معلومة

تنشيط الجزيئات الحاملة وعلاقتها بالأنزيمات

تنشيط الجزيئات الحاملة وعلاقتها بالأنزيمات


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أقرأ علم الأحياء الجزيئي للخلية ، والشيء الوحيد الذي لم أفهمه تمامًا هو الفرق بين الإنزيم والجزيء الحامل المنشط. أفهم أن الإنزيمات تقلل من طاقة التنشيط للتفاعل ، وبهذا المعنى تسرع معدل حدوث التفاعل. أفهم أيضًا أن الجزيئات الحاملة المنشطة تعمل كمصدر للطاقة يمكن أن تدفع التفاعلات غير المواتية (مثل التفاعلات الابتنائية) إلى الأمام. لكنني ما زلت لا أفهم الفرق الدقيق. كنت أتساءل عما إذا كان بإمكان أحدهم إلقاء بعض الضوء على هذا.


سأركز على معنى "الجزيء الحامل المنشط" حيث تكثر أوصاف الإنزيمات. من أجل القيام بذلك ، أحتاج إلى تقديم فكرتين أخريين أولاً. أعتذر لأصحاب الأصولية عن تكييف هذا مع مستوى السؤال.

1. الطاقة الحرة جيبس ​​في الاعتبارات البيوكيميائية

هناك طرق مختلفة للنظر في الطاقة ، وفي الكيمياء يمكن أن يعتاد المرء على التفكير فيها طاقة الرابطة فيما يتعلق بجزيء معين. ومع ذلك ، في الكيمياء الحيوية (وهو ما يهتم به هذا السؤال) ينصب التركيز على الطاقة في العمليات الكلية. على سبيل المثال "هل التفاعلات التي تدخل في تركيب الجلوكوز من البيروفات مواتية بقوة؟" أو "كيف يمكن أن يحدث تخليق الجلوكوز من البيروفات إذا لم يكن التفاعل العام مواتًا بقوة؟" وبالمثل بالنسبة للتفاعلات الفردية ، مثل تكوين روابط ببتيدية بين الأحماض الأمينية.

لاعتبارات من هذا النوع ، يعتبر مفهوم الديناميكا الحرارية (Gibbs) الطاقة الحرة (G) أكثر فائدة. هذا لأن ملف يتغيرون في الطاقة الحرة (ΔG) أثناء التفاعل (أو أي تغيير آخر في الحالة) يشير إلى ما إذا كان التفاعل يمكن أن يحدث تلقائيًا. اقتبس من قسم مفيد في بيرغ وآخرون.

يمكن أن يحدث رد الفعل بشكل عفوي فقط إذا ΔG سلبي.

لذلك في تسلسل التفاعل الذي تم ذكره للتو ، فإن التخليق الكلي للجلوكوز من البيروفات (استحداث السكر) له موجب G وهو غير موات بقوة ، في حين أن العملية العكسية (تحلل السكر) مواتية بقوة. وبالمثل ، ليس من المستغرب أن يكون تكوين رابطة الببتيد موجب ΔG وليس مواتياً بقوة.

2. كيف يتم تحقيق ردود الفعل غير المواتية في الخلايا الحية؟

ينشأ السؤال المطروح في العنوان من حقيقة أن تكوين الجلوكوز وتكوين الرابطة الببتيدية يحدثان في الخلايا الحية ، على الرغم من أن التفاعلات الأساسية التي تمثل العمليات وحدها غير مواتية بقوة. الإجابة موجودة في عنوان [القسم 14.1.1. بيرج وآخرون.]

يمكن أن يكون رد الفعل غير المواتي بالديناميكا الحرارية مدفوعًا برد فعل إيجابي

كما ذكرنا سابقًا ، فإن ΔG للعملية الكلية هو المهم ، لذلك إذا كان التفاعل مع موجب G `` مقترنًا '' بأحد G السالب ذي الحجم الأكبر ، يمكن أن يستمر التفاعل الكلي. على سبيل المثال:

A → B ΔG = 20 kJ / mol (غير موات) C → D ΔG = -30 kJ / mol (مفضل) A + C → B + D ΔG = -10 kJ / mol (مفضل)

إذا استمر التفاعل C → D بمفرده ، يتم تحرير الطاقة الحرة كحرارة غير مجدية كيميائيًا. إذا كان مقترنًا بالتفاعل A → B ، فإنه يدفع الأخير مع فقد التوازن كحرارة.

3. دور الجزيئات الحاملة النشطة في اقتران الطاقة

من الواضح أن أي تفاعل مقترن يمكن أن يتسبب في جريان الماء صعودًا ، كما كان. ولكن من أجل الاستمرار ، يحتاج المرء إلى تجديد جزيئات البداية للتفاعل المفضل. إنه أكثر كفاءة أن تخصص عملية التجديد هذه باستخدام نطاق محدود من التفاعلات المتخصصة مع تغيير سلبي في الطاقة الحرة. وصف واحد للركائز (الجزيئات المتفاعلة) للتفاعلات المفضلة المتخصصة مثل "الجزيئات الحاملة المنشطة". البرت وآخرون. عرفهم على أنهم:

جزيئات صغيرة قابلة للانتشار في الخلايا التي تخزن طاقة قابلة للتبديل بسهولة في شكل رابطة تساهمية غنية بالطاقة أو أكثر. ومن الأمثلة على ذلك ATP و NADPH.

بيرج وآخرون. استخدم أيضًا المصطلح ، لكن صِفه من حيث الأمثلة التالية:

  • ATP كحامل منشط لمجموعات الفسفوريل ، لأن نقل الفوسفوريل من ATP هو عملية طاردة للطاقة (أي يحتوي على ΔG سالب)
  • نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD+) هو ناقل رئيسي للإلكترون في أكسدة جزيئات الوقود. (على الرغم من أنه في هذه الحالة يكون رد الفعل النصف يتضمن أكسدة الشكل المختزل ، NADH - أو NADPH كما ذكر ألبرتس وآخرون. - يحتوي على ΔG سالب).
  • أنزيم أ... هو ناقل لمجموعات الأسيل (ولكنه نقل مجموعة الأسيل من جزيئات أسيل CoA - على سبيل المثال أسيتيل CoA - مع توليد CoA الذي يحتوي على G سالب).

يمكن العثور على أمثلة لمشاركة هذه الجزيئات في عملية التمثيل الغذائي في المجلد المشار إليه ، ولكن أود التأكيد على أن التفاعلات المحددة لهذه الجزيئات التي تتضمن المجموعات (أو الإلكترونات) التي تحملها هي المهمة.

وماذا عن الإنزيمات؟

كما ذكر الملصق "إنزيمات تخفض طاقة التفعيل لرد فعل ". إنها (بشكل عام) محفزات بروتينية كبيرة ليس لها أي تأثير على ΔG ، ولا تتغير في نهاية التفاعل.

بالطبع هي مهمة للتفاعلات البيوكيميائية ، فهي تشارك فيها ، وتوفر مواقع ربط لجلب الركائز والناقلات المنشطة في وضع متجاور بحيث يمكن أن تتفاعل. لكن لا يمكن أن يكونوا أكثر اختلافًا عن الناقلات الصغيرة النشطة.


4.2: التحكم في النشاط الأنزيمي

  • بمساهمة كيفن أهيرن وإنديرا راجاجوبال وأمبير تارالين تان
  • أستاذ (الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية) في جامعة ولاية أوريغون

نسخة قابلة للطباعة من هذا القسم هنا: BiochemFFA_4_2.pdf. الكتاب الدراسي بأكمله متاح مجانًا من المؤلفين على http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy


طرق التشوير داخل الخلايا

يعمل تحريض مسار الإشارة على تنشيط سلسلة من التعديلات الأنزيمية التي يتم التعرف عليها بدورها بواسطة المكون التالي في اتجاه مجرى النهر.

أهداف التعلم

اشرح كيف يبدأ ارتباط ligand في تحويل الإشارة في جميع أنحاء الخلية

الماخذ الرئيسية

النقاط الرئيسية

  • تعد الفسفرة ، إضافة مجموعة فوسفات إلى جزيء مثل البروتين ، أحد أكثر التعديلات الكيميائية شيوعًا التي تحدث في مسارات الإشارات.
  • يعد تنشيط الرسل الثاني ، الجزيئات الصغيرة التي تنشر إشارة ، حدثًا شائعًا بعد تحريض مسار الإشارة.
  • أيون الكالسيوم ، AMP الدوري ، وفوسفوليبيدات الإينوزيتول هي أمثلة على الرسل الثاني المستخدم على نطاق واسع.

