معلومة

كيف يتسبب تلف الحمض النووي في شيخوخة الخميرة؟

كيف يتسبب تلف الحمض النووي في شيخوخة الخميرة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كما أفهمها ، في شيخوخة الخميرة توجد خلية ابنة وخلية أم. تحتوي الخلية الوليدة على حمض نووي "جديد" وتموت الخلية الأم بعد بعض عمليات التكرار.

ماذا يحدث لتلف الحمض النووي المتراكم في الخلية الأم للخميرة؟

إحدى نظريات شيخوخة الإنسان هي تراكم الضرر في الحمض النووي النووي. خلية الخميرة البنت هي نسخة من الأم ، ولها نفس الحمض النووي. ماذا يحدث لهذا الضرر؟

تحرير للتبسيط: لماذا لا ينتقل تلف الحمض النووي على الإطلاق إلى الخلية الوليدة؟ من الواضح أن آلية الإصلاح لدى البشر ليست مثالية ، لأن تلف الحمض النووي هو إحدى نظريات الشيخوخة الرئيسية. لذا إذا متنا من هذا ، فكيف يمكن للخميرة أن تتغلب على الآثار الضارة لتلف الحمض النووي الذي يسبب الشيخوخة لدى البشر؟


في الخلايا حقيقية النواة لا يوجد فرق بين الخلية الأم والخلية البنت - الأحدث هو نسخة طبق الأصل من الخلية الأم. هذا صحيح بالنسبة للخميرة وكذلك على سبيل المثال بالنسبة للخلايا البشرية. الشيء الوحيد الذي يحدث بمرور الوقت هو أن التيلوميرات الموجودة في نهاية الكروموسومات تصبح أقصر (ما لم يكن للخلية تيلوميراز نشط لا تحتوي عليه معظم الخلايا) وتصل إلى حد Hayflick حيث يؤدي كل انقسام إضافي إلى نقص في ترميز المناطق الصبغية وبالتالي يسبب مشاكل. إذا لم تكتسب الخلايا أي ضرر كروموسومي آخر ولديها موارد كافية ، فسيكون هذا هو الحد الأقصى لمدة حياتها.

بالطبع هناك أضرار في الحمض النووي تحدث بمرور الوقت. يتم إصلاح معظمها إما عن طريق نظام إصلاح تلف الحمض النووي عالي الكفاءة للخلايا حقيقية النواة ، والذي يتكون من نقاط تفتيش مختلفة أثناء دورة الخلية. توجد نقاط التفتيش هذه عند الانتقال بين المراحل المختلفة لدورة الخلية. إذا تم تحديد تلف الحمض النووي ، يتم إيقاف دورة الخلية لتمكين إصلاح تلف الحمض النووي بواسطة بروتينات خاصة ولمنع تعرض الخلايا التالفة للانقسام (هنا تكون نقطة تفتيش G2-M مهمة). يعمل هذا بشكل تخطيطي كما في هذا الشكل (من مقالة ويكيبيديا حول إصلاح الحمض النووي):

إذا تعذر حل ضرر الحمض النووي ، فإن الخلايا إما أن تدخل في الشيخوخة (تدخل أساسًا في حالة نائمة دائمة) أو ستخضع لموت الخلايا المبرمج. إذا كانت هناك أضرار (لأي سبب من الأسباب) لم يتم رصدها أو حدثت أثناء إصلاح فواصل الحمض النووي المزدوج عن طريق الانضمام إلى طرف غير متماثل ، يتم تكرارها وتوريثها من قبل الأجيال الأخرى. ما لم تحدث هذه الأخطاء أثناء عملية النسخ المتماثل ، تكون الخلايا الأم والابنة متطابقة وراثيا.

لذلك تكتسب الخلايا حقيقية النواة تلف الحمض النووي بمرور الوقت (أحد الأسباب التي تجعل الحمل المتأخر يشكل خطرًا أكبر من الحمل المبكر) ، لكننا نختلف عن الخميرة في نقطة واحدة: تحتوي الخميرة على تيلوميراز نشط ، وهو غير نشط في معظم خلايانا ( بشكل رئيسي باستثناء الخلايا الجذعية). إذا جمعت الخلايا الكثير من الأضرار الصبغية فإنها ستموت.

تتعمق المراجع المدرجة أدناه في الموضوع وتكون ممتعة للقراءة.

مراجع:

  1. التنظيم السلبي لنشاط تيلوميراز الخميرة من خلال التفاعل مع منطقة المنبع من التمهيدي DNA
  2. التحكم في دورة الخلية في الكلى.
  3. تطور الاستجابات البيولوجية المتنوعة لتلف الحمض النووي: رؤى من الخميرة و p53
  4. تلف الحمض النووي والقرارات: ينسق CtIP إصلاح الحمض النووي ونقاط فحص دورة الخلية
  5. الاستجابات الخلوية لتلف الحمض النووي: إشارة واحدة ، خيارات متعددة

خلفية النظريات المختلفة للشيخوخة.

هذا الفيديو ، من محاضر كبير في جامعة ليفربول متخصص في الشيخوخة ، يناقش نظريات الشيخوخة. يتطرق إلى نظرية تلف الحمض النووي.

نظرية تلف الحمض النووي للشيخوخة.

لاحظ أنه عند الحديث عن نظرية تلف الحمض النووي ، فإننا نتحدث تحديدًا عن الضرر الذي لحق بعملية تجديد الخلايا من خلال آليات إصلاح تلف الحمض النووي في الخلايا الجذعية.

شيخوخة الطفرات ليست مثل تلف الحمض النووي الذي يسبب الشيخوخة ولا يمكن أن يسبب شيخوخة الخميرة حقًا. فكرة أن الخلايا تتعرض للضرر بمرور الوقت بسبب الحمض النووي الطافر تختلف اختلافًا جوهريًا عن نظرية تلف الحمض النووي للشيخوخة. تمت تغطية الآليات التي تؤدي إلى تلف الحمض النووي جيدًا في إجابةChris.

التأثير الجهازي المقترح لتلف الحمض النووي في جسم الإنسان يتسبب في عدم القدرة على تجديد الخلايا بسبب نقص الخلايا الجذعية القابلة للحياة. هذا يساهم في عملية الشيخوخة في الكائن الحي.

في الخميرة ، لا تحدث عملية استنفاد الخلايا الجذعية (فهي تتكون من خلية واحدة في الغالب). في التعليقات ، يبدو أنك تتحدث بالفعل عن الشيخوخة القائمة على الطفرات في سؤالك الأصلي. يتم تمرير الطفرات إلى الخلايا الوليدة. ولكن لا يبدو أن هذه الخلايا الوليدة تتقدم في العمر أو تموت بشكل أسرع (إذا كان عمر الخلية الأبوية 5 أيام ، فلا يبدو أن الخلية الوليدة عمرها 5 أيام). هذا هو السبب الأساسي وراء عدم دراسة هذا النوع من الشيخوخة - ليس من المنطقي حقًا أن الطفرات العامة تسبب الشيخوخة.

ملخص

للإجابة مباشرة على السؤال: "كيف يتسبب تلف الحمض النووي في شيخوخة الخميرة؟"

لا يلتقط السؤال الصورة الكاملة تمامًا ويخلط بين نظرية تلف الحمض النووي لشيخوخة الحيوانات وتلف الحمض النووي العام على المستوى الخلوي.

هناك العديد من النظريات المتعلقة بالشيخوخة. لا أحد يعرف أيها له تأثير أكثر أو أقل على الشيخوخة. تعتبر الخميرة نموذجًا جيدًا لبعض أنواع نمذجة نظرية العمر ، ولكن ربما ليس في حالة الشيخوخة القائمة على تلف الحمض النووي. على الرغم من أنهم يعانون من تلف الحمض النووي على شكل طفرة ، فإن هذا لا يسبب الشيخوخة بنفس الطريقة التي قد يتسبب بها تلف الحمض النووي في شيخوخة البشر لأنهم كائنات وحيدة الخلية ، ولا يعانون من نفس العلاقات بين الأنسجة الأكثر تعقيدًا. الكائنات الحية.


عمليات التحرير

تم تغيير هذه الإجابة على نطاق واسع منذ المسودة الأولى بناءً على أسئلة واستفسارات إضافية من OP في التعليقات. قررت الاحتفاظ ببعض النقاط المهمة التي أثيرت ورُفضت.

