معلومة

ما هي الإنزيمات التي يجب أن أستخدمها لإعداد معلق خلية واحدة من أنسجة القلب لقياس التدفق الخلوي؟

ما هي الإنزيمات التي يجب أن أستخدمها لإعداد معلق خلية واحدة من أنسجة القلب لقياس التدفق الخلوي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل يمكن لأي شخص أن يقترح أي إنزيمات يجب أن أستخدمها لتحضير تعليق خلية مفردة من نسيج القلب. سأبحث في كل من مستضدات سطح الخلية وداخل الخلايا التي تتضمن خلايا عضلة القلب والأرومات الليفية.


تطوير المضادات الحيوية النانوية الجديدة باستخدام آلية تدفق دوائية تعتمد على الحويصلة في الغشاء الخارجي

تفرز البكتيريا كميات كبيرة من الحويصلات المحملة بالمضادات الحيوية من خلال تعبير مضخة التدفق العالي وإفراز OMV.

تعمل OMVs بشكل فعال على تحميل المضادات الحيوية وتحسين استقرار المضادات الحيوية.

تمارس OMV المحملة بالمضادات الحيوية تأثيرات مبيد للجراثيم سلبية ونشطة من خلال إطلاق الدواء والغزو البكتيري.

تتمتع OMVs المحملة بالمضادات الحيوية بتوافق حيوي ممتاز.

يمكن أن تحمي OMVs المحملة بالمضادات الحيوية بشكل فعال من الالتهابات البكتيرية المعوية عن طريق الفم.


الملخص

أمراض القلب هي أحد الأسباب الرئيسية للوفاة حول العالم. التحدي الأكبر للعلماء هو تطوير طرق علاجية جديدة لهذه الأنواع من الأمراض. يمكن أن يكون العلاج بالخلايا الجذعية أحد الأساليب الواعدة المستخدمة لتجديد خلايا القلب وعلاج أمراض القلب. عادي في المختبر التقنيات المستخدمة للتحقيق في تجديد القلب لا تحاكي فسيولوجيا القلب الطبيعية. مختبر على رقاقة قد تكون الأنظمة هي الحل الذي يمكن أن يسمح بإنشاء نموذج لعضلة القلب ، مما يتيح نمو خلايا القلب في ظروف مشابهة في الجسم الحي شروط. يمكن أيضًا استخدام الأنظمة الدقيقة لتمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا القلب بنجاح. سيساعد على فهم أفضل لقدرة هذه الخلايا على التكاثر والتجدد. في هذا الاستعراض ، نقدم قلب على رقاقة أنظمة تعتمد على زراعة الخلايا القلبية وبيولوجيا الخلايا الجذعية. تبدأ هذه المراجعة بوصف البيئة الفسيولوجية ووظائف القلب. بعد ذلك ، وصفنا باختصار التقنيات التقليدية لتمايز الخلايا الجذعية في خلايا القلب. تركز هذه المراجعة في الغالب على الوصف مختبر على رقاقة أنظمة هندسة أنسجة القلب. لذلك ، في الجزء التالي من هذه المقالة ، يتم وصف الأنظمة الدقيقة لكل من زراعة الخلايا القلبية والتمايز بين الخلايا القلبية في خلايا القلب. ينقسم القسم حول تمايز SCs في خلايا القلب إلى أقسام تصف التحفيز الكيميائي الحيوي والفيزيائي والميكانيكي. أخيرًا ، نحدد التحديات الحالية والأبحاث المستقبلية المتعلقة قلب على رقاقة على أساس بيولوجيا الخلايا الجذعية.


2.4 تطبيقات في البحث والطب:

مزيج من التدفق الخلوي مع SMDC يوفر كفاءة استراتيجية جديدة ل المختبرات الموحدة التعبير عن تشخيص المرض, تشخيص المرض فضلا عن السيطرة على الكفاءة العلاجية في الطب السريري من خلال استخدام الخلية البيوكيميائية إلى جانب الكيمياء السريرية أو غيرها مرضي العوامل. والجهود جارية للتنفيذ العملي لهذا النهج ، على سبيل المثال: في ال بتمويل من الاتحاد الأوروبي مجموعة العمل الأوروبية لتحليل الخلايا السريرية (EWGCCA).


عزل وتنقية الفئران القلبية

لقد قمنا بتحسين بروتوكول لعزل وتنقية الخلايا القلبية الفأرية من أجل البحث الأساسي والتحقيق في بيولوجيا وإمكانياتها العلاجية.

تم تحسين بروتوكولنا ليناسب نموذج الماوس ويستخدم المواد المتاحة بسهولة لجميع الباحثين. يمكن تطبيق هذه التقنية على نماذج الفئران الصحية أو المرضية أو المعدلة وراثيًا. سيمكن بروتوكولنا الباحثين من الإجابة على أي أسئلة حول بيولوجيا محيط القلب من أي نموذج فأر للمرض أو الاختلاف الجيني.

سيوفر هذا الإجراء نظرة ثاقبة لبيولوجيا القلب ويساعدنا على فهم مساهمتها في التوازن القلبي وديناميكا الدم في كل من الصحة والمرض. ضع الماوس المخدر في وضع ضعيف ، وقم بشريط أسفل أطرافه الأمامية. افتح تجويف الصدر بحذر ، وقم بإدخال القنية على الشريان الأورطي الهابط باستخدام إبرة فراشة قياس 25.

اصنع شقًا في الأذين الأيمن. بعد ذلك ، قم بتروية القلب بما لا يقل عن 20 مليلترًا من 250 وحدة لكل مليلتر مملحة بالهيبارين ، خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم فوسفات Dulbecco المخزن بمحلول ملحي مخزون بمعدل 2 مليلتر في الدقيقة باستخدام مضخة تمعجية متغيرة التدفق. يكتمل الإرواء عندما يخرج برنامج تلفزيوني نظيف من الأذين الأيمن.

قطع القلب في الشريان الأورطي ، ووضعه في DPBS خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم الباردة الجليد. بعد ذلك ، انقل القلب إلى طبق بتري مقاس 15 × 15 سم. قطع القلب إلى قطع صغيرة باستخدام مقص الربيع وملقط دقيق مع ما يكفي من محلول الإنزيم لتغطية القطع.

الآن ، قم بنقل القطع والمحلول إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، وختمه بغشاء بلاستيكي بارافين. احتضان عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 75 دقيقة. بعد هضم الكولاجيناز بمحلول الإنزيم ، صب السائل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في أنبوب جديد سعة 50 مليلتر ، مع ترك محلول كافٍ حتى لا تجف القطع.

باستخدام ملقط دقيق ، خذ الأنسجة من الأنبوب وضع بضع قطع على شريحة مجهر. ثم ، قم بطحن الأنسجة بين شريحتين مجهر لتفتيت الأنسجة. اشطف الشرائح بوسائط استزراع خالية من الإنزيم في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلترًا.

كرر هذه الخطوة حتى يتم فصل جميع قطع الأنسجة. الجمع بين المحلول المجهد والأنسجة الأرضية في أنبوب واحد. صفي المعلق الناتج من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر.

قم بالطرد المركزي للعينة عند 220 مرة بالجرام وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. نضح من المحلول السابق ، وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في المخزن المؤقت لتلطيخ FACS البارد الذي يحتوي على DPBS وألبومين المصل البقري. عد الخلايا وتحقق من صلاحيتها باستخدام عداد الخلايا.

تمييع الخلايا إلى مليون خلية لكل مليلتر باستخدام محلول تلوين FACS بارد يحتوي على DPBS وألبومين مصل البقر. الخلايا جاهزة الآن للتلوين والفرز. قم بإعداد وتسمية أنابيب FACS سعة خمسة مليلتر لجميع عناصر التحكم وعينات الخلايا.

قسمة مليلتر واحد من الخلايا لكل أنبوب لعينة غير ملوثة ، وميض مطروحًا منه عنصر تحكم واحد ، وعناصر تحكم مطابقة للنمط المتماثل. استخدم الخلايا المتبقية للفرز. يمكن تحضير جميع عناصر التحكم والعينات وتلطيخها في نفس الوقت.

أيضًا ، قم بإعداد وتسمية أنابيب FACS بخمسة مليلتر لما مجموعه تسعة عناصر تحكم تعويض ، ونوعين من الخرز غير الملوث بالإضافة إلى سبعة فلوروكرومات مختلفة من لوحة التحديد. لتحسين عناصر التحكم في تعويض التألق ، أضف قطرة واحدة من حبات التعويض من قارورة الضغط إلى كل أنبوب. ثم أضف ميكروليترًا واحدًا من الجسم المضاد إلى الخرزات.

كرر لكل جسم مضاد من لوحة العلامة. استخدم عناصر تحكم FMO لتحسين تلطيخ الخلفية بسبب التداخل الطيفي. إلى الخلايا الموجودة في أنابيب التحكم FMO ، أضف جميع الأجسام المضادة من لوحة العلامات بتخفيف واحد إلى 100 ، لكن استبعد جسمًا مضادًا واحدًا.

كرر لكل جسم مضاد لما مجموعه سبعة عناصر تحكم. استخدم أجسامًا مضادة للتحكم المطابق للنمط المتماثل للتلوين غير المحدد. إلى الخلايا الموجودة في الأنابيب ذات العلامات المتطابقة للنمط المتماثل ، أضف جسم التحكم المطابق للنمط المتماثل بتخفيف واحد إلى 100.

بعد ذلك ، قم بإعداد الخلايا المراد فرزها. إلى الخلايا المعزولة حديثًا ، أضف كوكتيلًا من الأجسام المضادة بتخفيف واحد إلى 100. أضف أيضًا صبغة صلاحية الخلية بتخفيف واحد إلى 1000.

قم بخلط عناصر التحكم في التعويض بقوة من خلال دوامة النبض. احتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، محميًا من الضوء ، باستثناء حبات صلاحية الخلية ، والتي يمكن تركها في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. قم بخلط عناصر تحكم FMO ، وعناصر التحكم المطابقة للنمط المتماثل ، والخلايا المراد فرزها عن طريق دوامة النبض.

احتضان لمدة 30 دقيقة على أربع درجات مئوية ، محميًا من الضوء. أضف ثلاثة مليلتر من عازلة تلطيخ FACS إلى كل عنصر تحكم في التعويض ، والتحكم في FMO ، والتحكم في النمط المتماثل. الطرد المركزي للأنابيب 300 مرة g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

نضح من المحلول ، وأعد تعليق كل حبيبة في 400 ميكرولتر من عازلة تلطيخ FACS. ضوابط التعويض ، وعناصر تحكم FMO ، وعناصر تحكم isotype جاهزة الآن للاستخدام. بعد التلوين ، اغسل الخلايا باستخدام محلول تلطيخ FACS بالطرد المركزي 300 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

نضح من المحلول ، وأعد تعليق بيليه الخلية في المخزن المؤقت لتلطيخ FACS إلى 0.5 مليون خلية لكل مليلتر. باستخدام أنابيب FACS الجديدة التي تحتوي على قمم مرشح 35 ميكرون ، ماصة عينات الخلايا الملطخة على الأغطية وترشيح الجاذبية للحصول على معلقات أحادية الخلية. حافظ على الجليد.

استخدم فارز الخلايا لتنقية الخلايا. قم بتشغيل الخلايا غير الملطخة في فارز الخلية لضبط الفولتية وتصحيح إشارة الخلفية. قم بتشغيل كل عينة حبة تعويض أحادية اللون واحدة تلو الأخرى لضبط الفولتية لكل قناة وضبط البوابات للإشارة الإيجابية.

اجمع البيانات. استخدم البرنامج لحساب التداخل الطيفي عن طريق حساب مصفوفة التعويض. جميع الفولتية جاهزة ومحددة.

قم بتشغيل كل عنصر تحكم من نوع isotype واحدًا تلو الآخر. يمكن استخدام هذه البيانات لضبط البوابات للربط غير المحدد إذا كان هناك أي منها. قم بتشغيل كل عينة FMO واحدة في وقت واحد.

اضبط الفولتية لكل قناة لتصحيح التسييل الطيفي بسبب لوحة متعددة الألوان. قم بتشغيل عينات الخلايا الملطخة في فارز الخلية. اجمع الخلايا في وسائط مستنبتة خالية من الإنزيم سعة 10 مليلتر في أنبوب تجميع مخروطي بحجم 15 مليلترًا.

استخدم استراتيجية البوابة التالية. أولاً ، بوابة الخلايا المفردة. ثم بوابة الخلايا الحية.

بعد ذلك ، بوابة الخلايا السلبية CD45. بوابة لخلايا CD34 و CD31 سلبية. ثم ، بوابة للخلايا إيجابية NG2.

وأخيرًا ، بوابة الخلايا الموجبة لـ CD146 و CD140b. لثقافة الحبيبات ، قم بزرع الخلايا التي تم الحصول عليها حديثًا في وسائط استنبات خالية من الإنزيم على لوحة 24 بئر مغلفة. زرع الخلايا في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية ، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ، والأكسجين بنسبة 95٪.

بعد الهضم الأنزيمي وتفكك القلب بالكامل وقبل تنقية الخلايا من خلال نظام تحليل عينات الخلايا ، تكون الخلايا عبارة عن خليط خام يحتوي على العديد من أنواع الخلايا المختلفة من القلب. بعد تنقية واستنبات FACS ، تكون الخلايا متجانسة. وهي ذات نواة مفردة ، ومسطحة تمامًا ، ولها الشكل المعين المعين pericyte النموذجي.

باستخدام FACS ، يتم تنقية الخلايا حتى تصبح متجانسة. أولاً ، تم إغلاق الحطام والمزدوجات بناءً على توزيعات الانتثار الأمامية والجانبية. بعد ذلك ، تم عزل الخلايا الميتة بسبب تفاعلها الأميني مع الصبغة ، مما ينتج عنه إشارة أكبر وأكثر كثافة من الخلايا الحية.

من الخلايا الحية ، تم عزل الخلايا المكونة للدم من خلال كونها إيجابية CD45. لمزيد من إزالة الخلايا المكونة للدم والخلايا البطانية ، تم إغلاق الخلايا الإيجابية لـ CD34 والإيجابية لـ CD31. أخيرًا ، تم اختيار الخلايا الإيجابية لـ NG2 و CD140b / CD146 لكونها خلايا حول الأوعية الدموية مع تعبير عن علامات البوريتية النموذجية.

عند مقارنتها بنباتات الدماغ البشري ، كان للخلايا نفس التشكل. بالمقارنة مع خلايا العضلات الملساء للفأر والإنسان ، كان للخلايا توصيف شكل مختلف للخلايا عند المرور السابع عن طريق الكيمياء الخلوية المناعية لعلامات pericyte لم تظهر أي تغييرات ملحوظة في التشكل أو تعبير العلامة. وبالمثل ، أكد التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي للنباتات عند المرور السابع أن السكان ظلوا متجانسين.

جدوى الخلية أمر بالغ الأهمية للحصول على عائد جيد. حافظ على برودة الأنسجة أثناء الشراء ، وحافظ على برودة الخلايا أثناء تلطيخ الخلايا. تأكد أيضًا من تحضير المحلول الأنزيمي طازجًا في كل مرة.

لضمان عزل الخلايا الصحيحة بعد الزراعة ، قم بتمييزها باستخدام قياس التدفق الخلوي وتلطيخ الفلورسنت المناعي. يمكن استخدام هذه الخلايا في تجارب الزراعة مع الخلايا البطانية لدراسات الحاجز الوظيفي ، وكذلك الاختبارات لدراسة وظائفها وخصائصها البيولوجية والفسيولوجية. تلعب الخلايا القلبية دورًا أساسيًا في سلامة الأوعية الدموية واستقرارها ، كما أن خللها الوظيفي ناتج عن وظيفة القلب العالمية.

من خلال تقنيتنا ، يمكن للباحثين استكشاف الإمكانات العلاجية للخلايا القلبية.


الملخص

الأساس المنطقي:

تعتمد النتيجة المثلى بعد احتشاء عضلة القلب (MI) على استجابة الشفاء المنسقة التي يلعب فيها كل من إزالة الحطام وإصلاح المصفوفة خارج الخلوية عضلة القلب دورًا رئيسيًا. ومع ذلك ، فإن إعادة التشكيل العكسي والالتهاب المفرط يمكن أن يعزز قصور القلب ، ووضع الكريات البيضاء كأبطال مركزي وأهداف علاجية محتملة في إصلاح الأنسجة والتئام الجروح بعد احتشاء عضلة القلب.

موضوعي:

في هذه الدراسة ، درسنا دور تحفيز المستقبلات المعبر عنها في الخلايا النخاعية 1 (TREM-1) في تنظيم الاستجابة الالتهابية التي تلي MI. TREM-1 ، الذي يتم التعبير عنه بواسطة العدلات والخلايا الوحيدة الناضجة ، هو مكبر للصوت للاستجابة المناعية الفطرية.

الطرق والنتائج:

بعد الاحتشاء ، يتم تنظيم تعبير TREM-1 في عضلة القلب الإقفارية في الفئران والبشر. يثبط الإبطال الجيني Trem-1 أو التثبيط الدوائي باستخدام الببتيد الاصطناعي (LR12) التهاب عضلة القلب ، ويحد من تجنيد العدلات وإنتاج بروتين 1 كيميائي أحادي الخلية ، مما يقلل من تعبئة الخلايا الوحيدة الكلاسيكية للقلب. كما أنه يحسن وظيفة البطين الأيسر والبقاء على قيد الحياة في الفئران (ن = 20-22 لكل مجموعة). أثناء كل من نقص تروية عضلة القلب الدائم والعابر ، يعمل الحصار Trem-1 أيضًا على تحسين وظيفة القلب ويحد من إعادة تشكيل البطين كما تم تقييمه بواسطة التصوير المقطعي بالانبعاثات الفلوروكسيجلوكوز والبوزيترون ودراسات القسطرة التوصيلية (العدد = 9-18 لكل مجموعة). يمكن اكتشاف الشكل القابل للذوبان من TREM-1 (sTREM-1) ، وهو علامة لتفعيل TREM-1 ، في بلازما المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلي حاد (ن = 1015) ، وتركيزه هو مؤشر مستقل للوفاة.

الاستنتاجات:

تشير هذه البيانات إلى أن TREM-1 يمكن أن يشكل هدفًا علاجيًا جديدًا أثناء احتشاء عضلة القلب الحاد.

مقدمة

يؤدي نقص تروية عضلة القلب الحاد إلى تنشيط مكثف للجهاز المناعي مما يؤدي إلى إنتاج السيتوكينات والكيموكينات 1،2 وتجنيد الخلايا المتعادلة وحيدة النواة في المنطقة المصابة بالاحتشاء. 3،4 الإشارات المبكرة للالتهابات حاسمة في التوسط في الاستجابة للإصابة ، وتنظيم إزالة الخلايا العضلية القلبية الميتة وبدء الأحداث الخلوية اللازمة لالتئام الجروح. ومع ذلك ، فإن الشفاء الأمثل يتطلب تفعيل الآليات المثبطة التي تثبط تخليق السيتوكين والكيموكين وتتوسط حل الارتشاح الالتهابي. 5

لذلك ، يبدو أن الحد من تضخيم الاستجابة الالتهابية مهم لاحتواء الإصابة والشفاء الأمثل للاحتشاء. تحفيز المستقبل المعبر عنه في الخلايا النخاعية -1 (TREM-1) هو مستقبل مناعي يعبر عنه العدلات والضامة والخلايا الوحيدة الناضجة التي تعمل كمضخم للاستجابة المناعية الفطرية. 6 لقد ثبت أن الحصار المفروض على تنشيط TREM-1 عن طريق الببتيدات المثبطة القصيرة أو بروتين الاندماج يحمي من الاستجابة المفرطة والموت في نماذج مختلفة من العدوى الشديدة. 7-12 ما إذا كان استهداف الاستجابة المناعية بوساطة TREM-1 سيكون مفيدًا في احتشاء عضلة القلب الحاد (MI) لا يزال غير معروف.

في هذه الدراسة ، درسنا دور TREM-1 في تنظيم الاستجابة الالتهابية التي تلي احتشاء عضلة القلب. لقد أظهرنا أن الإبطال الجيني Trem-1 أو التثبيط الدوائي يخمد التهاب عضلة القلب ، ويحد من تجنيد الكريات البيض ، ويحسن وظائف القلب. علاوة على ذلك ، تم العثور على الشكل القابل للذوبان من TREM-1 (sTREM-1) في بلازما المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلي حاد ، وتركيزه هو مؤشر مستقل للوفاة.

أساليب

الحيوانات

تريم -1, خرقة 1 تم استخدام ذكور بالغ الضربة القاضية C57BL / 6 (6-8 أسابيع) وزملائه من النوع البري ، وكذلك ذكور فئران ويستار البالغة (تشارلز ريفر ، ليون ، فرنسا). تم وصف الفئران Trem-1 مؤخرًا بالتفصيل بواسطة Weber et al. تمت الموافقة على 11 تجربة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية الخاصة بنا.

الإجراءات الجراحية

تم إحداث MI في الفئران عن طريق ربط الشريان التاجي الدائم كما هو موضح سابقًا. 10 باختصار ، تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين (2٪ / 2 لتر O2/ دقيقة) ، عن طريق التنبيب والتهوية باستخدام جهاز تنفس إنسبيرا أحادي الأمان للتحكم في الضغط / الحجم للحيوان (جهاز هارفارد). حلق جدار الصدر وأجري بضع الصدر الأيسر في الفراغ الرابع بين الضلع الأيسر. تم تصوير البطين الأيسر (LV) وتم ربط الشريان التاجي الأيسر بشكل دائم بخيوط النايلون الأحادية 8-0 (Ethicon) في موقع ظهوره من تحت الأذين الأيسر. تم إغلاق جدار الصدر بخياطة 7-0 من النايلون ، وتم إغلاق الجلد بخيوط النايلون 6-0. تم إجراء إجراء مماثل لربط الشريان التاجي الدائم في الفئران. تم تحقيق نموذج نقص التروية - ضخه في الفئران من خلال ربط الشريان التاجي المؤقت (ساعة واحدة). خضعت فئران التحكم المزيفة للتدخل نفسه باستثناء أن الرباط ترك غير مقيد.

TREM-1 الببتيد المثبط

تم تصنيع LR12 (LQEEDAGEYGCM) و LR12-scramble (وهو ببتيد التحكم غير النشط) كيميائيًا (Pepscan Presto BV ، Lelystad ، هولندا) كـ COOH نهائيًا وسط الببتيدات. تم الحصول على الببتيدات الصحيحة مع إنتاجية & gt99٪ وكانت متجانسة بعد التنقية التحضيرية ، كما تم تأكيده بواسطة مطياف الكتلة والكروماتوجرافيا السائلة عالية الأداء التحليلية ذات الطور العكسي. كانت هذه الببتيدات خالية من السموم الداخلية.

تم اختيار الحيوانات عشوائياً بشكل أعمى بعد ساعتين من ربط الشريان التاجي لتلقي 5 مجم / كجم من LR12 أو LR12- التدافع داخل الصفاق مرة واحدة يوميًا لمدة 5 أيام.

علم الانسجة

تم تقسيم LVs إلى شرائح عرضية من القمة إلى القاعدة وتم تضمينها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (Tissue-Tek) للكيمياء المناعية. لقد قمنا بتلوين المقاطع بسمك 5 ميكرون بجسم مضاد أحادي النسيلة (mAb) إلى myeloperoxidase أو CD68 أو CD163 (Serotec) ، أو جسم مضاد متعدد الأضلاع للماعز لـ TREM-1 (رقم الكتالوج AF1278 ، R & ampD Systems). حددنا الخلايا متعددة الأشكال كخلايا MPO + مع مورفولوجيا نموذجية متعددة النوى ، وحيدات و macrophages مثل CD68 + / CD163 + خلايا أحادية النواة. اكتشفنا المصفوفة metalloproteinase 9 (MMP9) مع جسم مضاد للماعز للفأر MMP9 (رقم الكتالوج AF911 ، R & ampD Systems). تم تقييم شفاء القلب بعد احتشاء عضلة القلب في اليوم 1 و 14 و 42. تم استئصال القلوب وشطفها في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات وتجميدها في النيتروجين السائل. تم قطع القلوب بواسطة ناظم البرد (CM 3050S Leica) إلى أقسام بسمك 7 ميكرون. تم إجراء تلوين Masson's Trichrome و Sirius Red لتقييم حجم الاحتشاء وتقييم تليف عضلة القلب.

التدفق الخلوي

لتحضير المعلقات أحادية الخلية من الأنسجة المحتجزة ، تم حصاد القلوب باستخدام مقص دقيق يوضع في مزيج من كولاجيناز I ، كولاجيناز XI ، DNase I ، وهيالورونيداز (Sigma-Aldrich) وتهتز عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم تم سحن الخلايا وطردها مركزيًا (15 دقيقة ، 500 جم ، 4 درجات مئوية).

تمت إزالة الطحال ، وسحنها في محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) عند 4 درجات مئوية مع نهاية حقنة سعة 3 مل ، وتصفيتها من خلال مرشحات نايلون 70 ميكرومتر (BD). تم طرد تعليق الخلية عند 300ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم تحلل خلايا الدم الحمراء (محلول تحلل خلايا الدم الحمراء Miltenyi) ، وتم غسل الخلايا الطحالية باستخدام HBSS وتعليقها في HBSS المضاف إليها 0.2 ٪ (وزن / حجم) من ألبومين المصل البقري. تم سحب الدم المحيطي عن طريق ثقب القلب بمحلول السترات كمضاد للتخثر ، وتم تحليل خلايا الدم الحمراء. أخيرًا ، تم الحصول على معلقات أحادية الخلية لنخاع العظم من عظام الفخذ بعد غسلها بـ 1 مل HBSS ، والترشيح من خلال مرشحات نايلون 70 ميكرومتر ، والطرد المركزي عند 300ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم تحديد إجمالي عدد الخلايا القابلة للحياة من قسامات باستخدام مقياس الكريات مع تريبان الأزرق (BioRad).

