معلومة

حساب سطوع GFP

حساب سطوع GFP


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذن هذا السؤال هو جزء من الرياضيات ، وجزء بيولوجي ، لكني أسأل عن جزء علم الأحياء هنا (أو ربما جزء الكيمياء). أنا أسأل بشكل أساسي عن محاولتي لحساب السطوع المحتمل لكل وحدة كتلة من GFP ، وأسأل ما إذا كان ذلك منطقيًا. هذا ما فعلته: (أنا أتجاهل العائد الكمي الذي يجب أن يكون 0.8):

الكتلة المولية GFP = 27000 amus (27 كيلو دالتون)

1 مول يزن 27 كجم

لذلك 1 جرام = (6.02 * 10 ^ 23) / 27000 = 2 * 10 ^ 19 جزيء من GFP

الافتراض الذي أسأل عنه ؛ أفترض في هذا الحساب أن GFP يطلق الضوء من إلكترون واحد متحمس (حوالي 2.5 إلكترون فولت). كم عدد الإلكترونات متحمسة في مضان GFP؟

(2 * 10 ^ 19) / (6 * 10 ^ 18) ، (عدد الإلكترونات في كولوم / أمبير) = 3.3 أمبير

السطوع = 2.5 * 3.3 = 8.25 جول للجرام

من Researchgate: "إن ثابت الوقت للعملية الكيميائية السريعة المعتمدة على الأس الهيدروجيني يتناقص مع الرقم الهيدروجيني من 300 ميكروثانية عند الرقم الهيدروجيني 7 إلى 45 ميكروثانية عند الرقم الهيدروجيني 5 ..." نظرًا لأن هذا هو الحال ، فهذا ما يقرب من 3000 انبعاثات (أو 3333) في الثانية (عند 7 Ph) ، لذلك فإن 1 جرام من GFP سيكون سطوعه الأقصى 24750 واط ، إذا كان هناك ما يكفي من ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، أو 25 وات للمليغرام.
هذا يبدو معقولاً ، على الرغم من ارتفاعه. هل هذا منطقي ، أو أي جزء من هذا الحساب كان خاطئًا؟


القياس الكمي للبروتين الفلوري الأخضر في الصفائح الدقيقة

يعد تقييم التعبير الجيني أداة مهمة في علم الأحياء الجزيئي والخلوي. تم تطوير العديد من الطرق ، ولكن معظمها لا يستطيع توفير معلومات في الوقت الحقيقي فيما يتعلق بالتعبير. نحن هنا نبلغ عن التقدير الكمي للمستخلصات الخلوية من الخلايا التي تعبر عن الجين الخاص بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) باستخدام FL600 Fluorescent Microplate Reader من أجل إثبات جدوى GFP لتقييم التعبير الجيني والوقت الحقيقي.

مقدمة

أصبح تقييم التعبير الجيني أحد أكثر الأدوات استخدامًا في علم الأحياء الجزيئي والخلوي اليوم. يسمح التعبير عن تسلسل الحمض النووي المستنسخ بشكل عابر و / أو دائم للباحث بتحديد نشاط النسخ للمروجين. لسوء الحظ ، في معظم الحالات لا يمكن تقييم المنتج الطبيعي للمروج بطريقة كمية. في الماضي ، كان المحفز ينضم إلى جين المراسل الذي يشفر بروتينًا له نشاط إنزيمي فريد ، مثل & szlig-galactosidase أو chloramphenicol acetyltransferase ، والتي يمكن معايرتها بسهولة. سيتم بعد ذلك مراقبة مستوى نشاط الجين كدالة لهذا النشاط الأنزيمي. هذه المقايسات ، رغم أنها سهلة الأداء وكمية بشكل عام ، إلا أنها تعاني من عدم قدرتها على القياس في & quot؛ الوقت الحقيقي & quot. في هذه المقايسات كان من الضروري بشكل عام صنع محللات الخلية وإجراء التفاعل في وقت لاحق على المحللات. يتمثل كعب أخيل و rsquo في هذه التجارب في ثبات الإنزيم طوال فترة التخزين وأثناء الفحص الفعلي. في الآونة الأخيرة ، تم وصف استخدام البروتينات الفلورية بطبيعتها ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، كوسيلة لتقييم التعبير الجيني وكفاءة تعداء.

بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) من قنديل البحر Aequorea victoria هو بروتين أحادي 27 كيلو دالتون يتكون من 238 من الأحماض الأمينية الفلورية بشكل طبيعي (1). يتمثل دوره في تحويل الإشعاع الكيميائي الأزرق لبروتين آخر ، وهو aequorin ، إلى ضوء الفلورسنت الأخضر (10) ، عن طريق نقل الطاقة. يحتوي البروتين الفلوري الأخضر من النوع البري (wtGFP) على ذروة امتصاص / إثارة عند 395 نانومتر مع ذروة طفيفة عند 475 نانومتر (الأشعة فوق البنفسجية إلى الضوء الأزرق) ، وله ذروة انبعاث عند 508 نانومتر ، مع كتف عند 540 نانومتر (الضوء الأخضر) ). يشير التركيب البلوري للبروتين إلى علبة ب معبأة بشكل وثيق تحتوي على حلزون (9). تم تحديد التركيب الكيميائي اللازم للتألق ، وتشير البيانات إلى وجود هيكسا ببتيد يحتوي على شق حلقي ثلاثي الببتيد ، سيرين ، ديهيدرو-تيروسين ، جلايسين ، المرتبط تساهميًا من خلال البروتين و rsquos peptide backbone (2). الآلية الدقيقة لتشكيل هذا الهيكل الفريد غير معروفة ، ولكنها تحدث بعد الترجمة وتتطلب الأكسجين الجزيئي (6). ومن المثير للاهتمام ، أن سداسي الببتيد موجود في الجزء الحلزوني من البروتين مما يشير إلى أن علبة ب توفر وسيلة لاستبعاد المذيبات والأكسجين الجزيئي ، والتي تميل إلى إخماد إشارة الفلورسنت (9). على عكس المراسلين الآخرين الذين يتلألأون بيولوجيًا ، الذين يحتاجون إلى بروتينات أو ركائز أو عوامل مساعدة إضافية لإصدار الضوء ، فإن GFP متوهج بطبيعته ولا يكون مضانه خاصًا بالأنواع.

كما هو مبين في الجدول 1 ، تم إجراء العديد من الطفرات على البروتين من النوع البري (wtGFP) لتحسين واحدة أو أكثر من خصائص البروتين. المتغيرات الأكثر استخدامًا هي GFPs ذات الانزياح الأحمر. هذه المسوخات لها ذروة إثارة واحدة حوالي 488 نانومتر بدلاً من ذروة الإثارة الأولية والذروة الثانوية الموجودة في بروتين النوع البري (الجدول 2). ومع ذلك ، فإن هذه المتغيرات لها نفس أطياف الانبعاث مثل البروتين من النوع البري. يحتوي EGFP ، المعروف أيضًا باسم GFPmut 1:23 ، على طفرتين في منطقة chromophore (الجدول 1) ويقال إنه يحتوي على ذروة إثارة مفردة متغيرة باللون الأحمر عند 488 نانومتر ومتألق بكثافة أكبر من بروتين من النوع البري (3). متحولة GFP-S65T ، مع Serine في الموضع 65 تحور إلى Threonine ، لها أيضًا ذروة إثارة واحدة متغيرة باللون الأحمر ، تتألق بشكل مكثف أكثر من النوع البري ، ولها ميزة إضافية تتمثل في الحصول على مضان أسرع أربع مرات تقريبًا من GFP من النوع البري (4).