لماذا لا يتم نقل تلف الحمض النووي على الإطلاق إلى الخلية الوليدة؟

يمكن أن يحدث تلف الحمض النووي و يكون إلى زنزانة الابنة. الضرر نادر جدا بالرغم من ذلك.

فكيف تعيش الخميرة؟ الخلايا الجذعية البشرية تتقدم في العمر وتموت ، أو تصاب بالسرطان. لكن الخميرة لا. يبدأ الإنسان من خلية واحدة. و مت. تبدأ الخميرة من خلية واحدة وتعيش إلى الأبد (تنقسم مرارًا وتكرارًا)

تحرير بعد التعليقات:

خلية واحدة

في الخميرة لا توجد أنظمة بين الأنسجة. يتم تمرير الضرر المتحول ببساطة إذا كانت الخلية قابلة للحياة. كما أن الافتراض بأنهم يعيشون إلى الأبد ليس دقيقًا تمامًا. لكن الحمض النووي ينتقل في شكله المتحور أو التالف.

متعدد الخلايا

يعد تلف الحمض النووي الناتج عن الشيخوخة مشكلة كبيرة للحيوانات. (دوللي وآخرون 2013) أظهر أن تلف الحمض النووي لمسار إصلاح واحد يؤدي إلى تسريع الشيخوخة ، (لكن لاحظ أنه لم تكن هناك زيادة في الطفرة أثناء هذه الشيخوخة).

لكنك تتحدث عن السرطان ، إنه ليس مثالاً جيدًا ، خطأي. لكن الشيخوخة في البشر ليست كالسرطان - فهي تحدث في كل الجسم وجميع الخلايا. لذلك يوجد بعض التلف في الحمض النووي في جميع الخلايا.

تعديل آخر: كنت محقًا في الحديث عن السرطان في هذا السياق. نظرية تلف الحمض النووي للشيخوخة هي أن التغييرات الصغيرة (التلف) في الحمض النووي لدينا تتراكم بمرور الوقت وتتلف أنواع الخلايا عن طريق إتلاف مسارات إصلاح الحمض النووي المختلفة.

يتراكم الضرر وبمرور الوقت تصبح الخلايا الجذعية الأقل قابلة للتجديد ويبطئ الإصلاح الخلوي للخلايا التالفة الأخرى.

كما يمكن أن يؤدي نفس المبدأ الأساسي للضرر الطفري الذي يحدث بمرور الوقت إلى حدوث طفرات تؤدي إلى إيقاف آليات التحكم في الخلايا وتؤدي إلى الإصابة بالسرطان. على الرغم من أن هذه الطفرات لا تزداد مع تقدم العمر (Hill وآخرون.، 2005).

على سبيل المثال ، يعيش فأر الخلد العاري 10 أضعاف الأنواع المماثلة (أقل شيخوخة) ولم يُلاحظ أنه يصاب بالسرطان بشكل طبيعي (أقل من السرطان). تشير النظرية إلى أن الأمرين مرتبطان تمامًا بسبب الطريقة التي يتغير بها الحمض النووي ، ولكن لا يعني أن الطفرة تحديدًا هي سبب أو نتيجة للشيخوخة.

أتحدث أكثر عن الشيخوخة. لأن هناك شيخوخة في الخميرة. وإحدى نظريات الشيخوخة للإنسان - تلف الحمض النووي المتراكم. وماذا في ذلك كريس الكتابة هي أنها نادرة حقًا.

** تلف الخلايا الجذعية. ** لم أعد متأكدًا تمامًا مما تعنيه بالشيخوخة في الخميرة. لا تعتمد الخميرة على عدد محدود من الخلايا الجذعية لتجديد الخلايا ، فهي لا تتقدم في العمر بالطريقة التي قد تفكر بها. إنها ببساطة تكاثر نوع الخلية الطافرة. لا يوجد تأثير على كائن حي أكبر كما هو الحال في شيخوخة الإنسان.

تلف الحمض النووي. الخميرة هي كائن حي مفيد للغاية لفهم الكيمياء الحيوية الأساسية وعلم الوراثة للشيخوخة ، وليس أنظمة الشيخوخة الشاملة. هذان مجالان مختلفان للدراسة. ليس من الواضح ما الذي تتحدث عنه في هذه المرحلة.

هناك أيضًا شيخوخة في الأماكن التي لا توجد فيها خلايا جذعية - مثل الدماغ - لا يوجد تجديد للخلايا ، فقط الخلايا الموجودة تتقدم في العمر وتتلف وتموت ولا يتم استبدالها.

وجد Dolle 2006 أن التلف التلقائي للحمض النووي المرتبط بالعمر يحدث في الكبد وليس الدماغ.


الإجهاد التأكسدي والشيخوخة: التعلم من دروس الخميرة

الخميرة خميرة الخميرة لعب دورًا حيويًا في فهم الأساس الجزيئي للشيخوخة وعلاقة عملية الشيخوخة بالإجهاد التأكسدي (التراكم غير المتماثل لأنواع الأكسجين التفاعلية ، ROS). تتشابه استجابات مضادات الأكسدة في الثدييات والخميرة ، وأكثر من 25٪ من الجينات المرتبطة بالأمراض التنكسية البشرية لها متماثلات قريبة في الخميرة. تسهل التكرار الوراثي المنخفض للخميرة تصور تأثير الجين المحذوف أو المتحور. من خلال التلاعب بظروف النمو ، يمكن لخلايا الخميرة البقاء على قيد الحياة فقط في حالة التخمر (انخفاض مستويات ROS) أو التنفس (زيادة مستويات ROS) ، مما يسهل توضيح الآليات التي ينطوي عليها اكتساب تحمل الإجهاد التأكسدي. علاوة على ذلك ، فإن قواعد بيانات الخميرة هي الأكثر اكتمالا من بين جميع نماذج حقيقيات النوى. في هذا العمل ، نسلط الضوء على قيمة S. cerevisiae كنموذج للتحقيق في استجابة الإجهاد التأكسدي وتأثيره المحتمل على الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر.


مقدمة

يتم الحفاظ على استقرار نهايات الكروموسوم في خلايا الخميرة بواسطة مركب DNA – بروتين خاص بالتيلومير (Lydall ، 2003). المكون الرئيسي لغطاء التيلومير هو بروتين ربط الحمض النووي أحادي السلسلة ، Cdc13p (Nugent et al. ، 1996). في cdc13-1 متحولة حاضنة في درجة حرارة غير سائلة ، يتم التعرف على التيلوميرات غير المغطاة على أنها فواصل مزدوجة ، مما يؤدي إلى تراكم الحمض النووي أحادي الجديلة في نهايات الكروموسومات (Garvik et al. ، 1995 Maringele and Lydall ، 2002) ، مما يؤدي إلى نقطة تفتيش لتلف الحمض النووي إشارة (Garvik et al. ، 1995) وتعزيز إيقاف دورة الخلية الطرفية في G2 / M (Weinert and Hartwell ، 1993). عندما تُعاد هذه الخلايا إلى درجة الحرارة المسموح بها بعد توقف طويل الأمد ، يتعافى جزء صغير منها فقط. يُعزى موت الخلية هذا إلى فقدان الجينات الأساسية الموجودة في المناطق الفرعية التيلوميرية (Garvik et al. ، 1995 Booth et al. ، 2001) ، وتحويل الحمض النووي أحادي الجديلة في التيلوميرات إلى آفات مميتة لم يتم إصلاحها (Jia et al. ، 2004) ) ، و / أو تكوين اندماج الكروموسوم من طرف إلى طرف (DuBois et al. ، 2002).