تم تحضين المعلقات الخلوية في مزيج من mAbs ضد خلايا CD4 + أو CD8 + T (CD4- أو CD8-APC ، CD3ε-PE ، CD45-FITC) ، الخلايا البائية (CD19-PE ، CD45-FITC) ، الخلايا الحبيبية (CD11b- PB ، CD45-PerCP ، Ly-6G-PE) ، ومجموعات فرعية أحادية الخلية (Ly-6C-FITC ، F4 / 80-APC) ، جميع الأجسام المضادة من Miltenyi Biotech. تم حساب أرقام الخلايا التي تم الإبلاغ عنها على أنها ناتج إجمالي الخلايا الحية (إجمالي عدد الكريات البيض القابلة للحياة لكل مل) والنسبة المئوية للخلايا داخل البوابة المحددة ، وتم الإبلاغ عنها لكل ملجم من الأنسجة (القلب) ، لكل عضو (عظم الفخذ والطحال) ، أو لكل مل (الدم) ). تم الحصول على البيانات على مقياس الخلوي FACScalibur (BD).

تحليل فسفرة البروتين

تم تحليل خلايا عضلة القلب المعزولة في كاشف استخراج PhosphoSafe (Novagen Merck Biosciences ، نوتنغهام ، المملكة المتحدة) وتم طردها بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 16000ز عند 4 درجات مئوية لجمع المادة طافية. تم تحديد تركيز البروتين (BCA Protein Assay Kit ، Pierce ThermoScientific ، Brebières ، فرنسا). تم تحليل Lysates بعد ذلك بواسطة لطخة ويسترن (Criterion XT Bis-Tris Gel ، 4٪ -12٪ BioRad ، Marnes-la-Coquette ، فرنسا وغشاء PVDF ميليبور ، Saint-Quentin en Yvelines ، فرنسا) تم الكشف عنها باستخدام مضاد الفوسفو- p38 ، antipERK1 / 2 ، antipGSK3β ، anti-iNOS والجسم المضاد الثانوي المقابل المترافق مع الفجل البيروكسيديز (Cell Signaling Ozyme ، Saint-Quentin en Yvelines ، France) ، و SuperSignal West Femto Substrate (Pierce ThermoScientific). تم استخدام الأشكال غير الفسفورية أو التوبولين (تشوير الخلية) للتطبيع. تم إجراء عمليات الاستحواذ والتحليلات الكمية لكثافة الإشارة بواسطة جهاز تصوير LAS-4000 (FSVT ، Courbevoie ، فرنسا) وبرنامج متعدد المقاييس (LifeScience Fujifilm ، فرنسا).

رد فعل سلسلة النسخ العكسي الكمي - البوليميراز

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من عضلة القلب (المناطق المحتجزة أو النائية) باستخدام مجموعة RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen ، Courtaboeuf ، فرنسا) وقياسها الكمي باستخدام NanoDrop (ThermoScientific) قبل إعادة نسخها باستخدام مجموعة التوليف iScript cDNA (BioRad) وقياسها كميًا بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (PCR) باستخدام مجسات Qiagen المتاحة (Quantitect Primers) لـ تريم -1, إيل -6, تنف α, Timp1, مم 9، و قانون ب. قانون ب بمثابة الجينات التدبير المنزلي. بدلاً من ذلك ، تم إعادة نسخ إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام RT ° First Strand Kit (SABiosciences ، Tebu-bio ، Le Perray-en-Yvelines ، فرنسا) لمصفوفات PCR (الخلايا المناعية / البطانية للفأر RT ° ملف التعريف PCR Arrays SABiosciences). تم إجراء جميع PCRs في MyiQ Thermal Cycler وتم قياسها بواسطة برنامج iQ5 (Qiagen). تم تحليل نتائج صفيف PCR باستخدام برنامج تحليل بيانات صفيف PCR (SABiosciences) وتم تطبيعها باستخدام 5 جينات التدبير المنزلي.

تم إجراء قياسات تركيز السيتوكين باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (الماوس Quantikine ELISA Kits R & ampD Systems) وفحوصات لوحة السيتوكين (Proteome Profiler Mouse Cytokine Array Kit R & ampD Systems).

تم إجراء فحص zymography في هلام ومقايسة نشاط الجيلاتيناز كما هو موضح سابقًا. 13

قياسات تخطيط صدى القلب

تم إجراء تخطيط صدى القلب عبر الصدر في الفئران المخدرة (استنشاق الأيزوفلورين) بعد 14 و 42 يومًا من الجراحة باستخدام مخطط صدى القلب (ACUSON S3000 Siemens AG ، Erlangen ، ألمانيا) مع نقل خطي 14 ميجا هرتز. المحقق (P.B.) كان أعمى لتعيين المجموعة. تم الحصول على مناظر المحور الطويل ثنائية الأبعاد للقطر المنخفض لقياسات الوضع M الموجهة للقطر الداخلي LV عند الانبساط النهائي والانقباض النهائي ، وسماكة جدار الحاجز بين البطينين ، والسماكة الخلفية. تم حساب النسبة المئوية للتقصير الكسري على النحو التالي: النسبة المئوية للتقصير الكسري = [(قطر LV عند الانبساط النهائي - قطر LV عند انقباض النهاية) / قطر LV عند الانبساط النهائي] × 100.

التصوير المقطعي بانبعاث الفلوروديوكسيجلوكوز-البوزيترون

بعد التخدير الأيضي بواسطة acipimox (50 مجم / كجم) ، تم حقن 70 MBq من 18F-fluorodeoxyglucose عن طريق الوريد تحت تخدير قصير (1.5٪ -2.5٪ من استنشاق الأيزوفلورين). بعد ستين دقيقة ، بدأ تسجيل PET لمدة 20 دقيقة تحت التخدير المستمر بواسطة isoflurane ، باستخدام نظام PET مخصص للحيوانات الصغيرة (Inveon ، Siemens ، Knoxville ، TN). تم توصيل الحيوانات بجهاز مراقبة تخطيط القلب القياسي وأعيد بناء الصور لاحقًا في 16 فترة قلبية ، مما يوفر دقة زمنية من 11 إلى 15 مللي ثانية لقيم معدل ضربات القلب الشائعة. كانت الدقة المكانية المحورية 1.5 مم. تم تحديد مدى عضلة القلب النخرية كنسبة مئوية من شرائح الجهد المنخفض التي تظهر & lt50٪ من امتصاص الجلوكوز الفلوروديوكسي باستخدام برنامج QPS المخصص على قسم من 17 مقطعًا من الجهد المنخفض. تم تحديد الكسر القذفي للضغط المنخفض ، وكذلك الأحجام الانقباضية النهائية والانبساطية النهائية ، باستخدام برنامج QGS الأوتوماتيكي بالكامل. في هذه الظروف ، يتم توفير تحديد دقيق لأحجام التجويف الفعلية فوق مستوى 100 ميكرولتر المطابق للحد الأدنى لحجم الضغط الانقباضي النهائي في الفئران البالغة.

دراسات القسطرة المواصلة

تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران وتم إدخال قسطرة 2F عالية الدقة (SPR-407 Millar Institute ، هيوستن ، تكساس) في LV عبر الشريان السباتي الأيمن. تم توصيل قسطرة ميلار بنظام هارفارد لاكتساب البيانات المتصل بجهاز كمبيوتر مع برنامج AcqKnowledge III (ACQ 3.2).

دراسة سريرية

تم وصف عدد السكان وطرق التسجيل الفرنسي للارتفاع الحاد للجزء ST الحادة وعدم ارتفاع المقطع ST - الارتفاع MI (FAST-MI) بالتفصيل في المنشورات السابقة. 14،15 باختصار ، تم تضمين جميع المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 18 عامًا في السجل إذا كانت لديهم علامات مصل مرتفعة لنخر عضلة القلب أعلى من ضعف الحد الأعلى الطبيعي لكيناز الكرياتين ، أو الكرياتين كيناز- MB ، أو التروبونين المرتفع ، وإما الأعراض المتوافقة مع احتشاء عضلي حاد أو تغيرات تخطيط كهربية القلب على ما لا يقل عن خيوط متجاورة مع موجات Q المرضية أو ارتفاع ST أو انخفاض مستمر. يجب أن يكون الوقت من بداية ظهور الأعراض إلى دخول وحدة العناية المركزة & lt48 ساعة. تم تدبير المرضى وفقًا للممارسة المعتادة ، ولم يتأثر العلاج بالمشاركة في التسجيل. من بين 374 مركزًا في فرنسا عالجت مرضى احتشاء عضلي حاد في ذلك الوقت ، شارك 223 (60٪) في التسجيل. من بين هؤلاء ، استعان 100 مركز بـ 1015 مريضًا ساهموا في بنك المصل. قدم كل مريض موافقة خطية مستنيرة. أكثر من 99٪ من المرضى كانوا من البيض. تم جمع المتابعة من خلال الاتصال بأطباء المرضى والمرضى أنفسهم أو أسرهم ومكاتب التسجيل في مكان ولادتهم. اكتملت المتابعة لمدة عامين & GT98٪. تم تقييم أحداث النتيجة بالعمى عن نتائج قياسات sTREM-1. تمت مراجعة الدراسة من قبل لجنة حماية الأفراد في البحوث الطبية الحيوية في مستشفى جامعة سانت أنطوان ، وتم الإعلان عن ملف البيانات إلى اللجنة الوطنية للمعلوماتية والحريات. تم تحديد تركيزات sTREM-1 في البلازما في نسختين عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (أنظمة RnD).

تحليل احصائي

دراسات على الحيوانات

تم توزيع جميع البيانات بشكل طبيعي ، ما لم يُذكر ، ثم قدمت على أنها متوسط ​​± SD ، وتم تحليل الدلالة الإحصائية للاختلافات بين المجموعات باستخدام Student ر اختبار أو اختبار Kruskal – Wallis. تم تحليل منحنيات البقاء على قيد الحياة في كابلان-ماير باستخدام اختبار تسجيل الترتيب. أ ص القيمة & lt0.05 اعتبرت كبيرة.

دراسة سريرية

تم تعريف حدث النتيجة على أنه وفاة جميع الأسباب أو MI غير المميتة خلال فترة المتابعة لمدة عامين. تم الفصل في نقطة النهاية الأولية ، وهي عبارة عن مجموعة من الوفيات لجميع الأسباب وغير المميتة ، والتي تم تعريفها على أنها مؤشر الحلقة عند التضمين ، من قبل لجنة لم يكن أعضاؤها على دراية بأدوية المرضى وقياسات الدم. توصف المتغيرات المستمرة على أنها متوسط ​​± SD والمتغيرات الفئوية مثل الترددات والنسب المئوية. يتم تقدير منحنيات البقاء وفقًا لـ sTREM-1 باستخدام مقدر Kaplan-Meier. استخدمنا نموذج كوكس للمخاطر النسبية متعدد المتغيرات لتقييم القيمة الإنذارية المستقلة للمتغيرات مع نقطة النهاية الأولية خلال فترة المتابعة التي تبلغ عامين. يتألف النموذج متعدد المتغيرات من الجنس ، والعمر ، والتدخين السابق أو الحالي ، ومؤشر كتلة الجسم ، والتاريخ العائلي لمرض الشريان التاجي ، وتاريخ ارتفاع ضغط الدم ، واحتشاء عضلة القلب الحاد ، وفشل القلب ، والفشل الكلوي ، وداء السكري ، ومعدل ضربات القلب عند الدخول ، ودرس Killip ، وقذف البطين الأيسر الكسر ، إدارة المستشفى (بما في ذلك علاج ضخه ، الستاتين ، حاصرات بيتا ، كلوبيدوجريل ، مدرات البول ، الديجيتال ، والهيبارين) ، ومستويات البروتين التفاعلي. يتم التعبير عن النتائج كنسب مخاطر لنماذج كوكس بفواصل ثقة 95٪. تم إجراء جميع الاختبارات الإحصائية على جانبين وتم إجراؤها باستخدام الإصدار 9.1 من برنامج SAS.

نتائج

يحسن تثبيط Trem-1 وظائف القلب بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران

في الفئران ، يسبب نقص تروية البطين الأيسر الدائم تعبير Trem-1 في المنطقة المحتجزة (الشكل 1A). كان هذا التعبير عابرًا ولوحظ بشكل أساسي عند تسلل العدلات. تم التعبير عن Trem-1 أيضًا في عضلة القلب الإقفارية البشرية (الشكل 1B).

شكل 1. يتم التعبير عن المستقبلات المحفزة المعبر عنها في الخلايا النخاعية 1 (TREM-1) في عضلة القلب المحتشمة ، ويحسن تثبيطها وظيفة القلب بعد احتشاء عضلة القلب (MI) في الفئران. أ، تم تحليل مستويات التعبير عن البروتين Trem-1 mRNA في المناطق المحتجزة وغير الملتهبة بعد MI في الفئران عن طريق تفاعل سلسلة النسخ العكسي الكمي والبوليميراز ، وصمة عار الغربية ، وقياس التدفق الخلوي. تم تحليل فئران الشام بعد 24 ساعة من الجراحة ن = 5 في كل نقطة زمنية *ص& lt0.01 مقابل الحيوانات التي يديرها الشام **ص& lt0.001 احتشاء مقابل المنطقة غير الملتهبة. ب، تعبير TREM-1 في قلب المرضى بعد احتشاء عضلة القلب الحاد. تم تحديد تعبير TREM-1 عن طريق الكيمياء المناعية على عينات قمة عضلة القلب التي تم الحصول عليها في 5 مرضى خضعوا لتطعيم مجازة الشريان التاجي بعد 48 ساعة من احتشاء عضلة القلب الحاد. تم تلوين الخلايا الوحيدة / الضامة والعدلات بمضادات CD163 و CD68 و myeloperoxidase (MPO) على التوالي. يتم عرض الصور التمثيلية. ج، تحليل تخطيط صدى القلب بعد MI في الفئران. تم قياس تقصير البطين الأيسر (LV) الجزئي (FS) عند خط الأساس ، في اليوم 14 ، وفي اليوم 42 بعد MI n = 7 إلى 11 فأرًا لكل مجموعة *ص& lt0.05 مقابل الحيوانات المعالجة LR12scr. دتم قياس منطقة LV والمنطقة المعرضة للخطر (AAR) ومنطقة الاحتشاء (IA) (تلطيخ TTC [2،3،5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride]) ، والتحليل الكمي لحجم الاحتشاء في اليوم الأول ، تم إجراء 14 ، و 42 ن = 7 إلى 11 لكل مجموعة *ص& lt0.02 و **ص& lt0.01 مقابل LR12scr. ه، تم تقييم تليف القلب بعد تلطيخ سيريوس الأحمر (أعلى) (قاع) من المناطق المصابة بالاحتشاء في اليوم 14 ن = 4 إلى 5 فئران لكل مجموعة *ص& lt0.02 **ص& lt0.01 مقابل LR12scr ، ***ص& lt0.05 LR12 مقابل Trem-1 الفئران. F، تقدير Kaplan-Meier للبقاء على قيد الحياة بعد MI في Trem-1 - / - ، LR12 - أو التحكم في الببتيد (LR12scr) - معالج ومضاد Trem-1 وحيدة النسيلة (mAb) الفئران المعالجة (n = 20-22 لكل مجموعة ). تتم مقارنة منحنيات البقاء على قيد الحياة باستخدام اختبار تسجيل الترتيب. *ص= 0.008 و **ص& lt0.001 مقابل LR12scr. جF، تم اختيار الفئران من النوع البري بشكل عشوائي بعد ساعتين من ربط الشريان التاجي لتلقي الببتيد LR12 أو LR12-scramble peptide (ليكون بمثابة ببتيد تحكم) أو Trem-1 mAb (0.2 مجم / كجم) أو غير ذي صلة mAb (ليكون بمثابة عنصر تحكم Ab) . كانت تدار العلاجات داخل الصفاق مرة واحدة في اليوم لمدة 5 أيام.

نحن نراقب تريم -1 - / - الفئران وزملائها من النوع البري عن طريق تخطيط صدى القلب بعد 2 و 6 أسابيع من ربط الشريان التاجي الأيسر (الشكل 1C). تريم -1 أدى الإبطال الجيني إلى تحسين تقصير كسور البطين الأيسر (ص& lt0.05). على الرغم من عدم وجود فروق في اليوم الأول ، انخفض حجم الاحتشاء بشكل ملحوظ بحلول اليوم 14 في تريم -1 - / - الفئران وهذا الانخفاض لا يزال واضحًا في 6 أسابيع (الشكل 1 د). علاوة على ذلك ، فإن تليف القلب ، وكذلك عدد الخلايا المبرمج (على الرغم من أننا لم نتمكن من التمييز بين نوع الخلية التي خضعت لموت الخلايا المبرمج) ، قد انخفض في تريم -1 - / - ما بعد عضلة القلب الإقفارية (الشكل 1E). كان معدل البقاء على قيد الحياة أعلى في الحيوانات منه في تريم -1 + / + (91٪ مقابل 64٪ ، ص= 0.008 الشكل 1F). تم العثور على تمزق القلب ليكون سبب الوفاة في 62.5٪ و 25٪ من النوع البري و تريم -1 - / - الفئران ، على التوالي (ص& lt0.02).

الضعف الجيني Trem-1 وبالتالي تحسين وظيفة القلب والحماية من الموت بعد MI

لتأكيد هذه النتائج ، استخدمنا نهجين تكميليين. يمكن تقييد تنشيط TREM-1 باستخدام الببتيد المثبط (LR12) الذي أبلغنا سابقًا عن وجود تأثيرات وقائية أثناء الصدمة الإنتانية. 8-10 على العكس ، يمكن تعشيق TREM-1 بواسطة mAb ناهض (Trem-1 mAb). 6 على الرغم من أن إعطاء mAb أدى إلى انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة ، فقد ارتبط علاج LR12 بانخفاض معدل الوفيات ، لا يختلف عن ذلك الذي لوحظ في تريم -1 - / - (الشكل 1 و). علاوة على ذلك ، أدت إدارة LR12 أيضًا إلى تحسين وظيفة القلب ، وتقليل حجم الاحتشاء ، وموت الخلايا المبرمج ، والتليف (الشكل 1C – 1E).

Trem-1 يتحكم في تجنيد الكريات البيض وتنشيطها في عضلة القلب المحتجزة

نظرًا لأن TREM-1 هو مكبر للصوت للجهاز المناعي الفطري ، فقد قمنا بفحص ما إذا كان تعديله قد ينظم الاستجابة الالتهابية.

من بين الجينات الـ 168 المشاركة في المناعة الفطرية التي فحصناها ، تم تغيير تعبير 156 في عضلة القلب بعد ربط الشريان التاجي ، معظمها بعد 24 ساعة من احتشاء عضلة القلب. تعارض إدارة LR12 التنشيط الجيني الناجم عن MI (الجدول الأول عبر الإنترنت). والجدير بالذكر أن التعبير تنف α, Il6، و تريم -1 انخفض ، وانخفضت تركيزات البلازما للبروتينات ذات الصلة (الشكل 2 أ) في المجموعة المعالجة LR12. خفضت إدارة LR12 أيضًا الفسفرة p38-MAPK و ERK1 / 2 ، وخفضت التعبير عن iNOS ، وزادت من فسفرة GSK-3β (الشكل الأول عبر الإنترنت).

الشكل 2. يتحكم تشغيل المستقبل المعبر عنه في الخلايا النخاعية 1 (Trem-1) في تجنيد الكريات البيض وتنشيطها في عضلة القلب المحتجزة. أ، القياس الكمي تنف α, Il6، و تريم -1 التعبير الجيني في عضلة القلب المحتشمة في نقاط زمنية مختلفة بعد احتشاء عضلة القلب (MI اليسار) وتركيزات البلازما للبروتينات المقابلة (حق) عند 24 ساعة ن = 5 إلى 7 لكل نقطة *ص& lt0.01 LR12scr مقابل المجموعات الأخرى ، **ص=0.008 تريم -1 - / - مقابل LR12. ب، القياس الكمي لعضلة القلب Timp1 و مم 9 التعبير الجيني في عدة نقاط زمنية بعد MI في الفئران من النوع البري (WT) المعالجة بـ LR12 أو LR12scr (حق) التصوير المقطعي بالهلام في المنطقة المصابة بالاحتشاء في نقاط زمنية مختلفة بعد MI (وسط) ، وأقسام الأنسجة المناعية التمثيلية للمناطق المحتجزة بعد 24 ساعة من MI التي توضح تعبير المصفوفة metalloproteinase 9 (MMP9) (اليسار) ن = 5 لكل مجموعة ولكل نقطة زمنية ، *ص& lt0.01 مقابل LR12. ج، استراتيجية بوابات التدفق الخلوي والقياس الكمي للخلايا الوحيدة والبلاعم ، مع الكيمياء المناعية التمثيلية للمناطق المحتجزة بعد 24 ساعة من احتشاء عضلة القلب. د، القياس الكمي للتدفق الخلوي لتسلل العدلات في عضلة القلب المحتجزة وتركيز عضلة القلب من المايلوبيروكسيديز وأقسام الأنسجة التمثيلية للقلب الإقفاري بعد 24 ساعة من احتشاء عضلة القلب التي توضح تسلل العدلات. لهذه التجارب (ج و د) ، n = 7 إلى 10 فئران لكل مجموعة ولكل نقطة زمنية *ص& lt0.01، **ص& lt0.001 مقابل LR12scr.

بعد 24 ساعة من MI ، مم 9 زاد التعبير مرنا في المناطق المحتمة (الشكل 2 ب). ارتبط علاج LR12 بزيادة تيمب -1 وخفض مم 9 التعبيرات.

درسنا بعد ذلك ما إذا كان تعديل الالتهاب يمكن تفسيره عن طريق تقليل عدد الخلايا الالتهابية المتسللة في القلب المصاب بالاحتشاء.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، قمنا بتحليل تسلل الكريات البيض داخل عضلة القلب بعد ربط الشريان التاجي. تم تقليل عدد الخلايا الوحيدات والضامة بشكل كبير في تريم -1 - / - والفئران المعالجة بـ LR12 بالمقارنة مع تريم -1 + / + (الشكل 2C). ألغى حذف Trem-1 أو التثبيط الدوائي تقريبًا تسلل عضلة القلب المحتجزة عن طريق الخلايا الوحيدة الالتهابية Ly-6C العالية ، في حين كان له تأثيرات قليلة على التوظيف المنخفض Ly-6C (الشكل 2C). بدأ تسلل العدلات مبكرًا (6 ساعات) في الفئران الضابطة وتم حظره أيضًا بواسطة علاج LR12 ، وكذلك في تريم -1 - / - الحيوانات (الشكل 2 د). ظهرت هذه الظاهرة سابقًا في الرئة المصابة. 12

تأثير تريم -1 كما لوحظ حذف على هجرة العدلات في المختبر: تم السماح للعدلات المنقاة من نخاع العظام بالانتقال من خلال مرشح مسامي على التحفيز بالبلازما التي تم الحصول عليها من حيوانات MI أو محلولات القلب الدماغية. العدلات من تريم -1 - / - كان له هجرة أقل مقارنة بالخلايا من النوع البري. كما انخفض تنشيط العدلات الناجم عن عديد السكاريد الدهني في غياب تريم -1 (الشكل الثاني على الإنترنت).

على الرغم من عدم التعبير عنها بواسطة الخلايا الليمفاوية ، فقد أثر TREM-1 على تعبئة الخلايا B و T: تم تقليل تسلل الخلايا B و CD8 + ، بينما لم يتغير تجنيد خلايا CD4 + في الفئران المعالجة بـ LR12 والضربة القاضية (الشكل الثالث عبر الإنترنت).

وبالتالي ، فإن تعديل TREM-1 يحد من تجنيد الكريات البيض إلى عضلة القلب الإقفارية.

Trem-1 ينظم تعبئة الكريات البيض من المقصورات البعيدة

بعد ربط الشريان التاجي في الحيوانات الضابطة ، كما ورد سابقًا ، لاحظنا انخفاضًا في عدد الخلايا الوحيدة المشتقة من نخاع العظام والطحال في 24 ساعة تليها زيادة واضحة في عدد الخلايا الوحيدة المتداولة في 72 ساعة (الشكل 3 أ). ومن المثير للاهتمام ، أن الحذف الجيني Trem-1 أو التعديل الدوائي تسبب في تراكم الخلايا الوحيدة في الطحال وفي نخاع العظام خلال 24 ساعة وانخفاض في الدم عند H72 مما يشير إلى أن منع Trem-1 يقلل من تعبئة الخلايا الوحيدة.

الشكل 3. تنشيط المستقبل المعبر عنه في الخلايا النخاعية 1 (Trem-1) ينظم تعبئة الكريات البيض من الأجزاء البعيدة. أ، قياس التدفق الخلوي للوحيدات و (ب) العدلات في الطحال والدم ونخاع العظام في نقاط زمنية مختلفة بعد احتشاء عضلة القلب (MI). ج، Ccl-2 ، Ccl-7 ، و Cx3cl1 تركيزات البلازما بعد MI. د، تركيز Ccl-2 والتعبير عن طريق العدلات في القلب. ن = 6 إلى 8 في كل نقطة زمنية *ص& lt0.05 LR12scr مقابل LR12 أو تريم -1 - / -. يشير MCP إلى بروتين جاذب كيميائي وحيد الخلية.