الشروط الاساسية

  • الرسول الثاني: أي مادة تستخدم لنقل إشارة داخل الخلية ، خاصة تلك التي تطلق سلسلة من الأحداث عن طريق تنشيط المكونات الخلوية
  • الفسفرة: إضافة مجموعة فوسفات إلى مركب غالبًا ما يتم تحفيزه بواسطة الإنزيمات

يعتمد تحريض مسار الإشارات على تعديل مكون خلوي بواسطة إنزيم. هناك العديد من التعديلات الأنزيمية التي يمكن أن تحدث والتي يتم التعرف عليها بدورها من قبل المكون التالي في اتجاه مجرى النهر.

من أكثر التعديلات الكيميائية شيوعًا التي تحدث في مسارات الإشارات إضافة مجموعة الفوسفات (PO4 -3) لجزيء مثل البروتين في عملية تسمى الفسفرة. يمكن إضافة الفوسفات إلى نوكليوتيد مثل GMP لتشكيل الناتج المحلي الإجمالي أو GTP. غالبًا ما يتم إضافة الفوسفات إلى بقايا السيرين والثريونين والتيروزين للبروتينات حيث تحل محل مجموعة الهيدروكسيل من الأحماض الأمينية. يتم تحفيز نقل الفوسفات بواسطة إنزيم يسمى كيناز. تمت تسمية كينازات مختلفة على الركيزة التي تفسفرها. غالبًا ما تؤدي الفسفرة لبقايا السيرين والثريونين إلى تنشيط الإنزيمات. يمكن أن تؤثر فسفرة مخلفات التيروزين إما على نشاط الإنزيم أو إنشاء موقع ربط يتفاعل مع مكونات المصب في سلسلة الإشارات. قد تنشط الفسفرة أو تعطل الإنزيمات عكس الفسفرة ، إزالة الفسفرة بواسطة الفوسفاتيز ، سوف يعكس التأثير.

مثال على الفسفرة: في فسفرة البروتين ، تضاف مجموعة فوسفات (PO4-3) إلى بقايا الأحماض الأمينية سيرين ، ثريونين ، وتيروزين.

يعد تنشيط الرسل الثاني أيضًا حدثًا شائعًا بعد تحريض مسار الإشارات. إنها جزيئات صغيرة تنشر إشارة بعد أن تبدأ بربط جزيء الإشارة بالمستقبل. تساعد هذه الجزيئات في نشر إشارة عبر السيتوبلازم عن طريق تغيير سلوك بعض البروتينات الخلوية.

أيون الكالسيوم هو مرسال ثانٍ شائع الاستخدام. التركيز الحر لأيونات الكالسيوم (Ca 2+) داخل الخلية منخفض جدًا لأن مضخات الأيونات في غشاء البلازما تستخدم الأدينوزين -5 و # 8242-ثلاثي الفوسفات (ATP) بشكل مستمر لإزالته. لأغراض الإشارة ، يتم تخزين Ca 2+ في الحويصلات السيتوبلازمية ، مثل الشبكة الإندوبلازمية ، أو الوصول إليها من خارج الخلية. عند حدوث الإشارات ، تسمح قنوات أيونات الكالسيوم ذات البوابات الترابطية للمستويات الأعلى من Ca 2+ الموجودة خارج الخلية (أو في حجرات التخزين داخل الخلايا) بالتدفق إلى السيتوبلازم ، مما يرفع تركيز السيتوبلازم Ca 2+. تختلف الاستجابة للزيادة في Ca 2+ ، اعتمادًا على نوع الخلية المعنية. على سبيل المثال ، في خلايا β في البنكرياس ، تؤدي إشارات Ca 2+ إلى إطلاق الأنسولين ، بينما في خلايا العضلات ، تؤدي زيادة الكالسيوم 2+ إلى تقلصات العضلات.

رسول آخر يستخدم في العديد من أنواع الخلايا المختلفة هو دوري AMP (cAMP). يتم تصنيع AMP الدوري بواسطة إنزيم adenylyl cyclase من ATP. يتمثل الدور الرئيسي لـ cAMP في الخلايا في الارتباط وتنشيط إنزيم يسمى كيناز المعتمد على cAMP (A-kinase). ينظم A-kinase العديد من مسارات التمثيل الغذائي الحيوية. يقوم بتفسفرة بقايا السيرين والثريونين من البروتينات المستهدفة ، مما يؤدي إلى تنشيطها في هذه العملية. يوجد A-kinase في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، تختلف البروتينات المستهدفة في كل نوع من الخلايا. تؤدي الاختلافات إلى تباين الاستجابات لـ cAMP في الخلايا المختلفة.

مثال على cAMP كرسول ثانٍ: يوضح هذا الرسم البياني آلية تكوين AMP الدوري (cAMP). يعمل cAMP كرسول ثانٍ لتنشيط أو تعطيل البروتينات داخل الخلية. يحدث إنهاء الإشارة عندما يقوم إنزيم يسمى phosphodiesterase بتحويل cAMP إلى AMP.

توجد بتركيزات صغيرة في غشاء البلازما ، فوسفوليبيدات الإينوزيتول عبارة عن دهون يمكن أيضًا تحويلها إلى رسل ثانٍ. نظرًا لأن هذه الجزيئات عبارة عن مكونات غشائية ، فإنها تقع بالقرب من مستقبلات مرتبطة بالغشاء ويمكن أن تتفاعل معها بسهولة. Phosphatidylinositol (PI) هو الفوسفوليبيد الرئيسي الذي يلعب دورًا في الإشارات الخلوية. الإنزيمات المعروفة باسم كينازات فسفوريلات PI لتشكيل PI-phosphate (PIP) و PI-bisphosphate (PIP)2).


التركيب الحيوي والعلاقات بين النشاط والهيكل الدهني لعائلة من الجليكوليبيدات

دهون الجليكوليبيد أ هو جزء محمي من البرمائيات من LPS.

يرتبط Lipid A بمستقبلات Toll مثل المستقبلات و caspases ذات التقارب العالي.

تغير البكتيريا هياكلها الدهنية من أجل تعديل نشاط المناعة.

تعتبر متجانسات الدهون غير السامة من العوامل الفعالة في تعديل المناعة.

عديدات السكاريد الدهنية (LPS) ، وهي مادة جليكوليبيد موجودة في الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام ، هي عامل قوي لاستجابات المناعة الفطرية في الثدييات. يتكون جزيء LPS النموذجي من ثلاثة مجالات هيكلية مختلفة: عديد السكاريد يسمى ا-مستضد ، وهو قليل السكاريد الأساسي ، ودهون أ. إنه يحفز جهاز المناعة عن طريق الارتباط بإحكام بمستقبلات تشبه Toll 4. وفي الآونة الأخيرة ، ثبت أيضًا أن Lipid A ينشط داخل الخلايا caspase-4 و caspase-5. لوحظ تنوع مثير للإعجاب في تراكيب Lipid A من بكتيريا سالبة الجرام مختلفة ، ومن الثابت أن التغييرات الطفيفة في التركيب الكيميائي يمكن أن تؤدي إلى أنشطة مناعية مختلفة بشكل كبير. على سبيل المثال ، دهن أ من الإشريكية القولونية شديدة السمية للإنسان ، في حين أن سلائف التخليق الحيوي تسمى Lipid IVأ يحجب هذا النشاط السام ، ويمنع monophosphoryl Lipid A من السالمونيلا مينيسوتا هو لقاح مساعد. وبالتالي ، يمكن استخدام فهم العلاقات بين التركيب والنشاط في عائلة الدهون السكرية لتصميم عوامل تعديل مناعية مفيدة. هنا نراجع التركيب الحيوي والتعديل والعلاقات الهيكلية والنشاط لـ Lipid A.


الإنزيمات: كيف تعمل وماذا تفعل

تساعد الإنزيمات في تسريع التفاعلات الكيميائية في جسم الإنسان. ترتبط بالجزيئات وتغيرها بطرق محددة. فهي ضرورية للتنفس ، وهضم الطعام ، ووظيفة العضلات والأعصاب ، من بين آلاف الأدوار الأخرى.

في هذه المقالة ، سنشرح ماهية الإنزيم وكيف يعمل ، وسنقدم بعض الأمثلة الشائعة عن الإنزيمات في جسم الإنسان.

يقوم إنزيم الأميليز (في الصورة) بتقسيم النشا إلى سكريات.

تتكون الإنزيمات من بروتينات مطوية في أشكال معقدة موجودة في جميع أنحاء الجسم.

تعتمد التفاعلات الكيميائية التي تبقينا على قيد الحياة - التمثيل الغذائي لدينا - على العمل الذي تقوم به الإنزيمات.