تم تحسين العديد من المسوخات للتعبير في الخلايا البكتيرية. على سبيل المثال ، يحتوي GFPuv ، الذي تم تحسينه ليتألق عند الإثارة بالضوء فوق البنفسجي (UV) ، على ثلاثة بدائل للأحماض الأمينية ، لا يغير أي منها تسلسل الكروموفور. هذه البدائل تغير تشكيل البروتين وتشكيل الكروموفور. عندما يتم التعبير عنها في E. coli ، يكون GFPuv أكثر قابلية للذوبان من wtGFP ، والذي يوجد بشكل أساسي في أجسام متضمنة في شكل غير قابل للذوبان غير الفلوري. أيضًا ، تم استبدال خمسة أكواد Arg نادرًا الاستخدام من جين النوع البري بكودونات مفضلة في E. coli من أجل زيادة كفاءة التعبير. هذا البروتين لديه ميل إلى الثنائيات ، والذي يتشكل نتيجة للتفاعلات الكارهة للماء وينتج عنه انخفاض في الامتصاص بمقدار أربعة أضعاف عند 470 نانومتر وزيادة في الامتصاص عند 395 نانومتر. على الرغم من التغييرات ، فإن الحد الأقصى للإثارة والانبعاثات يظل كما هو في النوع البري. متحول Stemmer مشابه تمامًا لـ GFPuv ، باستثناء تغييرات كودون Arg.

تم استخدام الطفرات أيضًا لإنشاء متغيرات الانبعاث الأزرق GFP. يحتوي متغير Y66H على بقايا هيستيدين في الموضع 66 بدلاً من التيروزين. ينتج عن هذا الحد الأقصى للإثارة والانبعاثات 382 و 459 نانومتر على التوالي. تم إجراء تحسينات أخرى على البروتينات المنبعثة من اللون الأزرق لتحسين سطوعها. على سبيل المثال ، يحتوي EBFP أيضًا على تغييرات في الأحماض الأمينية في المواضع 64 و 65 و 145 التي تعمل على تحسين السطوع وتؤدي إلى إثارة وانبعاث بحد أقصى 380 و 440 على التوالي.

تم إجراء بدائل أخرى لتحسين عملية طي البروتين وتكوين الكروموفور. إلى جانب بدائل الأحماض الأمينية الواضحة التي سبق وصفها ، تم إجراء العديد من الطفرات الصامتة المختلفة في تسلسل النوع البري. أجرى Clontech أكثر من 150 بديلًا متسلسلًا لتسلسل الحمض النووي الأصلي من أجل تغيير استخدام الكودون ليعكس التحيز المقصود من المضيف و rsquos codon. تم أيضًا تحويل التسلسلات الأولية التي تحيط بمنطقة التشفير إلى موقع بدء ترجمة إجماع Kozak من أجل زيادة كفاءة بدء الترجمة.

لقد فتح التعبير عن GFP باعتباره جينًا متحورًا العديد من النوافذ الجديدة المثيرة للتحقيق في البيولوجيا الخلوية والنمائية والجزيئية. تم التعبير عن GFP الفلوريسنت في البكتيريا (1 ، 3) الخميرة (11) ، العفن الوحل (12) ، النباتات (13) ، درووفيليا (14) ، وخلايا الثدييات (17). يمكن أن تعمل GFP كعلامة بروتين ، وتتسامح مع اندماج N- أو C مع مجموعة متنوعة من البروتينات ، والتي ثبت أن العديد منها يحافظ على الوظيفة الأصلية (18). تسمح المرونة الهائلة لهذه البروتينات كواسم في الوقت الحقيقي غير جراحي في الخلايا الحية بتطبيقات عديدة. نحن هنا نصف تجارب عديدة توضح استخدام الفلورة لتقدير البروتينات الفلورية الخضراء المختلفة (GFPs) باستخدام قارئ FL600 الصفيحة الدقيقة.


الجدول 1. المسوخ GFP وبدائل الأحماض الأمينية

# تحتوي هذه المسوخات أيضًا على أكثر من 150 طفرة قاعدية صامتة تتوافق مع تفضيلات استخدام الكودون البشري. & amp تم تحويل تسلسلات المنبع التي تحيط بمنطقة الترميز إلى موقع بدء ترجمة إجماع Kozak. @ تم استبدال خمسة أكواد Arg نادرا ما تستخدم من النوع البري بكودونات مفضلة في E. coli من أجل زيادة كفاءة التعبير.

المواد والأساليب

تم شراء 96 لوحة ميكروسكوبية واضحة تمامًا ، رقم الكتالوج CFCP N96 ، من Biosearch ، (Bedford ، MA). تم شراء البروتينات المؤتلفة المنقى لـ wtGFP و EGFP و GFP-S65T و GFPuv من Clontech. كانت المستخلصات المنقاة جزئيًا التي تحتوي على بروتين wtGFP المؤتلف ، بالإضافة إلى البروتينات الطافرة EGFP و Y66H و Stemmer هدية سخية من Daniel Gonz & aacutelez (Rutgers ، New Brunswick ، ​​NJ). تم إجراء سلسلة من التخفيفات لكل مستخلص بروتين باستخدام محلول Tris-EDTA (10 ملي مولار Tris-HCl ، 10 ملي EDTA ، درجة الحموضة 8.0) كمادة مخففة. تم إجراء قرارات الفلورسنت باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة FL600 (BioTek Instruments ، Winooski ، Vermont) مع برنامج تقليل بيانات KC4 على وظيفة قارئ التحكم بجهاز الكمبيوتر الخارجي والتقاط البيانات (BioTek Instruments ، Winooski ، VT). اختلفت مجموعات المرشحات وفقًا لمتغير GFP المستخدم. تم إجراء تحديدات wtGFP باستخدام مرشح إثارة ممر النطاق بطول 400 نانومتر و 30 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 508 نانومتر و 20 نانومتر. تمت قراءة Stemmer و mutant و GFPuv باستخدام مرشح إثارة ممر النطاق بزاوية 360 نانومتر و 40 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 508 نانومتر و 20 نانومتر. تم تحديد المسوخات ذات التحول الأحمر EGFP و GFP-S65T باستخدام مرشح إثارة ممر النطاق بطول 485 نانومتر و 20 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 530 نانومتر و 25 نانومتر ، بينما تم فحص & quotblue & quot ، متحولة الانبعاث ، Y66H ، باستخدام 360 نانومتر ، 40 نانومتر. مرشح إثارة ممر النطاق مع مرشح انبعاث ممر النطاق ذي 460 نانومتر و 40 نانومتر. يشير الجدول 2 إلى الحد الأقصى للإثارة والانبعاثات للعديد من البروتينات المستخدمة. تم تحديد تركيزات البروتين لكل متغير GFP باستخدام الامتصاص عند الطول الموجي المناسب (l max) والتركيز المحسوب باستخدام معاملات الانقراض المبلغ عنها (e) لكل متغير (15 ، 16).


الجدول 2. بيانات الإثارة والانبعاثات لمتغيرات GFP

@ لاحظ أن كلا أطوال موجات الإثارة يشار إليها.