تم زيادة عدد العدلات في الدم المحيطي بعد 6 ساعات من احتشاء عضلة القلب. لم يتم ملاحظة هذه العدلات في تريم -1 - / - أو الفئران المعالجة بـ LR12 (الشكل 3 ب). زاد عدد الخلايا الليمفاوية B المنتشرة خلال 72 ساعة بعد MI ، في حين لم يتغير عدد الخلايا الليمفاوية CD4 + و CD8 + بشكل ملحوظ. منع منع Trem-1 جزئيًا من أنماط حركية الخلايا الليمفاوية B (الشكل الرابع عبر الإنترنت).

لشرح عيب تعبئة الكريات البيض الناجم عن تثبيط Trem-1 ، ركزنا بعد ذلك على الكيماويات. يعد بروتين الجاذب الكيميائي أحادي الخلية 1 (MCP-1 أو Ccl2) و Cx3cl1 (أو Fractalkine) و Mcp-3 (أو Ccl7) كيميائيات مهمة تشارك في توظيف ، على التوالي ، Ly-6C high ، و Ly-6C low monocytes ، والخلايا الليمفاوية إلى المواقع الالتهابية. زادت تركيزات Ccl-2 في البلازما والقلب مبكرًا (6 ساعات) ، بينما زادت مستويات البلازما من Ccl-7 و Cx3cl1 لاحقًا (24 ساعة) بعد MI. تم تخفيض مستويات Ccl-2 و Ccl-7 ، بينما لم يتغير تركيز Cx3cl1 تريم -1 - / - والفئران المعالجة بـ LR12 (الشكل 3C). انخفض إنتاج Ccl-2 بواسطة العدلات في عضلة القلب تريم -1 - / - والفئران المعالجة بـ LR12 (الشكل ثلاثي الأبعاد).

بعد MI ، تتسلل العدلات إلى عضلة القلب الإقفارية عدة ساعات قبل حيدات (الشكل 2C و 2 D). لذلك افترضنا أن العدلات قد تكون مسؤولة عن إنتاج Ccl-2 الذي سيؤدي لاحقًا إلى جذب وحيدات التهابية إلى القلب. حققنا استنفاد العدلات بكفاءة في الفئران عن طريق إدارة الجسم المضاد 1A8 (الشكل 4 أ). في الحيوانات المستنفدة للعدلات ، انخفض تركيز البلازما لـ Ccl-2 وبالكاد يمكن اكتشافه في عضلة القلب الإقفارية (الشكل 4 ب). تشير هذه البيانات إلى أن العدلات مصدر خلوي مهم لـ Ccl-2 في القلب ، على الرغم من أننا لا نستطيع استبعاد الإطلاق من نوع خلية آخر.

الشكل 4. العدلات هي الهدف الخلوي الرئيسي للمستقبل المحفز المعبر عنه في تعديل الخلايا النخاعية 1 (TREM-1). أ، قياس التدفق الخلوي للدم وعدلات القلب في نقاط زمنية مختلفة في فئران احتشاء عضلة القلب (MI) المستنفدة على العدلات بواسطة الجسم المضاد 1A8. ب، قياس تراكيز Ccl-2 في البلازما والقلب. أ و ب، n = 4 إلى 5 فئران لكل مجموعة ولكل نقطة زمنية *ص& lt0.05 مقابل 1A8 الحيوانات. ج، قياس التدفق الخلوي للدم وحيدات القلب في نقاط زمنية مختلفة في الفئران MI المستنفدة على العدلات بواسطة الجسم المضاد 1A8. ن = 4 إلى 5 فئران لكل مجموعة ولكل نقطة زمنية *ص& lt0.05 مقابل 1A8 الحيوانات. د، القياس الكمي تنف α, Il6، و تريم -1 التعبير الجيني في عضلة القلب المحتشمة بعد 24 ساعة من احتشاء عضلة القلب في الفئران المستنفدة للعدلات n = 4 إلى 5 لكل نقطة *ص& lt0.01 1A8-LR12 مقابل 1A8. يشير MCP إلى بروتين جاذب كيميائي وحيد الخلية.

وبالتالي ، لاحظنا أن نضوب العدلات المرتبط بانخفاض تسلل حيدات في القلب (الشكل 4 ج). لم تسفر إدارة الفئران المعالجة LR12- إلى 1A8 عن تأثيرات إضافية على التسلل الخلوي (غير موضح) ، على الرغم من تقليل الاستجابة الالتهابية القلبية (الشكل 4 د).

أخيرًا ، لاستبعاد تأثير LR12 على الخلايا الليمفاوية ، والذي كان بعيد الاحتمال للغاية بسبب غياب تعبير Trem-1 على هذه الخلايا ، أجرينا تجارب باستخدام خرقة 1 - / - الحيوانات. في غياب الخلايا الليمفاوية ، كان LR12 لا يزال قادرًا على منع ارتشاح وتفعيل العدلات في عضلة القلب (غير موضح).

مجتمعة ، تُظهر هذه البيانات أنه بعد MI ، يقلل تثبيط Trem-1 من تجنيد العدلات وتنشيطها ، مما يؤدي بدوره إلى انخفاض تعبئة الخلايا الأحادية من الحجرة البعيدة.

تعديل Trem-1 يحسن وظائف القلب بعد MI في الفئران

لتوسيع التحليلات الوظيفية ، انتقلنا إلى نموذج الفئران MI. في غضون ساعة واحدة بعد ربط الشريان التاجي الدائم ، تم تصوير الفئران عن طريق التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني باستخدام 18F-fluorodeoxyglucose لتحديد امتداد الاحتشاء وأحجام البطين ثم تم اختيارهم عشوائياً بشكل أعمى لتلقي الحقن اليومي داخل الصفاق لمدة 5 أيام من LR12 أو ببتيد التحكم (LR12scr). بعد ستة أسابيع من MI ، تعرضت الفئران مرة أخرى للتصوير المقطعي بالإصدار الفلوروديوكسي جلوكوز-البوزيترون (الشكل الخامس على الإنترنت) ودراسات ديناميكا الدم الغازية باستخدام قسطرة توصيل البطين الأيسر. كانت مجموعتا الحيوانات متشابهة في الأساس. بعد ستة أسابيع من احتشاء عضلة القلب ، حدث تمدد شديد في البطين الأيسر في الحيوانات الضابطة: تم منع إعادة تشكيل البطين المرضي جزئيًا بواسطة LR12 (الجدول). كانت بيانات الديناميكا الدموية الغازية متاحة لـ 12 من 18 LR12scr و 12 من 17 من الحيوانات المعالجة بـ LR12 بسبب عدم انتظام ضربات القلب البطيني في الفئران المتبقية. تم تحسين معلمات وظيفة عضلة القلب الانقباضي والانبساطي الرئيسية المستقلة عن الحمل بواسطة علاج LR12 (الشكل السادس عبر الإنترنت). تم الحصول على نتائج مماثلة في نموذج نقص التروية - ضخه (الشكل السابع على الإنترنت).

طاولة. تقييم وظائف القلب بواسطة FDG-PET في الفئران في اليوم الأول والسادس بعد احتشاء عضلة القلب

ص القيم هي لمقارنات مجموعات LR12scr و LR12. يشير EDV إلى الحجم الانبساطي النهائي ESV ، والحجم الانقباضي النهائي FDG-PET ، والتصوير المقطعي بانبعاث الفلوروكسي جلوكوز والبوزيترون HR ، ومعدل ضربات القلب MI ، واحتشاء عضلة القلب و SAP ، وضغط الشرايين الانقباضي.

وبالتالي منع تعديل TREM-1 من إعادة تشكيل البطين والضعف الانقباضي - الانبساطي بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران.

تركيز البلازما من TREM-1 القابل للذوبان في المرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي الحاد

يمكن تقييم تنشيط TREM-1 من خلال قياس شكله القابل للذوبان (sTREM-1) في البلازما. لقد تناولنا أهمية نتائجنا التجريبية للمرض البشري من خلال تقييم العلاقة بين تعميم تركيزات البلازما sTREM-1 والبقاء على قيد الحياة في مجموعة من 1015 مريضًا مسجلين في Fast-MI (NCT00673036) المرتقب متعدد المراكز. 14،15 من أصل 1015 مريضًا مسجلين ، توفي 154 مريضًا (15٪) خلال فترة المتابعة التي استمرت عامين. وجدنا أن زيادة تركيزات sTREM-1 في وقت القبول في المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلي حاد مرتبط بارتفاع خطر الوفاة بعد عامين من المتابعة ، حتى بعد تعديل العديد من عوامل الخطر متعددة المتغيرات ، بما في ذلك العمر والجنس وكتلة الجسم. المؤشر ، داء السكري ، حالة التدخين ، ارتفاع ضغط الدم ، التاريخ السابق لمرض احتشاء عضلي ، السكتة الدماغية ، القلب المزمن أو الفشل الكلوي ، جزء طرد البطين الأيسر ، إدارة المستشفى بما في ذلك علاج إعادة التروية ، العلاجات الدوائية الموصى بها بما في ذلك الستاتين ، والبروتين التفاعلي. كانت نسبة الخطر المعدلة للوفاة المرتبطة بزيادة 1 بيكوغرام / مل من sTREM-1 2.22 (فاصل الثقة 95٪ ، 1.69-2.93 ص& lt0.0001) ، 2 0.29 (95٪ مجال ثقة ، 1.71–3.06 ص& lt0.0001) مع إضافة الكرياتين كيناز في النموذج ، و 2.18 (فاصل ثقة 95٪ ، 1.61-2.94 ص& lt0.0001) مع تروبونين I.

لم تكن هناك ارتباطات بين sTREM-1 وكرياتين كيناز (ر=0.018 ص= 0.57) أو بين sTREM-1 وتروبونين I (ر=0.012 ص=0.72).

ويرد في الشكل 5. احتمالية أحداث النتيجة كدالة لمستويات الخط الأساسي لـ sTREM-1. بعد التعديل بنفس المتغيرات المذكورة أعلاه ، ظل تركيز البلازما sTREM-1 ارتباطًا مستقلاً لخطر الوفاة عند عامين ( تم ضبط نسبة الخطر عند 1.65 [0.87-3.10] و 3.11 [1.72-6.64] للثالث 2 والثالث 3 ، على التوالي ، مقارنةً بالثالث 1 ، المختار كمرجع ، ص& lt0.0001).

الشكل 5. تركيز البلازما لمستقبلات التحفيز القابلة للذوبان المعبر عنها في الخلايا النخاعية -1 (sTREM-1) تتنبأ بالوفاة بعد عامين من احتشاء عضلة القلب (MI) في البشر. منحنيات البقاء على قيد الحياة وفقًا لتركيز البلازما لـ TREM-1 القابل للذوبان في المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلي حاد. تتم مقارنة تقديرات البقاء على قيد الحياة باستخدام اختبار تسجيل الترتيب. تشير الموارد البشرية إلى نسبة الخطر.

مناقشة

تم إجراء قدر كبير من العمل لفك تشفير الأهداف الخلوية أو الجزيئية التي يمكن معالجتها في التجارب السريرية لمعهد MI ، على الرغم من النتائج المخيبة للآمال. 17،18،19 هنا ، استخدمنا العديد من النماذج الحيوانية التكميلية ، وكذلك عينات المرضى ، لإظهار دور TREM-1 في تنسيق الاستجابة الالتهابية التي يسببها MI. يثبط الإبطال الجيني أو الحصار الدوائي لـ Trem-1 تجنيد الخلايا الالتهابية إلى عضلة القلب المحتجزة وتنشيطها. هذا يترجم إلى تقليل حجم الاحتشاء وتحسين وظيفة القلب والبقاء على قيد الحياة. باستخدام مجموعة من المرضى على الصعيد الوطني تم قبولهم في احتشاء عضلي حاد ، لاحظنا أن تركيز البلازما TREM-1 القابل للذوبان (علامة تنشيط TREM-1) عند القبول هو عامل تنبؤي قوي للوفاة خلال متابعة لمدة عامين.

يكمن أحد المحددات الحاسمة لشفاء الاحتشاء وتكوين الندبة في التوازن الدقيق بين نوع وكمية الكريات البيض المعينة. 3 بعد الإصابة بنقص التروية بسرعة ، تتراكم العدلات في عضلة القلب المصابة ، ويُعتقد أن مثل هذا التسرب ، عندما يكون مفرطًا ، ضارًا. أدى تثبيط Trem-1 إلى إلغاء تسلل عضلة القلب تمامًا تقريبًا مع العدلات. تم وصف هذه الظاهرة مؤخرًا أثناء الالتهاب الرئوي حيث منع تثبيط Trem-1 هجرة العدلات عبر الظهارة. 12 بعد فترة وجيزة من العدلات ، يتم تجنيد حيدات عالية التهابية من Ly-6C والتي إذا تركت دون رادع قد تتسبب في توسع الاحتشاء وإعادة تشكيل البطين. يتم استبدال هذه المجموعة الفرعية الالتهابية تدريجياً بخلايا أحادية منخفضة Ly-6C تعويضية تعزز دقة الالتهاب وإعادة تنظيم المصفوفة خارج الخلية. 2 يعتبر الطحال خزانًا مهمًا للخلايا الوحيدة أثناء احتشاء عضلة القلب. لاحظنا هنا أن Trem-1 مهم في التوسط ليس فقط في خروج حيدات الطحال ولكن أيضًا في الحركة من النخاع العظمي وتسلل عضلة القلب. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن تثبيط Trem-1 يقلل من إنتاج Ccl-2 وبالتالي يمنع من تراكم الخلايا العالية Ly-6C ، إلا أنه لا يضر بتجنيد الخلايا الأحادية المنخفضة لـ Ly-6C الناجم عن Cx3cl1. تتواجد الخلايا الليمفاوية أيضًا ، وإن كانت بأعداد قليلة ، في المنطقة المحتشمة وتتكاثر بسرعة بعد احتشاء عضلة القلب. الدور الدقيق لمجموعات الخلايا الليمفاوية الفرعية ليس واضحًا ولكن الأدلة الحديثة تشير إلى وجود تأثير ضار للخلايا البائية ، 4 في حين أن خلايا CD4 + T ربما تسهل التئام الجروح والانتقال من حيدات Ly-6C عالية إلى Ly-6C منخفضة. 20 مرة أخرى ، يبدو أن Trem-1 مهم في التوسط في تجنيد الخلايا الليمفاوية ، وخاصة الخلايا CD8 + و B السامة للخلايا. على النقيض من ذلك ، فإن تثبيط Trem-1 لا يغير تجنيد CD4 +. على الرغم من أن الآليات الدقيقة لا تزال بحاجة إلى التوضيح ، فإن كل هذه البيانات تشير إلى أن Trem-1 يلعب دورًا مهمًا في توظيف الكريات البيض ، من الناحيتين الكمية والنوعية.

Trem-1 هو مكبر للاستجابة المناعية أثناء الأمراض الالتهابية المختلفة. 6 نظهر أن الشيء نفسه ينطبق بعد MI: تثبيط Trem-1 يثبط الجين الالتهابي وتنشيط البروتين ويقلل من إنتاج السيتوكين / الكيموكين. يقلل تثبيط MMPs من خطر تمزق القلب القاتل وإعادة تشكيل البطين بعد MI. تعد الخلايا النخاعية ، وخاصة العدلات ، مصدرًا رئيسيًا لـ Mmp9 في عضلة القلب المحتجزة. 13 تثبيط Trem-1 ، في تقليل تسلل الخلايا النخاعية ، يقلل من تعبير Mmp9 ونشاطه ، بينما يحسن تعبير Timp1. يؤدي هذا إلى تقليل نشاط MMP بشكل عام في عضلة القلب المصابة وبالتالي قد يمنع إعادة تشكيلها.

إلى جانب تحسين البقاء على قيد الحياة على الفور ، فإن أهداف علاج احتشاء عضلة القلب هي تجنب عواقبه الرئيسية المتأخرة ، وهي تطور قصور القلب المزمن. لذلك درسنا عواقب تعديل Trem-1 بعد MI في الفئران باستخدام تقنيتين تكميليتين: التصوير microTEP ودراسة الدورة الدموية الغازية. بعد ستة أسابيع من ظهور نقص تروية عضلة القلب الدائم ، ظلت وظيفة البطين الأيسر معرضة للخطر وحدثت عملية إعادة تشكيل هامة للبطين. العلاج القصير (للأيام الخمسة الأولى) للحيوانات التي تحتوي على مثبط Trem-1 يعارض هذا التمدد البطيني ويحسن وظائف البطين الانقباضي والانبساطي. كما أكدنا هذا التحسن في وظائف القلب أثناء نقص تروية عضلة القلب - ضخه.

بالنظر إلى أن تثبيط Trem-1 يحدث فقط خلال الأيام الخمسة الأولى بعد MI (عمر النصف LR12 قصير) ، 8 وبالتالي فإننا نتوقع أن التعديل الأولي للاستجابة الالتهابية يجب أن يكون مسؤولاً عن هذا التحسن المتأخر في وظيفة البطين.

غالبًا ما تثار الأسئلة حول ترجمة نتائج الحيوانات إلى علم أمراض الإنسان. 5 لفك ما إذا كان TREM-1 يمكن أن يلعب أيضًا دورًا في البشر ، قمنا بقياس شكله القابل للذوبان في بلازما المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلي حاد. باستخدام مجموعة من المرضى على الصعيد الوطني تم قبولهم في احتشاء عضلي حاد ، لاحظنا أن تركيز TREM-1 في البلازما القابلة للذوبان عند القبول مرتبط بخطر الوفاة خلال عامين من المتابعة. الأهم من ذلك ، يظل تركيز sTREM-1 تنبئيًا حتى بعد التعديل لجميع المعلمات المعروفة بتأثيرها على النتائج بما في ذلك الإدارة العلاجية ، مثل علاج إعادة ضخ الدم والأدوية الطبية الموصى بها. وهكذا يبدو أن TREM-1 أيضًا وسيط مهم أثناء احتشاء عضلة القلب لدى المرضى.

في الختام ، تشير نتائجنا إلى أن TREM-1 له دور رئيسي في التحكم في تجنيد الخلايا الالتهابية وتنشيطها بعد MI. تعديل TREM-1 قادر على منع الخلل البطيني. أخيرًا ، يعد تنشيط TREM-1 مؤشراً مستقلاً للنتائج للوفاة في المرضى بعد احتشاء عضلة القلب الحاد. تبدو القدرة على معالجة نشاط TREM-1 لتحقيق تأثيرات علاجية واعدة وتحتاج إلى مزيد من الاستكشاف بهدف الحد أخيرًا من التطور الوبائي لفشل القلب المزمن بعد الاحتشاء.


مقدمة لأنواع الأكسجين التفاعلية - قياس أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا

من المعروف منذ فترة طويلة أن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي أحد مكونات الاستجابة القاتلة للخلايا المناعية للغزو الميكروبي. أظهرت الأدلة الحديثة أن أنواع الأكسجين التفاعلية تلعب دورًا رئيسيًا كمرسل في نقل إشارة الخلية العادية ودورة الخلية. تتشكل هذه الجزيئات التفاعلية بواسطة عدد من الآليات المختلفة ويمكن اكتشافها بواسطة تقنيات مختلفة. هنا نصف بإيجاز البيولوجيا الكامنة وراء بعض هذه الجزيئات ووسائل اكتشافها.

مقدمة

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي عبارة تستخدم لوصف عدد من الجزيئات التفاعلية والجذور الحرة المشتقة من الأكسجين الجزيئي. إنتاج الجذور الأكسجينية هو لعنة لجميع الأنواع الهوائية. هذه الجزيئات ، التي يتم إنتاجها كمنتجات ثانوية أثناء نقل إلكترون الميتوكوندريا للتنفس الهوائي أو عن طريق إنزيمات أوكسيدوروكتاز والأكسدة المحفزة بالمعادن ، لديها القدرة على التسبب في عدد من الأحداث الضارة. كان يعتقد في الأصل أن الخلايا البلعمية فقط هي المسؤولة عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية كجزء من آليات دفاع الخلية المضيفة. أظهر العمل الأخير أن ROS لها دور في إشارات الخلية ، بما في ذلك التعبير الجيني لموت الخلايا المبرمج وتفعيل شلالات إشارات الخلية [1]. وتجدر الإشارة إلى أن ROS يمكن أن تعمل كمراسلين داخل وخارج الخلايا.

أنواع أنواع الأكسجين التفاعلي

يتم إنشاء معظم أنواع الأكسجين التفاعلية كمنتجات ثانوية أثناء نقل الإلكترون في الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) كمواد وسيطة ضرورية لتفاعلات الأكسدة المحفزة بالمعادن. يحتوي الأكسجين الذري على إلكترونين غير متزاوجين في مدارات منفصلة في غلافه الإلكتروني الخارجي. هذا الهيكل الإلكتروني يجعل الأكسجين عرضة للتشكيل الجذري. يؤدي الاختزال المتسلسل للأكسجين من خلال إضافة الإلكترونات إلى تكوين عدد من أنواع الأكسجين التفاعلية بما في ذلك: فوق أكسيد الهيدروجين فوق أكسيد الهيدروكسيل ، وأكسيد النيتريك. (شكل 1).

شكل 1. الهياكل الإلكترونية لأنواع الأكسجين التفاعلية الشائعة. يتم تزويد كل هيكل باسمه وصيغته الكيميائية. يعين Red & bull إلكترونًا غير مزدوج.

الدفاع الخلوي ضد ROS

تعتبر إزالة السموم من أنواع الأكسجين التفاعلية أمرًا بالغ الأهمية لبقاء جميع أشكال الحياة الهوائية. على هذا النحو ، فقد تطور عدد من آليات الدفاع لتلبية هذه الحاجة وتوفير توازن بين إنتاج وإزالة أنواع الأكسجين التفاعلية. غالبًا ما يشار إلى عدم التوازن تجاه الحالة المؤيدة للأكسدة باسم & ldquo الإجهاد التأكسدي & rdquo.

تمتلك الخلايا مجموعة متنوعة من آليات الدفاع لتخفيف الآثار الضارة لـ ROS. يحفز ديسموتاز الأكسيد الفائق (SOD) تحويل اثنين من الأنيونات الفائقة إلى جزيء من بيروكسيد الهيدروجين (H2ا2) والأكسجين (O2) [3] (مكافئ 1). في بيروكسيسومات الخلايا حقيقية النواة ، يحول إنزيم الكاتلاز H2ا2 إلى الماء والأكسجين ، وبالتالي يكمل إزالة السموم التي بدأتها SOD (مكافئ 2). الجلوتاثيون بيروكسيديز هو مجموعة من الإنزيمات التي تحتوي على السيلينيوم ، والتي تحفز أيضًا تحلل بيروكسيد الهيدروجين ، وكذلك البيروكسيدات العضوية إلى كحول.

هناك عدد من مضادات الأكسدة غير الأنزيمية ذات الجزيئات الصغيرة التي تلعب دورًا في إزالة السموم. قد يكون الجلوتاثيون أهم دفاع داخل الخلية ضد الآثار الضارة لأنواع الأكسجين التفاعلية. يوفر هذا ثلاثي الببتيد (جلوتاميل سيستينيل جلايسين) مجموعة سلفهيدريل مكشوفة ، والتي تعمل كهدف وفير للهجوم. تؤدي التفاعلات مع جزيئات ROS إلى أكسدة الجلوتاثيون ، لكن الشكل المختزل يتجدد في الأكسدة والاختزال بواسطة اختزال يعتمد على NADPH. فيتامين ج أو حمض الأسكوربيك هو جزيء قابل للذوبان في الماء قادر على تقليل ROS ، في حين أن فيتامين E (وألفا توكوفيرول) هو جزيء دهني قابل للذوبان تم اقتراح أنه يلعب دورًا مشابهًا في الأغشية.

نسبة الشكل المؤكسد من الجلوتاثيون (GSSG) والشكل المختزل (GSH) هي مؤشر ديناميكي للإجهاد التأكسدي للكائن الحي [2].

رد الفعل على الإجهاد التأكسدي

إن تأثير أنواع الأكسجين التفاعلية على العمليات الخلوية هو دالة على قوة ومدة التعرض ، وكذلك سياق التعرض. الاستجابة الخلوية النموذجية للإجهاد هي ترك دورة الخلية والدخول في G0. مع استمرار التعرض و / أو مستويات عالية من أنواع الأكسجين التفاعلية ، يتم تشغيل آليات موت الخلايا المبرمج. في خلايا الدوران ، يتم تنشيط p21 استجابة للإجهاد ، مثل المواد المؤكسدة أو الإجهاد التأكسدي ويمنع تقدم دورة الخلية [4]. وبالمثل ، يؤدي إنتاج p27 إلى إنتاج G1 اعتقال الخلايا. في خلايا الدوران ، يستجيب p53 و p21 للمؤكسدات عن طريق تحفيز نزع الفسفرة من الورم الأرومي الشبكي (RB). التعرض لمؤكسدات مثل H2ا2 أو أكسيد النيتريك يؤدي أيضًا إلى إزالة الفسفرة من RB التي تكون مستقلة عن p53 أو p21. في كلتا الحالتين يتم القبض على الخلايا في المرحلة S. يتم التحكم في التعبير عن p27 جزئيًا بواسطة عوامل النسخ Foxo ، والتي من المعروف أنها تتحكم في التعبير عن الجينات المشاركة في تقدم دورة الخلية ، والتمثيل الغذائي واستجابة الإجهاد التأكسدي [5]. على سبيل المثال ، يحافظ التحفيز الانقسامي عن طريق مسار PI3K / Akt على Foxo3a في السيتوبلازم ، ولكن في حالة عدم وجود التحفيز يدخل Foxo3a إلى النواة وينظم جينات التمثيل الغذائي للأكسدة وتوقف دورة الخلية ، مثل p27 [5]. في ظل بعض الظروف ، يمكن لـ Foxo3a تنشيط التعبير الجيني bim مباشرةً وتعزيز موت الخلايا المبرمج. [6]. وبالتالي ، فإن Foxo3a يعزز بقاء الخلية في دورة الخلايا تحت الإجهاد التأكسدي من خلال تمكين استجابة الإجهاد ، لكنه يحفز موت الخلية عندما تستدعي الظروف ذلك. تمتلك الخلايا غير الدورية ، مثل الخلايا العصبية ، أيضًا آليات تكيف مع الإجهاد التأكسدي الذي يتضمن Foxo3a. يحث Foxo3a على التعبير عن شكل المنغنيز من SOD استجابةً للإجهاد التأكسدي [7].