تسريع الإنزيمات (تحفيز) التفاعلات الكيميائية في بعض الحالات ، يمكن للأنزيمات أن تحدث تفاعلًا كيميائيًا أسرع بملايين المرات مما كان يمكن أن يكون بدونه.

أ المادة المتفاعلة يرتبط ب موقع نشط من إنزيم ويتم تحويلها إلى منتجات. بمجرد أن تغادر المنتجات الموقع النشط ، يكون الإنزيم جاهزًا للالتصاق بركيزة جديدة وتكرار العملية.

الجهاز الهضمي - تساعد الإنزيمات الجسم على تفكيك الجزيئات المعقدة الأكبر إلى جزيئات أصغر ، مثل الجلوكوز ، حتى يتمكن الجسم من استخدامها كوقود.

تكرار الحمض النووي - كل خلية في جسمك تحتوي على حمض نووي. في كل مرة تنقسم فيها الخلية ، يجب نسخ هذا الحمض النووي. تساعد الإنزيمات في هذه العملية عن طريق فك لفائف الحمض النووي ونسخ المعلومات.

إنزيمات الكبد - يفكك الكبد السموم في الجسم. للقيام بذلك ، فإنه يستخدم مجموعة من الإنزيمات.

تم اقتراح نموذج "القفل والمفتاح" لأول مرة في عام 1894. في هذا النموذج ، يكون الموقع النشط للإنزيم شكلًا محددًا ، ولا يتناسب معه إلا الركيزة ، مثل القفل والمفتاح.

تم الآن تحديث هذا النموذج ويسمى نموذج مناسب مستحث.

في هذا النموذج ، يتغير شكل الموقع النشط أثناء تفاعله مع الركيزة. بمجرد أن يتم تثبيت الركيزة بالكامل وفي الموضع المحدد ، يمكن أن يبدأ التحفيز.

يمكن أن تعمل الإنزيمات فقط في ظروف معينة. تعمل معظم الإنزيمات في جسم الإنسان بشكل أفضل عند حوالي 37 درجة مئوية - درجة حرارة الجسم. في درجات حرارة منخفضة ، ستظل تعمل ولكن ببطء أكبر.

وبالمثل ، يمكن أن تعمل الإنزيمات فقط في نطاق معين من الأس الهيدروجيني (حمضي / قلوي). يعتمد تفضيلهم على مكان وجودهم في الجسم. على سبيل المثال ، تعمل الإنزيمات في الأمعاء بشكل أفضل عند 7.5 درجة حموضة ، بينما تعمل الإنزيمات الموجودة في المعدة بشكل أفضل عند درجة الحموضة 2 لأن المعدة أكثر حمضية.

إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة جدًا أو إذا كانت البيئة حمضية جدًا أو قلوية ، فإن الإنزيم يغير شكله ، مما يغير شكل الموقع النشط بحيث لا يمكن للركائز الارتباط به - فقد أصبح الإنزيم مشوه.

لا يمكن لبعض الإنزيمات أن تعمل ما لم يكن لديها جزيء محدد غير بروتيني مرتبط بها. وتسمى هذه العوامل المساعدة. على سبيل المثال ، الأنهيدراز الكربوني ، وهو إنزيم يساعد في الحفاظ على الرقم الهيدروجيني للجسم ، لا يمكن أن يعمل ما لم يتم ربطه بأيون الزنك.

لضمان عمل أجهزة الجسم بشكل صحيح ، تحتاج أحيانًا إلى إبطاء الإنزيمات. على سبيل المثال ، إذا كان الإنزيم ينتج الكثير من المنتج ، فيجب أن تكون هناك طريقة لتقليل الإنتاج أو إيقافه.

يمكن منع نشاط الإنزيمات بعدة طرق:

مثبطات تنافسية - يحجب الجزيء الموقع النشط بحيث يتعين على الركيزة أن تتنافس مع المانع للارتباط بالإنزيم.

مثبطات غير تنافسية - يرتبط الجزيء بإنزيم في مكان آخر غير الموقع النشط ويقلل من فعالية عمله.

مثبطات غير تنافسية - يرتبط المانع بالإنزيم والركيزة بعد أن يرتبط كل منهما بالآخر. تترك المنتجات الموقع النشط بسهولة أقل ، ويتباطأ التفاعل.

مثبطات لا رجعة فيها - مثبط لا رجعة فيه يرتبط بالإنزيم ويثبطه بشكل دائم.

يوجد آلاف الإنزيمات في جسم الإنسان ، وإليك بعض الأمثلة:

  • ليباز - مجموعة من الإنزيمات التي تساعد على هضم الدهون في الأمعاء.
  • الأميليز - يساعد في تحويل النشويات إلى سكريات. تم العثور على الأميليز في اللعاب.
  • مالتاس - كما يوجد في اللعاب يكسر سكر المالتوز إلى جلوكوز. يوجد المالتوز في الأطعمة مثل البطاطس والمعكرونة والبيرة.
  • التربسين - الموجودة في الأمعاء الدقيقة ، تقسم البروتينات إلى أحماض أمينية.
  • اللاكتاز - يوجد أيضًا في الأمعاء الدقيقة ، يكسر اللاكتوز ، السكر الموجود في الحليب ، إلى الجلوكوز والجلاكتوز.
  • أستيل كولينستراز - يكسر الناقل العصبي أستيل كولين في الأعصاب والعضلات.
  • هيليكاس - يكشف الحمض النووي.
  • بوليميريز الحمض النووي - توليف الحمض النووي من ديوكسي ريبونوكليوتيدات.

تلعب الإنزيمات دورًا كبيرًا في سير العمل اليومي لجسم الإنسان. من خلال الارتباط بالمركبات وتغييرها ، فهي ضرورية لسير عمل الجهاز الهضمي والجهاز العصبي والعضلات وغير ذلك الكثير.


تطور الخلية الأولى | مادة الاحياء

كانت الخلايا الحية المبكرة عبارة عن أشكال حياة RNA ، وكان الحمض النووي الريبي المتكاثر ذاتيًا والمغطى بحويصلات البروتين الدهني هو ما قبل بدائيات النوى ، مع مرور الوقت استبدلت البروتينات الوظيفة التحفيزية لـ RNA ، واستبدل DNA وظيفة تشفير RNA ، أسلاف بدائيات النوى الحديثة مع DNA- تطورت أنواع وظائف بروتين RNA.

يمثل تطور أول خلية بدائية من عالم RNA فجوة كبيرة. تمثل الخلية البكتيرية البدائية هيكلًا معقدًا للغاية مع ما لا يقل عن 1000 جين مقارنة بأفكارنا حول عالم الحمض النووي الريبي.

يجب حل المشكلات التالية لسد هذه الفجوة:

1. الدور المسيطر للبروتين كأنزيمات على الريبوزيمات.

2. التمايز بين أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي.

3. التحول من الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي كحامل للمعلومات الجينية.

5. تكوين الكروموسوم.

6. زيادة المعلومات الوراثية.

7. التعبير المظهري للنمط الجيني.

9. تطور عملية التمثيل الغذائي.

أدى إدخال pro & shyteins كإنزيمات إلى مزيد من cata & shylysis. يمكن تحسين القدرة الأنزيمية لخيوط الحمض النووي الريبي إذا تم ربط الأحماض الأمينية الفردية كما هو الحال في الحمض النووي الريبي ، أي أن الأحماض الأمينية كانت بمثابة إنزيمات مشتركة للأحماض الريبوزيمات. الخطوة التالية هي تخصص الحمض النووي الريبي بحيث يكون للخيط & # 8216 + & # 8217 دور mRNA و & # 8216 - & # 8216 حبلا يعمل كـ tRNA ويرتبط بـ & # 8216 + & # 8217 حبلا مع مضاد -كودون ثلاثي.

أخيرًا ، يمكن أن تقترن الأحماض الأمينية معًا كخيط متعدد الببتيد من شأنه تحسين النشاط التحفيزي. هذه الفكرة مدعومة بحقيقة أن الحمض النووي الريبي من كائنات مختلفة لها وظيفة مماثلة أكثر ارتباطًا ، وبالتالي يمكن إرجاع الحمض النووي الريبي إلى أصل الكود الجيني وإلى عالم الحمض النووي الريبي.

التمايز بين أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي:

كان التخصص الوظيفي للـ RNAs متكيفًا في زيادة الكفاءة داخل الخلايا البدائية. بعض أنواع الحمض النووي الريبي (tRNA) المتخصصة في جمع الأحماض الأمينية وغيرها (الرنا الريباسي) في اقترانها ودمجها معًا هي أساس الكود في النوع الثالث من الحمض النووي الريبي (مرنا).