في الآونة الأخيرة ، Qi et al. (2003) أظهر أن الاحتضار cdc13-1 تعرض الخلايا علامات النمط الظاهري لموت الخلايا المبرمج مثل التعرض للفوسفاتيديل سيرين على النشرة الخارجية لغشاء البلازما ، وتراكم أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) ، وتحريض نشاط كاسباس على أساس الاحتفاظ بمثبط الكاسبيز FITC-VAD-FMK. يسمح ربط تسلسل valyl-alanyl-aspartyl (VAD) بكاسبيز الثدييات المنشط لشق فلوروميثيل كيتون (FMK) بالتفاعل مع سيستين الموقع النشط ، مما يؤدي إلى تعطيل وضع العلامات الفلورية للبروتين (Grabarek and Darzynkiewicz ، 2002). الخميرة تعبر عن بروتياز واحد يشبه كاسباس ، Yca1p. مثل الكاسبيسات في الثدييات ، يخضع Yca1p للانقسام ، مما ينشط نشاطه التحلل للبروتين تجاه العديد من ركائز الكاسباس الاصطناعية في المختبر (Madeo et al. ، 2002a). يمكن تثبيط نشاط Yca1p بواسطة Z-VAD-FMK (Madeo et al. ، 2002a). يمكن غسل FITC-VAD-FMK غير المشقوق بسهولة من الخلايا القابلة للحياة ، لكن الخلايا الميتة تحتفظ بـ FITC ويمكن اكتشافها عن طريق التألق الأخضر في قياس التدفق الخلوي. وهكذا ، فإن وضع العلامات في الجسم الحي على الخميرة باستخدام FITC-VAD-FMK يُعزى إلى تنشيط كاسباس النية (Madeo et al.، 2002a Qi et al.، 2003 Herker et al.، 2004 Wadskog et al.، 2004). حذف MEC1، وهو متماثل للخميرة ATM / ATR kinase ، منع هذا cdc13-1 موت الخلايا المبرمج ، مما يشير إلى أن التيلوميرات غير المحمية تولد a MEC1- إشارة موت موت الخلايا المبرمج (Qi et al. ، 2003).

في هذا التقرير ، نوضح أن موت الخلايا الناجم عن تعطيل Cdc13p لا يعتمد على بروتياز Yca1 الذي يشبه كاسباس أو زيادة إنتاج ROS. نوضح كذلك أن قياسات التدفق الخلوي لنشاط الكاسباس وإنتاج ROS ، باستخدام مثبطات الكاسبيز المقترنة بالفلوروكروم و dihydrorhodamine 123 (DHR123) ، على التوالي ، مرتبكة من خلال الارتباط بخلايا الخميرة الميتة بالفعل. يشير هذا العمل إلى أن تحليل التدفق الخلوي لخلايا الخميرة المحتضرة يخضع لأشكال مهمة ويشير إلى الحاجة إلى إعادة تفسير النتائج السابقة على آليات موت خلايا الخميرة.


المواد والأساليب

سلالات الخميرة والوسائط

سلالة خميرة من النوع البري (4741) وطفرة تكاثر الحمض النووي المتماثل (4741dna2-1) (Kuo and Campbell، 1983) تم استخدامها لجميع التجارب. تم استخدام وسائط YPD السائلة (2 ٪ جلوكوز ، 1 ٪ مستخلص الخميرة ، 2 ٪ ببتون) لزراعة خلايا الخميرة عند 24 & # x000b0C ، درجة حرارة النمو المسموح بها dna2-1 أضنى.

عزل الخلايا القديمة والشابة بواسطة Elutriation

لعزل الزنازين الصغار والكبار ، يقوم WT4741 سلالة وسلالة isogenic التي تحتوي على dna2-1 طفره، 4741dna2-1، تم تخفيفها بشكل مناسب ونمت عند 24 & # x000b0C في لترين من YPD تحتوي على 35 & # x003bcg / ml كلورامفينيكول. خلايا من النوع البري ، WT4741، نمت لأول مرة من أجل & # x0223c10 أجيال (A.600 = 10). ثم تم عزل الخلايا القديمة 3 & # x000d7 10 8 10 جيل عن طريق التصفية ثم تم تلقيحها في لترين من وسط YPD الطازج ونمت مرة أخرى لـ & # x0223c8 أجيال (A600 = 1.5). تم عزل كل من الخلايا الصغيرة (من 1 إلى 3 أجيال) والخلايا القديمة (16-18 جيلًا) عن طريق التصفية الثانية ، مما أدى إلى 2 & # x000d7 10 9 خلايا شابة و 4.8 & # x000d7 10 8 خلايا قديمة. تم تجميد الخلايا بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 & # x000b0C. لاحظ أن استخلاص الحمض النووي الريبي لم يتم إجراؤه على الخلايا البرية من 1 إلى 3 جيل و 10 جيل من الخلايا البرية التي تم حصادها في A600 = 10. نمت الثقافة الأخيرة للخلايا من النوع البري إلى مثل هذه الكثافة العالية لتجنب القيام بثلاث عمليات التصفية لكل مزرعة ، وبالتالي تقليل وقت التحضير. تم حصاد الخلايا الشابة من النوع البري والخلايا البرية البالغة من العمر 18 جيل والمستخدمة لاستخراج الحمض النووي الريبي أقل بكثير من حد diauxie بناءً على كثافة الثقافة في وقت التجميع (& # x0003c3.2) (DeRisi وآخرون., 1997 ).

لعزل الصغار والكبار dna2-1 الخلايا الطافرة ، 5 & # x000d7 10 8 4741dna2-1 تم تلقيح الخلايا التي تنمو بشكل أسي في لترين من YPD تحتوي على 35 & # x003bcg / ml كلورامفينيكول ونمت من أجل & # x0223c8 أجيال عند 24 & # x000b0C (A600 = 1.5-2). شاب و مسن 4741dna2-1 تم فصل الخلايا عن طريق التصفية. لقد جمعنا 1.2 & # x000d7 10 9 من 1 إلى 3 من الخلايا القديمة ، وكان عائد الخلايا القديمة من 8 أجيال 3.6 & # x000d7 10 8. مرة أخرى ، تم الحرص على الحصاد قبل فترة طويلة من التحول diauxic. تم تجميد عينات من الخلايا الصغيرة والكبيرة في النيتروجين السائل بسرعة وتخزينها في -80 & # x000b0C.

يمكن العثور على وصف كامل لتقنية التفريغ في (Diamond، 1991). باختصار ، تم غسل كريات الخلايا التي تم حصادها من الثقافات المتزايدة بشكل أسي في محلول ملحي بالفوسفات (PBS 136.89 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 2.68 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 5.37 ملي مولار الصوديوم.2HPO4، 1.76 ملم خ2ص4، ودرجة الحموضة 7.4) ، وخلايا معلقة في 20 مل من PBS وألبومين مصل البقر (2 ملغ / مل). تم فصل كتل الخلايا عن طريق التشعيع الصوتي (30 ثانية) ، وتم ترشيح معلق الخلية بشبكة (3-64 / 32 NITEX Tetko ، Briarcliff Manor ، NY). تم بعد ذلك تحميل غرفة التخصيب بـ 20 مل من المعلق الخلوي المطابق لـ & # x0223c3 & # x000d7 10 11 خلية (2 لتر من الثقافة ، A600 = 10 ، التصفية الأولى) WT4741 و & # x0223c7 & # x000d7 10 10 خلايا من أجل 4741 dna2-1 (2 لتر من الثقافة ، أ600 = 2). الشباب البرية من نوع و dna2-1 تم عزل الخلايا عن طريق تثبيت معدل تدفق الماء المحقون في جهاز الطرد المركزي عند 45 مل / دقيقة وسرعة دوار جهاز الطرد المركزي عند 1400 دورة في الدقيقة. القديمة البرية من نوع و dna2-1 تم التخلص من الخلايا عن طريق تثبيت معدل التدفق عند 85 مل / دقيقة وسرعة الدوار ، على التوالي ، عند 900 دورة في الدقيقة و 1550 دورة في الدقيقة (جهاز الطرد المركزي J-6M مع الدوار JE-10 & # x000d7 بيكمان كولتر ، فوليرتون ، كاليفورنيا). استغرق تحضير الخلايا قبل التحميل في elutriator & # x0223c1 h. بمجرد التحميل ، تم عزل الخلايا الصغيرة في غضون 30 دقيقة عند 24 & # x000b0C ثم وضعها في 4 & # x000b0C. استغرق الأمر & # x0223c3 h لعزل كسور الخلايا القديمة. أما بالنسبة للخلايا الفتية ، فقد أجرينا استخلاص الخلايا القديمة عند درجة حرارة 24 & # x000b0C ، ثم تم وضع الخلايا في 4 & # x000b0C. كشف تحليل التدفق الخلوي أن توزيع دورة الخلية كان هو نفسه بالنسبة للخلايا المخصبة وغير المغذية.