تنظيم إنتاج ROS

كان يطلق على الإنتاج المحفز لأنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة الخلايا البلعمية اسم & ldquothe انفجار الجهاز التنفسي & rdquo بسبب زيادة استهلاك هذه الخلايا للأكسجين [8]. يتم تحفيز هذه العملية من خلال عمل NADPH أوكسيديز ، وهو مركب إنزيمي مرتبط بغشاء متعدد المكونات ، وهو ضروري للعمل المبيد للجراثيم في البالعات [8].

في حين أن العديد من الإنزيمات معروفة بأنها قادرة على إنتاج شقوق ROS ، فإن NADPH أوكسيديز هو الأكثر أهمية [9]. يتم التحكم في نشاط NADPH أوكسيديز بواسطة نظام تنظيمي معقد يتضمن G-protein Rac [10] (الشكل 2).

في الخلايا المريحة ، يتيح غشاء مغاير مضمن في غشاء مكون من عديد ببتيدات (p22-phox و gp91-phox) ، والذي يحتوي أيضًا على مجموعتين من الهيم بالإضافة إلى مجموعة FAD ، نقل الإلكترونات من NADPH العصاري الخلوي عبر الغشاء إلى الأكسجين الجزيئي بدون NADPH أوكسيديز نشاط [9].

يُعتقد أن تعويض الشحنة يحدث عندما يعمل عديد ببتيد gp91-phox أيضًا كقناة H + أيون. عند التحفيز ، ينتقل عدد من عديد الببتيدات (p47-phox و p67-phox و p40phox) إلى الوجه الداخلي لغشاء البلازما لتشكيل مركب إنزيم نشط بالكامل يمتلك نشاط أوكسيديز NADPH. يُعتقد أن عملية مماثلة تحدث في الخلايا غير البلعمية أيضًا [11].

الشكل 2. توضيح تخطيطي لتفعيل NADPH أوكسيديز.

أنواع الأكسجين التفاعلية لها دور في عدد من العمليات الخلوية. يمكن أن تؤدي المستويات العالية من أنواع الأكسجين التفاعلية ، التي يمكن أن تؤدي إلى تلف الخلايا والإجهاد التأكسدي وتلف الحمض النووي ، إلى بقاء الخلية أو آليات موت الخلايا المبرمج اعتمادًا على شدة التعرض ومدته. لقد ثبت أن أكسيد النيتريك (& bullNO) يعمل كمرسل من خلية إلى خلية ، وهو مسؤول عن تأثيرات مثل خفض ضغط الدم [12]. داخل الخلايا ، يُعتقد أن أنواع ROS ، جنبًا إلى جنب مع الإنزيمات المضادة للأكسدة ، تلعب دورًا في تشغيل وإيقاف تشغيل الإنزيمات عن طريق إشارات الأكسدة والاختزال بطريقة مشابهة لتلك الموجودة في نظام cAMP المرسل الثاني [12]. ومن الأمثلة على ذلك الأنيون الفائق ، بيروكسيد الهيدروجين. مستوى الحالة المستقرة لـ & bullO2 - يُقدر أنه منخفض جدًا ، ولكن نشاطه محدود من الناحية المكانية. بيروكسيد الهيدروجين (H2ا2) غير متفاعل مع الثيول في حالة عدم وجود عوامل تحفيز (مثل الإنزيمات والمعادن متعددة التكافؤ وما إلى ذلك) ، فإنه يتفاعل مع أنيون الثيولات (S-) ، لتكوين حمض السلفنيك ، والذي بدوره يتأين لتشكيل كبريتات (SO-) . يمكن عكس هذا الوسيط بفعل الجلوتاثيون [13].

تبدأ إشارات Mitogenic على سطح الخلية مع التنشيط المعتمد على الترابط لمستقبلات كيناز التيروزين ، والتي تنشط شلالات كيناز MAP المهمة اللازمة للانتشار. هذه الشلالات تؤدي إلى توليد H.2ا2 من العديد من محفزات الإنزيم ، بما في ذلك NADPH oxidases [14]. تشير التقديرات إلى أن إنتاج H2ا2 على مستويات نانومولار مطلوب للتكاثر استجابة لعوامل النمو [15]. يتفاعل بيروكسيد الهيدروجين مع كل من مسارات SOS-Ras-Raf-ERK و PI3K / Akt من خلال عدة آليات وبطريقة تعتمد على (الشكل 3). لقد تم اقتراح أن الزيادات الصغيرة في H2ا2، نتيجة لتعبير Nox1 ، يؤدي إلى زيادة إعادة الدخول في دورة الخلية ، مع الحفاظ على مستويات عالية من H2ا2 يؤدي إلى توقيف الخلية وموت الخلايا المبرمج في نهاية المطاف بعد الاعتقال المطول.

تعمل البيروكسيدوكسينات كمنظمين مهمين لـ H.2ا2 والإشارات الانقسامية. يتم تنشيط هذه البيروكسيدات المعتمدة على الثيول وتوظيفها في المستقبلات كجزء من التحفيز الانقسامي وتعمل على الحد من تأثير التحفيز المرتبط بـ ROS على الأهداف النهائية لسلسلة الميتوجين [16]. (الشكل 3).

التحكم في دورة الخلية: إشارات الأكسدة والاختزال

عندما تتكاثر الخلايا ، فإنها تتحرك من خلال عملية منسقة لنمو الخلايا ، وتضاعف الحمض النووي ، والانقسام الخيطي المشار إليه بدورة الخلية. دورة الخلية هي عملية منظمة بإحكام مع العديد من نقاط التفتيش. يتم تنظيم كل نقطة من نقاط التفتيش هذه بواسطة البروتينات ومجمعات البروتين التي تتأثر بحالة الأكسدة للخلية. تم وصف العلاقة بين حالة الأكسدة والاختزال والتحكم في دورة الخلية بتفصيل كبير في مراجعة قام بها Heintz and Burhans [5].

في الحيوانات متعددة الخلايا ، لا تتكاثر معظم الخلايا وقد انسحبت من دورة الخلية إما بشكل مؤقت أو دائم عبر التمايز الطرفي. خروج G0 والدخول إلى G1 استجابة لعوامل النمو خارج الخلية يتم التحكم فيها بواسطة المؤكسدات. تعمل مسارات الإشارات المعتمدة على الأكسدة والاختزال على تعزيز التعبير عن Cyclin D1 [17] ، وهو البروتين الرئيسي للعودة إلى دورة الخلية. على هذا النحو ، تم الإبلاغ عن تعبير cyclin D1 ليكون علامة لتحفيز الانقسام الفتيلي الناجح [15]. النقطة التنظيمية الرئيسية في G1 هي نقطة التقييد (أو نقطة R) ، حيث تلتزم الخلايا بالدخول إلى المرحلة S. عند النقطة R ، يتحول بروتين الورم الأرومي الشبكي (pRB) إلى فسفرة بواسطة مجمعات Cyclin D / CDK. ومن المثير للاهتمام أن الدراسات الكافية قد أظهرت أن هناك إمكانية الأكسدة والاختزال بحوالي -207 مللي فولت لفسفرة pRB ، وفوق ذلك يتم إزالة الفسفرة من الخلايا وتتوقف الخلايا عن الدوران [18]. لقد لوحظ أنه في الخلايا المتزامنة يزيد إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية أثناء دورة الخلية ، مع حدوث مستويات الذروة في مرحلة G2 / M [19].

تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية دورًا في موت الخلايا المبرمج. NF-kB ، وهو مصطلح جماعي لوصف عائلة Rel لعوامل النسخ ، يمنع موت الخلايا المبرمج عن طريق تنظيم العديد من الجينات المضادة للخلايا [17]. على العكس من ذلك ، فإن كيناز c-Jun N-terminal kinase (JNK) يعزز موت الخلايا المبرمج عند تنشيطه لفترات طويلة [20]. لقد ثبت أن التنشيط المطول ناتج عن التعرض لـ ROS مباشرة وكذلك عن طريق تعطيل مثبطات JNK مثل فوسفاتاز MAP Kinase [20]. يبدو أن قمع تراكم ROS الناجم عن TNF و alpha هو الآلية التي ينظم بها NF-kB تنشيط JNK.

الشكل 3. رسم توضيحي تخطيطي للتفاعلات المبلغ عنها لـ ROS و Mitogenic Cascades.

قياس أنواع الأكسجين التفاعلية

يعتمد قياس أنواع الأكسجين التفاعلية على الهدف التحليلي جنبًا إلى جنب مع أنواع الأكسجين التفاعلية المعنية. على المستوى الخلوي ، يمكن تقييم أنواع أنواع معينة من أنواع الأكسجين التفاعلية بشكل فردي من زراعة الأنسجة ، بينما يتم قياس تأثيرات الإجهاد التأكسدي على مستوى الحيوان عادةً من منتج الدم (مثل المصل أو البلازما) أو من عينات البول.

الجلوتاثيون هو أهم آلية دفاع مؤكسد غير إنزيمي. إنه موجود بكميات كبيرة نسبيًا (مستويات ملي مول) ويعمل على إزالة السموم من البيروكسيدات وتجديد عدد من مضادات الأكسدة المهمة (مثل وحمض الأسكوربيك وحمض الأسكوربيك وألفا توكوفيرول) [21].

يتم تجديد الجلوتاثيون المختزل (GSH) من شكله المؤكسد (GSSG) عن طريق عمل اختزال يعتمد على NADPH (مكافئ 3).

مكافئ. 3. GSSG + NADPH + H + & rarr 2 GSH + NADP +

نظرًا للطبيعة السريعة لتقليل GSSG بالنسبة لتوليفه أو إفرازه ، فإن نسبة GSH إلى GSSG هي مؤشر جيد على الإجهاد التأكسدي داخل الخلايا. يمكن تحديد مستويات GSH و GSSG عن طريق HPLC [22] ، أو الرحلان الكهربائي الشعري [23] ، أو كيميائيًا في الصفائح الدقيقة [24].

تم تصميم عدة فحوصات مختلفة لقياس الجلوتاثيون في العينات. باستخدام مشتق لوسيفيرين بالتزامن مع إنزيم الجلوتاثيون S-ترانسفيراز ، ستكون كمية GSH متناسبة مع إشارة الإنارة المتولدة عند إضافة لوسيفيراز في خطوة لاحقة [25]. يمكن تحديد إجمالي الجلوتاثيون بطريقة القياس اللوني عن طريق تفاعل GSH مع DTNB (كاشف Ellman & rsquos) في وجود اختزال الجلوتاثيون. يقلل اختزال الجلوتاثيون من GSSG إلى GSH ، والذي يتفاعل بعد ذلك مع DTNB لإنتاج حمض 5-thio-2-nitrobenzoic ذو اللون الأصفر (TNB) ، والذي يمتص عند 412 نانومتر.

يعد الكشف عن الخلايا الخلوية وتحديد موقع GSH أمرًا مهمًا في فهم تعديل حالة الأكسدة الخلوية وتأثير الأدوية وآليات إزالة السموم. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن اختلافات في مستويات GSH في الاستجابة للإجهاد التأكسدي في مجموعات سكانية فرعية من الخلايا ، مما يؤكد أهمية طرق الكشف القابلة للتدفق الخلوي والكشف الآلي عن التألق.

المركبات ثنائية البيماني monobromobimane و monochlorobimane ، والتي هي أساسًا غير فلورية حتى يتم الاقتران ، تتفاعل بسهولة مع الثيول منخفض الوزن الجزيئي ، بما في ذلك الجلوتاثيون لتشكيل مقاربات الفلورسنت مع إثارة طول موجي 394 نانومتر وانبعاث عند 490 نانومتر [26] (الشكل 4). هذه الكواشف مفيدة للكشف عن توزيع بروتين ثيولز في الخلايا قبل وبعد الاختزال الكيميائي لثاني كبريتيد. لطالما كان أحادي كلوروبيمان ، وهو أكثر انتقائية للثيول من أحادي البروموبيمان ، هو المسبار التفاعلي للثيول المفضل لقياس مستويات الجلوتاثيون في الخلايا ولقياس نشاط GST [27]. بسبب تراكم الجلوتاثيون الأزرق الفلوريسنت لأحادي كلوروبيمان في النهاية في النواة ، فإنه ليس مؤشرًا موثوقًا للتوزيع النووي والهيولي للجلوتاثيون الخلوي [28].

الشكل 4. هيكل بيماني والتفاعل مع الثيول. أحادي بروموبيمان و monochlorobimane لهما ذرة Br أو ذرة Cl تقع في مجموعة الميثيل 3-postion على التوالي وغير متوهجة. تتفاعل هذه المجموعة التفاعلية مع الثيول ذو الوزن الجزيئي المنخفض لتشكيل مقاربات مشعة ، بحد أقصى للإثارة يبلغ 394 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 490 نانومتر.

يتفاعل ThiolTracker & trade Violet (Life Technologies) مع ثيول مخفض في الخلايا السليمة لاستخدامه في التحليل الخلوي باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري الفلوري. يمكن أن يعبر كاشف البنفسج ThiolTracker والتجارة أغشية الخلايا الحية ، ليصبح خلية نفاذة بعد التفاعل مع الثيول الخلوي. الإثارة 404 نانومتر وأطوال موجات الانبعاث 526 نانومتر مناسبة للتصوير باستخدام مجموعات مرشحات DAPI. تم الإبلاغ عن أنه أكثر سطوعًا بمقدار 10 مرات من المركبات ثنائية البيمان من قبل الشركة المصنعة.

يعد بيروكسيد الدهون أحد أكثر المؤشرات استخدامًا لتشكيل الجذور الحرة ، وهو مؤشر رئيسي للإجهاد التأكسدي. تعتبر الأحماض الدهنية غير المشبعة مثل تلك الموجودة في الأغشية الخلوية هدفًا شائعًا للجذور الحرة. تحدث التفاعلات عادةً كتفاعل متسلسل حيث يلتقط الجذور الحرة جزء الهيدروجين من الكربون غير المشبع لتكوين الماء. هذا يترك إلكترونًا غير متزاوج على الأحماض الدهنية يكون قادرًا بعد ذلك على التقاط الأكسجين ، وتشكيل جذر بيروكسي (الشكل 5). تعتبر بيروكسيدات الدهون غير مستقرة وتتحلل لتشكيل سلسلة معقدة من المركبات ، والتي تشمل مركبات الكربونيل التفاعلية ، مثل مالونديالديهيد (MDA).

الشكل 5. رسم توضيحي لأكسدة الدهون.

اعتمد قياس بيروكسيد الدهون تاريخيًا على اكتشاف المركبات التفاعلية لحمض الثيوباربيتوريك (TBA) مثل malondialdehyde المتولدة من تحلل منتجات بيروكسيد الدهون [25]. في حين أن هذه الطريقة مثيرة للجدل من حيث أنها حساسة للغاية ، ولكنها ليست بالضرورة خاصة بـ MDA ، إلا أنها تظل الوسيلة الأكثر استخدامًا لتحديد بيروكسيد الدهون. ينتج عن هذا التفاعل ، الذي يحدث في ظل ظروف حمضية عند 90-100 & ordmC ، تقارب يمكن قياسه قياسًا لونيًا عند 532 نانومتر أو عن طريق التألق باستخدام طول موجة إثارة 530 نانومتر وطول موجي انبعاث 550 نانومتر [29] (الشكل 6). يتوفر عدد من مجموعات الفحص التجارية لهذا الاختبار باستخدام تقنيات الكشف عن الامتصاص أو التألق.

الشكل 6. تشكيل MDA-TBA adduct.

لقد ثبت أن تكوين مشتقات البروستانويد الشبيهة بـ F2 لحمض الأراكيدونيك ، والذي يُطلق عليه F2-isoprostanes (IsoP) خاص ببيروكسيد الدهون [30]. على عكس مقايسة TBA ، يبدو أن قياس IsoP خاص ببيروكسيدات الدهون ، فهي مستقرة ولا يتم إنتاجها بواسطة أي مسار إنزيمي مما يجعل التفسير أسهل.

كان هناك عدد من مجموعات ELISA التجارية التي تم تطويرها لـ IsoPs ، لكن العوامل المتداخلة في العينات تتطلب تنقية جزئية للعينات قبل إجراء الفحص. الوسيلة الوحيدة الموثوقة للكشف هي من خلال استخدام GC / MS ، مما يجعلها باهظة الثمن وتحد من الإنتاجية [31].

يمكن تصور بيروكسيد الدهون في الخلايا الحية باستخدام مشتقات الفلورسنت التي تترجم إلى الأغشية. على سبيل المثال ، ينتج عن أكسدة الجزء متعدد البوتادينيل غير المشبع من BODIPY & reg 581 & frasl591 undecanoic acid fluorophore تحول في انبعاث التألق من 590 نانومتر إلى 510 نانومتر [32 ، 33] (الشكل 7). هذا الكاشف المتوفر تجارياً كمجموعة Image-iT & reg Lipid Peroxidation Kit (تقنيات الحياة) يوفر طريقة بسيطة لقياس النسب لاكتشاف التحلل التأكسدي للدهون الخلوية في الخلايا الحية [34]. توفر نسبة التألق الأحمر إلى التألق الأخضر مقياسًا لأكسدة الدهون التي تكون مستقلة عن عوامل مثل كثافة الدهون التي قد تؤثر على القياس باستخدام مجسات الانبعاث الأحادي. نظرًا لأن هذا الكاشف متوافق مع الخلايا الحية ، يمكن إجراء القياسات في الوقت الفعلي دون تثبيت أو تلطيخ. تم استخدام هذا الكاشف أيضًا لإثبات قدرة البلازما المضادة للأكسدة [35] والحويصلات الدهنية [36].

الشكل 7. هيكل C11-BODIPY (581/591).

يمكن الكشف عن تعديلات البروتين المشتقة من بيروكسيد الدهون في الخلايا الثابتة باستخدام linoleamide alkyne (LAA) بالتزامن مع Click-iT & reg chemistry (تقنيات الحياة). حمض اللينوليك هو أكثر الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة وفرة في الثدييات ، ومن المحتمل أن تمثل منتجات بيروكسيد الدهون غالبية البروتينات الكربونية المشتقة من الدهون [37]. عند احتضانه بالخلايا الحية ، يندمج LAA في الأغشية الخلوية. عند أكسدة الدهون ، يتأكسد LAA المرتبط بالغشاء وينتج حمض 9- و 13-hydroperoxy-octadecadienoic (HPODE). تتحلل هذه الهيدروبيروكسيدات إلى ألدهيدات & ألفا وبيتا غير المشبعة التي تعدل بسهولة البروتينات المحيطة بها. بمجرد إصلاح الخلايا ، يمكن اكتشاف البروتينات المحتوية على الألكين الناتجة عن طريق التفاعل مع Alexa Fluor & reg 488 azide (الشكل 8).

الشكل 8. آلية عمل Click-iT & reg LAA.

يعتمد اكتشاف الأكسيد الفائق على تفاعل الأكسيد الفائق مع بعض المركبات الأخرى لإنشاء نتيجة قابلة للقياس. تم استخدام اختزال فيريسيتوكروم ج إلى فيروسيتوكروم ج في عدد من المواقف لتقييم معدل تكوين الأكسيد الفائق [38]. (مكافئ 4)

في حين أنه ليس محددًا تمامًا للأكسيد الفائق ، يمكن مراقبة هذا التفاعل بالألوان عند 550 نانومتر. يمكن أن تؤدي إضافة مثبطات الإنزيم مثل CN- أو كاسحات الأنواع التفاعلية مثل الكاتلاز إلى تقليل أي إعادة أكسدة. يحفز Aconitase تحويل السترات إلى isocitrate. يعمل Superoxide على تعطيل هذا الإنزيم عن طريق أكسدة جزء Fe (II) من مجموعة الكوب <4Fe-4S>. وبالتالي يمكن تقدير تركيزات الأكسيد الفائق من خلال درجة تثبيط الإنزيم. يمكن مراقبة نشاط الإنزيم باتباع تحويل 20 ملي إيزوسيترات إلى سيكاكونيت باستخدام الامتصاصية عند 240 نانومتر. مقايسة مقترنة حيث يتم تحويل منتج الأكونيتاز ، isocitrate إلى & alpha-ketoglutarate بواسطة NADP + يمكن أيضًا استخدام إيزوسيترات ديهيدروجينيز المعتمد. في هذا التفاعل ، يمكن مراقبة إنتاج NADPH قياسًا لونيًا عند 340 نانومتر [21].

تم استخدام تفاعلات اللمعان الكيميائي لزيادة محتملة في الحساسية على طرق الكشف القائمة على الامتصاص. الركيزة الأكثر استخدامًا للإضاءة الكيميائية هي Lucigenin ، لكن هذا المركب يميل إلى تدوير الأكسدة والاختزال ، مما أثار الشكوك حول استخدامه في تحديد المعدلات الكمية لإنتاج الأكسيد الفائق [39]. تم اقتراح استخدام تركيزات منخفضة من هذا المركب كوسيلة لتقليل هذه المشكلة. تم استخدام Coelenterazine أيضًا كركيزة كيميائية. هذا المركب lypophilic لا يقوم بدورة الأكسدة والاختزال وهو أكثر إشراقًا من Lucigenin. ومع ذلك ، فهو ليس خاصًا تمامًا بالأكسيد الفائق ، لأن وجود البيروكسينيتريت سيؤدي إلى تلألؤ كيميائي [40].

أصباغ الهيدروسيانين عبارة عن مستشعرات فلورية للأكسيد الفائق وجذر الهيدروكسيل. يتم تصنيع هذه الأصباغ عن طريق تقليل الكاتيون الإيمينيوم لأصباغ السيانين (Cy) مع بوروهيدريد الصوديوم. بينما يتألق بشكل ضعيف ، عند الأكسدة ، تزداد شدة التألق 100 ضعف. بالإضافة إلى كونها فلورية ، تعمل الأكسدة أيضًا على تحويل الجزيء من كونه غشاء منفذ إلى جزء أيوني غير منفذ [41]. وأكثر هذه المجسات تميزًا هي Hydro- Cy3 و Hydro-Cy5.

يمكن تصور الإنتاج الخلوي للأكسيد الفائق بواسطة ثنائي هيدرو إيثيديوم ، والذي يشار إليه أيضًا باسم هيدرو إيثيدين. يُظهر هذا المركب مضانًا أزرق في العصارة الخلوية حتى يتأكسد بشكل أساسي بواسطة الأكسيد الفائق وإلى حد أقل بكثير من الأكسجين التفاعلي أو أنواع النيتروجين التفاعلي. ينتج عن أكسدة ثنائي هيدرو إيثيديوم الهيدروكسيل في الموضع الثاني مكونًا 2-هيدروكسي إيثيديوم (الشكل 9). مع الأكسدة ، يتم إقحام المركب مع الحمض النووي الخلوي ، مما يؤدي إلى تلطيخ النواة باللون الأحمر الفلوري الساطع مع الإثارة المبلغ عنها وأطوال موجات الانبعاث 535 نانومتر و 635 نانومتر على التوالي [42].

الشكل 9. أكسدة ثنائي هيدرو إيثيديوم إلى 2-هيدروكسي إيثيديوم بواسطة Superoxide.

يمكن تصور Superoxide الخاص بالميتوكوندريا باستخدام الفحص المجهري الفلوري باستخدام MitoSOX وكاشف التجارة الأحمر (تقنيات الحياة). الكاشف الأحمر MitoSOX والتجارة هو مشتق كاتيوني من ثنائي هيدرو إيثيديوم يتخلل الخلايا الحية حيث يستهدف بشكل انتقائي الميتوكوندريا. بديل ثلاثي فينيل فوسفونيوم الموجب لمؤشر MitoSOX Red مسؤول عن الامتصاص الكهربائي للمسبار في الميتوكوندريا التي تتنفس بنشاط (الشكل 10). كما هو الحال مع ثنائي هيدرو إيثيديوم ، يتداخل هذا المركب مع الحمض النووي للميتوكوندريا مما يؤدي إلى التألق الأحمر. بينما يمكن إجراء قياسات التألق باستخدام الطول الموجي الذروة للإثارة البالغ 510 نانومتر مع اكتشاف الانبعاث عند 590 نانومتر ، فقد تم الإبلاغ عن ذروة الإثارة الأقل عند

400 نانومتر غائب في طيف الإثارة لمنتج أكسدة الإيثيديوم الناتج عن أنواع الأكسجين التفاعلية غير الأكسيد الفائق قد يوفر تمييزًا أفضل للأكسيد الفائق [42].

الشكل 10. هيكل ميتوسوكس المؤكسد وتداول مؤشر فوق أكسيد الميتوكوندريا الأحمر.

يمكن ملاحظة توليد أنواع الأكسجين التفاعلي للميتوكوندريا عن طريق تصوير MitoSOX وتجارة الخلايا الملطخة. على سبيل المثال ، ارتبط عقار ديكلوفيناك غير الستيرويدي المضاد للالتهابات بالسمية الكبدية من خلال تحريض أنواع الأكسجين التفاعلية [43]. تم تأكيد الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا باستخدام مقايسة MitoSOX بعد معايرة سجل ثلاثة لجرعات ديكلوفيناك لأنسجة الكبد الدقيقة على مدار ثلاثة أيام ، ولم تظهر إشارة متزايدة بشكل ملحوظ من مسبار الفلورسنت الأحمر إلا في أعلى المستويات (300 ميكرومتر) ، مما يشير إلى أنه مرة واحدة عتبة هل وصلت إلى مستويات مرتفعة من الأكسيد الفائق لم يعد من الممكن تحييدها (الشكل 11).