نتائج

تم عمل منحنيات التركيز باستخدام عدة متغيرات GFP وتم تحديد التألق. في جميع الحالات لوحظ ارتباط خطي بالتركيز. تم قياس تألق بروتين wtGFP المنقى جزئيًا من 0 إلى 140 نانوغرام. يشير تحديد محتوى البروتين الكلي بطريقة Lowry إلى أن wtGFP يمثل 3 ٪ من إجمالي البروتين. كما هو موضح في الشكل 1 ، باستخدام طول موجة إثارة يبلغ 400 نانومتر وطول موجة انبعاث قدره 508 ، لوحظ استجابة خطية (ص 2 = 0.998). من حيث حدود الكشف يمكن اكتشاف ما لا يقل عن 5 نانوغرام لكل بئر من wtGFP. باستخدام wtGFP المأشوب المنقى الذي تم الحصول عليه تجاريًا ، تم الحصول على نتائج مماثلة فيما يتعلق بحدود الخطية والكشف.

عندما تم تحديد مضان البروتينات ذات الانزياح الأحمر ، لوحظ أيضًا وجود علاقة خطية بين التركيز والفلورة إما لـ EGFP أو GFP-S65T (الشكل 2). مع مجموعة مرشح الفلورسين ، تؤدي الزيادة في معامل الانقراض (الجدول 2) لـ EGFP إلى تألق أكثر إشراقًا من البروتين من النوع البري. قد يفسر هذا الحد الأدنى للكشف وهو 1 نانوغرام لكل بئر لاحظناه مع هذا البروتين (البيانات غير معروضة). يمكن استخدام التقدير الكمي لـ EGFP في المستخلصات باستخدام منحنى المعايرة المحدد بواسطة الانحدار الخطي بدرجة عالية من الثقة (r 2 = 0.998).

كما هو موضح في الشكل 3 ، يمكن لـ Stemmer mutant و GFPuv استخدام نفس مجموعة المرشح. كما هو الحال مع جميع المتغيرات GFP الأخرى التي تم فحصها تظهر كلا البروتينات علاقة خطية بين التركيز وإشارة التألق (الشكل 3). تم تحديد حد الكشف عن متحولة Stemmer ليكون 2.5 نانوغرام (البيانات غير معروضة). تتوافق هذه البيانات بشكل وثيق مع بيانات معامل الانقراض التي تشير إلى أن متحولة Stemmer نصف ساطعة مثل متغير EGFP. على الرغم من أنها محسّنة للإثارة باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية وفي هذه التجارب كانت متحمسة عند 360 نانومتر ، يمكن قياسها جيدًا باستخدام نفس مجموعة المرشح مثل wtGFP ، والتي تستخدم مرشح الإثارة 400 نانومتر.

تم إجراء الإسفار من التخفيف التسلسلي لمستخلص البروتين GFP-Y66H. على الرغم من أن عينة متحولة الباعثة للضوء الأزرق Y66H لم تكن نقية بما يكفي لقياس محتوى البروتين باستخدام الامتصاص ، كان هناك بروتين كافٍ لاكتشاف إشارة الفلورسنت. مع تخفيف مستخلص البروتين ، لوحظ وجود علاقة خطية بين التخفيف والفلورة (الشكل 4).

كما هو موضح في الشكل 5 ، يعد استخدام مجموعة المرشحات المناسبة أمرًا مهمًا من أجل تعظيم الإشارة. يسمح استخدام المسوخات ذات الانزياح الأحمر مثل EGFP باستخدام مجموعة المرشحات التقليدية & quotfluorescein & quot (إثارة 485 نانومتر ، انبعاث 530 نانومتر). عند استخدام المرشحات التي تزيد من الإشارة باستخدام wtGFP (إثارة 400 نانومتر وانبعاث 508 نانومتر) لاكتشاف EGFP ، تتضاءل الإشارة المرتجعة بشكل كبير ، على الرغم من وجود نفس إعداد الحساسية. لسوء الحظ ، يمنع تداخل المرشح استخدام مرشح الإثارة 485 نانومتر مع مرشح انبعاث 508 نانومتر. من النوع البري GFP ، كما هو موضح سابقًا ، لديه إثارة أولية تتمحور حول 395 نانومتر مع كتف يقع عند 485 نانومتر. مع مجموعة مرشح & quotfluorescein & quot التقليدية ، لوحظ فقدان إشارة الفلورسنت مقارنة بالنتيجة عند استخدام إثارة 400 نانومتر وانبعاث 508 نانومتر. بسبب ذروة الإثارة الثانوية عند 370 نانومتر مع wtGFP ، يتم تخفيف درجة الخسارة إلى حد ما مقارنة بـ EGFP ، التي لديها ذروة إثارة واحدة فقط. في حالة GFPuv ، التي تم تحسينها للإثارة باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، يكون فقدان إشارة الفلورسنت أكثر عمقًا عند استخدام مجموعة مرشح & quotfluorescein & quot (لا تظهر البيانات).

الشكل 1. منحنى التركيز باستخدام بروتين wtGFP المنقى جزئيًا. تم إجراء تخفيفات بروتين wtGFP باستخدام 10 ملي مولار تريس ، 10 ملي مولار EDTA كمخفف. تمت قراءة العينات باستخدام قارئ لوحة مضان FL600 مع وظيفة قارئ يتم التحكم فيها بواسطة برنامج تقليل بيانات KC4 على جهاز كمبيوتر خارجي. تم تحديد الإسفار باستخدام مرشح إثارة ممر النطاق 400 نانومتر و 30 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 508 نانومتر و 20 نانومتر مع إعداد حساسية الجهاز 175.

أ

ب

الشكل 2. منحنيات تركيز بروتينات GFP ذات الانزياح الأحمر. تم إجراء تخفيفات لبروتينات (A) EGFP أو (B) GFP-S65T باستخدام 10 ملي مولار تريس ، 10 ملي مولار EDTA كمخفف. تمت قراءة العينات باستخدام قارئ لوحة مضان FL600 مع وظيفة قارئ يتم التحكم فيها بواسطة برنامج تقليل بيانات KC4 على جهاز كمبيوتر خارجي. تم تحديد الإسفار باستخدام مرشح إثارة ممر النطاق بطول 485 نانومتر و 20 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 530 نانومتر و 25 نانومتر مع إعداد حساسية الجهاز 135.

أ

ب

الشكل 3. منحنيات التركيز باستخدام البروتينات المتحولة Stemmer GFP و rGFPuv المنقى جزئيًا. تم إجراء تخفيفات لبروتين GFP المنقى جزئيًا (A) أو بروتين rGFPuv (B) باستخدام 10 ملي مولار تريس ، 10 ملي مولار EDTA كمخفف. تمت قراءة العينات باستخدام قارئ لوحة مضان FL600 مع وظيفة قارئ يتم التحكم فيها بواسطة برنامج تقليل بيانات KC4 على جهاز كمبيوتر خارجي. تم تحديد الإسفار باستخدام مرشح إثارة ممر النطاق بزاوية 360 نانومتر و 40 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 508 نانومتر و 20 نانومتر مع إعداد حساسية للأداة يبلغ 140.

