cell population consistent with high purity of B cells. B cells were resuspended 0.5 million/ml ml in RPMI 1640 containing 10% heat-inactivated human serum, 2 mM l -glutamine, 1 mM Na-pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acids, 50 μM β-mercaptoethanol, streptomycin (100 μg/ml), and penicillin (100 U/ml), alone, or supplemented with IL-4 (20 ng/ml PeproTech, Rocky Hill, NJ) plus anti-human IgA + IgG + IgM (30 μg/ml Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) plus sCD40L (1000 ng/ml Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY). B cells (0.1 million) were added in 0.2 ml per well in 96-well U-bottom tissue culture plates and incubated at 37°C in 5% CO2. After 24 hours, supernatants were harvested and frozen until evaluation.

Cytokine assessments

Cytokines and chemokines from EDTA plasma, plasma from whole-blood IFN-γ release assay incubations, and medium from in vitro cell stimulations were measured at ImmusanT Inc. using a magnetic bead–based assay according the manufacturer’s protocol (MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel EMD Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAGPIX, Luminex Corporation, Austin, TX, USA). Final concentrations were the average of triplicate measurements. Olink Proteomics (Uppsala, Sweden) was provided frozen EDTA plasma collected at baseline 2, 4, and 6 hours after the first dose from three patients in the first cohort and three in the last cohort of the 16-dose study. Olink performed a 92-plex PEA with the Proseek Multiplex Inflammation I 96 × 96 panel. Cytokine data were expressed as relative fold change from predose levels. IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, TNF-α, eotaxin, eotaxin-3, IL-8, IL-8 (HA), IP-10, MCP-1, MCP-4, MDC, MIP-1α, MIP-1β, TARC (thymus and activation regulated chemokine) in EDTA plasma, and sera were measured at ImmusanT Inc. using ECL assay kits (V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit, V-PLEX Chemokine Panel 1 Human Kit, or V-PLEX IL-2, IL-8, and IL-10 as a three-plex Meso Scale Discovery, Rockville, MD). Data were analyzed by DISCOVERY WORKBENCH 4.0. Calculated values lower than LLOQ (lower limit of quantification) or values on the low end of the scale that were not achieved using the standard curves, were reported as equal to the LLOQ concentration analyzed for each cytokine on each plate.

تحليل احصائي

All statistical analyses were performed with GraphPad Prism version 7.0d and MathWorks MATLAB version 9.5. Nonparameteric tests were used to assess significance. الجميع ص values were adjusted by Benjamini-Hochberg method for multiple hypothesis testing. Cytokine signature in response to Nexvax2 administration was determined by comparing baseline-adjusted fold-change differences between placebo (ن = 28) and active (ن = 54) arms at specific time points after dosing to identify sequentially activated hierarchy of cytokines. ص values were estimated by Mann-Whitney يو اختبار. Cytokines with average fold change of >2-fold and false discovery rate–adjusted ص value of <0.05 were considered significant. Pearson’s correlation analysis between IL-2 concentration at 4 hours and concentrations of IL-8 and MCP-1 at 4 hours, and IP-10 at 6 hours, was used to assess strength and significance of correlation. Cytokines significant at onset of vomiting after first dose of Nexvax2 were determined by comparing fold-change response of Nexvax2-responsive signature cytokines, at onset of vomiting, in Nexvax2-treated patients (ن = 20) with peak response observed in placebo-treated patients (ن = 28). Concentration of each cytokine was inferred by linear interpolation at time of vomiting for each patient (ن = 20). Peak fold-change values were used for placebo-treated patients (ن = 28). ص values were assessed by Mann-Whitney يو اختبار.

Linear mixed effects regression modeling was used to test association of vomiting with higher cytokine response. Cytokine response at 4 hours for IL-2, IL-8, MCP-1, and IP-10 were modeled as a function of nine predictor variables including age, gender, height, weight, body mass index, HLA-DQ2.5 homozygosity status, exposure to the previous gluten challenge, Nexvax2 dose levels, and occurrence of vomiting. Analysis of plasma IL-2 levels, nausea score, and occurrence of vomiting was analyzed using a logistic dose-response curve fitted to model Nausea scores (ص) as a function of plasma (log-transformed) IL-2 levels (X). The 4-parameter logistic dose-response curve was fitted with Hill slope (ح) = 2.75, bottom (ب) and top (تي) nausea scores of 1 and 7, respectively, and half maximal effective concentration (EC50) = 62.19 pg/ml by ordinary least squares method. The model [ص = ب + (T − B)/(10^((log(EC50) − X]*ح))] was used to estimate the threshold of plasma IL-2 concentration (first X value at which ص > 1) beyond which significant self-reported nausea scores and occurrence of vomiting are observed.