الشكل 11. تقييم الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا بعد ثلاثة أيام من جرعة ديكلوفيناك. صور متراكبة لأنسجة كبدية ثلاثية الأبعاد ملطخة بـ Hoechst 33342 (أزرق) و MitoSOX & trade Red (أحمر) تم التقاطها باستخدام قنوات التصوير DAPI أو RFP Cytation 3 ، على التوالي. تم إجراء ضبط تلقائي للصورة على خلايا DAPI الملطخة [44].

كواشف CellROX & reg هي سلسلة من الكواشف المسجلة الملكية من Life Technologies. هذه الأصباغ التي تتخلل الخلايا تكون متألقة بشكل ضعيف بينما تكون في حالة منخفضة وتعرض مضانًا مستقرًا ضوئيًا عند الأكسدة بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS).يصبح CellROX & reg green فقط متوهجًا مع الارتباط اللاحق بالحمض النووي ، مما يحد من وجوده في النواة أو الميتوكوندريا. يبلغ طول موجة الإثارة لهذا المركب 485 نانومتر وطول موجة الانبعاث 520 نانومتر ، مما يجعله قابلاً للتصوير باستخدام مجموعات مرشحات GFP الخضراء. يمكن أن يكون هذا الكاشف ثابتًا بالفورمالديهايد وتبقى إشارته على قيد الحياة من معالجة المنظفات ، مما يسمح لها بأن تكون متعددة الإرسال مع الأصباغ والأجسام المضادة الأخرى المتوافقة. لا يتطلب CellROX & reg Orange و CellROX & reg Deep Red ارتباطًا بالحمض النووي من أجل التألق ويتم وضعهما في السيتوبلازم. يبلغ طول موجي CellROX & reg orange 545 وانبعاث 565 ويمكن تصويره باستخدام مكعب مرشح RFP ، بينما تبلغ ذروة الإثارة لـ CellROX & reg Deep Red 640 نانومتر وذروة انبعاث تبلغ 665 نانومتر ويمكن تصويرها باستخدام مكعب CY5.

بيروكسيد الهيدروجين (H2ا2) هو ROS الأكثر أهمية فيما يتعلق بالتحفيز الانقسام أو تنظيم دورة الخلية. هناك عدد من الركائز الفلورية التي تعمل كمانحين للهيدروجين والتي تم استخدامها بالتزامن مع إنزيم بيروكسيديز الفجل (HRP) لإنتاج منتجات فلورية بشكل مكثف [21]. في حين أن القائمة واسعة جدًا ، فإن الركائز الأكثر استخدامًا تشمل داسيتيالديكلورو فلورسين [45] وحمض الهوموفانيليك [46] وأمبليكس وريج الأحمر [47]. في هذه الأمثلة ، يتم زيادة كميات H2ا2 تشكل كميات متزايدة من منتج الفلورسنت. على سبيل المثال ، يتأكسد Amplex Red بواسطة بيروكسيد الهيدروجين في وجود HRP وبذلك يتم تحويله إلى resorufin [47]. على عكس Amplex Red ، فإن resorufin عبارة عن مركب عالي الألوان يمكن اكتشافه بطريقة لونية عند 570 نانومتر أو عن طريق التألق باستخدام إثارة 570 نانومتر وانبعاث 585 نانومتر [48] (الشكل 12).

الشكل 12. تحويل Amplex Red إلى resorufin بواسطة HRP باستخدام H.2ا2.

يتضاءل حمض الهوموفانيليك عندما يتأكسد بواسطة بيروكسيد الهيدروجين من خلال تحفيز بيروكسيداز الفجل. كما هو الحال مع أحمر Amplex ، فإن مونومر حمض homovanillic غير الفلوري ، ولكن باعتباره باهتًا ، فإنه يمتلك ذروة طول موجة إثارة يبلغ 315 نانومتر ، بطول موجة انبعاث يبلغ 425 نانومتر (الشكل 13). يجب توخي الحذر عند استخدام هذا المركب لتقييم إنتاج بيروكسيد الهيدروجين. إن الطبيعة القريبة من الأشعة فوق البنفسجية لأطوال موجات الإثارة والانبعاثات لقياسات التألق تجعل هذا المركب عرضة للإشارة الخلفية غير المنتظمة ، خاصة عند استخدام ألواح البوليسترين الدقيقة. وقد ثبت أن العديد من المعادن التي تشبه البيروكسيديز تكون محفزة للتفاعل بالإضافة إلى HRP [49].

الشكل 13. Dimerization حمض الهوموفانيليك عن طريق عمل HRP وبيروكسيد الهيدروجين.

كما تم استخدام عدد من الركائز اللونية مثل رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) وأحمر الفينول جنبًا إلى جنب مع HRP لقياس تركيزات بيروكسيد الهيدروجين. بشكل عام ، تكون الوسائل اللونية أقل حساسية من طرق الكشف الفلوري ، ولكن تكاليف الأجهزة أقل بكثير من تلك المطلوبة للقياسات القائمة على التألق عند استخدام منهجيات الكشف القائمة على الأنبوب أو الصفيحة الدقيقة.

هناك عدد من المشكلات التي يجب على المرء أن يكون على دراية بها عند استخدام ركائز محفزة في HRP لتقدير بيروكسيد الهيدروجين. يمكن أن تعمل المركبات الخلوية مثل الثيول كركيزة لـ HRP. يمكن أن يقلل نشاط الكاتلاز الداخلي بشكل مصطنع من كمية H2ا2 هدية. يمكن أن تؤثر المكونات الخلوية على إشارة الفلورسنت اعتمادًا على الإثارة وأطوال موجات الانبعاث ، كما هو الحال مع الثنائيات المتجانسة ، في حين أن الأطوال الموجية الأخرى قد تعاني من إخماد الإشارة.

Tarpley et. آل. تلخيص فائدة المقايسات المرتبطة بـ HRP بإيجاز شديد من خلال الإشارة إلى أن الطريقة (الطرق) مفيدة جدًا لتقدير H2ا2- المستويات والخلايا المستزرعة ldquo و hellip ، وزراعة الأعضاء ومستحضرات الأنسجة المعزولة المروية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليست مناسبة لتقرير H.2ا2 في البلازما ، أو المصل لأن العديد من عوامل الاختزال موجودة في السائل خارج الخلية و hellip & rdquo [21].

تم استخدام أكسدة 2 & rsquo-7 & rsquo dichlorofluorescin (H2DCF) إلى 2 & rsquo-7 & rsquodichlorofluorescein (DCF) على نطاق واسع جدًا لتقدير كمية H2ا2. يتم تناول شكل ثنائي الأسيتات ، H2DCFDA و acetomethyl ester H2DCFDA-AM بواسطة الخلايا حيث تعمل الاسترات الخلوية غير المحددة عليه لتقسيم المجموعات المحبة للدهون ، مما يؤدي إلى مركب مشحون يُعتقد أنه محاصر داخل الخلية. تعمل أكسدة H2DCF بواسطة ROS على تحويل الجزيء إلى 2 & rsquo ، 7 & rsquo dichlorodihydrofluorescein (DCF) ، وهو شديد الفلورية (الشكل 14). الأطوال الموجية المبلغ عنها لقياس مضان DCF هي 498 نانومتر للإثارة و 522 نانومتر للانبعاثات.

الشكل 14. تشكيل الفلورسنت المركب DCF بواسطة ROS.

في الأصل ، كان يُعتقد أن DCF خاص ببيروكسيد الهيدروجين ، لكن الأدلة الحديثة أظهرت أن أنواع أخرى من أنواع الأكسجين التفاعلية مثل النترات وحمض هيبوكلوروس يمكنها أكسدة H2DCF [66]. الأهم من ذلك هو حقيقة أن H.2ا2تتطلب أكسدة H2DCF المعتمد على الحديدوز [50]. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن H2DCF لم يعد أيونيًا ، فلا يُمنع من الهجرة خارج الخلية والتراكم في الوسائط ، حيث يكون حراً في التفاعل مع المواد المؤكسدة. بالإضافة إلى قياسات مضان PMT ، يمكن تصوير مضان DCF المؤكسد باستخدام مجموعات مرشح FITC أو GFP. على سبيل المثال ، الكينولين قلويد كامبتوثيسين السام للخلايا ، والذي يثبط DNA topoisomerase I ، يسبب الإجهاد التأكسدي مع خلايا الكبد الأولية المستزرعة [51]. كما هو موضح في الشكل 15 ، فإن التركيزات الميكرومولارية للكامبتوثيسين تحفز عادة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في حوالي 10-20٪ من الخلايا في مجال الرؤية.

الشكل 15. تأكسد DCF في خلايا الكبد. تم التقاط صور لخلايا الكبد المزروعة بعد 0 و 30 دقيقة من العلاج باستخدام 800 نانومتر كامبتوثيسين. نوى الخلية ملطخة بـ Hoechst 33342 (أزرق) ، الميتوكوندريا كانت ملطخة بـ MitoTracker & reg Red (أحمر) وكاشف DCF المؤكسد مرئي باللون الأخضر [68]. تم التقاط الصور باستخدام Cytation & trade 3 Imaging قارئ صفيحة ميكروسكوبية متعددة الوسائط (أدوات BioTek) باستخدام هدف 20x.

من أجل معالجة نقاط الضعف في مضان DCF تم تطوير العديد من مجسات الفلورسنت الجديدة. اثنان من هذه المجسات هما Peroxy Green 1 (PG1) و Peroxy Crimson 1 (PC1). هذه المستندة إلى البورونات H2ا2 تم الإبلاغ عن أن المجسات ذات انتقائية عالية ، ونفاذية غشاء ، جنبًا إلى جنب مع الإثارة ذات الطول الموجي المرئي وأطوال موجات الانبعاث [50]. يؤدي التفاعل مع بيروكسيد الهيدروجين إلى زيادة 10 أضعاف و 40 ضعفًا في التألق لـ PG1 و PC1 ، على التوالي. يتميز PG1 بطول موجة إثارة يبلغ 460 نانومتر مع أقصى انبعاث عند 510 نانومتر (الشكل 16). يوضح PC1 خصائص محسّنة للإثارة ذات الانزياح الأحمر والتحول الأكبر في ستوكس مما يقلل من التألق الذاتي (الإثارة: انبعاث 480 نانومتر: 584 نانومتر) [52].

الشكل 16. هيكل Peroxy Green 1 و Peroxy Crimson 1.

تظهر هذه الجزيئات تفاعلًا مباشرًا مع بيروكسيد الهيدروجين الذي لم يتم ملاحظته مع H22DCF. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه الجزيئات غير متفاعلة تجاه أنواع معدن أوكسو عالية التكافؤ المشتقة من بروتينات الهيم و H2ا2. عادةً ما يُظهر DCFH استجابة أكبر لهذه المجموعة من استجابة H.2ا2.

تم الإبلاغ أيضًا عن Calcein-acetoxymethylester (Calcein-AM) ككاشف للنشاط التأكسدي داخل الخلايا [53]. Calcein-AM عبارة عن مركب قابل للنفاذ للخلايا الفلوروجينية يتم تحويله بواسطة إسترات داخل الخلايا إلى أنيون كالسين خالي من الخلايا ، وهو مشع (الشكل 17). تاريخيا ، تم استخدام إنتاج الكالسين داخل الخلايا في كل من الفحص المجهري والقياس الفلوري كمؤشر على الخلايا القابلة للحياة. فيما يتعلق باكتشاف ROS ، فإن حركية تفاعل ROS مواتية بالنسبة لتحويل الإستريز إلى كالسين.

لقد ثبت أن منتج Calcein AM المؤكسد بـ ROS متميز كيميائيًا عن Calcein-AM من خلال كروماتوجرافيا الطبقة الرقيقة [53] ، لكنه لا يزال يحتفظ بالقدرة على عبور أغشية الخلايا وله خصائص طيفية مماثلة لمادة كالسين الفلورية. وبالتالي من المهم الاحتفاظ بالمركب في الوسائط بدلاً من غسله بعيدًا بعد تحميل الخلية ، والذي يتم إجراؤه عادةً عند استخدام المركب لصلاحية الخلية. ينتج عن إزالة الصبغة حركة المركب المتفاعل للخارج من الخلية على تدرج تركيز. تختلف الخصائص الفيزيائية لـ Calcein AM أيضًا عن Calcein-AM أو Calcein حيث تميل الصبغة إلى التجميع وتشكيل مواقع فلورية مكثفة داخل الخلية. في حين أن هذه الصبغة لها إمكانيات مع الفحص المجهري متحد البؤر حيث يكون التوطين الخلوي ممكنًا ، فإن عدم القدرة على التمييز طيفيًا بين ROS المتفاعل مع calcein-AM والمنتج المتفاعل مع esterase يجعل استخدام هذه الصبغة في الألواح الدقيقة مشكلة.

الشكل 17. هيكل كالسين- AM.

يتم إنتاج أكسيد النيتريك الجذور الحرة (& bullNO) بواسطة عدد من أنواع الخلايا المختلفة مع مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية. أكسيد النيتريك هو نتاج أكسدة L- أرجينين إلى L- سيترولين في عملية من خطوتين يتم تحفيزها بواسطة إنزيم أكسيد النيتريك سينثيز (NOS). تم تحديد شكلين رئيسيين من سينسيز أكسيد النيتريك. ينتج الشكل الإسوي التأسيسي الموجود في الخلايا العصبية والخلايا البطانية كميات قليلة جدًا من أكسيد النيتريك بطريقة تعتمد على الكالسيوم والكالموديولين. & bullNO ينشط محلقة الجوانيات القابلة للذوبان في الخلايا المستهدفة ، مما يؤدي إلى زيادة مستويات cGMP ، والذي بدوره يسهل انتقال الخلايا العصبية واسترخاء الأوعية الدموية ، ويمنع تراكم الصفائح الدموية [54].

ينتج الشكل الإسوي المحرض ، الموجود في الضامة والخلايا الليفية والخلايا الكبدية ، & bullNO بكميات كبيرة نسبيًا استجابة للمحفزات الالتهابية أو الانقسامية ويعمل في دور دفاعي للمضيف من خلال سميته التأكسدية [55]. بغض النظر عن المصدر أو الدور ، فإن للجذر الحر و bullNO نصف عمر قصير جدًا (t & frac12 = 4 ثوانٍ) ، يتفاعل مع عدة جزيئات مختلفة موجودة عادةً لتكوين أي نترات (NO3 -) أو نتريت (NO2 -)

طريقة شائعة الاستخدام للتحديد غير المباشر لـ & bullNO هي تحديد تكوين نواتجها النترات والنتريت اللوني. يتطلب هذا التفاعل أن النترات (NO3) أولاً إلى نتريت (NO2) ، عادة بفعل اختزال النترات (الشكل 18).

الشكل 18. تحويل النترات إلى نتريت بفعل اختزال النترات.

يوفر التحديد اللاحق للنتريت من خلال عملية من خطوتين (الشكل 19) معلومات عن & ldquototal & rdquo للنترات والنتريت. في وجود أيونات الهيدروجين ، يشكل النتريت حمض النيتروز ، والذي يتفاعل مع السلفانيلاميد لإنتاج أيون الديازونيوم. يقترن هذا بعد ذلك بـ N- (1-napthyl) ethylenediamine لتشكيل حامل الكروم الذي يمتص عند 543 نانومتر [56].

يمكن بعد ذلك إجراء قرارات النتريت فقط في اختبار مواز حيث لم يتم تقليل العينات قبل الفحص اللوني. ثم يتم حساب مستويات النترات الفعلية بطرح مستويات النتريت من الإجمالي. هذا الاختبار غير مكلف نسبيًا وسهل الأداء. يمكن الحصول على الكواشف بسهولة وهناك العديد من المجموعات التجارية المتاحة لهذا الاختبار.

الشكل 19. رد فعل جريس لتحديد النترات.

من أجل تحسين حساسية مقايسة كاشف Griess لـ & bullNO تم تطوير عدد من فحوصات قياس الفلور. مثل تفاعل Griess فهي تعتمد على ثنائي أكسيد النيتروجين أو حمض النيتروز (N2ا3) ، والذي يتكون تلقائيًا عن طريق تحمض النتريت (NO2 -). تستخدم الطريقة الأكثر شيوعًا 2 ، 3-ديامينونافثالين (DAN) ، وهي غير فلورية نسبيًا ، للتفاعل مع حمض النيتروز لتكوين 2 ، 3 نافثوتريازول (NAT) ، وهو شديد الفلورية مع طول موجة إثارة 375 نانومتر وطول موجة انبعاث 415 نانومتر (الشكل 20).

الشكل 20. الكشف عن النتريت الفلوروميتر باستخدام 2 ، 3-ديامينونافثالين (DAN).

مجسات مشفرة وراثيا

تم تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على البروتين الفلوري لفحص ROS في الموقع في الوقت الفعلي. ينتج هذا الجيل الجديد من مستشعرات الخلايا الفلورية الحية تغييرات في التألق استجابةً للتغيير في حالة الأكسدة والاختزال أو مع التقلبات في مادة تحليلية محددة الهدف. يتم ترميز هذه المستشعرات وراثيًا ، استنادًا إلى بروتين فلورسنت واحد ولا تتطلب إضافة أي كواشف أو تحلل خلوي آخر ، مما يجعلها قابلة جدًا للتعدد.

يعد بروتين الفلورسنت الأخضر الحساس للاختزال (roGFP) مثالًا على جهاز استشعار حيوي حساس للأكسدة. تم إدخال اثنين من السيستين في البقايا المكشوفة السطحية لهيكل برميل بيتا في مواضع مناسبة لتكوين روابط ثاني كبريتيد لبروتين GFP من Aequorea victoria. تحدد حالة أكسدة الثيول المهندسة خصائص التألق في المستشعر [57]. في الأصل ، تم تقديم إصدارات مختلفة من roGFP للسماح بالتصوير في الجسم الحي للمقصورات المختزلة مثل العصارة الخلوية (roGFP2) في النباتات [58] ، مع إدخال السيستين في مواضع الأحماض الأمينية 147 و 204 لإحداث أكبر تغيير [59] . يتم زيادة خصوصية roGFP2 للجلوتاثيون عن طريق ربطه بالجلوتاريدوكسين البشري 1 (Grx1) [60]. الجلوتاريدوكسين عبارة عن إنزيمات صغيرة تتأكسد بواسطة ركائز ويتم تقليلها غير الإنزيمي بواسطة الجلوتاثيون. من خلال التعبير عن مستشعرات الاندماج Grx1-roGFP في الكائن الحي محل الاهتمام و / أو توجيه البروتين إلى حجرة خلوية ، من الممكن قياس إمكانات اختزال الجلوتاثيون في حجرة خلوية معينة في الوقت الفعلي ، وهي ميزة كبيرة على الغازية طرق ثابتة. لاحظ أن هذا المسبار لا يقيس مركبات ROS مباشرة. ومع ذلك ، فإنه يكتشف التحول في توازن الجلوتاثيون المؤكسد / المنخفض (GSH / GSSG). فيما يتعلق بالكشف ، فإن roGFP لها حد أقصى لإثارة الفلورة عند حوالي 400 و 490 نانومتر مع انبعاث 515 مشترك والذي يعرض تغيرات سريعة وقابلة للانعكاس في مقياس التألق استجابةً للتغييرات في إمكانات الأكسدة والاختزال في المختبر وفي الجسم الحي. ينتج عن تكوين ثاني كبريتيد بروتون GFP مع زيادة 405 إشارات إثارة على حساب 488 نانومتر لإشارات الإثارة عند تحديد خرج الانبعاث عند 510 نانومتر. وبالتالي فإن نسبة التألق من الإثارة عند 405 و 488 نانومتر تشير إلى مدى الأكسدة. نظرًا لأن هذا القياس هو مقياس النسبة ، يتم تصحيح الاختلافات في مستويات المستشعر الحيوي أو الحساسية الضوئية المستحثة بالمصفوفة.

الشكل 21. مبدأ GFPs الحساسة للاختزال النسبي. شدة التألق النسبية لحدتي الإثارة القصوى لتحولات roGFP اعتمادًا على حالة الأكسدة والاختزال: يؤدي الاختزال إلى انخفاض في الإثارة عند 400 نانومتر وزيادة في الإثارة عند 480 نانومتر (أسهم). من [61].

من أجل الإحساس المباشر بـ H2ا2 تم ربط بنية roGFP بـ peroxidase Orp1 ، وهو بروتين خميرة يشكل ثاني كبريتيدات عند التفاعل مع H2ا2، والتي يتم نقلها إلى roGFP من خلال آلية تبادل ثيول ثاني كبريتيد [62]. يمكن عكس التفاعل من خلال عمل أنظمة الثيوريدوكسين الخلوي (Trx) أو أنظمة GRx / GSH. تتوفر هذه المجسات أيضًا في صورة BacMam 2.0 التي تصنع تحت الاسم التجاري Premo & trade (تقنيات الحياة) للسماح بترنسفكأيشن بسهولة.

طريقة أخرى لاستشعار H2ا2 بشكل مباشر هو اقتران البروتينات الفلورية المخففة دائريًا مع مجالات البروتين المتفاعل مع الأكسدة والاختزال ، مثل أن التغييرات المطابقة الناتجة عن نشاط الأكسدة والاختزال تُترجم إلى البروتين الفلوري. تم تصميم أحد هذه الوهميات ، المسمى HyPer ، في مختبر سيرجي أ. لوكيانوف [63]. يتكون HyPer من بروتين فلوري أصفر متناوب دائريًا (cpYFP) يتم إدخاله في المجال التنظيمي لـ بدائية النواة H2ا2- استشعار البروتين ، OxyR [64 ، 65]. تم إنشاء HyPer2 ، وهو نسخة محسنة من المسبار ، من خلال طفرة نقطة واحدة A406V من HyPer المقابلة لـ A233V في النوع البري OxyR [64]. على عكس الوهم roGFP-Orp1 ، لا يوجد نقل ثيول- ثاني كبريتيد ، ولكن بدلاً من ذلك ، فإن اثنين من السيستين من OxyR يشكلان رابطة ثنائي كبريتيد قابلة للانعكاس مما يؤدي إلى تغيير تكوين يتم نقله إلى جزء cpYFP [65]. يُظهر HyPer تقاربًا فرعيًا للكرومولار مع بيروكسيد الهيدروجين وقد ثبت أنه غير حساس لمؤكسدات أخرى ، مثل الأكسيد الفائق والجلوتاثيون المؤكسد وأكسيد النيتريك والبيروكسينيتريت.

يمكن أن تستهدف المستشعرات المشفرة وراثيًا مقصورات خلوية محددة عن طريق استخدام تسلسلات الاتجار الخلوي كجزء من الجزيء الخيمري. على سبيل المثال ، يمكن توجيه الببتيدات إلى النواة عن طريق إدخال تكرارات إشارة التوطين النووي (NLS) ، والتي تتكون من متواليات قصيرة من اللايسينات والأرجينينات ذات الشحنة الموجبة المكشوفة على سطح البروتين. يتم التعرف على هذه التسلسلات بواسطة البروتينات الخلوية (importin & alpha و importin & beta) ، والتي تتوسط نقلها إلى نوكلياز. يمكن استخدام تسلسلات مماثلة لتوجيه مستشعرات ROS إلى الميتوكوندريا أو البيروكسيسومات أو السيتوبلازم.

مناقشة

دار الاهتمام بأنواع الأكسجين التفاعلية في الأصل حول علم الأمراض المرتبط بالآثار الضارة للتنفس الهوائي: الشر الضروري الناجم عن التسرب من سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا. في هذا السياق ، شمل البحث الدور الذي لعبته هذه العوامل في الشيخوخة والأمراض المزمنة والسرطان.

ولدت حدود جديدة مع اكتشاف أن اندفاع الأكسدة والانفجار بواسطة الخلايا البلعمية كان في الواقع نتيجة للإنتاج المتعمد لأنواع الأكسجين التفاعلية. كان يُعتقد أن هذا تطبيق محدد للغاية حيث تنتج خلايا معينة ما لا يمكن وصفه إلا بالعوامل السامة من أجل قتل الكائنات الحية الدقيقة الغازية. أظهر المزيد من الأعمال الحديثة أن ROS يتم إنتاجه في جميع أنواع الخلايا ويعمل كمراسلين خلويين مهمين لكل من الاتصالات داخل وخارج الخلايا. من الواضح الآن أن هناك نظامًا تنظيميًا معقدًا للغاية داخل الخلايا يتضمن أنواعًا من أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. تستجيب الخلايا لشقوق ROS بطرق مختلفة اعتمادًا على شدة الإشارة ومدتها وسياقها. فيما يتعلق بالإشارات داخل الخلايا ، يبدو أن بيروكسيد الهيدروجين (H2ا2) هو المرشح الأكثر إثارة للاهتمام ، في حين أن أكسيد النيتريك (& bullNO) متورط بشكل أساسي في الإشارات بين الخلايا.

كانت الكيمياء المستخدمة في البداية للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية تعتمد بشكل أساسي على قياس الامتصاص. تضمنت الأبحاث عمومًا قياس مستويات الجلوتاثيون لتقييم الإجهاد التأكسدي على مستوى الأنسجة أو الجسم كله. مع المستويات الملليمترية من القياسات القائمة على الامتصاص التحليلي حيث تكون أكثر من كافية لتكون مفيدة وكمية. مع اكتشاف استخدام أنواع الأكسجين التفاعلية كمراسلين ومنظمين داخل الخلايا ، تم تطوير كيميائيات جديدة مع وضع متطلبات الكشف الميكرومولار في الاعتبار. تعتمد هذه العوامل بشكل أساسي على الفلورة ، ولكن تم إدخال اكتشافات تعتمد على الإنارة مؤخرًا.