الشكل 4. منحنى التركيز باستخدام بروتين متحولة GFP-Y66H المنقى جزئيًا. تم إجراء تخفيفات لبروتين GFP-Y66H الطافر باستخدام 10 ملي مولار تريس ، 10 ملي مولار EDTA كمخفف. تمت قراءة العينات باستخدام قارئ لوحة مضان FL600 مع وظيفة قارئ يتم التحكم فيها بواسطة برنامج تقليل بيانات KC4 على جهاز كمبيوتر خارجي. تم تحديد الإسفار باستخدام مرشح إثارة ممر النطاق 360 نانومتر و 40 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 460 نانومتر و 45 نانومتر مع إعداد حساسية الجهاز 150.

أ

ب

الشكل 5. فقدان الإشارة عند استخدام مجموعات المرشحات البديلة. تم إجراء تخفيفات لبروتين (A) EGFP أو (B) wtGFP باستخدام 10 ملي مولار تريس ، 10 ملي مولار EDTA كمخفف. تمت قراءة العينات باستخدام قارئ لوحة مضان FL600 مع وظيفة قارئ يتم التحكم فيها بواسطة برنامج تقليل بيانات KC4 على جهاز كمبيوتر خارجي. تم تحديد الإسفار باستخدام إما إثارة ممر النطاق 485 نانومتر ، 20 نانومتر ، 530 نانومتر ، مجموعة مرشح انبعاث ممر النطاق 25 نانومتر أو 400 نانومتر ، 30 نانومتر إثارة تمرير النطاق ، 508 نانومتر ، 20 نانومتر مجموعة مرشح انبعاث ممر النطاق. بالنسبة لقرارات EGFP و wtGFP باستخدام أي من مجموعة المرشح ، تم استخدام إعداد حساسية يبلغ 170.

مناقشة

أصبحت فائدة البروتينات الفلورية الخضراء واضحة بشكل متزايد. يتطلب الاكتشاف فقط إضافة الأشعة فوق البنفسجية القريبة إلى الضوء الأزرق ولا يقتصر على توفر الركائز ، وبالتالي توفير المعلومات المتعلقة بالتعبير الجيني والتوطين الخلوي في الوقت الفعلي. كما لا تتداخل GFPs مع نمو الخلايا في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ، وبالتالي فهي مؤشر مناسب للتحول. في مذكرة التطبيق هذه نصف الكمي المباشر للعديد من الأشكال المتحولة المختلفة لـ GFP باستخدام الفلورة.

نظرًا لأن GFPs عبارة عن بروتينات بدلاً من جزيئات الفلورسنت الصغيرة ، يجب مراعاة الخصائص الفيزيائية لـ GFPs كببتيدات. على الرغم من كونه ببتيدًا ، فإن GFP مقاوم للتمسخ. GFP ، مع Tm = 70 & degC ، مقاوم تمامًا لتمسخ الحرارة بمجرد تشكيله. في الجسم الحي ، يبدو أن تكوين GFP حساس لدرجة الحرارة إلى حد ما. في الخميرة ، تم الإبلاغ عن أن مضان GFP يكون الحد الأقصى عند 15 درجة مئوية وينخفض ​​إلى حوالي 25 ٪ من الحد الأقصى عندما ترتفع درجة حرارة الحضانة إلى 37 درجة مئوية (7). لقد ثبت أن الطفرات التي تزيد من كفاءة طي البروتين ، كما هو الحال مع EGFP و GFPuv ، تثبط حساسية التألق لدرجة حرارة حضانة النمو (3). فيما يتعلق بحالة الأكسدة والاختزال ، يجب أن يكون GFP في حالة مؤكسدة من أجل التألق ، حيث يتطلب تكوين chromophore ثلاثي الببتيد الدوري الأكسجين الجزيئي (6). عوامل الاختزال القوية ، مثل 5 ملي مولار الصوديوم2س2ا4 أو 2 مم FeSO4 تحويل GFP إلى جزء غير فلوري. لحسن الحظ ، لا يبدو أن عوامل الاختزال الأضعف مثل ، 2٪ و szlig-mercaptoethanol ، و 10 mM dithiotheitol (DTT) ، و 10 mM glutathione ، أو 10 mM L-cysteine ​​، لا تؤثر على مضان GFP (16). عوامل مؤكسدة قوية مثل 1٪ H2ا2 سوف يلغي أيضًا التألق كما سيكمل التشبع الطبيعي. GFP مقاوم تمامًا لتغيرات الأس الهيدروجيني.على سبيل المثال ، يكون wtGFP متوهجًا على نطاق واسع جدًا من الأس الهيدروجيني (درجة الحموضة 5.5-12) مع فقد سريع للضوء مع مستويات الأس الهيدروجيني إما أعلى أو أقل من هذا النطاق. تم الإبلاغ عن أن المسوخات ذات الانزياح الأحمر لها نطاق أضيق من استقرار الأس الهيدروجيني وتظهر مضانًا بين درجة الحموضة 7.0 و 11.5.

فيما يتعلق بالفلورة ، يقدم GFP بعض المزايا التي لا يتوقعها المرء من البروتينات. على عكس العديد من البروتينات ، لا يتم فقد النشاط ويتم الحفاظ على التألق بعد التثبيت مع الجلوتارالدهيد أو الفورمالديهايد. الأهم من ذلك ، تم الإبلاغ عن أن GFP ومعظم متغيراته مقاومة تمامًا لتبييض الصور. عوامل تشوتروبيك مثل 8 م يوريا ، وتركيزات منخفضة من المنظفات (1٪ SDS) أيضا لا تؤثر على مضان البروتين.

هناك العديد من القضايا التي يجب وضعها في الاعتبار عند استخدام GFP كجزيء مراسل. يمكن أن يؤدي التعبير عن البروتينات الخارجية في الكائنات الحية إلى مشاكل الذوبان. يوجد GFP البري ، مثل العديد من البروتينات الأخرى عندما يتم التعبير عنه في البكتيريا ، بشكل أساسي في أجسام متضمنة في شكل غير قابل للذوبان وغير متوهج. تم العثور على الطفرات التي تزيد من طي البروتين وكفاءة الترجمة للقضاء على العديد من مشاكل الذوبان. على سبيل المثال، بكتريا قولونية يُقال إن التعبير عن GFPuv ، مع طفراته لتحسين طي البروتين وتكوين الكروموفور ، يكون أكثر إشراقًا 18 مرة من البكتيريا التي تعبر عن wtGFP بسبب زيادة قابلية ذوبان البروتين. فيما يتعلق باستخدام GFP كوسيلة لقياس النسخ ، قد يحول معدل تكوين الكروموفور والاستقرار الظاهر لـ wtGFP دون استخدام GFP كمراسل لمراقبة التغيرات السريعة. يحدث تكوين Chromophore بعد متعدية ويتطلب الأكسجين الجزيئي. الخلايا والبكتيريا على وجه الخصوص ، التي تزرع في ظروف لاهوائية ستكون مقاومة لفلورة GFP. وبالمثل ، إذا تم التحقيق في تغييرات سريعة جدًا في معدلات النسخ ، فقد يحول التأخر بين إنتاج البروتين وتكوين الكروموفور دون استخدام GFP. وبالمثل ، فإن بروتينات GFP التي يتم إنتاجها مرة واحدة مستقرة تمامًا ومقاومة للتدهور ، مما يقلل مرة أخرى من فائدتها كمراسل للتغيرات السريعة. هناك نقطة مهمة أخرى يجب مراعاتها فيما يتعلق باستخدام GFP كمراسلين كميين وهي الافتقار إلى تضخيم الإشارة. لا تحتوي الإشارة المرتبطة بـ GFP على أي نشاط إنزيمي مرتبط بها ، وبالتالي لا توجد فرصة للتضخيم كما هو الحال بالنسبة للمراسلين مثل b-galactosidase أو luciferase أو alkaline phosphatase.