يتطلب ظهور الكائنات الحية المعقدة الانتقال من الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي كمواد وراثية. الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل أكثر استقرارًا من الحمض النووي الريبي (RNA) ويسمح بقراءة وتصحيح الإثبات النسيجي والماضي فيما يتعلق بالنسخ المتماثل وبالتالي يقلل من معدل الطفرات (الشكل 2.10).

تتوافق المعلومات الجينية في كائنات الحمض النووي الريبي بحد أقصى 10 آلاف زوج قاعدي مقارنة بـ 10 ملايين زوج قاعدي في الكروموسوم البكتيري.

أدى استبدال الريبوز بواسطة deoxyribose في العمود الفقري للكربوهيدرات في RNA واستبدال قاعدة uracil بواسطة thymine إلى DNA. يتشكل ديوكسيريبوز في الخلايا من خلال اختزال إنزيمي متحرك للريبوز. التوليف الأنزيمي للحمض النووي من الحمض النووي الريبي عن طريق النسخ العكسي في فيروس الحمض النووي الريبي معروف جيدًا اليوم.

أصل الكود في الخلية الأولى:

الكود الجيني المستند إلى أربع قواعد معبراً عنها في ثلاثة توائم مع التكرار لعشرين حمضًا أمينيًا يكاد يكون عالميًا. على الرغم من عدم وجود علاقة كيميائية بين كودون mRNA أو anticodon من الحمض الريبي النووي النقال والتركيب الكيميائي للحمض الأميني ، إلا أن خصائص وخواص الحمض النووي الريبي المعطى لحمض أميني معين قد تطورت. كل هذه الميزات تقلل من مخاطر أخطاء النسخ ومعدل الطفرات النقطية.

تكوين الكروموسوم:

تصبح جزيئات الحمض النووي الريبي الحرة العائمة بمجرد وضعها في غشاء متكيفة مع جينات مرتبطة ببعضها البعض في كروموسوم واحد. تخضع الأنواع المختلفة من جزيئات الحمض النووي الريبي الحرة العائمة التي يتم نسخها داخل خلاياها الأولية لتوزيع غير متساو في الخلايا الوليدة بعد انقسام الخلية الأولية مع انخفاض اللياقة.

يمكن التغلب على هذا عن طريق ربط جزيئات الحمض النووي الريبي وربطها في حبلا واحد جنبًا إلى جنب مع النسخ المتماثل المتزامن الذي ينتج عنه توزيع متساوٍ للجينوم بين الخلايا الوليدة.

زيادة المعلومات الجينية:

يزداد حجم الجينوم مع زيادة التعقيد من اثنين من الجينات في الفيروس إلى 1000 في البكتريا والشيريا ، و 5000 في ذبابة الفاكهة ، و 30000 في الإنسان أو النباتات الأعلى ، ولكن لا يرتبط بزيادة كبيرة في عدد الجينات القابلة للترجمة.

تتمثل الآلية المهمة لزيادة المعلومات الجينية في مضاعفة الجينات متبوعًا بالطفرة والطفرة والاختيار الذي يؤدي إلى إنتاج إنزيم وجزيئات حيوية جديدة. يمكن أن يؤدي نقل الجينات الأفقي الطبيعي كما هو موجود في البكتيريا (التحويل والتحول ، الاقتران ، التنبيغ) إلى زيادة المعلومات الوراثية.

التعبير الظاهري عن النمط الجيني:

على الرغم من أن الجينات غالبًا ما ترتبط ببعض السمات المظهرية ، إلا أن الجينات تحدد فقط البروتينات / الإنزيمات. يمكن أن يكون لتغيرات الجين (الأليلات) تأثيرات على النمط الظاهري من خلال الاختلافات في البروتين المحدد. في الواقع ، فإن إنتاج نمط ظاهري معين هو نتيجة شبكة من التفاعلات بين الجينات والإنزيمات وبين الإنزيمات المختلفة التي لا يمكن تفكيكها.

أصل غشاء الخلية في الخلية الأولى:

العفوية لتلوين طبقة مزدوجة جزيئية على أسطح الماء عن طريق الدهون بمثابة نموذج لأوري وخجول غشاء الخلية الفوسفورية مزدوج الطبقة. ويرجع ذلك إلى مسعور (الانجذاب المتبادل) ومحبة للماء (تنجذب إلى الماء) نهاية الجزيئات الخطية (الشكل 2.11).

إذا كانت الأغشية الدهنية تشكل كرات ، فإن النهايات الكارهة للماء تكون مخفية داخل الفيلم لتصل إلى أدنى حالة طاقة. تتشكل الفوسفات والشيليبيدات بسهولة في وجود الدهون والجلسرين والفوسفات ويمكن صنع هذه الكرات تجريبيًا من خلال الاهتزاز والصوتنة.

تؤدي الإضافة المستمرة للكتلة إلى محتويات الكرات والغشاء إلى تبرعم الخلايا وانقسامها. يعتمد إقامة معظم الوظائف الحيوية (استقلاب الطاقة ، قنوات النقل) للخلية في غشاء الخلية على مجموعة متنوعة من البروتينات المضمنة (الشكل 2.12).

تطور التمثيل الغذائي في الخلية الأولى:

الأنواع الأساسية لاستقلاب الطاقة هي التصوير الفوتوغرافي ، والتنفس ، والتخمير ، والتكوين الميتاني ، وكلها ممثلة بين البكتيريا. استقلاب الطاقة التبديد (تقويضي) يشير إلى آلية توليد ATP مع روابط فوسفات غنية بالطاقة عالية (الشكل 2.13).

يشير التمثيل الغذائي الاستيعابي (الابتنائي) إلى عمليات التمثيل الغذائي التي تعمل على بناء مكونات الخلية من المركبات الكيميائية للبيئة من خلال التغذية الضوئية (التمثيل الضوئي والتحليل) ، والتغذية الكيميائية (التخليق الكيميائي) أو الأنماط غير المتجانسة والتضخم. تعتمد عملية ميتا والشيبولية على عمليات الأكسدة والاختزال المقترنة من النوع AH2 -1- B BH2 + A.

الحامل المهم للهيدروجين الموجود في الخلية هو NADVNADFH أو نسخته المُفسفرة NADP / NADPH (الشكل 2.14).

يمثل التخمير الشكل الأكثر بدائية لاستقلاب الطاقة الذي تكون كيمياءه الحيوية وخجله بسيطًا ولا يتطلب مؤكسدًا خارجيًا (متقبلًا للإلكترون) ومستقلًا عن O2. تشمل عمليات التخمير المعروفة تخمير حمض اللاكتيك ، تخمير الإيثانول ، تخمير حمض الزبد. يبدأ التمثيل الغذائي للكربوهيدرات والجهاز التنفسي عن طريق الخميرة اللاهوائية والخجل.

استندت آلية نقل وشيبورت الإلكترون المرتبطة بالغشاء الأول على جزيئات وظيفية بسيطة ولكن بدون مكون البروتين. تم تطوير مكون البروتين لاحقًا مما أدى إلى تحسين الكفاءة والنوعية.

مثل هذه الجزيئات العارية مثل الكينين ، والمعادن المحتوية على بور وشيفيرينات ، والحديد الفوسفوري غير العضوي الشائع في التراب البدائي الخجول ، يمكن أن تندمج في غشاء الخلية البدائي الذي يمكن تنشيطه ضوئيًا والمسؤول عن نظام نقل الإلكترون البدائي أو نوع من نقل الطاقة الكيميائية الضوئية وإزالتها (الشكل 2.15) ).

أصبح البورفيرين الحساس للضوء بمثابة بروتوكلوروفيل وسيتوكروم. يتم اشتقاق الكائنات التي تتنفس من كائن ضوئي التغذية من خلال الفقد الثانوي للكلورو والشيفيل وتعتمد على مخفضات كيميائية خارجية. تمتلك البكتيريا الأرجواني غير الكبريتية ذات التركيب الضوئي نظام نقل إلكتروني مطابق تقريبًا لنظام الميتوكوندريا (الشكل 2.16).

تتمثل آلية شرح أصل العمليات الكيميائية الحيوية المتوافقة والمختلطة التي تتضمن العديد من الخطوات والدورات في حقيقة أن هذه المسارات يمكن عكسها في الغالب ، مما يحفز العملية في أي من الاتجاهين.

التخفيض الاستيعابي لثاني أكسيد الكربون2 بمساعدة NADFH2 والطاقة (ATP) قد تعمل بطريقة معاكسة وتصبح مسارًا مؤكسدًا ومشتتًا ، مما يؤدي إلى تدهور وتأكسد المواد العضوية إلى CO2 وإطلاق ATP من خلال مسار انحلال السكر في الجهاز التنفسي ودورة حمض الستريك (الشكل 2.17).