أدى ظهور التحليل القائم على الصور باستخدام مستشعرات الفلورسنت الجزيئية الصغيرة أو المستشعرات المشفرة وراثيًا إلى توفير رؤى جديدة فيما يتعلق ببحوث ROS. يمكن أن يوفر تحليل الصور ليس فقط المعلومات الكمية ، ولكن أيضًا التوطين الخلوي. يمكن تحقيق ذلك من خلال تصميم المراسل أو تحليل الصور.تم تصميم مراسلي ROS الكيميائية أو مستشعرات ROS المشفرة وراثيًا بهياكل كيميائية أو متواليات الببتيد ، على التوالي ، مما يؤدي إلى توطين الكاشف لعضيات خلوية محددة (مثل النواة ، الميتوكوندريا ، الجسيمات الحالة ، إلخ). لذلك يمكن ربط أي تغييرات في الصور مباشرةً بموقع خلوي معين. بدلاً من ذلك ، يمكن أن يتم توطين تغييرات ROS مع المراسلين غير المتخصصين بالعضوية مع البقع غير المرتبطة بـ ROS والمحددة بالموقع. من خلال تراكب الصور الملونة المنفصلة ، يمكن تحديد المواقع الخلوية.

كانت الصعوبة الأكبر التي تم الإبلاغ عنها في الكثير من أبحاث ROS الخلوية هي عدم وجود عوامل مراسلة خاصة بالجزيئات المنفصلة. شقوق ROS بطبيعتها تتفاعل مع عدد من الجزيئات المختلفة ، حيث كان تصميم عوامل المراسلة أمرًا صعبًا. مع وجود كيمياء أكثر تحديدًا ، خاصةً لبيروكسيد الهيدروجين ، سيتم توضيح الآليات المحددة للتنظيم.


مقدمة

في كل من أمراض القلب الخلقية والمكتسبة ، يتضرر عدد كبير من خلايا عضلة القلب وتفقد وظائفها الطبيعية. غالبًا ما تُستخدم الأنسجة والأعضاء المتبرع بها لاستبدال الأنسجة والأعضاء التالفة ، ولكن هناك حاجة إلى الأنسجة والأعضاء القابلة للزرع. في الآونة الأخيرة ، أحد الأساليب السريرية لعلاج أمراض القلب هو إصلاح واستبدال الأنسجة التالفة من خلال حقن الخلايا الجذعية في الدورة الدموية أو زرعها المباشر في أنسجة القلب المصابة لتحسين وظائف القلب والحث على تكوين شعيرات دموية جديدة [1-3]. ومع ذلك ، فقد فشل هذا النهج في إثبات إمكانات كبيرة في التجارب السريرية. تختلف مجموعات الخلايا الجذعية التي تم اختبارها في هذه الدراسات على نطاق واسع ، لأن الخلايا المحقونة يتم غسلها بسرعة عن طريق تدفق الدم وغير قادرة على الاندماج بسهولة مع أنسجة القلب المضيف بعد الزرع [4 ، 5]. علاوة على ذلك ، فإن الحقن المباشر للخلايا في أنسجة القلب أمر خطير بسبب الانسداد المحتمل في مسارات الدورة الدموية ، مما يؤدي إلى المزيد من المضاعفات التي تهدد الحياة مثل عدم انتظام ضربات القلب البطيني [6]. للتغلب على هذه المشاكل ، من الضروري اتباع استراتيجية جديدة للعلاجات القائمة على الخلايا. لذلك ، من المهم تحسين الالتصاق بين الخلايا المزروعة وأنسجة القلب. لتعزيز الالتصاق ، تم تطوير تقنية مبتكرة لهندسة الصفائح الخلوية مع طبق ثقافة مستجيب لدرجة الحرارة من قبل المؤلفين [7 ، 8]. على مدى عشر سنوات ، تم تطبيق صفائح الخلايا التي أعدتها هذه التقنية لإصلاح الأنسجة والأعضاء المختلفة في الدراسات التي أجريت على الحيوانات بالإضافة إلى التجارب السريرية بما في ذلك القرنية [9 ، 10] ، القلب [11-14] ، المريء [15 ، 16] ، اللثة [17 ، 18] ، الكبد [19 ، 20] ، الكلى [21] ، إلخ.

عندما تنخفض درجة حرارة المزرعة من 37 إلى 20 درجة مئوية ، تنفصل صفيحة خلية أحادية الطبقة تلقائيًا عن سطح طبق الثقافة المستجيب لدرجة الحرارة دون استخدام أي إنزيمات محللة للبروتين مثل التربسين للحصاد. تسمح طريقة الاستزراع هذه بالحفاظ على الاتصالات والتفاعلات بين الخلايا وتحافظ على وجود الخلايا التي تفرز وتنظم مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) بما في ذلك بعض الكولاجين واللامينين والفيبرونكتين والفيترونكتين والإيلاستين والبروتينات المتخصصة [22 ، 23]. يوفر ECM الدعم الهيكلي لالتصاق الخلايا وتنظيم الأنسجة. لذلك ، يمكن زرع صفائح الخلايا مباشرة على أنواع مختلفة من الأنسجة والأعضاء دون استخدام أي جهاز ميكانيكي مثل الخياطة. تتفوق هذه الطريقة على الحقن المعلق للخلية المفردة ، كما أن الحفاظ على ECM في صفيحة الخلية ينظم سلوك الخلية من خلال التأثير على بقاء الخلية وشكلها وانتشارها وانتقالها وتمايزها [24]. ECM مهم جدًا للمرحلة المبكرة من تجديد الأنسجة.

في السنوات الأخيرة ، تم التحقق من الخلايا الجذعية السرطانية باعتبارها واحدة من أكثر مصادر الخلايا شيوعًا لتجديد الأنسجة المعقدة والأعضاء الداخلية المكونة من أنواع متعددة من الخلايا [1]. تشير الأبحاث الأولية التي أجريت على الحيوانات إلى أن الخلايا الجذعية الوسيطة المزروعة في أنسجة القلب التالفة يمكن أن يكون لها آثار مفيدة [2]. أفادت نتائج المؤلفين أن الخلايا الجذعية السرطانية المشتقة من الأنسجة الدهنية المزروعة على طبق مستجيب لدرجة الحرارة قادرة على تكوين صفيحة خلوية ، والتي يمكن استخدامها لإصلاح عضلة القلب المحتشمة لدى الفئران [11]. على الرغم من استكشافها في نماذج الفئران والجرذان ، إلا أن التجارب على الحيوانات الصغيرة غير كافية لاستقراء نتائجها على البشر. من الضروري أن يكون هذا التطبيق ممكنًا في النماذج الحيوانية الأكبر مثل الخنازير. ستشجع هذه النتائج على استخدام هذه التقنية للتطبيق السريري لعلاج أمراض القلب البشرية. من المهم أيضًا تحديد الوقت المطلوب حتى تلتصق صفائح الخلايا المزروعة بقوة بأنسجة القلب التالفة أثناء جراحة القلب المفتوح.

في هذه الدراسة ، تمت زراعة صفائح MSCs المشتقة من نخاع عظم الخنازير على أطباق مستجيبة لدرجة الحرارة ، وزُرعت صفائح الخلايا التي تم الحصول عليها في البطين الأيسر للقلب. تم فحص الالتصاق بين ورقة الخلية وأنسجة القلب تشريحياً لتحديد الحد الأدنى من الوقت المطلوب لتحقيق التصاق ناجح. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء عملية الزرع أيضًا إما مع الجانب القاعدي أو الجانب القمي من صفيحة الخلية الملامسة لأنسجة القلب للتحقق من عنصر ECM في ورقة الخلية كان ضروريًا لتحقيق أقصى قدر من الالتصاق. هذه الدراسة هي التقرير الأول الذي يقدم أدلة ومعايير سريرية للزراعة الناجحة لأوراق MSC في عضلة القلب ، والمعلومات التي تم الحصول عليها في هذا العمل هي خطوة حاسمة في تطوير تقنية صفائح الخلايا كعلاج محتمل قائم على الخلايا لأمراض القلب والأوعية الدموية.


معلومات الكاتب

الانتماءات

مركز الخلايا الجذعية والطب التجديدي ، كلية الطب بجامعة تشجيانغ ، هانغتشو ، 310058 ، الصين

شياو بينغ هان ، هايد تشن ، داوشينغ هوانغ ، ليجيانغ فاي و غوجي قوه

معهد أمراض الدم ، أول مستشفى تابع ، كلية الطب بجامعة تشجيانغ ، هانغتشو ، 310003 ، الصين

شياو بينغ هان ، وهو هوانغ ، وأمبير غوجي قوه

مركز الدكتور لي داك سوم و أمبير ييب ييو تشين للخلايا الجذعية والطب التجديدي ، مختبر مقاطعة تشجيانغ الرئيسي لهندسة الأنسجة والطب التجديدي ، هانغتشو ، 310058 ، الصين

قسم الإحصاء الحيوي والبيولوجيا الحاسوبية ، معهد دانا فاربر للسرطان ، كلية هارفارد تشان للصحة العامة ، بوسطن ، ماساتشوستس ، 02115 ، الولايات المتحدة الأمريكية

Huidong Chen & amp Guo-Cheng Yuan

كلية علوم الحيوان ، جامعة تشجيانغ ، هانغتشو ، 310058 ، الصين

قسم علوم وتكنولوجيا الكمبيوتر ، جامعة تونغجي ، شنغهاي ، 201804 ، الصين

كلية علوم الحياة ، جامعة تشجيانغ ، هانغتشو ، 310058 ، الصين

معهد الخلايا الجذعية ، جامعة تشجيانغ ، هانغتشو ، 310058 ، الصين

Xiaoping Han و Daosheng Huang و Lijiang Fei و He Huang & amp Guoji Guo

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

قام XH و HC بتصميم وإجراء تجارب ، بما في ذلك التمايز المكونة للدم و EB. قدم سمو دليل التمايز المكونة للدم. قام كل من HC و DH و HC و LF و CC بتحليل البيانات وإجراء تحليل إحصائي. قام GG و GY بتصميم الدراسة والإشراف عليها وكتب المخطوطة. كل الكتاب قراءة وافقت على المخطوط النهائي.


النتائج

عدم تجانس البيئات المجهرية الوعائية عبر الأعضاء والعمر

لفهم التغيرات المرتبطة بالعمر في البيئات الدقيقة للأنسجة ، اختبرناها

100 جسم مضاد لرسم خرائط للخلايا البطانية (EC) ، و pericyte ، وخلية انسجة ، ومصفوفة لفهم توزيعها على مستوى الأنسجة في عينات مختارة. ثم اخترنا

50 من هذه الأجسام المضادة التي كانت مفيدة للغاية في تحديد البيئات الدقيقة للأوعية الدموية ووسعت التحليل عبر الكلى ، وعضلة الفخذ المستقيمة ، والطحال ، والغدة الصعترية ، والكبد ، والرئة ، والرحم ، والقلب ، والمثانة ، والدماغ ، والجلد ، والأمعاء. تم إنشاء مقاطع طولية سميكة تغطي هذه الأعضاء والأنسجة وتعرضت للوسم المناعي المتعدد عن طريق الاقتران بالأجسام المضادة الأولية (الجدول S1) مع مجموعات الأجسام المضادة الثانوية المثلى ذات العلامات الفلورية. نقدم معلومات كاملة عن ظروف العمل وأنواع الخلايا المميزة بهذه الأجسام المضادة والصور النموذجية لعناصر التحكم السلبية (الجدول S1 والشكل S1A).

تم استخدام علامات EC Endomucin (Emcn) و Endoglin (CD105) و CD31 (PECAM1) و CD102 (ICAM2) لتحليل كثافة الوعاء أيضًا ، وعلامات سطح الخلية الأخرى مثل Tie-2 و Bcam1 و VEGFR2 (مستقبل عامل النمو البطاني الوعائي 2 ) ، و Podocalyxin لتصوير وتحليل الأوعية الدموية. تم استخدام تلطيخ الأكتين (α-SMA) للعضلات الملساء لتقدير حجم الشرايين ، وتم تحديد الخلايا المحيطة بواسطة مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية β (PDGFRβ) والمستضد العصبي / الدبقي 2 (NG2). لتصوير الخلايا الليفية في الأنسجة الشابة وكبار السن ، تم استخدام البروتين الخاص بالأرومة الليفية -1 (FSP1) والأجسام المضادة للبودوبلانين. تم استخدام HSPG2 و Laminin و Collagen IV و Vimentin لتحديد المصفوفة. تم استخدام Desmin و Decorin و PDGFRα و SM22α لتصوير خلايا اللحمة المتوسطة. تم إنشاء عمليات مسح البلاط ثلاثية الأبعاد (3D) للمقاطع على مجهر متحد البؤر مسح بالليزر بدقة خلية واحدة (الشكل 1 ، A و B). أظهرت عمليات مسح البلاط النموذجية من أعضاء مختلفة التنظيم ، وأنماط التعبير ، والتوزيعات المكانية للخلايا اللحمية ، والخلايا اللحمية ، والخلايا اللحمية المتوسطة ، ومكنت من إنشاء خرائط ثلاثية الأبعاد للبيئات الدقيقة الوعائية (الشكل 1 ب). بعد ذلك ، تم إجراء عرض السطح الحسابي على مناطق الاهتمام (ROIs) ، والتي توفر معلومات على مستوى خلية واحدة من الصور ثلاثية الأبعاد لمسح البلاط (الشكل 1C والشكل S1B). علاوة على ذلك ، سمحت هذه الصور عالية الدقة بتحليل التوطين وتفاعلات الخلية الخلوية والمصفوفة الخلوية بدقة خلية واحدة (الشكل 1C والشكل S1B). على سبيل المثال ، تم تسليط الضوء على عدم التجانس الهيكلي للشعيرات الدموية في القشرة مقابل مناطق النخاع من خلال عمليات مسح القرميد للكلية (الشكل 1 ج). كما يتضح من هذه الصور ، كانت الخلايا اللحمية المعبرة عن Desmin موضعية بشكل رئيسي في منطقة النخاع ولكن ليس لقشرة الكلى (الشكل 1C). في المقابل ، كان Podoplanin محصورا في منطقة الكبيبات (الشكل 1C). وبالمثل ، اقتصر تعبير Isolectin على منطقة القشرة (الشكل 1C). تم تطبيق مثل هذا التصوير عالي الدقة لمسح البلاط عبر أعضاء مختلفة من الفئران الصغيرة والشيخوخة للتحقيق في التغييرات التي تعتمد على العمر. أظهرت صور مسح البلاط ثلاثية الأبعاد النموذجية المأخوذة من فئران مستمدة من فئران شابة مقابل فئران مسنة تغيرات تعتمد على العمر (الشكل 1 د). تم الكشف عن عدم التجانس المعتمد على العضو والعمر من خلال تحليل خرائط الأنسجة ثلاثية الأبعاد للعضو بأكمله. يتوفر أكثر من 1000 من خرائط الأنسجة ثلاثية الأبعاد (حوالي 6 تيرابايت من البيانات) كمورد مجاني للتنزيل (الجدول S2) والمزيد من التحليل عبر واجهة الويب OMERO (http://homeros.kennedy.ox.ac.uk/ pub / chen-et-al-2021-3dOrgans).

(أ) رسم تخطيطي للأعضاء التي تم تحليلها في الفئران الشابة والمسنين من النوع البري (WT). تم إجراء تلطيخ متعدد (من ثلاثة إلى خمسة أجسام مضادة) ، وتم الحصول على صور مسح لبلاط العضو بالكامل عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. أكثر من

تم الحصول على 1000 عملية مسح ضوئي أثناء الدراسة مع توفر جميع البيانات الأولية كقاعدة بيانات مشتركة. (ب) صور تمثيلية للعضلات والطحال والقلب والمثانة والأمعاء والجلد والرحم والكبد والغدة الصعترية والرئة من الفئران الصغيرة الملطخة بالأجسام المضادة كما هو محدد. تُظهر الأشكال الداخلية الموجودة على اليمين تكبيرًا عاليًا لمناطق معينة في الأعضاء المختلفة. (ج) صور ثلاثية الأبعاد تمثيلية أحادية الخلية بدقة لفأر شاب ملطخ بـ Desmin و Podoplanin و Isolectin و CD102. تُظهر الأجزاء الداخلية (الوسطى) تكبيرًا عاليًا لمناطق معينة في الكلى. تشير النجمة الموجودة على اليمين إلى نسبة تكبير أعلى مع عرض السطح لجميع العلامات. (د) صور ثلاثية الأبعاد نموذجية للكلى الصغار وكبار السن الذين تمت معالجتهم بمناعة Podocalyxin و SM22α و CD102. تُظهر الأجزاء الداخلية تكبير أعلى مع سطح الأوعية الدموية الذي يتم تقديمه باللون الأزرق حول كريات الكلى (RC). النوى: TO-PRO-3 أو DAPI كما هو محدد. أشرطة مقياس ، (من B إلى D) 200 ميكرومتر لفحص البلاط للعضلات والرحم والمثانة والجلد والأمعاء والغدة الصعترية 400 ميكرومتر للطحال والكلى والقلب والرئة والكبد ، 50 ميكرومتر وصور أحادية الخلية بدقة ، 10 ميكرومتر.

التنظيم ثلاثي الأبعاد المحدد والتوزيع المكاني لأنواع مختلفة من الخلايا الوعائية ، بشكل جماعي مع تفاعلات الخلية الخلوية والمصفوفة الخلوية في بيئتها الطبيعية ، يؤثران ويحددان وظائفهما داخل العضو (13, 14). على سبيل المثال ، يقدم الغدة الصعترية نموذجًا لشيخوخة الأعضاء مع تغييرات ملحوظة مرتبطة بالعمر في التركيب الخلوي وبنية الأنسجة التي تؤدي إلى تقليل حجم الغدة الصعترية وفقدان وظيفتها لدعم نمو الخلايا التائية (15). تحافظ الأوعية الدموية على حالة الأكسجة الإقليمية الخاصة بالأنسجة والبيئات الدقيقة الأيضية في الغدة الصعترية ، والتي تشمل مقصورات ناقصة التأكسج (16). علاوة على ذلك ، فإن الإشارات المشتقة من الأنسجة في الغدة الصعترية تنظم نمو شبكتها الوعائية ، والتي بدورها تحدد الظروف لتطور الخلايا التائية (17, 18). أبرز الفحص الشامل للخرائط ثلاثية الأبعاد للغدة الصعترية من الفئران الصغيرة في قاعدة بيانات صور الغدة الصعترية الاختلافات في تنظيم الشعيرات الدموية وتوزيعها عبر مناطق القشرة المخية والنخاع (الشكل S1 ، C إلى E). أظهر المناعة مع العديد من علامات EC كثافة أعلى للأوعية الدموية في القشرة مقارنة بالنخاع (الشكل S1 و C و D). علاوة على ذلك ، دخلت الفروع الشريانية القشرة واتصلت بالشعيرات الدموية القشرية (الشكل S1C). تماشيًا مع التوزيعات الشعرية والكثافة ، أظهر العامل المناعي المحفز لنقص الأكسجة 1α (HIF1α) أن القشرة كانت مؤكسجة بينما كانت النخاع ناقصة التأكسج (الشكل S1C). ميزة أخرى ملحوظة هي أن اللب وليس القشرة كانت مأهولة بالخلايا اللحمية اللحمية الوسيطة التي تعبر عن SM22α و Desmin والأرومات الليفية التي تم تحديدها من خلال التعبير عن FSP1 و Podoplanin (الشكل S1 و D و E). علاوة على ذلك ، فإن اللب وليس القشرة كانت غنية بالعديد من بروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين الرابع واللامينين والبروتينات المرتبطة بمركب الالتصاق Vimentin و Vinculin (الشكل S1 و D و E). وهكذا ، فإن خرائط الأنسجة ثلاثية الأبعاد أحادية الخلية مع تحليل للعديد من الواسمات قدمت معلومات شاملة عن عدم تجانس المصفوفة الإقليمية خارج الخلية وتوزيعات الخلايا. يتم عرض العديد من خرائط الأوعية الدموية هذه في الجدول S3.

فقدان وفرة الأوعية الدموية و pericyte في شيخوخة الأنسجة في الفئران والبشر

بعد ذلك ، قمنا بتصوير ومقارنة الأعضاء الشابة والشيخوخة على نطاق واسع. أجرينا تحليل الصور للاختلافات الإقليمية ، والتعبير عن علامات الخلية والمصفوفة ، وتوزيع الأوعية الدموية ، وكثافة الأوعية الدموية ، وأقطار الشعيرات الدموية ، وأقطار الشريان ، وأرقام الشرايين (الشكل 2 والتين. S1 ، F إلى H ، و S2 إلى S5). أكد تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (H & ampE) الحالة الصحية للأنسجة المسنة (الشكل S2A). كشف هذا التحليل أن العديد من الأعضاء أظهرت خسارة ملحوظة مرتبطة بالعمر في وفرة الأوعية الدموية (الشكل 2 أ والشكل S2 ، B إلى D). انخفضت أعداد الشرايين كما تم تحديدها بواسطة تلطيخ ألفا-SMA في أعضاء الفئران المسنة بما في ذلك الكلى والطحال والغدة الصعترية والكبد والقلب (الشكل 2 أ والشكل S2 و B و D). بالإضافة إلى ذلك ، انخفضت كثافة الأوعية الدموية الدقيقة في الكلى والعضلات والطحال والغدة الصعترية والكبد والدماغ مع تقدم العمر (الشكل 2 أ والشكل S2B). علاوة على ذلك ، أكد تحليلنا للعديد من علامات EC أن الانخفاض في كثافة الأوعية الدموية لم يكن نتيجة لانخفاض في التعبير عن علامات معينة على سطح الخلية. بالإضافة إلى انخفاض كثافة الأوعية الدموية ، كانت هناك ميزة أخرى ملحوظة وهي فقدان PDGFRβ + pericytes في هذه الأعضاء (الشكل 2 ب والشكل S2C). أظهر التحقيق في التغيرات الوعائية عبر الأنسجة المختلفة مزيدًا من التغيرات المرتبطة بالعمر حسب العمر في الخلايا وعلامات المصفوفة. على سبيل المثال ، أظهر كل من الغدة الصعترية والطحال زيادة في الخلايا التي تعبر عن Desmin عند الشيخوخة (التين. S1G و S4 و C و D و S5B). تضمن التغيير المعماري الأساسي في الكلى انخفاض أعداد الكريات الكلوية وزيادة حجم الكريات الكلوية عند التقدم في السن (الشكل S5A). في المقابل ، من الأعضاء التي تم تقييمها ، الأنسجة ذات القدرة العالية على إعادة التشكيل مثل الجلد والأمعاء والرحم والرئة لم تظهر أي تغيرات واضحة في كثافة الأوعية عند الشيخوخة (الشكل 2C والشكل S5K). وهكذا ، أظهر 9 (الكلى والعضلات والطحال والغدة الصعترية والقلب والكبد والدماغ والمثانة والرئة) من 12 عضوًا استنزافًا للأوعية الدموية مرتبطًا بالعمر ، في حين أن الأعضاء المتبقية - الأمعاء والجلد والرحم - لم تظهر أي عمر- التغيرات الوعائية ذات الصلة (الشكل 2D والتين. S2 و B إلى D و S5K). أظهرت الكلى والعضلات والطحال والغدة الصعترية أبرز التغيرات في كل من فقدان كثافة الأوعية الدموية وفقدان البويضات. لذلك ، بالنسبة للتحليل الجزيئي والوظيفي اللاحق الكامن وراء هذا الاستنزاف الوعائي المعتمد على العمر ، ركزنا على هذه المجموعة الأساسية المكونة من ثلاثة إلى أربعة أعضاء.

(أ و ب) مسح ثلاثي الأبعاد لبلاط تمثيلي للكلى والعضلات والطحال والغدة الصعترية للشباب وكبار السن مع الحفاظ على المناعة كما هو محدد. رؤوس الأسهم تمثل الشرايين. تشير العلامات النجمية إلى إدخالات عالية التكبير تظهر الشعيرات الدموية السطحية. (أ) مخططات التحرير والسرد (يمين) التي توضح كميات كثافة السفينة (ن = 5). (ب) مؤامرات كومبو (أسفل) تظهر كميات PDGFRβ + pericytes في الشباب وكبار السن الكلى والعضلات والطحال (ن = 5) والغدة الصعترية (ن = 6). (ج) تُظهر المؤامرات المجمعة كميات لكثافة الأوعية في الجلد الشاب والمسنين والأمعاء والرحم والرئة (ن = 5). (ديوضح الرسم البياني تسعة أعضاء مع تدهور الأوعية الدموية المرتبط بالعمر وثلاثة أعضاء دون تغيرات وعائية مرتبطة بالعمر. ال ص قيمة مشتقة من ثنائي الطرف غير زوجي ر اختبارات لجميع الرسوم البيانية. ns ، غير مهم ، *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ****ص & lt 0.0001. النوى: DAPI أو TO-PRO-3. في مخطط التحرير والسرد ، يمثل المربع يعني ± SD ، ويمثل الخط الموجود في المربع الوسيط ، بينما يعرض الخطان السفلي والعلوي الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم ، ويمثل الخط الموجود على الجانب الأيمن من المربع توزيع العينة. أشرطة مقياس ، (أ) مسح البلاط من الطحال والكلى ، 400 ميكرومتر للغدة الصعترية والعضلات ، 200 ميكرومتر 50 ميكرومتر لإدخالات (ب) 20 ميكرومتر.