مشكلة أخرى مرتبطة بـ GFP هي التألق الذاتي للخلفية. يرجع معظم التألق الذاتي في خلايا الثدييات إلى وجود مركبات الفلافين FAD و FMN. تحتوي هذه المركبات على أقصى قدر من الإثارة والانبعاث يبلغ 450 نانومتر و 515 نانومتر على التوالي وتميل إلى التسبب في مشاكل في المقام الأول مع المتغيرات ذات الانزياح الأحمر. وبالمثل ، فإن NADH ، وهو عامل مساعد خلوي آخر شائع ، لديه إثارة 365 نانومتر وانبعاث 445 نانومتر وقد ينتج عنه مضان في الخلفية عندما يتم قياس مضان wtGFP. إذا كان التألق الذاتي للخلفية يمثل مشكلة ، فقد يكون من الضروري تكييف متحولة GFP لنوع التألق الذاتي الذي تمت مواجهته. تم تقدير أن تركيز السيتوبلازم يجب أن يكون 1.0 & microM حتى تكون إشارة wtGFP ضعف تلك الناتجة عن التألق الذاتي. المتغيرات ذات الانزياح الأحمر ، لأنها أكثر إشراقًا ، لها عتبة أقل من 100-200 نانومتر (16).

على الرغم من أن معظم التجارب التي تستخدم GFP يتم إجراؤها باستخدام إما الفحص المجهري الفلوري أو قياس التدفق الخلوي ، فإن هذه البيانات المقدمة في ملاحظة التطبيق هذه توضح فائدة القياس المباشر لـ GFP باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية. يمكن أن يوفر الفحص المجهري معلومات عن عدد الخلايا التي تعبر عن GFP ، ولكنه شخصي تمامًا فيما يتعلق بالكميات. يمكن أن يوفر قياس التدفق الخلوي معلومات كمية ، ولكن الإنتاجية محدودة للغاية. يسمح تحديد التألق باستخدام مقياس التألق الصفيحي بالمعلومات الكمية بالإضافة إلى الإنتاجية العالية.

ملاحظات التطبيق الأخرى ذات الصلة إثارة وانبعاث البروتين الفلوري الأخضر

مراجع

(1) Chalfie، M.، Y. Tu، G.Euskirchen، W. Ward، D. Prasher (1994) Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression، Science 263: 802-805.

(2) Cody، C. D. Prasher، W. Westler، F. Prendergast، W. Ward (1993) Chemical Structure of the Hexapeptide Chromophore of the Aequorea Green-Fluorescent Protein، Biochemistry، 32: 1212-1218.

(3) كورماك ، ب. ر. فالديفيا ، وس. فولكو. (1996) المسوخ المحسن من قبل FACS لجين البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، 173: 33-38.

(4) Heim، R.، A.B. كوبيت ، و R.Y. تسلين. (1995) تحسين الأسفار الأخضر ، الطبيعة ، 373: 663-664.

(5) ديلاجريف ، إس. هاوتن ، سي. سيلفا ، م. يانغ ، ودي سي يوفان. (1995) المسوخات الإثارة ذات الانزياح الأحمر للبروتين الفلوري الأخضر ، الحيوية / التكنولوجيا ، 13: 151-154.

(6) هايم ، أر.دي.سي. براشر ، و ر. Tsien (1994) طفرات الطول الموجي والأكسدة التلقائية لما بعد التحويل للبروتين الفلوري الأخضر ، بروك. ناتل ، أكاد. Sci ، USA 91: 12501-12504.

(7) Lim، C.R.، Y. Kimata، M. Oka، K. Nomaguchi، and K. Kohno (1995) الحساسية الحرارية لبروتين الفلورسنت الأخضر الفلوريسنت المستخدم للكشف عن مقصورات شبيهة بالمواد النووية في نوكليوبورين Nsp1. الكيمياء الحيوية 118: 13-17.

(8) كوبيت ، إيه ، آر هايم ، إس آدامز ، إيه بويد ، إل جروس ، آر ، آر. تسين (1995) فهم وتحسين واستخدام البروتينات الفلورية الخضراء. الاتجاهات في العلوم البيوكيميائية ، 20: 448-455.

(9) يانغ ، ف. موس ، ج. Phillips (1996) التركيب الجزيئي للبروتين الأخضر الفلوري. Nature Biotechnology 14: 1246-1251.

(10) وارد ، دبليو في مراجعات الكيمياء الضوئية والبيولوجية الضوئية ، K. Smith Ed. 1979 ، Plenum NY. ص 1-57.

(11) Kahana، J.، B. Schapp، and P. Silver (1995) Kinetics of Spindle Pole Body Separation in Budding Yeast. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 92: 9707-9711.

(12) موريس ، إس ، جيه صبري ، وجيه سبوديتش (1996) ديناميات الميوسين في خلايا ديكتيوستيليوم الحية. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 93: 443-446.

(13) Epel، B.، H. Padgett، M. Heinlein، and R. Beachy (1996) تم فحص ديناميات بروتين حركة الفيروسات النباتية باستخدام GFP-protein Fusion. الجين. 173: 75-79.

(14) Wang، S.، and T. Hazelrigg (1994) الآثار المترتبة على توطين bcd mRNA من التوزيع المكاني لبروتين exu في تكوين ذبابة الفاكهة. طبيعة سجية. 369: 400-403.

(15) Gonzalez، D. الاتصالات الشخصية.

(16) دليل مستخدم الألوان الحية Clontech Laboratories Inc. Palo Alto CA.

(17) أ.إ.كراميري. وايتهورن ، إي تيت ، و دبليو بي سي. Stemmer (1996) تحسين البروتين الفلوري الأخضر عن طريق التطور الجزيئي باستخدام خلط الحمض النووي. Nature Biotechnology 14: 448-455.

(18) ت. ستيرنز (1995) الثورة الخضراء. علم الأحياء الحالي. 5: 262-264.


حساب سطوع GFP - علم الأحياء

معلمات التصوير للبروتينات الفلورية

إن الطيف الواسع من البروتينات الفلورية ومشتقاتها التي تم الكشف عنها حتى الآن متعددة الاستخدامات وقد تم استخدامها بنجاح في كل تخصص بيولوجي تقريبًا من علم الأحياء الدقيقة إلى فسيولوجيا الأنظمة. أثبتت هذه المجسات الفريدة أنها مفيدة للغاية كمراسلين لدراسات التعبير الجيني في كل من الخلايا المستنبتة والحيوانات بأكملها. في الخلايا الحية ، يتم استخدام البروتينات الفلورية بشكل شائع لتتبع توطين وديناميكيات البروتينات والعضيات والمقصورات الخلوية الأخرى ، بالإضافة إلى تتبع تهريب البروتين داخل الخلايا. يتم إنجاز التصوير الكمي للبروتينات الفلورية بسهولة من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات ، بما في ذلك الفحص المجهري واسع النطاق ، ومتحد البؤر ، ومتعدد الفوتون ، لتوفير نافذة فريدة لفضح تعقيدات البنية الخلوية والوظيفة.