In the randomized double-blind sham-controlled gluten food challenge study, fold-change responses in cytokines at 4 hours after gluten challenge (ن = 11) and placebo controls (ن = 8) were compared using Mann-Whitney يو اختبار. In the study investigating cytokine response to muesli bars containing 5.7 g of gluten, paired changes in cytokine concentrations at 4 hours after challenge were compared with baseline levels using Wilcoxon signed rank test. Elevation of circulating levels of IL-2, IL-8, and IL-10 after muesli challenge was summarized as area under the curve using trapezoidal numerical integration from 0 to 6 hours, and their correlation with prechallenge baseline frequency of circulating gluten-specific CD4 + T cells and duodenal histology measured by villous height–to–crypt depth ratio were independently assessed by Pearson’s correlation analysis.


Oral Food Challenges

Since there is no predictive or diagnostic test, oral food challenge remains the "gold standard." The most rigorous method is double blind and placebo controlled, but single-blind (ie, the patient) and open-label challenges can be performed. Double-blind placebo-controlled challenges are indicated when the endpoints are subjective complaints (ie, bias is possible) or when there are specific research objectives. The challenge procedure involves giving increasing doses at intervals during constant observation. The starting dose is sufficiently low to avoid triggering a severe reaction (eg, ≈100 - 500 mg). Intervals are shorter (≈20 minutes) when testing for IgE-mediated processes rather than for T cell-mediated processes (hours, for example, for FPIES). Once the top dose is reached, the observation period varies: 2.5 hours for IgE-mediated reactions and 4 hours for T cell-mediated processes (eg, FPIES). Longer periods and multiple doses may be required to elicit a reaction in patients with some disorders (eg, EE). For EE cases, biopsies are needed to confirm the results making food challenges. Therefore, definitive diagnostic procedures are more time consuming in cases of non-IgE-mediated reactions than in cases of IgE-mediated reactions. When a food challenge is unsuccessful, repeat challenge is recommended every 6 months to 2 years, depending on the clinical severity of the reaction.


المواد والأساليب

Subjects and inclusion/exclusion criteria.

The study was approved by the Committee for Clinical Investigations at the Beth Israel Deaconess Medical Center and the Institutional Review Board at Boston University. Parotid secretion (PS) was collected from four groups of subjects: 1) healthy subjects (HC) having no signs (genetic, serological, or histological) or symptoms of CD or gluten sensitivity and presenting in overall good health (ن = 19) 2) nonceliac patients (GI) suffering from non-immune-mediated gastrointestinal symptoms and in whom CD was excluded by serological and histological testing (ن = 11) 3) celiac disease patients (CD) with positive anti-DGA (deamidated gliadin antibodies) and/or anti-TG2 antibodies (30) and duodenal villous atrophy at diagnosis and who were clinically responsive to a gluten-free diet (GFD) (ن = 20) and 4) refractory CD type 1 patients (RCD) who were previously diagnosed as CD and met criteria for RCD after a minimum of 6 mo on the GFD (1) (ن = 8). Exclusion criteria were illicit drug or excessive alcohol use unstable or uncontrolled heart, kidney, or liver disease a clinically defined mental illness sicca syndrome or overt signs of severe dental or periodontal health issues. All subjects enrolled were at least 18 years old and consented prior to participation in the study. The demographics of the enrolled patients are shown in Table 1 . More detailed clinical characteristics of these patients have been reported earlier (53). The majority of the donors were women, and all patients were Caucasian. The HC group was matched in age, gender, and race to the CD group.

الجدول 1.

HC (ن = 19)GI (ن = 11)CD (ن = 20)RCD (ن = 8)
Age, mean ± SD33.6 ± 13.941.0 ± 14.835.1 ± 16.654.1 ± 13.5* a,b
Gender, %M 5 (26.3%)M 3 (27.3%)M 3 (15%)M 3 (37.5%)
F 14 (73.7%)F 8 (72.7%)F 17 (85%)F 5 (62.5%)

HC, healthy controls GI, (unrelated) gastrointestinal disorders CD, celiac disease RCD, refractory CD M, male F, female.

Collection of parotid secretion.

A Curby cup was placed over the orifice of the Stensen's duct and was held in place under negative pressure (9). PS was stimulated by providing donors with a sour candy. Volumes of 10 ml PS were collected on ice (6). Immediately after collection the PS samples were aliquoted in 1.5-ml fractions and stored at �ଌ until analysis. The protein concentrations of the PS samples were determined with the bicinchoninic acid assay (BCA assay Pierce, Thermo Fisher Scientific).

SDS-PAGE and immunoblotting.