تلطيخ Calcofluor

لقد قمنا بتلوين الخلايا الصغيرة والكبيرة التي تم تفريغها باستخدام منير الفلورسنت (Calcofluor White M2R Tinopal UNPA-GX # F3543) لحساب ندوب البراعم وتحديد عمر الخلايا المعزولة عن طريق التصفية. تم غسل حوالي 10 6 خلايا مرة واحدة في 150 & # x003bcl من 1 M سوربيتول وتم تعليقها في 150 & # x003bcl من منير الفلورسنت (10 مجم / مل) لمدة 5 دقائق عند 4 & # x000b0 درجة مئوية. بعد غسلها أربع مرات باستخدام 1 M من السوربيتول الطازج ، تم تعليق الخلايا في 20 & # x003bcl من 1 M من السوربيتول ثم تمت ملاحظتها تحت منظار أكسيوسكوب مضان (Carl Zeiss ، Jena ، ألمانيا).

التألق المناعي غير المباشر

تمت مراقبة النوى بواسطة التألق المناعي غير المباشر باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة ضد البروتين النووي الوفير Nop1 (Aris and Blobel، 1988 Mays Hoopes وآخرون. ، 2002). بعد الحضانة لمدة ساعة مع محلول فوسفات البوتاسيوم (KPO4) ، كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) ، و 37 ٪ فورمالدهايد ، تم وضع الخلايا في محلول سوربيتول 2 ميكرولتر ومعالجتها بـ Zymolyase (0.3 مجم / مل Zymolyase 20T ، 0.1٪ & # x003b2-mercaptoethanol) عند 30 & # x000b0C لمدة 45 دقيقة WT4741 سلالة و 15 دقيقة ل 4741dna2-1 أضنى. تم بعد ذلك تثبيت الخلايا على شرائح مطلية بالتفلون ثمانية آبار ومعالجة مسبقًا بـ 0.1 ٪ بوليسين 6040805 ICN Biomedicals ، كوستا ميسا ، كاليفورنيا). بعد 15 دقيقة في محلول الحجب (PBS ، 0.5٪ ألبومين مصل بقري ، 0.5٪ ألبومين دجاج ، 0.5٪ توين 20) ، تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة الأولية المخففة عند 1: 2000 في محلول الكتلة لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك غسل الخلايا أربع مرات في محلول مانع للحظر واحتضانها لمدة ساعتين باستخدام الجسم المضاد الثانوي ، وتم تخفيف الأرانب المضادة للفأر عند 1: 5000 في محلول مانع. بعد الحضانة ، تم غسل الخلايا أربع مرات في محلول مانع وتكلفتها على الفور بـ 4 & # x02032،6 & # x02032-diamidino-2-phenylindole (DAPI). تم استخدام DAPI عند 50 نانوغرام / مل كما هو موضح سابقًا (Mays Hoopes وآخرون. ، 2002). ثم لوحظت الخلايا تحت أكسيوسكوب مضان (كارل زايس) مقترنًا بكاميرا Orca 2 (هاماماتسو ، بريدجووتر ، نيوجيرسي).

التدفق الخلوي

لتحليل التدفق الخلوي ، تم إصلاح العينات في 70 ٪ من الإيثانول. بعد هضم طوال الليل باستخدام RNase I (8 مجم / مل في برنامج تلفزيوني) عند 37 & # x000b0C وهضم 4 ساعات مع بروتيناز K (1 مجم / مل) عند 50 & # x000b0C ، تم إعادة تعليق الخلايا في بروبيديوم يوديد في PBS (50 & # x003bcg / ml) ، صوتنة (دورة عمل خرج 3-20٪ ، 15 ثانية) ومفلترة بشبكة (3-64 / 32 NITEX Tetko). سلالة التحكم (WT4741) بشكل غير متزامن عند 24 & # x000b0C (مع & # x0223c52 ٪ من خلايا سلالة التحكم التي تحتوي على 1C و 48 ٪ بها محتوى 2C) وحتى التشبع لتحديد ذروة 1C (100 ٪ بها محتوى 1C).

تجارب وتحليل ميكروأري الحمض النووي

تم عزل الخلايا البرية القديمة والشابة كما هو موضح تحت & # x0201c عزل الخلايا الصغيرة والقديمة بواسطة Elutriation. & # x0201d الخلايا المخصبة من ست تجارب من هذا القبيل (إجمالي 12 لترًا) ، ينتج عنها 4.8 & # x000d7 10 8 خلايا لكل منها ، تم تجميعها. تم استخدام عينات من هذه الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي المتعدد (انظر أدناه). الكبار والصغار dna2-1 تم عزل الخلايا كما هو موصوف تحت & # x0201c عزل الخلايا الشابة والقديمة بواسطة Elutriation. & # x0201d تم تجميع الخلايا المخصبة من ثماني تجارب من هذا القبيل (إجمالي 16 لترًا) ، ينتج عنها 3.6 & # x000d7 10 8 خلايا لكل منهما. تم استخدام عينات من هذه الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي المتعدد (انظر أدناه).

تم إجراء عمليات استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام كلوروفورم ساخن / الفينول متبوعًا بعمود Rneasy (74104 QIAGEN ، فالنسيا ، كاليفورنيا). تم تصنيع (كدنا) باستخدام أوليجو (dT) التمهيدي (18418-012 Invitrogen ، Carlsbad ، CA) ونسخة عكسية Powerscript (8460-1 BD Biosciences Clontech ، Palo Alto ، CA) باستخدام 60 & # x003bcg من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل تفاعل. تم تصنيف (كدنا) أثناء النسخ العكسي باستخدام إما dCTP المسمى Cy5 (أحمر ، PA55021 Amersham Biosciences ، Piscataway ، NJ) ، أو Cy3 المسمى dCTP (أخضر ، PA53021 Amersham ، Biosciences) ، وفقًا لتوجيهات المورد (BD Biosciences Clontech ). تم استخدام الاستعدادات المستقلة RNA لكل إعداد (كدنا).

تم تحديد مستويات الحمض النووي الريبي في الخلايا الصغيرة والكبيرة في نسختين لكل سلالة بطريقة قياس النسب باستخدام تحليل تهجين المصفوفات الدقيقة. أجرينا تجربتي تحكم (واحدة للنوع البري والأخرى من أجل dna2-1) ، والذي يتألف من تحديد مستويات الحمض النووي الريبي في الخلايا الشابة من نفس السلالة ، بدلاً من تسميتها بـ Cy3 و Cy5. أجرينا أيضًا أربع تجارب تهجين تتألف من مقارنة بين مستويات الحمض النووي الريبي في الخلايا الشابة والخلايا القديمة من نفس السلالة. لكل سلالة ، من النوع البري و dna2-1، تم إجراء تجربتين تهجين. في التجربة الأولى ، تم استخدام Cy3 لإعداد (كدنا) من الخلايا الشابة و Cy5 للخلايا القديمة. في التجربة الثانية ، تم تبديل الأصباغ لإزالة أي تحيز قد يكون ناتجًا عن الاختلافات الجينية في دمج الصباغين. على سبيل المثال ، تم استخدام كميات متساوية من الأصباغ ذات العلامات Cy3 و Cy5 ، المرفقة مع cDNAs الخاصة بها ، لكل مجموعة (على الأقل 20 pmol). بالإضافة إلى ذلك ، كما ذكر للتو ، تم استخدام عزلات RNA مستقلة لكل تحضير (كدنا) للتحكم في الاختلافات المحتملة بسبب إجراءات الاستخراج. تم إجراء عمليات التهجين على المصفوفات الدقيقة للحمض النووي من تقنية Corning Microarrays Technology (Fountain Valley ، كاليفورنيا). يحتوي الإصدار 1.31 من صفيف الجينات CMT Yeast-S228c على & # x0003e6160 منتجات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (& # x0223c1 kb) التي تمثل إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) من التسلسل الكامل S. cerevisiae الجينوم ، بالإضافة إلى 108 جينات تحكم من العصوية الرقيقة. من أجل التهجين ، تم تحضين المصفوفات الدقيقة في 50 & # x003bcl من محلول التهجين (1 ٪ من حيوانات منوية السلمون الصوتية ، 24.75 ٪ فورماميد ، 4.95 & # x000d7 SSC ، 0.099 ٪ SDS ، و 0.99 مم ديثيوثريتول) لمدة 10-18 ساعة عند 42 & # x000b0C . بعد الغسيل (دقيقة واحدة في 2 & # x000d7 SSC ، 0.1٪ SDS عند 42 & # x000b0C 5 دقائق في حل جديد من 2 & # x000d7 SSC ، 0.1٪ SDS عند 42 & # x000d7C 10 دقائق في 0.1 & # x000d7 SSC ، 0.1٪ SDS 15 s ، 2 min ، 2 min ، و 1 min في 0.1 & # x000d7 SSC 15 s في 0.01 & # x000d7 SSC) ، تم الحصول على صور منفصلة لكل صبغة ، وتم الحصول على نسب شدة التألق لجميع الجينات (Genepix-Pro3.0 ماسح أكسون 4000A).