كو2 يتم استيعابها من خلال دورة كالفين في مادة عضوية تخضع للأكسدة من خلال مسار تحلل السكر وهو في الواقع عملية عكسية لدورة كالفين. يمكن تتبع أصل دورة حامض الستريك من خلال حقيقة أن بكتيريا الكبريت الخضراء تستوعب ثاني أكسيد الكربون2 من خلال دورة حمض الستريك العكسية التي تكون اختزالية وتتطلب ATP (الشكل 2.18).

خلية بدائية النواة:

من المناقشة أعلاه ، من الواضح تمامًا أن التطور الكيميائي على الأرض البريبايوتيك أدى إلى ظهور جزيئات عضوية تضمنت البروتين والحمض النووي وما إلى ذلك.

قد يكون هذا بداية لتنظيم هيكلي ووظيفي مستقر يشبه الخلية البيولوجية. تسمى هذه الخلايا بدائية النواة بسبب عدم وجود نواة وعضيات مرتبطة بالغشاء.

كانت الخلايا بدائية النواة البدائية في الأساس خلايا لاهوائية (البكتيريا اللاهوائية) لأن الأرض المبكرة كانت خالية من الأكسجين. أدى استنفاد المركبات العضوية في الحساء البدائي إلى ظهور خلايا التمثيل الضوئي (الطحالب الخضراء المزرقة) التي يمكنها إصلاح ثاني أكسيد الكربون.2 وربما النيتروجين أيضًا.

كانت خلايا التمثيل الضوئي مسؤولة عن إنتاج الأكسجين في الغلاف الجوي مما أدى إلى تكوين الخلايا الهوائية (البكتيريا الهوائية) مع مسارات التمثيل الغذائي للتنفس الهوائي.


إنتاج الإنزيمات وتنقيتها: طرق الاستخراج وفصل الأمبير | علم الأحياء الدقيقة الصناعية

في هذه المقالة سوف نناقش حول إنتاج وتنقية الإنزيمات. تعرف على المزيد حول e طرق xtraction والفصل لعزل وتنقية الانزيمات. طرق الاستخراج هي: 1. استخراج ثقافات الركيزة الصلبة 2. استخراج الخلايا وطرق الفصل هي: 1. تقنيات فصل المواد الصلبة 2. تقنيات فصل الغشاء 3. الترشيح الهلامي 4. تقنيات الامتزاز 5. تقنيات الترسيب. وأيضًا إلقاء نظرة على المقالة الواردة أدناه للحصول على فكرة حول قابلية الإنزيمات و e تجميد الإنزيم .

في إنتاج الإنزيم ، توجد نسبة غير مواتية للغاية بين مدخلات المواد الخام ومخرجات المنتج. هذا يتطلب تركيب إجراءات الاحتيال والترابط. لأسباب اقتصادية لتطبيق الإنزيم ، عادة ما يكون التباين والترابط حتى 10 أضعاف مرضيًا للإنزيمات المحضرة والصناعية.

على سبيل المثال - تحتوي منتجات الإنزيم المستخدمة في المنظفات على حوالي 5-10٪ بروتياز بينما تحتوي مستحضرات الأميليز المستخدمة في معالجة الدقيق والخجل على حوالي 0.1٪ أميليز نقي فقط. ومع ذلك ، في التطبيقات التي تتطلب إنزيمات عالية النقاء ، على سبيل المثال ، في التحليل الإنزيمي ، فإن التنقية بمقدار 1000 ضعف أمر شائع جدًا.

في بعض التطبيقات ، مثل صناعة الخبز والدكستروز ، يجب أن يكون وجود الإنزيمات الملوثة منخفضًا جدًا أو يتم التحكم فيه بشكل صارم. علاوة على ذلك ، فإن محاليل الإنزيم الخام التي يتم الحصول عليها من المزارع الميكروبية تتداخل مع أنواع مختلفة من المنتجات الثانوية - بغض النظر عن مصدرها -. قد يكون فصل كل هذه المواد ضروريًا بسبب احتمالية حدوث تأثيرات غير مرغوب فيها.

بالنظر إلى استقرار الإنزيم ، هناك سبب آخر لمعالجة مستحضرات الإنزيم الخام. نظرًا لأن الاتجاه في تطبيقات الإنزيم هو استخدام المستحضرات السائلة والخجل ، فإن التثبيت هو إجراء مهم.

تستخدم تقنيات العزل والتنقية (الجزئية) على نطاق واسع للأنزيمات من المصادر الدقيقة والشبيبية بشكل أساسي الإجراءات التقليدية. يمكن العثور على معظم المعدات والخجل في مصانع تجهيز الأغذية. لا يتم تسويق المعدات واسعة النطاق الخاصة بعزل الإنزيم.

يتم تنفيذ جميع عمليات المعالجة تقريبًا في درجات حرارة منخفضة (يفضل وبخجل من 0 درجة إلى 10 درجات مئوية) ، باستثناء التجفيف.

عادة ما يتم إجراء عمليات الفصل على دفعات بدلاً من الخداع. ومع ذلك ، فإن توسيع نطاق عمليات الدُفعات يؤدي بطبيعته إلى إطالة أوقات المعالجة والتي تؤدي بالنسبة للعديد من الإنزيمات إلى زيادة فقدان النشاط بسبب تمسخ بروتين الإنزيم.

لهذا السبب ، يبدو أن تطبيق العمليات المستمرة مفيد ، لكن الضرورة والخداع للآلات الموثوقة للغاية والتحكم في العمليات البارعة يؤخران إدخال الأساليب المستمرة. بالإضافة إلى ذلك ، تُفقد قيمة المعالجة المستمرة عند إجراء خطوة عملية واحدة على دفعات ، وربما خجولة أثناء هطول الأمطار.

طرق الاستخراج :

الخطوة الأولى في عزل الإنزيمات هي استخلاصها. يتم استخدام التقنيات التي تندرج في هذه المجموعة إما لفصل الإنزيمات عن ثقافة الركيزة الصلبة أو لإطلاق الإنزيمات من داخل الخلايا الميكروبية.

استخراج ثقافات الركيزة الصلبة:

تستخدم الأنزيمات التي تنتجها الزراعة الصلبة والشيستراتية من النوع خارج الخلية. لذلك من السهل تصور أن استخراج نخالة العفن هو بالأحرى عملية غسل. تعد تقنيات الترشيح المعاكس هي أكثر عمليات الوحدة استخدامًا.

في كثير من الحالات ، يتم تجفيف نخالة العفن قبل الاستخراج. يكون هذا واضحًا ولامعًا عندما يكون استخدام مستحضر إنزيم معين موسميًا. يمكن إنتاج المزارع في معدات صغيرة نسبيًا على مدار السنة ، بينما يتم الاستخراج في أوقات الطلب على الإنزيم.

من ناحية أخرى ، من السهل ملاحظة أن الاستخراج من النخالة المجففة سينتج عنه محاليل ذات تركيزات إنزيمية أعلى. وأخيرًا ، يمنع التجفيف التداخل والخجل الناجم عن نشاط الخلايا الحية للمزارع الطازجة. ومع ذلك ، قد لا ينطبق هذا الجدال والخجل في مصانع الاستزراع التي تعمل باستمرار.

في جميع الحالات ، يكون المستخلص عبارة عن ماء قد يحتوي ، مع ذلك ، على أحماض (غير عضوية أو عضوية) ، أو أملاح ، أو مواد عازلة ، أو مواد أخرى لتسهيل حل الإنزيم وتثبيته أو تحسين ثباته في المحلول ، أو لاستبعاد أو تقليل الآثار غير المرغوب فيها التي تسببها تلويث المنتجات الثانوية أو الكائنات الحية الدقيقة.

يعتمد القرار بشأن استخدام خلايا كاملة في عملية كيميائية حيوية أو استخدام إنزيمات معزولة على العديد من العوامل. Technical difficulties and the related cost of large-scale isolation play an important role.

There are a number of methods for cell disruption, as reviewed by Hughes et al. (1971). Chemical and biochemical methods, such as autolysis, treat­ment with solvents, detergents, or lytic enzymes, have the disadvantage of being in principle batch operations. Their conduct is difficult to standardize and optimize. More recommendable are mechanical techniques.