شكل 1 - التصوير الرقمي للكيميرا البروتينية الفلورية الموضعية

تؤثر الخصائص الطيفية والفيزيائية المعقدة لبروتينات الفلورسنت على دقة وفائدة أي قياس كمي. العديد من هذه الخصائص ، مثل معامل الانقراض المولي ، والعائد الكمي ، ومعدل التبييض الضوئي ، والاعتماد على الأس الهيدروجيني على الملامح الطيفية ، يمكن قياسها بسهولة باستخدام البروتينات النقية في المختبر. ومع ذلك ، هناك خصائص مهمة وحرجة تجريبية أخرى ، بما في ذلك الدورة الزمنية لتكوين الكروموفور (النضج) ومعدلات تدهور البروتين في الجسم الحي، يصعب التأكد منها. بالنسبة للتجارب النموذجية ، يجب اختيار مشتق البروتين المونومري الأكثر سطوعًا واستقرارًا لتقليل الحاجة إلى تطبيق تصحيحات الخلفية المعقدة وتصحيحات التبييض الضوئي في التطبيقات الأقل تطلبًا.

في اختيار نواقل البروتين الفلورية لتجارب التصوير ، والمتاحة تجارياً  المحسن ينبغي النظر بجدية في المتغيرات من قنديل البحر والشعاب المرجانية ومشتقاتها. هذه متوفرة مع ملفات تعريف مضان باللون السماوي (ECFP)، لون أخضر (EGFP) والأصفر (EYFP) مناطق طيفية ، وقد تم الآن إدخال بروتينات فلورية جديدة مشعة للأحمر. يتضح في شكل 1 هي مجموعة مختارة من الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجموعة متنوعة من نواقل انصهار البروتين الفلوري المتاحة تجارياً والتي تستهدف عدة مواقع خلوية فرعية مختلفة. الملامح الطيفية لانبعاث الأسفار للمسبارات المبينة في شكل 1 تغطي عرضًا تردديًا يبلغ 180 نانومترًا تقريبًا ، وتتميز بحد أقصى يتراوح من 440 إلى 618 نانومتر. هذه المجسات هي أكثر أنواع البروتين الفلوري سطوعًا واستقرارًا وتسمح بالتصوير بالإضاءة عند مستويات الإضاءة المنخفضة ، مما يقلل من المشكلات مثل التبييض الضوئي (الذي تمت مناقشته أدناه) والسمية الضوئية. يمكن للعديد من متغيرات البروتينات الفلورية (بما في ذلك EGFP و ECFP و EYFP) تشكيل ثنائيات بتركيزات عالية بما فيه الكفاية ، وهي قطعة أثرية يمكن أن تزعج بنية الغشاء أو تؤدي إلى افتراضات غير صحيحة عند إجراء تقنيات مضان متقدمة كمية ، مثل نقل طاقة الرنين (أقلق).

بالإضافة إلى السطوع الجوهري للبروتينات الفلورية المعدلة وراثيًا ، فإن مستوى التعبير هو عامل آخر يجب مراعاته في إنتاج إشارة ساطعة بشكل كبير داخل الخلايا من بناء الاندماج. يعد استخدام المتجهات مع المروجين الأقوياء لتحسين مستويات النسخ وتطبيق الكودونات المناسبة لتحسين الترجمة أمرًا ضروريًا لزيادة مستويات التعبير عن بروتين الاندماج ، وبالتالي تحسين مستوى الإشارة الإجمالي. هذا مهم بشكل خاص عندما يجعل التألق الذاتي الخلوي من الصعب التمييز بين انبعاث بروتين الانصهار الفلوري من مضان الخلفية.

يمكن تطبيق مجموعة متنوعة من التقنيات لتحسين مستوى التعبير وسطوع الخلايا التي تحتوي على منتج انصهار البروتين الفلوري. ستؤدي إضافة زبدات الصوديوم (حوالي 1 إلى 5 مللي مولار) إلى وسط المزرعة إلى زيادة مستويات التعبير الجيني الكلي في خطوط الخلايا المستقرة التي تعبر عن بروتين الاندماج. بالإضافة إلى ذلك ، يعد استخدام الخلايا المنقولة بشكل عابر خيارًا جذابًا أيضًا ، لأنها غالبًا ما تعرض مستويات تعبير أعلى بكثير من الخلايا المنقولة بشكل مستقر. يجب توخي درجة من الحذر مع العدوى العابرة العابرة ، ومع ذلك ، نظرًا لاحتمال وجود آثار مفرطة في التعبير ، بما في ذلك تجميع البروتين أو تشبع آلات استهداف البروتين ، مما يؤدي إلى توطين غير مناسب. أخيرًا ، تعد زيادة عدد متواليات البروتين الفلوري الترادفي (مزدوج أو ثلاثي) في ناقل الاستنساخ طريقة بديلة لزيادة مستويات سطوع بروتين الاندماج.

خصائص البروتين الفلوري الحرجة

تتميز معظم نواقل البروتين الفلوري المتاحة تجاريًا بأداء محسن بسبب تحسين استخدام الكودون للترجمة في خلايا الثدييات والطفرات الموجهة للموقع لزيادة كفاءة نضج الكروموفور في درجات حرارة أعلى. بالنسبة لتطبيقات التصوير الأكثر تطلبًا والتي يكون فيها التعبير أو مستويات الوفرة المستهدفة للبروتينات الفلورية منخفضة ، فمن المحتمل أن تكون الخصائص الجوهرية للمسبارات عاملاً مقيدًا. لذلك من الضروري أن نفهم تمامًا الخصائص المتأصلة لبروتينات الفلورسنت وتطبيق الضوابط اللازمة لتقليل الآثار التي قد تنشأ أثناء تصوير المجسات في تجارب الخلايا الحية.

التدمير الناجم عن الفوتون للكروموفور ، وهي ظاهرة تعرف باسم photobleaching، في البروتينات الفلورية عادة ما يتم تقليل السرعة والحجم عند مقارنتها بالفلوروفورات الاصطناعية التقليدية ، مثل الفلورسين والرودامين في ظل ظروف مماثلة. يُعتقد أن هذه المقاومة لتبييض الصور تنشأ من حماية الكروموفور للبروتين الفلوريسنت من خلال المحيط المعبأ بإحكام بيتا-يمكن أن يكون هيكل البروتين. بغض النظر ، لا يزال من المهم إجراء تدابير التحكم في التبييض بصرامة في تجارب التصوير الكمي.

الشكل 2 - خصائص التبييض الضوئي للبروتينات الفلورية

يمكن تحديد معدل التبييض الضوئي في بروتينات الفلورسنت من خلال الحصول على سلسلة صور بفاصل زمني على خلايا التحكم المسمى ، متبوعًا بقياس الخسارة التدريجية في شدة الانبعاث الكمي ، والتي تتجلى عادة من خلال الاضمحلال الأسي. منحنى فقدان مضان التبييض الضوئي (كما هو موضح في الشكل 2) لتصحيح تجارب التصوير. على الرغم من أنها ليست مشكلة كبيرة بشكل عام ، إذا أصبح التبييض الضوئي هو العامل المحدد عند تصوير الخلايا الحية ، يمكن إضافة الكواشف المضادة مثل حمض الأسكوربيك ، أو ترولوكس ، أو أوكسيريز (أكسجين وكاسحات الجذور الحرة) إلى وسط الاستزراع.