أجرينا التحليل باستخدام MArray ، وهو برنامج يسمح للمستخدم بتحليل مجموعات بيانات ميكروأري مفردة أو مقترنة (Wang وآخرون. ، 2002). يحدد MArray جودة تجارب ميكروأري ويقيم قابلية تكرار التجارب المكررة. يتكون التحليل من ثلاث خطوات: التصفية والتطبيع والتفسير. أثناء التصفية ، تمت إزالة جميع النقاط الفارغة أو التي تم وضع علامة عليها بشكل سلبي (يتم توفير معامل العلم بواسطة ملف Genepix) (انظر البيانات التكميلية http://woldlab.caltech.edu/

lesur / old_and_young_cells / MArray_output.pdf). استبعدنا الجينات التي لم تُظهر ملف تعريف تعبير متسقًا في التكرارات (على سبيل المثال ، الجينات التي تم التعبير عنها بدرجة أكبر في الخلايا الشابة من النوع البري في التجربة الأولى ولكن تم التعبير عنها بعد ذلك بدرجة أكبر في الخلايا البرية القديمة في التجربة المتكررة). بعد كل التصفية ، 5733 جينات من النوع البري و 6141 dna2-1 تركت الجينات. تم ضبط الحد الأدنى من شدة الإشارة لكل بقعة على الصفر. استخدمنا تجربتي تحكم لتحديد الضوضاء الناتجة عن التقنية في حد ذاتها ، وخاصة تحيز الصبغة ، ولتحديد عتبات تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بشكل كبير في الخلايا القديمة أو الشابة في كل سلالة. هذا يحدد حدود الشدة لتفسير المصفوفات التجريبية. ثم قمنا بتطبيع شدة الخلايا الشابة / القديمة باستخدام التطبيع المعتمد على الكثافة للنسب كما وصفه يانغ وآخرون. (2002). يتم تقديم البيانات كخلفية مطروحة ، ونسب صغار / كبار السن طبيعية لكل مجموعة. لكل سلالة ، نسب التعبير المبلغ عنها هي متوسط ​​نسبتي التعبير للخلايا الصغيرة / الخلايا القديمة بعد تطبيع التهجين اللذين تم فيهما عكس الأصباغ الفلورية Cy3 و Cy5 (انظر الجداول في البيانات التكميلية). لإثبات إمكانية تكرار نتائج التهجين ، قمنا بحساب معاملات الارتباط لكل مجموعة من التجارب المعكوسة.

تم إجراء التجربة بأكملها مرة أخرى لمقارنة الخلايا الشابة المعزولة دون التصفية مع الخلايا القديمة المعزولة عن طريق التصفية. تراجعت الجينات التي تم تنشيطها في نفس المسارات المحددة في البيانات المبلغ عنها. لم يتم تضمين النتائج لأن الخلايا الشابة لم يتم عزلها عن طريق التصفية كما كانت في مجموعة البيانات المقدمة هنا ، مما يجعل حساب متوسط ​​البيانات مستحيلًا. ومع ذلك ، من الجدير بالذكر أن النتائج تتداخل بشكل كبير وتؤدي إلى تفسيرات متطابقة.

قاعدة بيانات بروتينات الخميرة (http://www.incyte.com/proteome/mainmenu.jps) ، وقاعدة بيانات جينوم Saccharomyces (http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces) ، وشروح الخميرة الشاملة MIPS تم استخدام قاعدة بيانات الجينوم (http://mips.gsf.de/proj/yeast/CYGD/db/index.html) لتفسير ملفات تعريف التعبير. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مقارنة نتائجنا مع قواعد البيانات التي تم إنشاؤها مؤخرًا والتي تصف استجابات النسخ في الخميرة للضغوط البيئية المختلفة ، والظروف التي تطيل العمر الافتراضي ، والطفرات المختلفة التي تؤدي إلى تلف الكروموسوم أو إصلاحه ، كانت ذات قيمة (Jelinsky and Samson، 1999 Gasch وآخرون. ، 2000 ، 2001 جيلينسكي وآخرون. ، 2000 مندوب وآخرون. ، 2000 Kaeberlein وآخرون. ، 2002 لين وآخرون. ، 2001 لين وآخرون., 2002 ).

النسخ العكسي الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR

تم إجراء تأكيد للنصوص المعبر عنها تفاضليًا باستخدام نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي iCycler IQ (Bio-Rad ، Hercules ، CA) على cDNA التي تم الحصول عليها من الخلايا القديمة والشابة المعزولة بنظام التصفية. تم الحصول على إجمالي الحمض النووي الريبي من كل عينة وتم معالجته باستخدام ديوكسي ريبونوكلياز (كتالوج رقم 1906 أمبيون ، أوستن ، تكساس) لإزالة تلوث الحمض النووي. تم تصنيع (كدنا) باستخدام 5 & # x003bcg من الحمض النووي الريبي ومجموعة التوليف iScript cDNA من Bio-Rad (الكتالوج رقم 170-8891).

تم تضخيم أربعة ميكرولتر من التخفيف التسلسلي 10 أضعاف (10 و 100 و 1000 و 10000) من cDNA الذي تم الحصول عليه عن طريق النسخ العكسي في مزيج تفاعل 25 - & # x003bcl يحتوي على 1 & # x000d7 SYBR Green Supermix (كتالوج رقم 170-8880 Bio-Rad) و 25 مساءً من كل تمهيدي. تم تشغيل كل عينة في ثلاث نسخ. بعد 3 دقائق طق خطوة التنشيط عند 95 & # x000b0C ، تعرضت التفاعلات إلى 50 دورة من 10-s تمسخ عند 95 & # x000b0C و 10-s امتداد عند 54 & # x000b0C. تم شراء مواد التمهيدي من IDT Integrated Technologies (Coraville ، IA). تم اختيار أزواج التمهيدي لتقليل dimerization التمهيدي ولتوليد amplicon بين 100 و 150 زوجًا أساسيًا. تم جمع البيانات الضوئية أثناء خطوة التلدين لكل دورة. بعد PCR ، صهرت منتجات التفاعل لمدة دقيقة واحدة عند 95 & # x000b0C ثم تم ضبط درجة الحرارة على 54 & # x000b0C وزادت إلى 94 & # x000b0C بزيادات 0.5 & # x000b0C. تم جمع البيانات البصرية خلال فترة زيادة درجة الحرارة. تم إجراء ذلك للتأكد من تضخيم منتج PCR واحد فقط لكل تفاعل.

تم تحديد التعبير النسبي لمنتجات RT-PCR باستخدام النموذج الرياضي من MW Pfaffl (Pfaffl ، 2001). يحسب هذا النموذج التعبير النسبي باستخدام نسبة المعادلة = [(Eاستهداف) & # x00394Ct target (control - sample)] / [(E.المرجع) & # x00394Ct المرجع (عنصر تحكم - عينة)]. يتم التعبير عن نسبة الجين المستهدف في عينة مقابل عنصر تحكم مقارنة بجين مرجعي. هاستهداف هي كفاءة PCR في الوقت الحقيقي لنسخة الجينات المستهدفة ، Eالمرجع هي كفاءة PCR في الوقت الفعلي لنسخة الجينات المرجعية ، & # x00394Ctاستهداف هو انحراف Ct للتحكم - عينة من نسخة الجين الهدف ، و & # x00394Ctالمرجع = Ct انحراف عن السيطرة - عينة من نسخة الجينات المرجعية. الجين المرجعي الذي استخدمناه هو TUB1 لأنها نسخة مستقرة غير منظمة في كل مجموعة من مجموعات بيانات المصفوفات الدقيقة الخاصة بنا. تمت دراسة تسعة جينات مستهدفة تنتمي إلى المسار التأشبي في النوع البري و dna2-1 سلالات. لحساب نسبة الخلايا القديمة / الخلايا الشابة ، يجب معرفة كفاءات PCR الفردية في الوقت الفعلي (E) والانحراف & # x00394Ct. حسبنا الكفاءات وفقًا لـ E = 10 [-1 / ميل]. نظرًا لأن كل عينة تم تشغيلها في ثلاث نسخ ، فقد تم استخدام متوسط ​​قيمة Ct في المعادلة وكانت قيم & # x00394Ct هي الاختلافات في متوسط ​​قيم Ct بين الخلايا القديمة والشابة لنفس الجين. تم اختيار عينة التحكم التي تحتوي على نفس تركيز (كدنا) لمقارنتها مع الجين المستهدف.