At present, the APV-Manton-Gaulin homogenizer seems to be the most versatile type for cell disintegration. In this machine the cell suspension passes a homogenizing valve at the selected operating pressure and im­pinges on an impact ring. The strong shearing forces combined with the sudden decompression lead to a disruption of the cell wall. Dunnill and Lilly (1972), who examined the disruption of yeast, found that release of protein can be described by a first order rate equation-

Where R is the amount of soluble protein released in g per kg cell mass, Rم the maximum amount of soluble protein released, K a temperature-dependent rate constant, N the number of times the cell suspension has passed the homogenizer, and P the operating pressure. With industrial models, be­tween 50 and 9000 liters of bacterial suspension per hr can be treated, depending on the size of the machine. Ball mills available on the market have a volume capacity of 0.6-250 liters.

Separation Methods :

It is possible here to give only the barest outline of methods that find wider application in the large-scale production of enzymes.

Solids Separation Techniques:

Such methods are involved in the clari­fication of culture liquors and extracts, in the separation of precipitates, and in the sterilization of liquid enzyme preparation by mechanical methods.

The solids to be separated may have a number of properties which make separation processes difficult. For instance, they may be greasy, sometimes colloidal, and often density differences between solid particles and liquid phase are very small. Therefore, pretreatment of the liquor is usually inevitable, as conducted by acidification, addition of water miscible sol­vents or liquid polyions, mild heating, etc.

The problems of large-scale solid-liquid separation are complex and di­verse. There are two approaches- centrifugation and filtration. Industrial centrifuges are not ideal for removal of finely divided biological solids. Disc type centrifuges without solid discharge have proved most efficient for separation of easily settling suspensions of greasy particles. Decanters are used in cases where solids content is high but easily settling, e.g., in the production of dried acetone precipitates.

In cases of poorly settling protein precipitates, hollow bowl centrifuges are employed for separation from low solids suspensions as obtained during fractionated enzyme precipitation. In all cases flow rates must be determined empirically. Sometimes (e.g., with precipitates) the throughput is reduced to less that 10% of the nominal capacity. This requires the integration of cooling devices.

Most frequently filters are more suitable for separation of biological particles. Generally large proportions of filter aids are required. In continu­ous processes vacuum drum filters are used, with diatomaceous earth, wood-meal, or starch as pre-coat materials. Batch operations are conducted with filter presses.

Membrane Separation Techniques:

Membrane processes allow separa­tion of solutes from one another or from a solvent, with no phase change or interphase mass transfer. There are many different kinds of membrane processes, the classification of which is based on the driving forces that cause the transfer of solutes through the membrane. Such a force may be trans-membrane differences in concentrations, as in dialysis electric poten­tial, as in electro-dialysis or hydrostatic pressure, as in microfiltration, ultrafiltration, and reverse osmosis.

At present, ultrafiltration is the only membrane process of importance in large-scale enzyme production. From normal filtration processes it differs just by the size range of the particles to be separated (molecular weight cutoffs between 500 and 300,000). Two types of ultrafiltration membranes are used, which differ in their transport mechanisms and their separation properties.

Isotropic porous membranes are the type most similar to conventional filters. They possess a spongy structure with extremely small random pores the average size of which is in the range of 0.05 to 0.5 microns. Molecules with a diameter smaller than that of the smallest pore will pass the mem­brane quantitatively, whereas particles larger than the largest pore will be retained at the filter surface. Molecules of intermediate size, however, will only pass to some extent.

Another proportion of these particles will be retained within the structure of the membrane. This leads, first, to a decrease in retention (or vice versa, in permeation) with a resulting fouling of the membrane, and secondly, to a reduced discrimination among solutes of different size. In order to minimize fouling it is useful to use membranes with a mean pore size well below that of the solute to be retained. Therefore, porous membranes are advisable for the concentration of high molecular weight solutes (molec. Weight < 1 x 10 6 ).

Diffusive membranes are capable of more selective molecular discrimina­tion. They are essentially homogeneous hydrogel layers, through which the solvent as well as the solute is transported by molecular diffusion under the driving force of a concentration or a chemical potential gradient. The transportation of a molecule through the membrane requires considerable kinetic energy.

This depends, of course, on the dimensions of the diffusing molecule and on the mobility of the single polymer chains within the membrane matrix. As a rule, the rate of diffusion is high when the polymer segments of the matrix are only loosely interlaced, i.e., when the gel matrix is highly hydrated. For this reason all membranes made from hydrophilic polymers and capable of swelling in water to a certain degree are princi­pally suited as pressure filtration membranes for aqueous solutions.

In addition to the retention potential of the membrane the flux is impor­tant for economic reasons. Since in both the porous and the diffusive filter types the flux depends largely on the thickness of the membrane, it is necessary to keep the membrane as thin as possible.

This requirement has been fulfilled by the construction of anisotropic membranes. They consist of a highly consolidated but very thin (0.1-5 μm) active layer on a compara­tively thick (1 to 20 microns) highly porous support. The advantage of these anisotropic membranes is that there is no reduction in solvent permeability at constant hydrostatic pressure because there is no blockage within the membrane.

In any ultrafiltration system, accumulation of solutes at the membrane surface occurs, which leads to formation of a “slime” that increasingly impedes solvent flow through the membrane, until convective transport of solute toward the membrane is equal to the rate of back diffusive transport away from the membrane. This phenomenon is called “concentration polar­ization”.

Proteins and colloidal particles build up solid or thixotropic gels when concentrated beyond a certain point. The solute concentration on the membrane surface reaches an upper limit which is typically between 20 and 70% solute by volume. In order to reduce the polarization effect, in industrial ultrafiltration equipment the feed solution passes the membrane surface at high flow rate.

When a macromolecular solution is ultra-filtered, flux of solvent is de­scribed by the relationship-

Where A is the membrane constant (dependent on temperature, indepen­dent of pressure over the normal operating range), ΔP is the hydrostatic pressure driving force, and Δπ is the osmotic pressure difference across the membrane. For macromolecular solutions with concentrations over 1% w/v, osmotic pressures exceeding 10 to 50 psi are not uncommon.

There are several basic types of ultra-filters – thin channel, tubular, helical tubes, spiral wrapped, and hollow fiber systems. Suitability of a single type depends on the properties of the system to be treated.

The technique of ultrafiltration has the advantage of combining both separation of impurities and concentration of the desired enzyme. However, due to its principle, it is a rather nonselective process. Better results, regarding separation of molecules from each other, can be obtained by gel filtration, but in many cases its application is not economically feasible.

In principle, gel filtration is the diffusional partitioning of solute mole­cules between the readily mobile solvent phase and that confined in spaces within the porous gel particles that make up the stationary phase. Diffusional exchange of solutes takes place between the stationary and mobile phases. The extent to which a molecule penetrates the station­ary phase is represented by the partition coefficient Kav, according to the equation

Where Vه is the volume of solvent required to elute solute from the gel column, V0 is the void volume (i.e., the volume of liquid external to the gel particles), and Vر is the total volume of column bed. كav is inversely proportional to the log of the molecular weight, as shown empirically.

Gel filtration works rapidly and preservingly, without mechanical stress as in ultrafiltration. However, precipitation of proteins within the gel column may occur as a consequence of desalting. In some cases it has been observed that the metal bridges of enzyme quaternary structures were uncoupled.

Adsorption Techniques:

Because of the possibility of highly selective separations, adsorption processes are increasingly used. Properties of en­zyme molecules as different as, e.g., lipophily, electric charge, specificity, etc., are the basis of separation. This results in a great number of adsor­bents, such as active carbon, hydroxyapatite, ion exchangers, carrier fixed substrate analogs, and so forth.

A common feature of all adsorption tech­niques is the principle of adsorption followed by desorption or elution. Separation is achieved by adsorption and elution of either enzyme or impu­rities. Two methods are available, batch wise adsorption or column chroma­tography. The latter process has greater separation efficiency and, in addi­tion, offers the possibility of semi-continuous operation.

Among the different adsorption techniques, affinity chromatography is of very great interest, but far from being applicable on a large scale. Ion exchangers available for large-scale processes are of the resin, large-pore gels, or cellulose types. In particular, ion exchange resins exhibit useful properties for industrial production of enzymes.

It must, however, be taken into consideration that the proximity of a resin matrix with a high charge density can affect the structural integrity of enzymes. Large-pore ion exchangers and cellulose exchangers have a number of properties which make them very suitable for enzyme separation processes, but the former are very costly. Obviously, they are only suitable for batch processes be­cause they are compressed in columns.

Precipitation Techniques:

Separation from solution by salting out is one of the oldest and yet most important procedures of concentration and purification of enzymes. The logarithm of the decrease in protein solubility in concentrated electrolyte solutions is a linear function of increasing salt concentration (ionic strength), as described by the equation-

where s is the solubility of the protein in g/liter solution τ the ionic strength in moles per liter B 1 , an intercept constant, is dependent on pH, tempera­ture, and the nature of the protein in solution K 1 is the salting out constant which is independent of pH and temperature, but varies with the protein in solution and the salt used. From the preceding relationship it can be derived that precipitation of protein of known concen­trations will occur when the ionic strength satisfies the equation

This means that the electrolyte concentration required for protein precipi­tation varies with protein concentration.