Gliadins (0.1 μg), amylase (15 μg), or PS protein (48 μg) were subjected to 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Bis-Tris) PAGE (NuPAGE, Invitrogen, Carlsbad, CA). Electrophoresis was carried out at a constant voltage of 120 V at room temperature. The proteins were immunoblotted onto polyvinylidene difluoride membranes (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) at a constant current of 400 mA for 2 h at 4ଌ. Blots were blocked with 5% nonfat dry milk, washed three times with TBS-T (25 mM Tris·HCl, 125 mM NaCl, 0.1% Tween 20) and then incubated with 1:1,000 diluted horseradish peroxidase-conjugated anti-gliadin antibody (Sigma, St. Louis, MO). Binding was detected with enhanced chemiluminescent substrate (ECL, Thermo Fisher Scientific) and signals were visualized on an X-ray film (Denville, NJ) by using a Konica Minolta SRX-101A film processor (Konica Minolta Medical & Graphic, Shinjuku-Ku, Tokyo, Japan).

ELISA.

A sandwich ELISA was carried out employing the R5 monoclonal antibody (Ridascreen Gliadin kit, R-Biopharm, Darmstadt, Germany). Experiments were performed according to the manufacturer's instructions. In brief, aliquots of 100 μl standards or parotid saliva from each subject were added to the R5 antibody-coated microtiter plate. The plates were incubated for 30 min at room temperature, washed with washing buffer, and incubated with 100 μl of peroxidase-conjugated secondary antibody for 30 min at room temperature. After washing, substrate solution containing tetramethylbenzidine was added and incubated for 15 min. Finally, 100 μl stop reagent was added to each well and the absorbance was measured at 450 nm.

Enzymatic treatment of gliadins and PS proteins.

Mixed gliadins (Sigma) were dissolved in 0.1 N HCl to 20 mg/ml. Aliquots of 1.5 ml PS were diluted to 5 ml and acidified with HCl to a pH of 1.0. Pepsin (3,200𠄴,500 U/mg Sigma) was added at an enzyme-to-protein (wt/wt) ratio of 1:100 (wt/wt) (34) and the mixture was incubated for 4 h at 37ଌ. After adjustment of the pH to 7.8 with NaOH, trypsin (𢙙,000 U/mg Sigma)was added at an enzyme-to-protein ratio of 1:100 (wt/wt), and the mixture was incubated for 4 h at 37ଌ. The pepsin and trypsin (PT)-treated protein mixtures were then boiled for 10 min to abolish enzymatic activities. Subsequently, the protein mixtures were incubated with guinea pig transglutaminase 2 (TG2 𢙑.5 U/mg Sigma) at an enzyme-to-protein ratio of 1:5 (34) in PBS (pH 7.2) containing 1 mM CaCl2 for 4 h at 37ଌ, after which the samples were frozen at �ଌ.

PBMC isolation.

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were separated from other blood cells by density gradient centrifugation by using Histopaque (Sigma), essentially as described (8). The cell density of the PBMC suspension was determined by use of a hemocytometer. PBMCs were then adjusted to 2 × 10 6 cells/ml in CTL serum-free test medium (Cellular Technology, Cleveland, OH) containing 2 mM l -glutamine (GIBCO BRL-Life Technologies, Grand Island, NY), 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin and immediately used in the cytokine-induction assays.

Cytokine induction in PBMCs.

Aliquots of 100 μl PBMCs in CTL medium (2 × 10 5 cells) were mixed with 50 μl PT-TG2-treated gliadins (final gliadin concentration 100 μg/ml) or/and PT-TG2-treated PS protein (final PS protein concentration 25, 50, 100 μg/ml). CTL medium was added to a final volume of 200 μl. Controls contained PT-TG2 only, at concentrations used to treat the respective gliadin or PS protein samples. The mixtures were incubated in a 37ଌ incubator with humidified air and 5% CO2 for 24 h. After incubation, the cells were centrifuged and the secreted TNF-α, IL-10, IFN-γ, and IL-21 were quantitated in the supernatant by a Luminex cytokine assay (EMD Millipore, Billerica, MA). Briefly, 25 μl PBMC culture supernatants were mixed with 25 μl assay buffer and added to wells in a 96-well microtiter plate. The standards contained 25 μl of the selected cytokines at seven concentrations mixed with 25 μl CTL media. To each well, 25-μl beads coated with anti-TNF-α, IL-10, IFN-γ, or IL-21 antibodies were added. After 16 h incubation at 4ଌ, the wells were washed, incubated with 25 μl detection antibodies for 1 h at room temperature, washed, and then incubated with 25 μl streptavidin-phycoerythrin solution for 30 min at room temperature. After washing, 150 μl washing buffer (sheath fluid) was added and the level of cytokines in each well was quantified by using the Luminex MAGPIX 4.2 equipment with xPONENT system software (EMD Millipore, Billerica, MA).