النتائج

تحريض الموت بواسطة بيروكسيد الهيدروجين وحمض الخليك والصدمة المفرطة

اخترنا بيروكسيد الهيدروجين وحمض الخليك لتحفيز النمط الظاهري PCD و TUNEL الإيجابي في S. cerevisiae، لتحديد طبيعة آفات الحمض النووي المكتشفة بواسطة مقايسة TUNEL. يتميز موت الخلايا الشبيه بالاستماتة الناتج عن هذين المركبين على نطاق واسع بالعديد من المختبرات (Madeo وآخرون. ، 1999 ، 2002 لودوفيكو وآخرون. ، 2001 أ ، 2002 فابريزيو وآخرون. ، 2004 ويسينج وآخرون. ، 2004 جاناتاسيو وآخرون، 2005). تم وصف صدمة فرط التماثل بنسبة 60 ٪ (وزن / وزن) من الجلوكوز مؤخرًا أيضًا للحث على النمط الظاهري الإيجابي لـ TUNEL بالإضافة إلى علامات موت الخلايا المبرمج الأخرى (Silva وآخرون، 2005). نمت الخلايا في مرحلة ما قبل الاستزراع بين عشية وضحاها ثم لمدة جيلين في وسط طازج قبل المعالجة ببيروكسيد الهيدروجين أو حمض الخليك أو 60٪ (وزن / وزن) جلوكوز ، كما هو موصوف في المواد والأساليب. تم أخذ العينات في الوقت صفر وفي نقاط زمنية مختلفة ، كما هو موضح في الشكل 1. تم نشر الخلايا على وسط YPD الصلب وتم حساب وحدات تشكيل المستعمرة (cf.u.) بعد 3 أيام من الحضانة. تم حساب نسبة البقاء على قيد الحياة على أنها عدد c.f.u. تم الحصول عليها في كل نقطة زمنية مقسومة على عدد c.f.u. تم الحصول عليها في الوقت 0. بدأ العلاج بـ 10 ملي بيروكسيد الهيدروجين موت الخلية (الشكل 1 أ) دون مرحلة التأخر. أظهر موت الخلية بحمض الخليك 175 ملي مولار عند درجة الحموضة 3.0 مرحلة تأخر أولية قدرها 30 دقيقة ، قبل أن يكون موت الخلية واضحًا (الشكل 1 ب). أدى العلاج لمدة 200 دقيقة باستخدام 175 ملي مولار من حمض الخليك عند درجة الحموضة 3.0 أو 10 ملي بيروكسيد الهيدروجين أو 60 ٪ (وزن / وزن) جلوكوز لمدة 10 ساعات (الشكل 1 ج) إلى بقاء 10 ٪ ، وهو ما يحدث في تجربتنا وتجربة الآخرين (مايدو وآخرون. ، 1999) أعلى إنتاجية للخلايا الإيجابية لـ TUNEL. أعطت المعالجة لمدة 20-25 دقيقة باستخدام 150 ملي مولار من بيروكسيد الهيدروجين (الشكل 1 د) نفس البقاء على قيد الحياة المتبقية مثل 10 ملي مولار لمدة 200 دقيقة ، مما يمثل تحريض موت الخلية أسرع بنحو 10 مرات.

شكل 1. S. cerevisiae تم تحضين BY4741 باستخدام 10 ملي بيروكسيد الهيدروجين (A) أو 175 ملي مولار من حمض الخليك ، ودرجة الحموضة 3.0 (B) ، و 60 ٪ (وزن / وزن) جلوكوز (C) أو 150 ملي بيروكسيد الهيدروجين (D). تم أخذ العينات في النقاط الزمنية المحددة وطليها على وسط YPD الصلب. c.f.u. تم عدها بعد يومين من الحضانة عند 30 درجة مئوية. البقاء النسبي مؤامرة على x-axis (100% corresponds to the number of c.f.u. at time 0). Values are mean ± SEM of three independent experiments.

TUNEL Stains Both SSBs and DSBs in S. cerevisiae

Cells grown as described in المواد والأساليب were fixed with formaldehyde and subsequently digested with Zymolyase to remove the cell wall. Cells were treated with DNaseI to generate chromosomal DSBs. DNaseI cleaves both DNA strands at approximately the same site, producing DNA fragments with blunt ends or to a lesser extent protruding termini of one or two nucleotides. The cells were then stained with TUNEL protocol according to previously published protocols (Madeo وآخرون., 1997). The nuclei was intensely stained by TUNEL in cells treated with DNaseI (Figure 2, DNaseI) This staining does not occur in nontreated cells (Figure 2, negative control). Positive TUNEL staining was also obtained by treatment with N.BbvCIA nicking endonuclease (Figure 2, N.BbvCIA). N.BbvCIA is a restriction enzyme engineered to cut one DNA strand only. This result shows that the free 3′-OH exposed in SSBs in S. cerevisiae is a good substrate for the terminal transferase in the TUNEL reaction. Cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid (as described in المواد والأساليب), but no added restriction enzymes, did also show TUNEL staining (Figure 2, hydrogen peroxide and acetic acid). TUNEL staining is more diffuse and has slightly higher background for the hydrogen peroxide-treated cells. Nevertheless, nuclei are clearly visible against the background.

Figure 2. Bright field and epifluorescence images of TUNEL and in situ ligation-stained cells. Left column, TUNEL staining of exponentially growing cells, fixed and treated with DNaseI or N.BbvCIA nicking endonuclease. Right column, in situ ligation staining of exponentially growing cells, fixed and treated with BsuRI (blunt endonuclease) or DNaseI and N.BbvCIA (nicking endonuclease). Row marked negative control shows exponentially growing cells stained with TUNEL or in situ ligation staining. Rows marked hydrogen peroxide and acetic acid show cells incubated for 200 min with 10 mM hydrogen peroxide or 175 mM acetic acid, pH 3.0. Left, phase-contrast microscopy right, fluorescence microscopy of the same cells. Bar, 5 μm.

ISL Assay Specifically Stains DSBs in S. cerevisiae

Cells were also subjected to ISL staining with a fluorescent double-stranded DNA hairpin probe according to the methods published by Didenko and coworkers (Didenko and Hornsby, 1996 Didenko وآخرون., 1999). A small double strand fluorescent DNA probe is ligated to sites of DSBs. It has been shown to specifically stain mammalian apoptotic cells (Didenko وآخرون., 2003). The probe cannot ligate to single-stranded DNA breaks and is therefore in theory more specific for DSBs than TUNEL staining. Specific ISL staining, visually similar to staining by TUNEL, was evident in cells treated with DNaseI and the blunt restriction enzyme BsuRI (Figure 2, in situ ligation, DNaseI and BsuRI). There was no detectable staining in the absence of endonucleases (Figure 2, in situ ligation, negative control). ISL does not stain cells treated with nicking endonuclease N.BbvCIA, confirming that SSBs do not facilitate ligation of the ISL probe (Figure 2, N.BbvCIA). These results show that both TUNEL and ISL procedures are equally efficient at detecting DSBs in S. cerevisiae chromosomal DNA, but TUNEL assay also detects nicked DNA. Cells treated with peroxide or acetic acid did not show any ISL staining (Figure 2, hydrogen peroxide and acetic acid), indicating that these cells do not contain blunt DSBs.

Staggered DSBs Can Be Discriminated by ISL in Combination with Klenow DNA Polymerase

ISL has been used to distinguish between different types of staggered DSBs in combination with Klenow DNA polymerase (Didenko وآخرون., 2003). Theoretically, if DSBs with 5′ overhangs are present, the DNA polymerase activity of Klenow will synthesize the missing DNA in the presence of dNTPs and produce blunt ends. In contrast, if DSBs breaks with 3′ overhangs are present, the Klenow 5′-3′ exonuclease activity will degrade the overhang until the DNA is blunt.