علاوة على ذلك ، لوحظ فقدان الأوعية الدموية على الرغم من الاستطالة المعتمدة على العمر وزيادة حجم ECs في أنسجة الشيخوخة ، كما هو محدد من خلال تحليل المسافة بين نوى ECs المجاورة (الشكل 3A والشكل S5L). أظهر تحليل تكاثر EC عن طريق عمليات فرز الخلايا التي يتم تنشيطها بالفلور (FACS) باستخدام علامة الانتشار Ki67 انخفاضًا يعتمد على العمر في تكاثر ECs (الشكل S6 و A و B).أشار تحليل موت الخلايا المبرمج عن طريق فحص TUNEL القائم على التصوير (الشكل S6C) إلى زيادة في موت الخلايا المبرمج EC في الغدة الصعترية والعضلات ولكن ليس في أنسجة الكلى والطحال ، مما يشير إلى مشاركة آليات خاصة بالأعضاء في تنظيم الأوعية الدموية المعتمدة على العمر خسارة.

(أ) تظهر الصور ثلاثية الأبعاد (على اليسار) الأوعية الدموية في الكلى والعضلات والطحال الصغار (عمر 6 أسابيع) وكلى الفئران (60 أسبوعًا). تُظهر المخططات المجمعة (على اليمين) القياس الكمي للمسافة النووية للمفوضية الأوروبية في الأعضاء الشابة والمسنين (الكلى ، ن = 42 من سبعة عضلات بيولوجية مكررة ، ن = 47 من ثمانية مكررات بيولوجية للطحال ، ن = 37 من سبع مكررات بيولوجية). (ب) صور تمثيلية لأنسجة بشرية صغيرة وكبار السن ملطخة بـ α-SMA و PDGFRβ و Endoglin. تظهر المخططات المجمعة (على اليمين) انخفاضًا كبيرًا في كثافة الأوعية الدموية في الكلى (ن = 5) ، عضلة (ن = 5) والطحال (ن = 4) عند التقدم في العمر. تُظهر المخططات المجمعة (أسفل اليسار) كميات خلايا PDGFRβ في الكلى والعضلات البشرية الشابة وكبار السن (ن = 5). تظهر مؤامرة كومبو (أسفل اليمين) القياس الكمي لتغطية α-SMA (٪) في طحال بشري صغير وكبار السن (ن = 4). (ج) صور تمثيلية لأنسجة جلد الإنسان الشاب والمسنين. مخطط كومبو (يمين) يوضح القياس الكمي لكثافة الوعاء الدموي في بشرة الشباب والمسنين (ن = 4). البيانات تمثل يعني ± SD. ال ص قيمة مشتقة من ثنائي الطرف غير زوجي ر اختبارات لجميع الرسوم البيانية. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ****ص & lt 0.0001. النوى: DAPI أو TO-PRO-3. N، نوى. أشرطة مقياس ، (A) 20 ميكرومتر و 10 ميكرومتر لإدخالات (B و C) 40 ميكرومتر.

تم تحليل تسرب الأوعية الدموية لتقييم تأثير فقدان الحبيبات على سلامة السفينة. لم تلاحظ أي علامات على تسرب الأوعية الدموية في الأنسجة من الفئران البالغة من العمر 55 أسبوعًا (شكل S6D). لتحليل تأثير فقدان كثافة الأوعية الدموية المرتبط بالعمر على حالة أكسجة الأنسجة ، أجرينا تلطيخ البيمونيدازول على أقسام هذه الأعضاء الأربعة - الكلى والعضلات والطحال والغدة الصعترية. في حين أظهرت عضلات الشيخوخة والطحال زيادة في نقص الأكسجة ، فإن الغدة الصعترية والكلى لم تظهر أي تغيرات (الشكل S6E). وبالتالي ، فإن تأثيرات فقدان الأوعية الدموية على نقص الأكسجة كانت خاصة بالأعضاء. بينما كان هناك فقدان مرتبط بالعمر في وفرة الأوعية الدموية ، أظهر تحليل الأوعية اللمفاوية باستخدام LYVE-1 و PROX-1 عدم وجود تغيرات في كثافة الأوعية اللمفاوية (الشكل S7 ، A إلى D). نظرًا لأن LYVE-1 يتم التعبير عنه أيضًا بواسطة الضامة ، فقد تم تمييز الأوعية اللمفاوية على أساس شكلها الأنبوبي. لم تظهر الكميات لأرقام البلاعم بواسطة المناعية CD68 أو F4 / 80 أي تغييرات مع تقدم العمر (الشكل S7E).

لفهم الصلة الفيزيولوجية المرضية للتغيرات المرتبطة بالعمر التي لوحظت في أنسجة الفئران ، قمنا بتحليل عينات الأنسجة البشرية. تم تحليل الأنسجة البشرية السليمة للشباب (& lt20 عامًا) والشيخوخة (& GT70 عامًا) للأفراد (الجدول S4) لفهم التغيرات الوعائية عن طريق إجراء الكيمياء المناعية للعلامات البطانية والسمعية (الشكل 3 ب). بالمقارنة مع أنسجة الفئران ، أظهرت الكلى والعضلات والطحال البشرية المسنة انخفاضًا كبيرًا في كثافة الأوعية الدموية وأعداد الحبيبات (الشكل 3 ب) ، بينما ، على غرار الفئران ، احتفظ الجلد البشري المسن بالأوعية الدموية (الشكل 3 ج). وبالتالي ، فإن الأنسجة التي يتم إعادة تشكيلها بشكل كبير مع إمكانات تجديد عالية مثل الجلد تحتفظ بكثافة الأوعية الدموية أثناء الشيخوخة بينما تظهر الأنسجة الأخرى استنزافًا للأوعية الدموية مرتبطًا بالعمر. أظهر الكبد ، الذي يتمتع بإمكانية تجديد عالية نسبيًا مقارنة بالأعضاء الأخرى مثل الكلى ، انخفاضًا في الأوعية الدموية مرتبطًا بالعمر في الفئران (الشكل S2 و B و D) ، ومع ذلك ، احتفظ الكبد البشري بكثافة الأوعية الدموية عند التقدم في السن (شكل S7F). وهكذا ، أوضحت البيانات المذكورة أعلاه الخسارة الخاصة بالأعضاء في وفرة الأوعية الدموية كميزة رئيسية لشيخوخة الفئران والأنسجة البشرية.

تآكل الأوعية الدموية هو نذير شيخوخة الخلايا

لاستجواب ما إذا كانت التغيرات الوعائية المعتمدة على العمر والتي لوحظت في العديد من الأعضاء هي نتيجة التدهور الخلوي مع التقدم في السن ، قمنا بالتحقيق في النقطة الزمنية التي بدأت فيها هذه التغيرات الوعائية على مستوى الأنسجة بالسيطرة في فترة حياة الفأر. من أجل ذلك ، تم تحليل أعضاء من الفئران في مختلف الفئات العمرية. كان الانخفاض ، في كل من كثافة الأوعية الدموية وأعداد PDGFRβ + pericyte ، واضحًا بالفعل في الفئران البالغة من العمر 30 أسبوعًا (الشكل 4 أ). تراكم الخلايا المتشيخة هو سمة من سمات شيخوخة الأنسجة (19) ، والشيخوخة الخلوية تتميز بتوقف ثابت لدورة الخلية بسبب تقصير التيلومير التدريجي (20) والغاء قمع INK4 / ARF مكان (21). وبالتالي ، قمنا بتحليل أحد أفراد عائلة INK4 ، وهو علامة شيخوخة راسخة ، p16 / CDKN2A ، باستخدام الفئران المراسل CDKN2A luciferase (22). كان التلوين المناعي Luciferase / CDKN2A سلبياً على أقسام الأنسجة من الفئران البالغة من العمر 30 أسبوعًا (الشكل S7G) ، ومع ذلك ، تم اكتشاف تعبير luciferase / CDKN2A في الأنسجة المسنة (الشكل S7G). وبالمثل ، أظهر تحليل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لـ CDKN2A زيادة في مستويات CDKN2A في الفئران البالغة من العمر 55 أسبوعًا أو في الفئران البالغة من العمر 90 أسبوعًا مقارنة بالفئران البالغة من العمر 10 و 30 أسبوعًا (الشكل 4 ب) .

(أ) الرسوم البيانية الشريطية للكلية والعضلات والطحال والغدة الصعترية لكثافة الأوعية الدموية (أعلى ، ن = 5) و PDGFRβ + خلايا (أسفل ، ن = 4 أو 5). (ب) تظهر الرسوم البيانية الشريطية تركيز CDKN2A المقاس بواسطة ELISA في الأنسجة من p16LUC الفئران بعمر 10 و 30 و 55 و 90 أسبوعًا (ن = 5). (ج) مخططات FACS التمثيلية لمنطقة التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل PE-Texas red-A (تمثل خلايا DHE +) في الغدة الصعترية في 10 و 30 أسبوعًا والتحكم الإيجابي (Luperox المعالج). توضح الرسوم البيانية الشريطية القياس الكمي لخلايا DHE + في الأنسجة في مختلف الأعمار (الكلى والطحال ، ن = 5 آخرين ، ن = 4). (د) مخططات FACS التمثيلية لـ MSPCs من الغدة الصعترية في 10 و 30 و 55 أسبوعًا. توضح الرسوم البيانية الشريطية القياس الكمي لـ MSPCs (٪) في الأنسجة في مختلف الأعمار (ن = 5). (ه) صور ثلاثية الأبعاد من الغدة الصعترية من نباتي 2 iΔEC (M) والتحكم في littermate (C) الفئران المناعية كما هو محدد. توضح الرسوم البيانية الشريطية القياسات الكمية لتركيز CDKN2A و MSPCs (٪) وأرقام الخلايا الليفية (ن = 5). البيانات تمثل يعني ± SD. ال ص قيمة مشتقة من ثنائي الطرف غير زوجي ر يتم إجراء الاختبارات لمجموعتين واختبار ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey للمقارنات المتعددة لأكثر من مجموعتين. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ****ص & lt 0.0001. أشرطة مقياس ، (E) 50 ميكرومتر.

تحدد البيانات المختلفة دور أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الشيخوخة ، وتظهر الخلايا المسنة عادةً زيادة في تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يحدث هذا الإنتاج المتزايد لـ ROS بسبب خلل في الميتوكوندريا مع تقدم العمر ، والذي بدوره يؤدي إلى مزيد من تنكس الميتوكوندريا وتلف خلوي عالمي (23). لذلك ، قمنا بتحليل ROS الخلوية في أنسجة الفئران في الفئات العمرية المختلفة (الشكل 4C). تم اكتشاف أنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام مسبار ثنائي هيدرو إيثيديوم الفلورسنت (DHE) ، والذي يتحول إلى الفلورسنت بعد التفاعل مع الأكسيد الفائق وبيروكسيد الهيدروجين في الخلايا الحية (11). أظهر تحليل التدفق الخلوي لـ DHE عدم وجود زيادة كبيرة في تراكم ROS في الأنسجة من الفئران البالغة من العمر 30 أسبوعًا مقارنة بالفئران البالغة من العمر 10 أسابيع (الشكل 4C). تم استخدام Luperox ، وهو أكسيد بيروكسيد عضوي ، كعنصر تحكم إيجابي.

يعد الانخفاض في القدرة التجديدية للأعضاء سمة واضحة لشيخوخة الثدييات الناجم عن التدهور الوظيفي للخلايا الجذعية البالغة في الأنسجة المتعددة بسبب تكاثرها الناقص (24). لتحليل حالة الخلايا الجذعية في الفئران ذات الفئات العمرية المختلفة ، قمنا بتحليل وتحديد الخلايا الجذعية / السلفية اللحمية المتوسطة (MSPCs) لأنها تتواجد في العديد من الأنسجة ولها موقع حول الأوعية الدموية (25). تحليل التدفق الخلوي لـ MSPCs كـ CD45 - / Ter119 - / CD31 - / Sca-1 + / CD140a + (26) لم تظهر أي فروق ذات دلالة إحصائية في تكرار MSPC بين الفئران بعمر 10 و 30 أسبوعًا ، بينما أظهرت الفئران البالغة من العمر 55 و 90 أسبوعًا انخفاضًا في MSPCs (الشكل 4 د). ميزة أخرى للشيخوخة هي وجود التهاب مزمن منخفض الدرجة ، وغالبًا ما يرتبط بزيادة مستويات إنترلوكين 6 (IL-6) و IL-1β (27). أظهر تحليل ELISA لـ IL-6 زيادة مستويات IL-6 في الأنسجة التي تبلغ من العمر 55 أسبوعًا ولكن ليس في وقت مبكر مثل الأنسجة البالغة من العمر 30 أسبوعًا عندما تظهر التغيرات الوعائية (الشكل S7H). أظهرت النتائج المذكورة أعلاه أن فقدان الأوعية الدموية و pericyte حدث في وقت مبكر من عمر الفأر وسبق السمات الخلوية للشيخوخة. يتم توفير التغييرات الوعائية والخلوية الأخرى المرتبطة بالشيخوخة والإجهاد في الجدول S5. لذلك ، لم يكن الاستنزاف الوعائي المرتبط بالعمر نتيجة للتدهور الخلوي المرتبط بالشيخوخة.

بعد ذلك ، قمنا بفحص ما إذا كانت التغيرات الوعائية تؤثر على السمات الخلوية للشيخوخة. تعد إشارات VEGFA-VEGFR2 محركًا حاسمًا لتكوين الأوعية الفسيولوجية والمرضية ، كما أن فقدان VEGFR2 على ECs يمنع تكوين الأوعية الدموية وإعادة تشكيل الأوعية الدموية (28). لذلك ، قمنا بفحص تأثير التداخل مع إشارات VEGFA-VEGFR2. على وجه التحديد ، أنشأنا الفئران الخاصة بفقدان الوظيفة الخاصة بـ EC (نباتي 2 iΔEC) عن طريق الجمع بين أليلات Vegfr2 المحاطة بـ loxP (نباتي 2 loxP / loxP) و Cdh5 (PAC) -CreERT2 المعدلة وراثيًا. بعد إعطاء عقار تاموكسيفين في الفئران البالغة بعمر 8 أسابيع ، تحليل أنسجة الكلية والعضلات والطحال والغدة الصعترية من نباتي 2 تم إجراء الفئران iΔEC في عمر 11 أسبوعًا. تم تأكيد كفاءة الحذف عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) لـ نباتي 2 (الشكل S7I). الأنسجة من نباتي 2 أظهرت الفئران المتحولة iΔEC فقدان الأوعية الدموية و PDGFRβ - معربًا عن الفئران (الشكل 4E والتين. S7J). تم الكشف عن زيادة مستويات CDKN2A في الفئران الطافرة بالمقارنة مع الفئران التحكم في القمامة (الشكل 4E). أشارت هذه النتائج إلى أن تراكم الخلايا المتشيخة مرتبط بفقدان الأوعية الدموية. ومع ذلك ، ظلت مستويات CDKN2A دون تغيير في ECs المصنفة من نباتي 2 الفئران iΔEC مقارنةً بعناصر التحكم في فضلاتهم ، مما يشير إلى أنه بينما يرتبط فقدان الأوعية الدموية بالشيخوخة الخلوية في البيئة الدقيقة للأنسجة ، لا يتم تحفيز ECs نفسها للشيخوخة في هذه الفئران (الشكل S7K). بالإضافة الى، نباتي 2 أظهرت الفئران المتحولة iΔEC انخفاضًا في أعداد MSPC (الشكل 4E) ، ومع ذلك ، كان هناك تراكم من الخلايا الليفية (الشكل 4E). وهكذا ، أظهرت النتائج المذكورة أعلاه أن تدهور الأوعية الدموية أثر على السمات الخلوية للشيخوخة وأدى إلى تدهور خلوي عالمي.

التمايز المعتمد على العمر من pericytes إلى الخلايا الليفية

أظهر تحليل البيئات المجهرية الوعائية عبر أعضاء الفأر زيادة في المناعة المناعية لعلامات الخلايا الليفية عند التقدم في السن ، وهي Podoplanin و FSP1 (2931) (الشكل 5 أ والشكل S8A). بالإضافة إلى ذلك ، فإن نباتي 2 أظهرت الفئران المتحولة iΔEC زيادة كبيرة في أعداد الخلايا الليفية (الشكل 4E). علاوة على ذلك ، أظهر القياس الكمي للخلايا الليفية زيادة كبيرة في الخلايا الليفية الإيجابية لـ FSP1 في أنسجة الشيخوخة (الشكل 5 أ). وبالمثل ، أظهر تحليل وتقدير أعداد الخلايا الليفية ، كما هو محدد في الأنسجة البشرية بناءً على تعبير FSP1 ، زيادة الخلايا الليفية في الأنسجة من متبرعين متقدمين في السن مقارنة بالمتبرعين الصغار (الشكل 5 ب). علاوة على ذلك ، تم زيادة التعبير المتداخل لـ FSP1 و Decorin ، وهو بروتيوجليكان مصفوفة مثبطة لتكوين الأوعية الدموية ، في أنسجة الشيخوخة (الشكل S8B).

(أ) أعداد تلطيخ FSP1 والأرومة الليفية في أنسجة الفئران (ن = 7). (ب) تلوين FSP1 وتقديرات كمية الخلايا الليفية في الأنسجة البشرية (ن = 5). (ج) FSP1 المناعي في PDGFRβ-P2A-CreERT2 ROSA26-td-Tomato الفئران. تشير العلامات النجمية إلى تكبير أعلى للمناطق بدقة خلية واحدة. تُظهر المخططات المجمّعة أرقام خلايا الطماطم + / FSP1 + (ن = 4 أو 5). (د) تلطيخ FSP1 وكميات الطماطم + / FSP1 + أرقام الخلايا في NG2-CreERTM ROSA26-td-Tomato عضلات شابة وكبار السن (ن = 5). (ه) تلطيخ FSP1 في كلية التحكم والتليف وتقديرات تغطية PDGFRβ وأرقام خلايا الطماطم + / FSP1 + (ن = 4). (F) FSP1 المناعية والقراءات على المفاصل الزليليّة من PDGFRβ-P2A-CreERT2 ROSA26-td-Tomato التحكم وفئران RA (ن = 4). (جي) صور ثلاثية الأبعاد لمفاصل الفأر الصغيرة وكبار السن الملطخة بالمناعة كما هو محدد. تظهر المؤامرات المجمعة كثافة الوعاء (ن = 5) و PDGFRβ + أرقام الخلايا (ن = 4). البيانات تمثل يعني ± SD. ال ص القيمة مشتقة من ثنائي الطرف غير زوجي ر الاختبارات. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ***ص & lt 0.001 ****ص & lt 0.0001. تظهر المربعات الصفراء الأشكال الداخلية بتكبير أعلى. تمثل رؤوس الأسهم خلايا الطماطم + / FSP1 +. fm ، عظم الفخذ ، عظم الساق ، الزليل. النوى: DAPI. أشرطة مقياس ، (A و B) 40 ميكرومتر (د) 50 ميكرومتر (C ، E ، و F) مسح البلاط ، 250 ميكرومتر إدراج ، 50 ميكرومتر (G) 50 ميكرومتر.

أظهرت أنسجة الشيخوخة توسعًا في الخلايا الليفية (الشكل 5 ، أ و ب) ولكن انخفاض الخلايا الليفية (الشكلان 2 ب و 4 أ) لذلك ، توقعنا أن فقدان الخلايا الليفية المعتمد على العمر يرجع إلى تمايزها إلى أرومات ليفية. لفحص هذا ، أجرينا تتبع النسب الجينية للنباتات في الفئران الصغيرة والشيخوخة ، حيث إنها طريقة قوية للتحقيق في مصير الخلايا والتمايز (32). تم إجراء حقن تاموكسيفين للصغار (6 أسابيع) وكبار السن (55 أسبوعًا) بدجفرب- كريرت 2 x ROSA26 td-Tomato الجينات المزدوجة (الشكل 5 ج). أدى تحليل الفئران في اليوم 11 بعد تناول عقار تاموكسيفين إلى ظهور الطماطم في البويضات في كل من الفئران الشابة والشيخوخة ، وكما هو متوقع ، مع انخفاض في الفئران المسنة (الشكل 5C والشكل S8C). أظهر المناعة المناعية لـ FSP1 تداخلًا نادرًا أو معدومًا بين الحبيبات الإيجابية للطماطم وتعبير FSP1 في الفئران الصغيرة (الشكل 5 ج) ، ومع ذلك ، أظهرت الفئران المسنة خلايا إيجابية مزدوجة وفيرة مع تعبير الطماطم و FSP1 (الشكل 5 ج). وهكذا ، كانت البويضات هي السلائف للأرومات الليفية التي تعبر عن FSP1 في الفئران المسنة ولكن ليس في الفئران الصغيرة. لقد اختبرنا هذه الفرضية أيضًا باستخدام محفزات وراثية أخرى خاصة بالخلية ، NG2-CreERTM × ROSA26td- طماطم. مرة أخرى ، في اليوم 11 بعد تناول عقار تاموكسيفين ، نادرًا ما تم اكتشاف تعبير FSP1 في الخلايا الإيجابية للطماطم في الفئران الصغيرة (الشكل 5 د) ، ولكن الخلايا الإيجابية المزدوجة (معبرة عن الطماطم و FSP1) كانت وفيرة في الفئران المسنة (الشكل 5 د). 5 د).

تساهم الأرومات الليفية المشتقة من البريسليت في تليف الأعضاء أثناء الشيخوخة والتهاب المفاصل

تساهم الأرومات الليفية غير المكونة للدم والمقيمة في الأنسجة في التسبب في العديد من الأمراض (33) والتليف الناجم عن الإصابة (34). والجدير بالذكر أن تعبير FSP1 يعزز التليف ، وقد ثبت أن الخلايا الليفية الإيجابية لـ FSP1 تقود التليف (31). لذلك ، للتحقيق في تورط الحبيبات أثناء التليف ، قمنا بعد ذلك بتحليل مصير pericytes في الفئران الصغيرة والشيخوخة أثناء التليف الناجم عن الإصابة في الكلى. بدجفرب- كريرت 2 × ROSA26 td-Tomato تم حقن الفئران بسيسبلاتين للحث على تليف الكلى ، وتم تتبع النسب (الشكل 5E والشكل S8D). تم استخدام تلطيخ H & ampE لعرض الحالة الصحية للفئران المعالجة بالسيسبلاتين (الشكل S8E). أظهر تتبع النسب لأنسجة الكلى من الفئران المعالجة والسيسبلاتين زيادة كبيرة في الخلايا الإيجابية المزدوجة للطماطم و FSP1 مقارنة بالأنسجة المأخوذة من فئران التحكم في القمامة (الشكل 5E والشكل S8D). بالإضافة إلى تعبير FSP1 ، فإن جزءًا من هذه الخلايا الليفية الإيجابية للطماطم عبرت أيضًا عن Podoplanin و Vimentin و PDGFRα (الشكل S8F). علاوة على ذلك ، كان تواتر هذه الخلايا الموجبة المزدوجة والطماطم FSP1 أعلى بشكل ملحوظ في الفئران المسنة التي أصيبت بالتليف مقارنة بالفئران الصغيرة المصابة بالتليف (الشكل S8G). وبالتالي ، يتم زيادة تمايز الخلايا الليفية إلى الخلايا الليفية في التليف الناجم عن الإصابة الذي يحدث أثناء الشيخوخة.

بالإضافة إلى التليف ، تساهم الخلايا الليفية في التسبب في الأمراض الالتهابية (35) ، والأرومات الليفية الزليلية ، على وجه الخصوص ، تساهم في تلف والتهاب المفاصل في التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) من خلال اتخاذ النمط الظاهري الغازي المدمر للأنسجة (33, 36). لذلك ، قمنا بعد ذلك بالتحقيق فيما إذا كانت الخلايا الليفية المشتقة من البويضات تساهم في تكاثر الخلايا الليفية والتوسع في التهاب المفاصل. وهكذا ، استخدمنا نموذجًا تجريبيًا لحقن RA zymosan في مفاصل الركبة بدجفرب- كريرت 2 × ROSA26 td-Tomato الفئران للحث على التهاب المفاصل (37) بهدف تتبع الحبيبات في المفاصل الزليليّة. أظهر تتبع النسب في خط الماوس هذا زيادة كبيرة في خلايا الطماطم و FSP1 المزدوجة الإيجابية في المفاصل المصابة بالتهاب المفاصل ولكن ليس في مفاصل التحكم (الشكل 5F). وهكذا ، كانت البويضات مصدرًا للأرومات الليفية في التهاب المفاصل الالتهابي التجريبي. علاوة على ذلك ، أظهرت مقارنة بين أنسجة المفصل الزليلي الشابة مقابل الشيخوخة زيادة في الخلايا الليفية مع انخفاض في الخلايا والأوعية الدموية في الفئران المسنة مقارنة بالفئران الصغيرة (الشكل 5G والشكل S8H). أشارت البيانات المذكورة أعلاه معًا إلى أن تمايز الأرومة الليفية المحيطة بالخلية كانت سمة بارزة لحالتين من الأمراض الالتهابية ، حيث تساهم الأرومات الليفية بطرق مختلفة.