Challenge of DQ2/DQ8 transgenic mice.

AEo DQ2 mice on a mixed genetic background of FVB, B6, and 129/J (44) and AEo DQ8 mice (52) were crossed to generate AEo DQ2DQ8 mice. The expression of DQ2 and DQ8 was checked by PCR. Expression levels of DQ2 in AEoDQ2 mice and DQ8 in AEoDQ8 have been described (44, 52). Both AEo DQ2DQ8 and NOD Abo DQ8 mice were weaned and maintained on a GFD (33). For immunization, mice were subcutaneously injected into the tail with an emulsion of Complete Freund's Adjuvant and the following agents: PT-gliadin, a mixture of acidic salivary proteins, a mixture of basic salivary proteins, the unfractionated pool of salivary proteins (all), a natural peptide derived from PRB1 PRB1-pep1 (APPAGQPQGPPRPPQ), and two PRB1-pep1 derivatives with single substitutions PRB1-pep1-Y11 (APPAGQPQGPYRPPQ), and PRB1-pep1-E8 (APPAGQPEGPPRPPQ). Each group contained five mice. After 10 days the mice were euthanized and the lymph nodes were extracted. Proliferation evaluation was based on incorporation of [ 3 H]thymidine (7) wherein each agent was evaluated in triplicate wells. The stimulation index was calculated by dividing the average counts per minute (cpm) of the agent (triplicate wells) by the average cpm of media alone (triplicate wells).

Statistical analysis.

Differences in the stimulation index of DQ2/DQ8 mice studies and ELISA results were analyzed with the Mann-Whitney يو-اختبار. Significance was set at ص < 0.05.


استنتاج

Most recombinant engineered therapeutic proteins are administered to patients as repeated doses, over their lifetime. Generation of ADA is a potential outcome to almost all such therapeutics. These can form ICs with the therapeutic which in turn can drive more ADA formation. Clinical consequences of ADA make a compelling case for early IC formation that is an important consideration whether or not a long-lasting, pharmacologically meaningful ADA response will form. With the advent of personalized treatment, there will be a greater need to monitor underlying differences between individuals who are reactive to a therapeutic and how they impact either their response to treatment or their manifestation of any immunological adverse effects. Clinical decisions in routine practice rarely make use of information on the patient’s immune response to a therapeutic as a basis to understand poor therapeutic response or an unexpected adverse effect to some extent, this has been due to limitations to identify the right dose of the drug required to neutralize the target in the presence of ADA, challenges in ascertaining total amount of ADA, and a general lack of immunogenicity assessments in patients to investigate failure of response after a drug has been approved for market. The semi-quantitative nature of routine ADA assays, and diversity in assay formats and platforms also make it difficult to make meaningful comparisons in immunogenicity data across multiple therapeutics that a clinician might consider for treatment of a specific disease. Instead, the approach has been to switch to an alternate treatment (77) or take advantage of other immunomodulatory agents that negate the titer and impact of ADA. Patients with autoimmune conditions, such as rheumatoid arthritis, spondyloarthritis, and Crohn’s disease, and treated with anti-TNF-α agents have benefited from concomitant methotrexate treatment (87). Clinicians should be aware that formation of ICs and the accompanying risks they entail could persist as long as the same treatment continues unabated even with symptomatic remediation of adverse effects. Despite understanding and mitigating risk from the therapeutic aspect, such as selecting the right molecular structure and sequence, formulation, preventing aggregation, and choosing appropriate routes of dosing, the question on why some individuals and other do not develop clinically significant ADA titers persists and has also been discussed (3). Some aspects, such as genetic differences, HLA allelic variants, underlying disease state, and presence of preexisting reactive T cells and natural antibodies, might shed additional clarity on this variability. However, the formation and contribution of ICs is central to most of the downstream sequelae that are seen following development of ADA. Of particular importance, is the role of IC with low affinity non-neutralizing binding ADA these IC through FcR interaction, complement fixation and subsequent downstream effects on APCs and B cells, further potentiate the ADA response leading to epitope spreading of ADA, formation of neutralizing antibody, ADA affinity maturation and further IC formation. The study of IC biology specific to the therapeutic will shed more light on the role and relationship of ADA to clinical outcome measures.


شاهد الفيديو: تحاليل بداية الحمل من اجل حمل سليم وجنين بصحة جيدة (قد 2022).


تعليقات:

  1. Garran

    الجملة الخاصة بك ببساطة ممتازة

  2. Brigliadoro

    هذه فكرة جيدة.

  3. Fek

    في هذا الشيء. قبل أن أفكر في خلاف ذلك ، أشكرك كثيرًا على مساعدتك في هذا السؤال.

  4. Tesho

    يرجى إعطاء التفاصيل



اكتب رسالة