على الرغم من أن التبييض الضوئي غالبًا ما يكون العامل المحدد النهائي في الفحص المجهري الفلوري ، إلا أن معدل التبييض الضوئي للعديد من مشتقات البروتين الفلوري يكون بطيئًا نسبيًا (انظر الشكل 2). عامل مقيد آخر هو تشبع الفلوروفور ، والذي لا يحدث في الفحص المجهري واسع النطاق ولكن يمكن أن يكون مشكلة كبيرة مع أدوات متحد البؤر المسح بالليزر حيث يتم أحيانًا استخدام شدة الإثارة عالية بما يكفي للوصول إلى التشبع. يحدث تشبع الفلوروفور عندما تكون جميع الجزيئات المتاحة في حالة الإثارة باستمرار ، بحيث لا تؤدي الزيادة في ضوء الإثارة إلى زيادة مقابلة في انبعاث التألق. في هذه الحالة ، من الصعب جدًا معايرة إشارات التألق بسبب عدم الخطية ، وهي مشكلة لا يمكن تصحيحها إلا بخفض طاقة إدخال الليزر.

يمكن للظروف البيئية داخل الخلايا ، وخاصة الأس الهيدروجيني والتركيزات المحلية العالية من الكاتيونات أحادية التكافؤ وثنائية التكافؤ ، أن تغير مستوى سطوع مشتقات البروتين الفلوري. على سبيل المثال ، البروتين الفلوري الأخضر من النوع البري (wtGFP) سطوعًا متساويًا نسبيًا من الرقم الهيدروجيني 5 إلى الرقم الهيدروجيني 10 ، بينما يتم إخماد البروتينات الفلورية الخضراء والصفراء المحسنة عند مستويات الأس الهيدروجيني الحمضية ، مما يقلل من فعاليتها عند استهداف العضيات (الجسيمات الحالة) أو الأجزاء الخلوية الفرعية ذات الأس الهيدروجيني الداخلي المنخفض. المشتقات الأخرى ، مثل ECFP و DsRedFP أقل حساسية لانخفاض درجة الحموضة. ومع ذلك ، سيتم توطين العديد من منتجات اندماج البروتين الفلوري في مناطق قريبة من درجة الحموضة الفسيولوجية ، والتي لا ينبغي أن تؤثر بشكل خطير على كثافة التألق.

من بين المعلمات الفيزيائية الأخرى الملازمة لبروتينات الفلورسنت التي قد تغير التصوير الكمي بشكل كبير (ولكن لا يمكن قياسها بدقة في المختبر) ، حركية طي اللون ، أو شغله يمكن أن يكون للوقت عواقب وخيمة. مشتقات ايكوريا فيكتوريا تتطلب البروتينات الفلورية لقنديل البحر (ومعظم الشعاب المرجانية) أكسدة لتكوين الكروموفور ، لكن الأكسجين لا يخترق بسهولة بنية البروتين الكثيفة المحيطة بالفلوروفور ثلاثي الببتيد. لذلك ، يمكن أن يحدث تأخير كبير (غالبًا ما يتجاوز عدة ساعات) بين تعبير البروتين وظهور التألق. لسوء الحظ ، ليس من السهل في كثير من الأحيان التمييز بين التأخيرات بسبب تعبير البروتين الفلوري (القياس المثالي) والتأخيرات الناتجة عن تكوين الكروموفور البطيء (قطعة أثرية). العملية العكسية ، في الجسم الحي من الصعب أيضًا مراقبة تدهور البروتينات الفلورية الناضجة ، لكن الأدلة الدامغة تشير إلى أن العديد من هذه المجسات مستقرة جدًا.

معلمات المجهر

تعد مجاهر Widefield و (كنفوكل) ومتعددة الفوتون ، سواء في التكوين المستقيم أو المقلوب ، الأدوات المثالية لمراقبة البروتينات الفلورية في الخلايا والأنسجة الحية. تتراوح مصادر الإضاءة المطلوبة من الزئبق ومصابيح تفريغ قوس الزينون في المجال الواسع ، إلى أشعة الليزر ذات الموجة المستمرة للغاز وأشباه الموصلات في الليزر النبضي متحد البؤر والمغلق على النمط من أجل الفحص المجهري متعدد الفوتونات (انظر الجدول 1). يتم تصوير البروتين الفلوري الأخضر ومتغيراته بسهولة باستخدام الخطوط الطيفية الزرقاء الساطعة لمصباح الزئبق أو خط 488 نانومتر المنبعث من ليزر غاز الأرجون أو كريبتون-أرجون. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم مجموعة من ليزر الحالة الصلبة الجديدة التي تنتج خطوطًا في أجزاء كثيرة من الطيف المرئي ، بما في ذلك المناطق البنفسجية والزرقاء. غالبًا ما يتم تصوير متغيرات البروتين الفلوري التي تحتوي على ملامح طيفية تحولت إلى أطوال موجات الأشعة تحت الحمراء والأزرق والأشعة تحت الحمراء القريبة بكفاءة أكبر باستخدام مصابيح زينون أو مصابيح هاليد معدنية ، بالإضافة إلى خطوط انبعاث ليزر تتطابق بشكل وثيق مع الحد الأقصى للإثارة. بغض النظر عن مصدر الضوء ، فإن المشكلة الأساسية لتصوير البروتينات الفلورية هي أن ضوء الإثارة الكافي متاح للحصول على مستويات إشارة معقولة.

بصرف النظر عن الأهداف ، التي تمت مناقشتها أدناه ، فإن أهم مكونين لتصوير البروتينات الفلورية هما مرشح الانبعاث والكاشف. في المجاهر ذات المجال العريض ، يتم دمج مرشح الإثارة والمرآة ثنائية اللون ومرشح الانبعاث في كتلة بصرية مع عرض النطاق الترددي لمرشح الإثارة الذي يتم تحديده بواسطة مصدر الضوء المستخدم للإثارة. على سبيل المثال ، يتطلب مصباح الزئبق ممر نطاق لمرشح الإثارة له انتقال عالٍ يتراوح بين 450 و 490 نانومترًا لتصوير بروتين الفلوريسنت الأخضر. تعد نطاقات الطول الموجي الأقصر ضرورية للمتغيرات السماوية والأزرق ، بينما تُستخدم نطاقات الطول الموجي الأطول للمشتقات الصفراء والبرتقالية والحمراء. خطوط الليزر لها عرض نطاق يبلغ حجمه بضعة نانومترات فقط ، وبالتالي لا تتطلب عادةً استخدام اختيار الطول الموجي مع مرشحات التداخل. يجب أن يفصل الطول الموجي لقطع المرآة ثنائية اللون بوضوح الملامح الطيفية للإثارة والانبعاث عن طريق عكس الأول بكفاءة ونقل الأخير. هناك هامش ضئيل للغاية للخطأ في اختيار المرايا ثنائية اللون المناسبة. من ناحية أخرى ، يمكن ضبط مرشحات الانبعاث لتمرير نطاقات تتراوح من 20 إلى مئات النانومتر ، اعتمادًا على المتطلبات التجريبية. هذه المرشحات هي الأكثر مرونة من حيث تحديد مستوى كثافة انبعاث الفلورة التي تم تمريرها إلى الكاشف. مفهرسة في الجدول 1 هي قائمة بتركيبات المرشحات المقترحة للتصوير الكمي لبروتينات الفلورسنت. يجب اعتبار توصيات المرشح ، التي تتضمن فقط مرشحات انبعاث ممر النطاق (في الواقع ، مع إهمال اقتراحات مرشح الممر الطويل) ، مجرد نقطة انطلاق لتصميم التجارب.