The influence of the most important precipitation parameters can be outlined shortly as follows – Higher valency salts produce higher ionic strength than lower valency salts. At a constant ion strength, protein solubility increases with increasing distance (in both directions) from its isoelectric point. As a result, lower ionic strength is required for precipita­tion when carried out at the isoelectric point of the protein.

The commonly used salt for precipitation is ammonium sulfate. The reasons can be found in the high solubility of this salt and in its low price. In addition, ammonium sulfate is nontoxic for most enzymes and in many cases it acts as a stabilizing agent. In ammonium sulfate solutions precipitated enzymes are often storable for years without significant loss when kept at low temperatures.

In contrast to neutral salts, solvents are less customary for large-scale precipitation of enzymes. The reason is higher costs of raw materials and equipment. Explosion proof equipment and recycling of the solvents are inevitable requirements.

Solvent precipitation is based on the fact that the solubility of enzymes decreases with the decreasing dielectric constant (ϵ) of the solvent. The concentration required is lower the less hydrophilic the solvent is. Thus, an increasing precipitating effect can be achieved in the series methanol (ϵ25 = 33), ethanol (ϵ25 = 24), isopropanol (ϵ25 = 18). Besides aliphatic alcohols, acetone (ϵ25 = 20) is often used as a precipitant.

Solvent precipitates are distinguished from salt precipitates by the ease with which they settle. However, at temperatures above 4°C denaturation of the enzyme protein can occur. Therefore, it is quite normal to work at temperatures below zero. This, however, requires large cooling capacity in industrial manufacture.

All these difficulties can be avoided by using polyethyleneglycol with a molecular weight of 6000. This precipitant does not effect enzyme denatur­ation and is relatively independent of temperature and electrolyte concen­tration. However, there is a strong dependence on hydrogen ion concentra­tion. The best results are obtained at the isoelectric point of the enzyme to be precipitated.

As the solubility of a protein molecule is lowest at its isoelectric point, successive precipitation of different enzymes from a solution can be achieved by changing the pH. These precipitates settle easily and can easily be separated from the solution by centrifugation.

Conversion to Storage Form :

Storability of an enzyme requires the preparation of a suitable storage form. Commercial enzyme products are available either in solution or in solid state. Generally, users prefer solutions because of their easier han­dling, but enzymes are usually very unstable in aqueous solution.

For this reason stabilization of dissolved enzymes is a very important step in the manufacture of liquid enzyme preparations. The storage stability is af­fected by the following two factors- microbial deterioration of the enzyme solution and denaturation of the enzyme protein. These two problems seem to be closely related to each other.

Many treatments have been tried in order to prevent growth of microor­ganisms. The methods include, for instance, incorporation of chemical pre­servatives, pasteurization, addition of salts and polyhydric alcohols, and irradiation. But some of those treatments are undesirable due to legal aspects. Therefore, the most suitable method to repress microbial growth is to dissolve the enzyme in a highly concentrated solution of salts and sugars.

With liquid preparations, storage at low temperatures and at suitable pH is essentially inevitable. It is well known that substrates almost invariably protect the corresponding enzyme against physical, chemical, or physicochemical agents. This can be attributed to either conformational stabiliza­tion or steric or competitive protection.

From a number of publications it can be seen that almost any effect on enzyme stability may a priori be an allosteric one due to attack at sites other than the active site of the enzyme. For example- in thermolysin, a bacterial protease, Ca ions stabilize the enzyme molecule, while Zn ions are required for activity. The enormous value of Ca ions in stabilizing bacterial α-amylase has long been known.

A number of techniques are available for stabilization.

Some of them are presented in the following list, immobilization methods excluded:

(1) Conformational or charge stabilization and/or protection from dilution-dissociation by using buffers, glycerol, substrates, or inhibitors.

(2) Protection of active site thiol via disulfide exchange by thiols, redox dyes, oxygen-binding agents, or chelating agents.

(3) Miscellaneous methods include, e.g., inhibition or removal of proteo­lytic enzymes protection from light by photosensitive dyes lowering activity of water by viscosity effectors, salts, or sugars lowering surface energy by antifoams cooling and crystallization protection by antifreeze removal of harmful agents and sterilization for protection against microbial attack.

Commercially available solid enzyme preparations are dried mold brans, dried precipitates, or dried solutions. Spray drying is the preferred method for removal of water from enzyme solutions due to economic reasons. How­ever, it is only applicable to enzymes sufficiently resistant to the tempera­ture conditions of this process. On the other hand, freeze drying is most preserving, but its use is limited by cost considerations as well as by the fact that unless the salt concentrations of the enzyme solution are sufficiently reduced, eutectic mixtures may be formed.

This may lead to incomplete drying or to severe foaming and protein denaturation. A specific method of drying sometimes used is granulation in a fluidized bed with milk sugar or maltodextrin as carrier. In this case, of course, sufficiently high specific activity of the enzyme is required in order to ensure satisfactory activity of the commercial preparation.

Enzyme Immobilization :

In commercial applications enzymes are used commonly in the soluble or “free” form. This practice, however, is very wasteful, because the enzyme is discharged at the end of the reaction, although its activity is scarcely lessened in reactions carried out under optimum conditions.

Immobiliza­tion prevents diffusion of the enzymes in the reaction mixture and permits their recovery from the product stream by simple solid-liquid separation methods. As a consequence, reaction products are free of enzyme and reuse of the enzyme is possible. Another advantage of immobilized enzymes is that they can be used in continuously operated reactors.

Methods of Immobilization:

In principle, immobilization of an enzyme can be achieved by fixing it on the surface of a water-insoluble material, by trapping it inside a matrix that is permeable to the enzyme’s substrate and products, and by cross-linking it with suitable agents to give insoluble particles. Bound enzymes may be prepared by covalent coupling to active matrices or by heteropolar and/or van der Waals binding to adsorbents or ion ex­changers.

Covalent coupling to activated carrier materials is achieved by methods known in peptide and protein chemistry. Some examples of enzymes immo­bilized in this pattern are given in Table 15.3. The formation of covalent bonds has the advantage of an attachment which is not reversed by pH, ionic strength, or substrate. However, covalent binding offers the possibil­ity that the active site of enzyme may be blocked through the chemical reaction used in the immobilization reaction and the enzyme rendered inactive.

There are a large number of methods of covalent attachment. The groups of enzymes that take part in the formation of the chemical bond are- amino, imino, amide, hydroxyl, carboxy, thiol, methylthiol, guanidyl, imidazole groups, and the phenol ring. Methods have been developed for covalently attaching enzymes to inorganic carriers such as alumina, glass, silica, stainless steel, etc.

Adsorption of enzymes at solid surfaces (Table 15.4) offers the advantage of extreme simplicity. It is carried out accord­ing to the principles of chromatography. The conditions of adsorption in­volve no reactive species and thus do not result in modification of the enzyme. The binding of enzymes, however, is reversible and for this reason adsorbed enzymes present the problem of desorption in the presence of substrate or increased ionic strength.

Commonly used adsorbents include many organic and inorganic materials such as alumina, carbon, cellulose, clays, glass (including controlled-pore glass), hydroxyapatite, metal oxides, and various siliceous materials. Ion exchange resins bind enzyme by electrostatic interactions. The first successful commercial application of immo­bilized aminoacylase (for resolution of DL-amino acids) involved fixing of the enzyme by adsorption to DEAE-Sephadex as carrier.

Inclusion of enzymes in polymer gels, microcapsules, or filamentous structures has the advantage of relatively mild reaction conditions. This method is free from the risk of blocking active site groups on the enzyme molecule by chemical bonds the enzyme is retained in its native state.

The major drawbacks of this immobilization technique are two- retardation of the enzymic reaction due to diffusional control of the transport of substrate and products (particularly with high molecular weight substrates and/or products) and continuous loss of enzyme due to the distribution of pore sizes. Materials used for entrapment include silicone rubber, silica gel, starch, and, preferably, polyacrylamides. Exam­ples of enzymes immobilized by entrapment are given in Table 15.5.

A variation of the inclusion method is encapsulation within semiperme­able membranes. Materials such as collodion poly­styrene, cellulose derivatives, and, most commonly, nylon have been used to form thin, spherical, semipermeable membranes shaped into micro­capsules which include the enzyme to be immobilized. The size of the capsules can range from μm to many μm. As has been demonstrated by Kitajima and Kondo (1971) with yeast, it is possible to encapsulate multi-enzyme systems from cell extracts and to carry out fermentation in such artificial cells.