To test whether ISL could discriminate between different types of DSBs in S. cerevisiae, we performed ISL on cells treated with endonucleases producing 5′ or 3′ overhang. Cells were grown, fixed, and Zymolyase treated, as described above, and subsequently treated with restriction endonucleases, creating either 1-base pair 3′ overhangs (HhaI) or 1-base pair 5′ overhangs (Bme1390I). None of the enzyme-treated samples showed any positive staining with ISL assay (Figure 3, − Klenow). This shows that ISL does not stain staggered DSBs. ISL staining is restored to cells treated with HhaI and to cells treated with Bme1390I, by treatment with Klenow DNA polymerase and Klenow DNA polymerase plus dTNPs, respectively (Figure 3, + Klenow). This means that different types of staggered double-stranded DNA ends can be discriminated by the ISL assay in yeast. The intensity is lower than for the DNaseI or BsuRI treatment (Figure 2), probably due to incomplete transformation of staggered DSBs.

Figure 3. Bright field and epifluorescence images of in situ ligation-stained cells. Exponentially growing cells were treated with HhaI (1-base pair 3′ overhang) and Bme1390I (1-base pair 5′ overhang) endonucleases. The cells in the right column were treated with Klenow (+ Klenow, HhaI) or Klenow + dNTPs (+ Klenow, Bme1390I) before in situ ligation staining. Left, phase-contrast microscopy right, fluorescence microscopy of the same cells. Bar, 5 μm.

We reasoned that the lack of ISL staining of cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid (Figure 2, hydrogen peroxide, acetic acid) may be that they contain staggered DSBs that are not detectable by ISL. We added Klenow or Klenow and dNTPs to cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid in a manner similar to the experiment described in Figure 3, but the ISL staining was still negative (Figure 4). This indicates that hydrogen peroxide- or acetic acid-treated cells do not contain staggered DSBs with 1-base pair overhangs.

Figure 4. Bright field and epifluorescence images of in situ ligation-stained cells. In situ ligation staining of cells incubated for 200 min with 10 mM hydrogen peroxide or 175 mM acetic acid, pH 3.0. The cells were treated with Klenow (left column) or Klenow + dNTPs (right column) before in situ ligation staining. Left, phase-contrast microscopy right, fluorescence microscopy of the same cells, Bar, 5 μm.

Chromosomal DNA Is Damaged in Cells Treated with Hydrogen Peroxide, Acetic Acid, or High Concentrations of Glucose

In our hands, ISL assay together with Klenow or Klenow + dNTPs is limited in the overhang length of staggered DSBs that the method can overcome. We treated cells with enzymes creating four-base pair overhangs with subsequent Klenow transformation to blunt DSBs, and we noted a considerable decrease in the ISL signal (our unpublished data) compared with the treatments with HhaI and Bme1390I (Figure 3). This led to the hypothesis that cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid may have staggered DSBs with long overhangs, undetectable by ISL.

To overcome this difficulty, we analyzed chromosomal DNA from cells treated with hydrogen peroxide, acetic acid, or glucose-induced hyperosmotic shock using PFGE (Figure 5A). Samples were taken at six time points between zero and 200 min (hydrogen peroxide, acetic acid) or 10 h (hyperosmotic shock). DNA from cells treated with hydrogen peroxide after 200 min (Figure 5A, hydrogen peroxide, lane 200 min) was completely degraded to a smear of fragments slightly shorter than S. cerevisiae chromosome I (225 kb) but still of a considerable size. The DNA from acetic acid-treated cells showed less degradation but still a visible smear and chromosomal bands of lower intensity (Figure 5A, acetic acid, lanes 60–200 min). DNA from cells killed by hyperosmotic shock showed degradation over 10 h comparable to that of hydrogen peroxide-treated cells (Figure 5A, glucose 60%, lanes 6–10 h). This is the first time that clear DNA degradation has been shown in S. cerevisiae associated with PCD.

Figure 5. Genomic DNA analyzed by PFGE from viable cells (A and C–E) or fixed S. cerevisiae cells (B). Cells were exposed to 10 mM hydrogen peroxide, 175 mM acetic acid, pH 3.0, 60% (wt/wt) glucose, or 150 mM hydrogen peroxide as indicated in the figure. Lanes marked as control were loaded with DNA isolated from exponentially growing cells without further treatment. Samples were collected after various periods as indicated (minutes) except for treatment with 60% (wt/wt) glucose, where time points are indicated in hours. (D) Cells were exposed to 10 mM hydrogen peroxide or 175 mM acetic acid, pH 3.0, and isolated chromosomal DNA was subsequently treated with S1 nuclease to degrade nicked DNA. Lane marked control S1 is similar to control lanes, but the DNA was treated with S1 nuclease before PFGE. (E) Lanes 1 and 2 show chromosomal DNA from nontreated cells, digested with N.BbvCIA nicking endonuclease (1) or DNaseI (2).

DNA Fragmentation by Hydrogen Peroxide Requires Active Enzymes

Cells were fixed with 3.7% (vol/vol) formaldehyde before treatment with 10 mM hydrogen peroxide for 200 min or 150 mM for 25 min (Figure 5B) to test whether the presence of active enzymes is necessary for DNA fragmentation to proceed. Fixing cells with formaldehyde preserves the structure of cells and enzymes, but it eliminates enzymatic activity. The fixed cells treated with hydrogen peroxide show no DNA damage, indicating that the DNA fragmentation requires some enzymatic activity within the cell and that fragmentation is not due to a direct chemical reaction between hydrogen peroxide and DNA (Figure 5B). In addition, purified yeast chromosomes were not degraded by 10 mM hydrogen peroxide in vitro for 200 min (our unpublished data).

DNA Fragmentation by Hydrogen Peroxide Does Not Occur after Treatment with High Concentrations of Hydrogen Peroxide

A common observation regarding PCD is that specific markers of PCD usually only occur within a rather limited window of treatment intensity. At too high intensity of the treatment, the cell is presumed to die from complete breakdown (necrosis) before any PCD process can be initiated. Chromosomal DNA was fragmented during 200-min treatment with 10 mM hydrogen peroxide (Figure 5A). During this process, the fraction of viable cells decreases from 100 to ∼5–10% (Figure 1A). The DNA in S. cerevisiae cells treated with 150 mM hydrogen peroxide remained intact (Figure 5C) for the 25 min necessary for a decrease from 100 to ∼1% surviving cells (Figure 1C). This result shows that cell death is only associated with DNA fragmentation for treatment of relatively low intensity.

DNA Damage in Hydrogen Peroxide- or Acetic Acid-treated Cells Is Primarily Made Up of SSBs

Lack of ISL staining of cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid combined with the finding that TUNEL assay is not specific for DSBs led us to the hypothesis that the main type of DNA damage detected by TUNEL in our experiments consists of SSBs. This hypothesis can be tested by treatment of the DNA with S1 nuclease that will preferably attack at sites of single-stranded DNA breaks, reducing SSBs to DSBs, causing the DNA to migrate faster on the gel. Figure 5D shows a PFGE gel with DNA from cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid, with and without treatment with S1 nuclease. Untreated DNA (Figure 5D, lane control) shows little degradation with S1 nuclease treatment (Figure 5D, lane control S1), indicating that no or few single-stranded breaks are present in untreated cells. Comparing the same time points for hydrogen peroxide- and acetic acid-treated cells without (Figure 5A) and with S1 treatment (Figure 5D, lanes marked +), there is an enhanced degradation upon S1 treatment. We conclude that the main form of DNA damage in hydrogen peroxide- and acetic acid-treated cells consists of single-stranded DNA breaks.

N.BbvCIA Nicking Endonuclease and Hydrogen Peroxide Treatment Yield Similar DNA Damage

It is evident from the images showing DNA damage (Figure 5A) that although the chromosomes are broken down to the point of not being visible, the resulting fragments are still several hundreds of kilobases and do not seem to break down into smaller fragments. We treated isolated DNA with DNaseI and N.BbvCIA nicking endonuclease (Figure 5E). Isolated DNA treated with DNaseI broke down into fragments too small to be visible on the gel (Figure 5E, lane 2), whereas DNA treated with N.BbvCIA (Figure 5E, lane 1) revealed DNA fragmentation with the same visual appearance on the gel as cells treated with hydrogen peroxide for 200 min (Figure 5A, lane 200 min). This observation is consistent with the conclusion that DNA damage in hydrogen peroxide-treated cells are primarily a consequence of accumulation of SSBs.


Boy Is Clue to What Causes Aging

One of Niederhofer's colleagues on the study was Jan Hoeijmakers, PhD, of Erasmus Medical Center in Rotterdam, Netherlands.