التنظيم السفلي لمسارات صيانة الأوعية الدموية والسمك في ECs الشيخوخة

لتحديد الوسطاء الجزيئي الذين يقودون التغيرات المرتبطة بالعمر وفقدان الأوعية الدموية ، تم إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) للشبان المنقى مقابل الشيخوخة من أنسجة الغدة الصعترية (الشكل 6 أ). تم تحليل أنسجة الغدة الصعترية هنا ، حيث من المعروف أنها تخضع لتغيرات ملحوظة مع تقدم العمر. تمت معالجة الزعتر الفأر الصغير والشيخوخة للحصول على معلقات وحيدة الخلية. تم عزل ECs من هذه الأعضاء بواسطة طريقة الفصل القائمة على حبة مغناطيسية باستخدام الجسم المضاد المضاد لـ Endomucin وخضعت لتحليل RNA-seq. أشار تحليل التجميع غير الخاضع للإشراف إلى ملامح مميزة لل ECs بين الفئران الشابة والشيخوخة (الشكل 6 أ). تم تحديد mRNAs المنظم تفاضليًا على ECs من فئران الشيخوخة مع EC من الفئران الصغيرة كعينات مرجعية. تم الحصول على الجينات المعبر عنها تفاضليًا بشكل كبير مع معدل قطع الاكتشاف الخاطئ (FDR) المعدل ص تم ضبط قيمة & lt0.01 491 جينًا في الغدة الصعترية ، بينما تم تنظيم 503 جينًا منخفض التنظيم (الشكل 6 أ). أجرينا إثراء مجموعة الجينات لتحليل المسار (GAGE) باستخدام قاعدة بيانات KEGG (موسوعة كيوتو للجينات والجينوم). تم ترشيح المسارات الهامة بـ a ف قيمة & lt 0.1. أظهرت ECs المتقادمة تنظيمًا منخفضًا لإشارات الشق (الشكل 6 أ). ينظم Notch و ligand Dll4 تكوين الأوعية بطريقة خاصة بالأنسجة. في العديد من الأنسجة ، يعتبر Notch منظمًا سلبيًا لتكوين الأوعية الدموية ، ولكن في نظام الهيكل العظمي ، فهو منظم إيجابي لتكوين الأوعية (38). لذلك ، أجرينا بعد ذلك استهدافًا محرضًا لـ دلل 4 الجين. تحليل أنسجة الغدة الصعترية في دلل 4 أظهرت طفرات iΔEC (عمرها 11 أسبوعًا) فقدانًا للأوعية الدموية ، وانخفاض في الخلايا الحبيبية ، وزيادة في الخلايا الليفية (الشكل 6 أ والتين. S9A). على النقيض من ذلك ، فإن اكتساب وظيفة الشق الخاص بـ EC Fbxw7 أناأظهرت الفئران ΔEC (11 أسبوعا) زيادة في الأوعية الدموية و pericytes وانخفاض في أعداد الخلايا الليفية (الشكل 6 أ والتين. S9A). تشير هذه النتائج إلى أن فقدان إشارات الشق المرتبط بالعمر أدى إلى حدوث انحرافات الأوعية الدموية وحول الأوعية الدموية العالمية. علاوة على ذلك ، تتغير الأوعية الدموية في دلل 4 أدت طفرات iΔEC إلى انخفاض هائل في أسلاف الخلايا التائية واضطراب تطور ظهارة الغدة الصعترية ، مما أثر سلبًا على البيئة الدقيقة للغدة الصعترية ووظيفتها (الشكل S9 ، B إلى E).تشير هذه النتائج إلى أن فقدان الأوعية الدموية المرتبط بالعمر كان مرتبطًا سببيًا بانخفاض إنتاج الغدة الصعترية للخلايا التائية الناضجة (39, 40).

(أ) خريطة الحرارة (يسار) تُظهر مستويات تعبير RNA-seq للجينات المعبر عنها تفاضليًا بين الشباب (من 8 إلى 10 أسابيع من العمر) والعمر (من 50 إلى 55 أسبوعًا) من الغدة الصعترية (تعديل FDR ص القيمة المقطوعة من & lt0.01). تمثل شدة اللون الصف سجل المقياس المحجّم2(CPM) ، بينما يمثل العمود التكرارات. تشير شدة اللون الأحمر والأزرق إلى جينات منظمة ومتدنية. يُظهر الجزء السفلي الأيسر أهم العمليات البيولوجية المنظمة التي تم الحصول عليها من تخصيب مجموعة الجينات. تُظهر الصور ثلاثية الأبعاد التلوين المناعي PDGFRβ و FSP1 بتنسيق دلل 4 iΔEC و littermate السيطرة على الغدة الصعترية وكذلك Fbxw7 iΔEC والتحكم في الغدة الصعترية (11 أسبوعًا). تعرض المؤامرات المجمعة أرقام الخلايا الليفية (ن = 4). (بتُظهر خرائط الحرارة مستويات تعبير RNA-seq للجينات المعبر عنها تفاضليًا بين الشباب (من 8 إلى 10 أسابيع من العمر) وكبار السن (من 50 إلى 55 أسبوعًا) الطحال والكلى. يُظهر الجزء السفلي أهم شروط GO للمسارات الخاضعة للتنظيم السفلي. (ج) مخطط فين للعمليات البيولوجية التي تم الحصول عليها من تحليل إثراء مجموعة الجينات الذي يمثل المسارات المنظمة من الكلى والطحال والغدة الصعترية. (دتُظهر خرائط الحرارة مستويات تعبير RNA-seq للجينات المعبر عنها تفاضليًا بين الشباب (Y) وكبار السن (A) الجلد والأمعاء. يُظهر الجزء السفلي شروط GO الخاصة بالمسارات الخاضعة للتنظيم السفلي. البيانات تمثل يعني ± SD. ال ص القيمة مشتقة من ثنائي الطرف غير زوجي ر الاختبارات. **ص & لتر 0.01. النوى: DAPI. أشرطة مقياس ، (أ) 50 ميكرومتر. ECM ، مصفوفة خارج الخلية.

بعد ذلك ، للتحقيق فيما إذا كان هذا التنظيم النازل لإشارات الشق البطاني مع التقدم في السن ميزة شائعة عبر أنسجة متعددة ، أجرينا تحليل RNA-seq للمكونات الأوروبية من أنسجة الطحال والكلى المستمدة من الشباب (من 8 إلى 10 أسابيع من العمر. ) وشيخوخة الفئران (من 50 إلى 55 أسبوعًا). تم اتباع نهج تحليلي مماثل ، كما هو موضح أعلاه للغدة الصعترية. تم تنظيم ما مجموعه 1397 جينًا في الكلى و 537 في الطحال ، بينما تم تنظيم 1286 جينًا في الكلى و 341 في الطحال عند التقدم في السن (الشكل 6 ب والشكل S10 و A و B). كما كان من قبل ، أجرينا GAGE ​​باستخدام قاعدة بيانات KEGG في ECs المتقادم. تم ترشيح المسارات الهامة بـ a ف قيمة & lt 0.1. أظهرت المسارات التي يتم تنظيمها من أعلى إلى أسفل في كلا الجهازين تنظيمًا سفليًا للمسارات المعروفة بأهميتها لصيانة الأوعية الدموية والحيوية وإعادة تشكيلها (الشكل 6 ب). ومع ذلك ، لم يتم تغيير إشارات الشق عند الشيخوخة في هذه الأنسجة (الشكل 6 ب). أظهر التعبير الجيني التفاضلي في الكلى تنظيمًا سفليًا لمسارات إشارات Hippo و Wnt ، وهي ضرورية لتكوين الأوعية الدموية وصيانة الأوعية الدموية (الشكل 6 ب) (41, 42). في الطحال ، أظهرت ECs الشيخوخة تنظيمًا هبوطيًا لمسارات التمثيل الغذائي ، بما في ذلك إشارات HIF1α (الشكل 6 ب) (43) ، وكذلك اتصال مفرق الفجوة (44) كان خاضعًا للتنظيم (الشكل 6 ب). تشير هذه النتائج إلى أن التغييرات المتعددة التي تعتمد على العمر في مسارات صيانة الأوعية الدموية المعروفة تتقارب مع فقدان الأوعية الدموية في الأنسجة المختلفة. لقد استجوبنا أيضًا بصمة الشيخوخة المشتركة للمفوضية الأوروبية بين هذه الأنسجة الثلاثة التي تم تحليلها: الغدة الصعترية والطحال والكلى. أظهرت شيخوخة ECs من هذه الأنسجة 84 جينًا شائعًا منظمًا وحددت التنظيم الأعلى لتفاعل مستقبلات السيتوكين والسيتوكين واستقلاب الكائنات الحيوية بواسطة السيتوكروم 450 بواسطة تحليل GAGE ​​، مما يشير إلى الطبيعة المسببة للالتهابات للشيخوخة ECs بين هذه الأنسجة (الشكل 6C و الشكل S10 ، C إلى E). يتم توفير شروط GO (علم الوجود الجيني) للمسار المنظم والمنظم من الكلى والطحال والغدة الصعترية في الجدول S6. ثم قمنا بمقارنة ECs الشابة والشيخوخة من الأمعاء والجلد ، حيث احتفظت هذه الأنسجة بكثافة الأوعية الدموية عند الشيخوخة. تمت معالجة أمعاء الفئران الصغيرة والشيخوخة والجلد للحصول على معلقات أحادية الخلية وخضعت لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي كما تم إجراؤه في الغدة الصعترية والطحال والكلى. لم يتم تحديد جينات ومسارات شائعة منظمة أو خاضعة للتنظيم بين جميع الأنسجة الخمسة: الأمعاء والجلد والغدة الصعترية والطحال والكلى (الشكل 6D والشكل S10F). على عكس تلك الموجودة في الغدة الصعترية والطحال والكلى ، تفتقر ECs الشيخوخة من الأمعاء والجلد إلى التنظيم الأعلى لمسار تفاعل مستقبلات السيتوكين والسيتوكين ، مما يشير إلى عدم وجود الطبيعة المسببة للالتهابات لهذه ECs (الجدولان S7 و S8). وبالتالي ، فإن العامل المميز الرئيسي بين ECs من الأنسجة الذي يدل على فقدان الأوعية الدموية مقابل الأنسجة التي تحتفظ بالأوعية الدموية هو زيادة تنظيم العمليات الالتهابية في ECs المشتقة من الأنسجة مع فقدان الأوعية الدموية. تشير هذه النتائج إلى أن ECs في الأنسجة التي أعيد تشكيلها بشكل كبير والتي تحتفظ بوفرة الأوعية والخلية ربما تكون قد تطورت مع آليات وقائية للوقاية من الشيخوخة الالتهابية والأضرار الالتهابية المرتبطة بها التي تحدث أثناء الشيخوخة.


نقاش

في هذه الدراسة ، حددنا PSF كبروتين تفاعلي Fox-3 وأظهرنا أن هذا التفاعل ضروري لـ Fox-3 لتنشيط الربط البديل الخاص بالخلايا العصبية لـ N30 exon لـ NMHC II-B. قمنا أيضًا بمقارنة نمط تعبير Fox-3 بنمط Fox-1 و 2 على المستوى الخلوي في الجهاز العصبي المركزي للماوس ووجدنا ارتباطًا بين تعبير Fox-3 وربط N30.

أبلغ مختبرين عن توزيع الأنسجة والتوطين الخلوي لـ Fox-1 في الجهاز العصبي للثدييات (24 ، 29). على الرغم من أنهم اتفقوا على أن Fox-1 يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية ، إلا أن هناك تناقضًا حول ما إذا كان يتم توطينه في النواة أو السيتوبلازم. تتفق ملاحظاتنا إلى حد كبير مع ملاحظات بلاك وزملائه بأن Fox-1 يوضع في الغالب في النوى. ومع ذلك ، اكتشفنا أيضًا Fox-1 في سوما ونواة الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي. قد ترجع الاختلافات في الملاحظات النسيجية جزئيًا إلى الاختلافات في عمر الحيوانات وأنواعها ، والاختلافات في طرق تثبيت الأنسجة واسترجاع المستضد والاختلافات في الحلقات التي تم التعرف عليها بواسطة Abs. من المثير للاهتمام ، تم الإبلاغ عن أن التغيير الناجم عن إزالة الاستقطاب في الشكل الإسوي Fox-1 ينتج عنه تغيير في النسبة النووية السيتوبلازمية لـ Fox-1 (32). لقد أبلغنا أيضًا سابقًا أن الأشكال الإسوية المختلفة لـ Fox-1 تُظهر مواقع خلوية مختلفة عندما يتم التعبير عنها خارجيًا في الخلايا المستنبتة (23). لذلك ، قد يكون من الضروري تحديد الشكل الإسوي لـ Fox-1 السائد في كل نظام معين.

أظهر تحليلنا المناعي المشترك و FACS متبوعًا بالخلايا المناعية أن بعض الخلايا العصبية التي تعبر عن Fox-1 أو 2 لا تعبر عن Fox-3. وتجدر الإشارة إلى أن مستويات التعبير عن Fox-3 ، وليس Fox-1 أو 2 ، ترتبط بأنماط التضفير N30 في المخيخ وجذع الدماغ والحبل الشوكي. استخدمت معظم الدراسات السابقة حول التضفير البديل الخاص بالدماغ الدماغ بالكامل أو أجزاء من الدماغ قابلة للتشريح تشريحًا. استخدمنا FACS لفصل الخلايا وفقًا لمستويات التعبير عن Fox-3. قادنا مزيج من فرز الخلايا والتحليل الكيميائي الحيوي إلى إيجاد أنماط ربط مختلفة بين مجموعات الخلايا الإيجابية والسلبية لـ Fox-3. على الرغم من ملاحظتنا السابقة أن التعبير الخارجي عن Fox-1 أو 2 يعزز إدراج N30 في الخلايا المستنبتة (23) ، فإن خلايا الدماغ التي تعبر عن Fox-1 و / أو Fox-2 ولكن ليس Fox-3 لا تنشط التضفير N30. يمكن تفسير ذلك جزئيًا من خلال ما يلي. نظرًا لأن متوسط ​​مستوى التعبير عن Fox-1 أو 2 متشابه بين الخلايا الإيجابية والسلبية لـ Fox-3 في المخيخ وجذع الدماغ والحبل الشوكي ، فإن التعبير الإضافي عن Fox-3 يزيد ببساطة من الكميات الإجمالية لجميع بروتينات Fox الثلاثة. سبب آخر قد يكون مرتبطًا بالأشكال الإسوية لـ Fox-1 و 2. تولد جينات Fox-1 و 2 العديد من الأشكال الإسوية المقسمة بدلاً من ذلك. تؤدي الاختلافات في تسلسل الأحماض الأمينية في المنطقة الطرفية C إلى اختلافات كبيرة في نشاط الربط تجاه N30 (23). لا تميز دراستنا حاليًا الاختلافات في الأحماض الأمينية C- الطرفية ، حيث تم إنشاء Anti-Fox-1 ضد المنطقة الطرفية N المشتركة مع الأشكال الإسوية Fox-1 وينطبق الشيء نفسه على anti-Fox-2. لذلك ، قد تعبر الخلايا السلبية لـ Fox-3 عن الأشكال الإسوية Fox-1 و / أو Fox-2 مع أنشطة الربط الأقل. قد يكون السبب الثالث هو الاختلاف في التقارب لتفاعل البروتين (البروتينات). تم الإبلاغ عن عدد من البروتينات بما في ذلك ataxin-1 و 2 و atrophin-1 و quaking و Fyn tyrosine kinase ومستقبلات هرمون الاستروجين α للتفاعل مع Fox-1 أو Fox-2 في الثدييات (29 ، 44-46). ومع ذلك ، فإن معظم هذه البروتينات لم يتم توصيفها وظيفيًا في سياق التضفير السابق للـ mRNA. من الأمور ذات الأهمية الخاصة تقرير يوضح تفاعل مكون U1 snRNP ، بروتين U1C ، مع Fox-1 و 2 في فحص الخميرة ثنائي الهجين (47) ، على الرغم من عدم دراسة النتيجة الوظيفية لهذا التفاعل. في هذه الدراسة ، حددنا PSF باعتباره بروتينًا تفاعليًا أساسيًا لـ Fox-3 لتنشيط الربط N30. على الرغم من أننا قارنا الأشكال الإسوية لـ Fox-1 و 2 والتي تظهر أعلى تشابه في التسلسل مع Fox-3 وأعلى نشاط للربط N30 بين الأشكال الإسوية المعروفة ، فإن PSF يرتبط بـ Fox-3 بشكل أكثر كفاءة مقارنةً بـ Fox-1 و 2. لذلك قد يفسر هذا سبب كون Fox-3 أكثر نشاطًا في تضمين N30. يشير هذا الاختلاف في التقارب أيضًا إلى أن Fox-3 قد يلعب دورًا في تحديد الخصوصية العصبية للربط البديل. ومع ذلك ، لا تزال الاختلافات في تقارب PSF لبروتينات Fox بحاجة إلى الدراسة بمزيد من التفصيل من الناحية الكيميائية الحيوية وتقييمها بشكل أكثر دقة في السياق الخلوي.

على الرغم من أننا وجدنا علاقة جيدة بين مستوى تعبير Fox-3 ومدى الربط N30 ، إلا أن هذه الدراسة لا تستبعد مساهمة محتملة من Fox-1 و 2 إلى N30 splicing. تم الإبلاغ عن أن Fox-1 و 2 يتفاعلان مع بعضهما البعض باستخدام نظام الخميرة ثنائي الهجين (46). اكتشف مختبرنا أيضًا تفاعل Fox-2 مع Fox-3 باستخدام نظام الخميرة ثنائي الهجين بالإضافة إلى تفاعل Fox-3 مع Fox-1 ومع Fox-2 عن طريق الترسيب المناعي المشترك (ملاحظات غير منشورة). في الواقع ، نادرًا ما نلاحظ الخلايا العصبية التي تعبر عن Fox-3 فقط. لم يكن من غير المتوقع أن نجد أن Fox-1 مترجمة في الغالب إلى نوى في دماغ سليم ، نظرًا لأن جميع الأشكال الإسوية Fox-1 التي قمنا بتحليلها كانت موزعة بشكل منتشر في كل من النوى والسيتوبلازم أو تم توطينها في الغالب في السيتوبلازم عندما تم التعبير عنها خارجيًا في الخلايا المستنبتة. (23). على النقيض من ذلك ، فإن الأشكال الإسوية Fox-3 المعبر عنها خارجيًا توضع بشكل حصري تقريبًا في النوى في الخلايا المستزرعة (الشكل التكميلي S1D). الأشكال الإسوية Fox-2 التي قمنا بتحليلها توطين في الغالب إلى النوى (23). تثير هذه الملاحظات احتمال أن يتناقص Fox-1 مع Fox-3 أو Fox-2 ويتحول إلى نوى في الجسم الحي . قد تعمل بروتينات فوكس كمقاسات غير متجانسة أو مغاير مغايرة ، خاصةً عندما يحتوي pre-mRNA على عناصر UGCAUG متعددة. لا يزال هناك حاجة إلى تحديد ما إذا كان هناك اختلاف في نشاط التضفير بين المتجانسين وغير المتجانسين.

يمكن لبروتينات الثعلب أن تعمل كمنشّطات أو مثبطات اعتمادًا على موقع ارتباطها على ما قبل الرنا المرسال بالنسبة للإكسونات المنظمة. اقترحت الدراسات الحديثة على مستوى الجينوم جنبًا إلى جنب مع الدراسات السابقة باستخدام أنظمة نموذجية قاعدة عامة لبروتينات فوكس للتأثير على اختيار الإكسونات (8 ، 20). عندما ترتبط بروتينات Fox بمجرى intron في اتجاه exon البديل ، يحدث تضمين exon. من ناحية أخرى ، عندما ترتبط بروتينات Fox مع intron في أعلى تيار exon البديل ، يحدث تخطي exon. في الآونة الأخيرة ، بدأت بعض التقارير في معالجة الآلية التي تقوم بها بروتينات فوكس بقمع أو تنشيط استخدام الإكسونات البديلة. باستخدام F1γ pre-mRNA ، ثبت أن Fox-1 الذي تم تجنيده في intron المنبع يمنع تكوين معقد pre-spliceosome المبكر على intron في اتجاه مجرى exon المنظم (48). في حالة calcitonin / CGRP pre-mRNA ، فإن Fox-2 المرتبط بإنترون المنبع يمنع توظيف SF1 في موقع الفرع ، علاوة على ذلك ، فإن Fox-2 المرتبط بـ exon البديل يمنع توظيف U2AF في موقع لصق 3 (27). تم الإبلاغ عن تفاعل بروتينات Fox (FOX-1 و ASD-1) مع بروتين آخر مرتبط بالحمض النووي الريبي SUP-12 خاص بالتسلسل ، والذي يتم التعبير عنه على وجه التحديد في العضلات ، في C. ايليجانس . يعزز تفاعل FOX-1 (أو ASD-1) و SUP-12 ارتباطهما بعناصر RNA المستهدفة المجاورة على egl-15 pre-mRNA ويؤدي إلى تضمين exon محدد للعضلة بشكل متبادل. يقدم هذا التقرير آلية لخصوصية الأنسجة الصارمة للربط البديل الخاضع للتنظيم من قبل Fox (49).

حددنا في هذه الدراسة مركب PSF و PSF – NonO كبروتينات تتفاعل مع Fox-3. غالبًا ما يُطلق على تقويم العظام البشري لـ NonO اسم p54nrb. PSF و NonO عبارة عن بروتينات مرتبطة هيكليًا تحتوي على اثنين من RRM ويمكنهما الارتباط بـ RNA وكذلك DNA (40). يتفاعل PSF و NonO مع بعضهما البعض لتشكيل مغاير مغاير وقد تم الإبلاغ عن مشاركة PSF أو مجمع PSF-NonO في العديد من جوانب الوظيفة النووية بما في ذلك النسخ ، وإنهاء النسخ ، وربط ما قبل mRNA ، و 3 ′ معالجة نهائية لـ mRNA و RNA الاحتفاظ (40 ، 50 ، 51). يتم التعبير عن PSF و NonO في أنواع مختلفة من الأنسجة والخلايا. لقد أوضحنا أن المنطقة الطرفية C من Fox-3 ترتبط مباشرة بالمنطقة الطرفية N في PSF ، وأن Fox-3 و NonO يتفاعلان بشكل غير مباشر عبر PSF. يعزز PSF ارتباط Fox-3 بعنصر UGCAUG المستهدف في ملف في المختبر فحص التشابك. علاوة على ذلك ، فإن وجود PSF يعزز توظيف Fox-3 في IDDE لنسخة NMHC II-B ، والتي تحتوي على عناصر UGCAUG ، في الخلايا السليمة. يظهر تأثير PSF على ارتباط Fox-3 بعنصر الحمض النووي الريبي المستهدف في الخلايا السليمة على ما يبدو درجة أكبر من التعزيز (& gt30 أضعاف) من في المختبر (من 2 إلى 3 أضعاف). قد يكون هذا الاختلاف بسبب الكفاءات المختلفة لتشكيل معقد Fox-3 و PSF بينهما في المختبر والخلايا السليمة. الاحتمال الآخر هو أن PSF و Fox-3 قد يتم تجنيدهما بشكل مشترك في مواقع Fox-3 المستهدفة لـ pre-mRNAs. تم الإبلاغ عن ارتباط PSF و NonO ببوليميراز الحمض النووي الريبي الفسفوري II في مجمع كبير يحتوي على عوامل استطالة النسخ (52 ، 53). إذا تم تضمين Fox-3 في هذا المجمع عبر PSF ، فيمكن تجنيد Fox-3 بشكل أكثر كفاءة لاستهداف مواقع ما قبل mRNAs أثناء استطالة النسخ ، مقارنةً بالانتشار البسيط في النواة.

على الرغم من أننا أظهرنا أن ارتباط Fox-3 بعنصر الحمض النووي الريبي المستهدف قد تم تعزيزه بواسطة PSF ، إلا أن دور PSF في التنشيط المعتمد على Fox-3 للربط البديل قد لا يقتصر على هذا التأثير. تم العثور على PSF في الأصل كبروتين مرتبط بالجبن (54). أظهر عدد من الدراسات وجود PSF في الجسيم القبلي وفي الجسيم الملصق في مراحل مختلفة وفي المجمعات التي تحتوي على snRNPs (55). تم الإبلاغ أيضًا عن تفاعل PSF مباشرة مع U5 snRNA ومع موقع لصق 5 في ظل ظروف الربط (42 ، 53). لذلك قد يعمل PSF كوسيط بين ما قبل mRNA المرتبط بـ Fox-3 وآلة الربط. يتم دعم هذه الفكرة من خلال ملاحظتنا أن PSF لا يرتبط مباشرة بـ IDDE أو بـ pre-mRNA من NMHC II-B minigene في غياب العوامل النووية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يعد كل من Fox-3 (أو بروتينات Fox-أخرى) و PSF ضروريين للتفعيل المعتمد على UGCAUG لتوصيل N30. في ظل وجود PSF و Fox-2 داخليًا ، ينشط Fox-3 الخارجي التضفير N30 إلى حد ما كما يفعل PSF الخارجي. يبدو أن هذه التأثيرات الخارجية لـ Fox-3 و PSF مضافة. عندما يتم التخلص من Fox-2 أو PSF الداخلي ، لا يمكن لـ Fox-3 أو PSF الخارجي تنشيط التضفير N30. يعتمد التأثير المعزز لـ PSF على الربط N30 على عنصر UGCAUG ، على الرغم من أنه لا يرتبط بهذا العنصر ، ويعتمد تمامًا على وجود Fox-3 (أو بروتينات Fox الأخرى). التأثير المعزز لـ Fox-3 على الربط N30 يعتمد بشكل مطلق على وجود PSF. وبالتالي ، فإن تأثيرات البروتينين ليست في الواقع مضافة ، بل تعاونية. يبدو أن PSF يعمل كمنشط أو وسيط لـ Fox-3 أثناء عملية الربط. أبسط نموذج لاستيعاب جميع البيانات هو أن PSF أو الجسور المعقدة المحتوية على PSF Fox-3 وآلية الربط. على الرغم من أن الآلية الجزيئية التفصيلية للتعرف على N30 exon بعد تفاعل Fox-3 و PSF لا يزال يتعين توضيحها ، فقد تبين الآن أن هذا التفاعل جزء لا يتجزأ من الآلية المسؤولة عن التنشيط المنظم لبروتين Fox لإدراج exon البديل عبر intronic المتجه نحو المصب. محسن.


شاهد الفيديو: 11- Flow cytometry FCM - قياس التدفق الخلوي (يونيو 2022).