Enzymes can be polymerized by cross-linking with low molecular weight multifunctional agents (see Table 15.6). This method leads to the formation of a three-dimensional network of enzyme molecules when the reaction is carried out in the absence of a support. However, usually it results in a considerable loss of activity. Com­monly, enzymes are cross-linked after adsorption onto a suitable carrier.

Cross-linking agents most commonly used include diazobenzidine and its derivatives and particularly glutaraldehyde. On the other hand, enzymes can become immobilized by copolymerization, i.e., covalent incorporation into polymers. The methods most often em­ployed involve copolymerization with maleic anhydride and ethylene. As with entrapped and microencapsulated enzymes, these derivatives show little or no activity toward macromolecular substrates.

An alternative to the immobilization of isolated enzymes is immobiliza­tion of whole microbial cells. This method provides a means of avoiding expensive enzyme purification operations. Entrapment of enzymes within whole cells may also be useful when various enzymes are involved in a given process.

And, finally, immobilized intact cells have proved effective in processes involving enzymes that require cofactors for mediating their catalytic action. Some examples of whole cell immobilization are shown in Table 15.7. Cells can be immobilized by fixing them to carriers, such as fibers or granular materials, or by entrapment.

Properties of Immobilized Enzymes:

After immobilization of an en­zyme, its properties can be changed significantly. Such alterations may be attributed to (1) the physical and chemical nature of the carrier used, (2) the chemical and/or conformational changes in the enzyme structure, and (3) the “heterogeneous nature” of catalysis caused by immobilization.

Effects of altered reactivity include kinetic constants (resulting from a change in activation energy), optimum pH, Michaelis constant, and sub­strate specificity. A matrix charge can affect the hydrogen ion concentra­tion in the locus of the attached enzyme and thus change its apparent pH optimum in one direction or the other, depending on the use of either cationic or anionic carriers, and the apparent Michaelis constant if the substrates are also charged it is increased if the matrix and the substrate charges are alike and decreased if they are opposite. Changes in enzyme specificity can result from conformational changes in the enzyme molecule caused by the attachment itself.

One of the more important results of enzyme immobilization is the reten­tion of activity for considerable periods of time under suitable conditions of storage. The stability of immobilized enzymes to storage, heat, and pH basically depends on the nature of the carrier surface to which the enzyme is bound.

Among 50 immobilized enzymes, as compared with their soluble counterparts, Melrose (1971) found 30 more stable and 8 less stable than the soluble forms 12 showed no difference from the free systems. The reasons for the observed increase in stability are not clear. It may be attributed, for example, to prevention of conformational inactivation or to shielding of active groups on the enzyme from reactive groups in solution.


How Enzymes Work

Figure 3. Diagram of a catalytic reaction showing difference in activation energy in uncatalysed and catalysed reaction. The enzyme reduces the energy barrier required to activate the substrate, allowing more substrates to become activated, which increases the rate of product formation. Note that the energy difference between the substrate and the product is not changed by the enzyme.

In all chemical reactions, there is an initial input of energy that is required before the reaction can occur. If this initial energy requirement (called the activation energy or energy barrier) is small, then the reaction will happen quickly and easily. If the activation energy is large, then the reaction will take longer to occur. Enzymes function to reduce the activation energy required for a chemical reaction to occur.

First, the enzyme binds to the substrate and slightly distorts its shape. The change in shape activates the substrate molecule and decreases the total activation energy required for the substrate to be turned into product. As the number of activated substrate molecules increases, so does the conversion of substrate to product. An analogy for this effect is a ski hill, with skiers at the bottom of one side of the hill representing substrates, skiers on the top of the hill representing activated substrates, and the products being the number of skiers that ski down the other side. If the height of the hill is lowered (due to the presence of the enzyme), then more skiers can make it to the top, increasing the number that ski down to become products.

Practice Questions

Fill in the blank: When an enzyme catalyzes a reaction, ________.

  1. it raises the activation energy of the reaction.
  2. it is used once and discarded.
  3. it becomes a product.
  4. it acts as a reactant.
  5. it lowers the activation energy of the reaction.

What will happen to the rate at which a chemical reaction proceeds if the activation energy is increased?

  1. The reaction will happen faster (at a higher rate).
  2. The reaction will happen slower (at a lower rate).
  3. The reaction rate will not change.

In Summary: Enzymes

Enzymes are proteins that speed up reactions by reducing the activation energy. Each enzyme typically binds only one substrate. Enzymes are not consumed during a reaction instead they are available to bind new substrates and catalyze the same reaction repeatedly.


Key Pathway • Ras/RAF/Mitogen-Activated Protein [MAP] Kinase Pathway

Ras = G-protein specific to this pathway RAF = proto-oncogene serine/threonine kinase

MEK = mitogen-activated protein kinase MAPK = mitogen-activated protein kinase

Ras • a small G protein (GTPase) involved in signal transduction leading to cell division and proliferation. If not regulated properly, Ras proteins can lead to uncontrolled cell division that eventually results in tumor formation.

RAF [Rapidly Accelerated Fibrosarcoma] • family of protein kinases that are involved with retroviral oncogenes (genes that can potentially cause cancer).

Tyrosine-Kinase Associated Receptors • associate with intracellular proteins that have tyrosine kinase activity. These receptors lack the tyrosine kinase domain that was discussed earlier and, therefore, accomplish tyrosine phosphorylation by cytoplasmic tyrosine kinases instead.

Cytokine receptors make up the largest family of receptors that relay signals into the cell by cytoplasmic tyrosine kinases. These particular receptors are associated with the cytoplasmic kinase, Jak (Janus kinase). Jak will go on to activate a gene regulatory protein called STAT (signal transducers and activators of transcription). The pathway is described and depicted below:

Key PathwayJak/Stat pathway (Janus kinase/signal transducers and activators of transcription) • The Jak/Stat pathway is the principal pathway for cytokines and growth factors in humans. This pathway is activated by a number of cytokines (most commonly interferons) and growth factors. Activation stimulates cell proliferation, differentiation, migration and apoptosis. Furthermore, cytokines control the synthesis and release of a number of inflammatory mediators. When a cytokine binds to its enzyme-linked receptor it results in a conformational change leading to phosphorylation of the intracellular active-enzyme domain, eventually leading to the transcription of inflammatory mediators. As with all signal transduction mechanisms, homeostasis is reliant on proper regulation of all these different pathways. Lack of proper regulation of the JAK pathway can cause inflammatory disease, erythrocytosis, gigantism and leukemias.


ER/SR Calcium Pump: Function

Ca 2+ Binding and Catalytic Activation

Binding of two calcium ions per ATPase molecule is an absolute requirement for enzyme activation . The cooperative character of binding is consistent with a sequential binding mechanism to two interdependent sites (I and II). Spectroscopic studies provided early suggestions of Ca 2+ -induced conformational effects, accounting for binding cooperativity and enzyme activation. A detailed characterization of the large conformational changes produced by Ca 2+ binding was then obtained by high-resolution diffraction studies.

The functional role of the Ca 2+ -induced conformation change lies in its absolute requirement for enzyme activation, rendered possible by the long-range intramolecular linkage. The requirement for Ca 2+ involves both ATP use for phosphoenzyme formation in the forward direction of the cycle and the formation of ATP upon addition of ADP to phosphoenzyme formed with Pi in the reverse direction of the cycle. Activation is not obtained by Ca 2+ occupancy of the first binding site only but requires the occupancy of the second site, which may then be considered a Ca 2+ trigger point for enzyme activation. Ca 2+ -binding affects directly the M4, M5, and M6 transmembrane helices and is then transmitted to the extramembranous region, resulting in the large displacement of the headpiece domains and catalytic activation. Single mutations of several residues in the segments connecting the Ca 2+ -binding region with the phosphorylation domain, such as M4, M5, and the M6–M7 loop, interfere with the phosphorylation reactions.


C3 and C4 Plants

Carbon fixation resulting in a three-carbon sugar is known as C3 photosynthesis, and most plants use this kind of photosynthesis. It works well in cool, moist conditions where plants can keep the pores that let carbon dioxide in, called stomata, open throughout the day.

For many summer annual plants, conditions are too hot to allow stomata to remain open throughout the day, so these plants have adapted by developing C4 photosynthesis. C4 photosynthesis is named as such because the fixation of carbon dioxide, by an enzyme called PEP carboxylase, results in a four-carbon sugar. The carbon acquired this way is then passed on to RUBISCO and enters the Calvin cycle.


شاهد الفيديو: وضح بالرسم البيانى دور العامل الحفاز فى توفير طاقة التنشيط (يونيو 2022).