Hoeijmakers had heard from doctors in Germany about a 15-year-old Afghan boy with an extreme form of premature aging, a condition called progeria.

واصلت

The boy was extremely sensitive to sunlight and had had an old, wizened appearance since age 10.

He was gaunt, had hearing loss and vision problems, and had had hepatitis A and tuberculosis as a young child.

The boy died when he was 16 after getting severe pneumonia and having organ failure. Genetic tests showed the boy had a severe mutation in his XPF gene, a gene involved in DNA repair.


الحواشي

إخلاء مسؤولية الناشر: هذا ملف PDF لمخطوطة غير محررة تم قبولها للنشر. كخدمة لعملائنا ، نقدم هذه النسخة المبكرة من المخطوطة. ستخضع المخطوطة للتدقيق والتنضيد ومراجعة الدليل الناتج قبل نشره في شكله النهائي القابل للاستدلال عليه. يرجى ملاحظة أنه أثناء عملية الإنتاج قد يتم اكتشاف أخطاء قد تؤثر على المحتوى ، وجميع إخلاء المسؤولية القانونية التي تنطبق على المجلة مرتبطة.


Deleting 'Anti-Aging' Gene From Yeast Greatly Lengthens Life Span

A counterintuitive experiment has resulted in one of the longest recorded life-span extensions in any organism and opened a new door for anti-aging research in humans.

Scientists have known for several years that an extra copy of the SIR2 gene can promote longevity in yeast, worms and fruit flies.

That finding was covered widely and incorporated into anti-aging drug development programs at several biotechnology companies.

Now, molecular geneticists at the University of Southern California suggest that SIR2 instead promotes aging.

Their study, "Sir2 Blocks Extreme Life-Span Extension," appears in the Nov. 18 edition of the biology journal Cell. The lead author is Valter Longo, assistant professor in the Leonard Davis School of Gerontology and the USC College of Letters, Arts and Sciences.

Rather than adding copies of SIR2 to yeast, Longo's research group deleted the gene altogether.

The result was a dramatically extended life span - up to six times longer than normal - when the SIR2 deletion was combined with caloric restriction and/or a mutation in one or two genes, RAS2 and SCH9, that control the storage of nutrients and resistance to cell damage.

Human cells with reduced SIR2 activity also appear to confirm that SIR2 has a pro-aging effect, Longo said, although those results are not included in the Cell paper.

Since all mammals share key aging-related genes, the paper points to a new direction for human anti-aging research.

Longo proposes that SIR2 and possibly its counterpart in mammals, SIRT1, may block the organism from entering an extreme survival mode characterized by the absence of reproduction, improved DNA repair and increased protection against cell damage. Organisms usually enter this mode in response to starvation.

The long-lived organisms in Longo's experiment showed extraordinary resilience under stress.

"We hit them with oxidants, we hit them with heat," Longo said. "They are highly resistant to everything. What they're doing is basically saying, 'I cannot afford to age. I still have to generate offspring, but I don't have enough food to do it now."

Longo predicted that as molecular geneticists master the levers of aging, they will be able to design drugs that coax the body into entering chosen aspects of a starvation-response mode, such as stress resistance, even when food is plentiful.

If enough food is available, an organism might be programmed both to reproduce normally and to maximize its survival systems.

Longo urged caution in extrapolating the result to humans.

"We have been very successful with simple organisms," he said. "Naturally, mammals are complex, and it will be a great challenge to get major life-span extension."

A "really exciting" implication, Longo said, is that cells may be able to speed up their DNA repair efforts. All organisms have the ability to repair harmful mutations in their DNA, whether caused by age, radiation, diet or other environmental factors. Cancer often begins when DNA mutations outstrip a cell's ability to remain differentiated.

Many researchers believe DNA repair systems are already running flat out. The organisms in Longo's experiment say otherwise.

"In our paper, we show that age-dependent mutations increase at a much slower pace in organisms lacking RAS2 or SCH9 and at a remarkably low pace in organisms lacking both SCH9 and SIR2, raising the possibility that the mutations that cause human cancers can be delayed or prevented," Longo said.

"Notably, mutations that increase the activity of human homologs of the yeast SCH9 and RAS2 genes play central roles in many human cancers." Homologs are genes descended from a common ancestral DNA sequence.

Joining with researchers at the USC Norris Comprehensive Cancer Center, Longo is studying the feasibility of reducing or preventing the age-dependent DNA mutations that cause cancer.

Longo and his collaborators began studying SIR2 in 2000, soon after a well-known set of experiments by Leonard Guarente at the Massachusetts Institute of Technology. Guarente was the first to show that over-expression of the SIR2 gene could extend life span beyond its natural limit.

However, Longo said, "We were convinced that SIR2 had the potential to be a more potent pro-aging than an anti-aging gene. And the reason was in part because of the similarity with this other gene, called HST1, which negatively regulated so-called protective genes. So we set out to test whether SIR2 could do the opposite of what everybody said it does."

The researchers do not quarrel with Guarente's finding of a moderate increase in life span when SIR2 is over-expressed. But their work shows that much greater potential gains lie in the opposite direction.

Longo's co-author was USC research scientist Paola Fabrizio. The other USC authors were Cristina Gattazzo, Luisa Battistella, Min Wei, Chao Cheng and Kristen McGrew.

Funding for this research came from the American Federation for Aging Research and from the National Institute of Aging of the National Institutes of Health.


The type of vacuole found in yeast cells is somewhat analogous to the lysosome that we animals possess in that it is involved in breaking down waste products and recycling broken cellular components (via the process of autophagy) that would otherwise harm the cell. It is an agent of cellular housekeeping, in other words. There the similarities end, however, as the vacuole performs many other vital tasks that the more specialized lysosome does not.

So here, researchers show that they can extend life in yeast by reversing a change that occurs in the vacuole. Because the vacuole has many more tasks than the lysosome, it's not immediately clear that this has any application to our biology of aging, however. It is still worth keeping an eye on this research as we know that decline in lysosomal function (and thus of cellular housekeeping) is important in animal aging. You might recall, for example, that researchers managed to reverse the age-related loss of liver function in mice by finding a way to keep lysosomal function running at youthful rates. Similarly, reversing the root causes of lysosomal decline is on the SENS agenda - to be achieved by breaking down the build up of metabolic waste products that accumulate in lysosomes and cause them to malfunction.

Normally, mitochondria [in yeast] are beautiful, long tubes, but as cells get older, the mitochondria become fragmented and chunky. The changes in shape seen in aging yeast cells are also observed in certain human cells, such as neurons and pancreatic cells, and those changes have been associated with a number of age-related diseases in humans.

The vacuole - and its counterpart in humans and other organisms, the lysosome - has two main jobs: degrading proteins and storing molecular building blocks for the cell. To perform those jobs, the interior of the vacuole must be highly acidic. [Researchers] found that the vacuole becomes less acidic relatively early in the yeast cell's lifespan and, critically, that the drop in acidity hinders the vacuole's ability to store certain nutrients. This, in turn, disrupts the mitochondria's energy source, causing them to break down. Conversely, when [researchers] prevented the drop in vacuolar acidity, the mitochondria's function and shape were preserved and the yeast cells lived longer.

Until now, the vacuole's role in breaking down proteins was thought to be of primary importance. We were surprised to learn it was the storage function, not protein degradation, that appears to cause mitochondrial dysfunction in aging yeast cells. . The unexpected discovery prompted [the researchers] to investigate the effects of calorie restriction, which is known to extend the lifespan of yeast, worms, flies and mammals, on vacuolar acidity. They found that calorie restriction - that is, limiting the raw material cells need - delays aging at least in part by boosting the acidity of the vacuole.


Variations

  • Use the procedure above to make plates with diluted yeast cultures and expose the yeast to sunlight at various times of day for example, at 10:00 AM, noon, and 2:00 PM. Use the same duration of exposure.
  • Expose the yeast for various durations at the same time of day, for example 0, 0.5, 1, 2, 4, and 8 minutes at noon.
  • Compare wild-type and DNA-repair-deficient yeast strains for UV sensitivity. Obtain wild-type S. cerevisiae from a science supply company for example, Carolina Biological, item # 898900. Culture this strain and plate out dilutions, as described in the procedure. Compare the sensitivity of the wild-type and DNA-repair-deficient strains to ultraviolet light from the sun.


شاهد الفيديو: Getting Started with ArcGIS Pro (يونيو 2022).