الشكل 3 - أداء مجموعة مرشح الإثارة الفلورية GFP (أزرق)

يمكن الحكم على أداء العديد من مجموعات فلاتر البروتين الفلورية الخضراء الشائعة من خلال مقارنة الصور من نفس مجال الرؤية الملتقطة مع كل مجموعة من مجموعات المرشحات الفردية ، كما هو موضح في الشكل 3. العينة عبارة عن مزرعة ملتصقة من الخلايا العضلية الأبهرية الجنينية للجرذان التي تم نقلها بواسطة ناقل يحتوي على بروتين اندماج يجمع بين جين السيتوبلازم البشري بيتا-الاكتين مع متغير البروتين الفلوري الأخضر المتحول إلى اللون الأحمر (المعزز) ، EGFP. يتجلى التعبير عن بروتين الاندماج من خلال دمجه في خيوط الأكتين المتزايدة التي تتيح تصور الهياكل تحت الخلوية باستخدام الفحص المجهري الفلوري مع مجموعات المرشح المناسبة (انظر الشكل 3). تم تلوين الأرومات العضلية الشريان الأورطي الصدري أيضًا باستخدام MitoTracker Red CMXRos (التألق الأحمر للميتوكوندريا) و Hoechst 33258 (الحمض النووي في النواة الزرقاء الفلورية). لاحظ عدم وجود إشارة من الفلور الأزرق والأحمر مع مرشحات ممر النطاق Piston و Endow (الشكل 3 (أ) و 3 (ب)) ، ولكن الدرجة الكبيرة من التألق البرتقالي والأحمر التي ينتجها مسبار الميتوكوندريا مع مرشح Endow longpass (الشكل 3 (ج)). إن تركيبات ممر النطاق ومرشحات GFP طويلة الممر ، ذات عرض النطاق الترددي 30 نانومتر (مكبس) ، و 50 نانومتر (Endow BP) ، وأكثر من 100 نانومتر (Endow LP) ، مفيدة أيضًا مع مجموعة متنوعة من الفلوروفورات الاصطناعية التي تثيرها الضوء في الجزء الأزرق من الطيف المرئي.

على الرغم من أنه يمكن تصوير البروتين الفلوري الأخضر عمومًا باستخدام تركيبة مرشح فلورسين قياسي إذا كانت الكثافة عالية بما يكفي ، فإن استخدام المرشحات المتخصصة (انظر الشكل 3) إلى ضبط دقيق لمجموعة الإشارات لتضمين أو استبعاد المكونات الأخرى. يجب أن تستخدم مجموعة المرشح المخصصة للتصوير الكمي لـ GFP مرشح انبعاث ضيق النطاق لتعظيم البروتين الفلوري مقابل إشارة الخلفية (عادةً ما يكون التألق الذاتي). مع مرشح انبعاث النطاق الضيق ، إشارة البروتين الفلورية الزرقاء المخضرة الحادة (الشكل 3 (أ)) بشكل مفضل للكاشف على اللون الأصفر المخضر (الشكل 3 (ب)) أو برتقالي مخضر (الشكل 3 (ج)) خلفية التألق الذاتي الخلوي والفلوروفورات الأخرى التي تنبعث منها أطوال موجية أطول. عادةً ما يُظهر التألق الذاتي طيفًا واسعًا جدًا ، في حين أن طيف انبعاث البروتين الفلوري الأخضر ضيق نسبيًا. من حيث المبدأ ، يجب اختيار أضيق مرشح نطاق لزيادة تمييز انبعاث البروتين الفلوري على إشارات الخلفية الأخرى. ومع ذلك ، فإن نطاق التمرير الأمثل للمرشح سيكون مقيدًا بنسبة الإشارة إلى الضوضاء المطلوبة وخصائص الكاشف ، كما هو موضح أدناه. يجب تحديد ممر النطاق الأمثل لكل حالة تصوير. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن البروتين الفلوري الأخضر المحسن موضح في الشكل 3، لا تعتمد تركيبة المرشح المحددة المختارة على قوة الإشارة فحسب ، بل تعتمد أيضًا على المظهر الطيفي لانبعاث الفلورة لمتغير البروتين (انظر الجدول 1) يتم تصويره.

يمكن تصوير متغيرات البروتين الفلوري الأزرق في الفحص المجهري واسع النطاق باستخدام المعيار دابي مجموعات المرشحات مع ملفات تعريف مرشح الإثارة في نطاق 330 إلى 380 نانومتر ، ومرايا ثنائية الألوان بأطوال موجية مقطوعة من 385 إلى 400 نانومتر ، وإما ممر النطاق أو مرشحات الانبعاث طويلة الممر (420 نانومتر وما فوق). مجموعات المرشحات هذه ليست مفيدة جدًا لبروتينات الفلورسنت السماوي ، والتي تنتج صورًا مثالية مع مرشحات مصممة لتصوير الفلوروفورز المتحمسة بالضوء الأزرق البنفسجي (400 إلى 440 نانومتر). يجب أن تحتوي المرايا ثنائية اللون للبروتينات الفلورية السماوية على أطوال موجية مقطوعة بين 455 و 460 نانومتر ، بالإضافة إلى مرشحات انبعاث تنقل الضوء بين 460 و 500 نانومتر. يمكن استخدام العديد من مجموعات مرشحات الممر الطويل والممر الموجي القياسي الأزرق البنفسجي بنجاح لتصوير مشتقات البروتين الفلوري السماوي (بما في ذلك Cerulean و AmCyan1) ، لكن مصنعي المجهر وفلتر ما بعد البيع يوفرون أيضًا مجموعات مخصصة مصممة خصيصًا لهذه المجسات.

على الرغم من أن مشتقات البروتينات الفلورية الصفراء (بما في ذلك المعزز ، فينوس ، وسترين) تنتج عادةً صورًا مقبولة باستخدام تركيبات مرشح مصممة من أجل FITC والبروتينات الفلورية الخضراء ، يتم الحصول على نتائج أفضل عندما يتم تحسين معلمات المرشح من أجل الامتصاص الأطول قليلاً وملامح الطول الموجي للانبعاثات التي تعرضها هذه المجسات. التوليفات المثالية للبروتينات الفلورية الصفراء هي مرشحات الإثارة مع منطقة ممر النطاق تمتد من 490 إلى 510 نانومتر ، ومرآة ثنائية اللون بطول موجة مقطوع يبلغ 515 نانومتر ، ومرشح انبعاث يمر بأطوال موجية بين 520 و 550 نانومتر. مرشح انبعاث طويل الممر بطول موجة مقطوع يبلغ 515 نانومتر أو أعلى قليلاً سينتج أيضًا صورًا جيدة ببروتينات الفلورسنت الصفراء.

تمتد الملامح الطيفية للبروتينات الفلورية البرتقالية والحمراء على منطقة طول موجي كبيرة ، ولسوء الحظ ، لا توجد مجموعة مرشح واحدة مثالية لتصوير المجموعة الكاملة من هذه الفلوروفورات. غالبًا ما يمكن تصور متغيرات البروتين الفلوري DsRed باستخدام المعيار TRITC مجموعات المرشحات ، بالإضافة إلى العديد من مجموعات الممر الطويل والممر الموجي المصممة لمجسات أخرى تمتص في المنطقة الخضراء من الطيف المرئي. يجب تصوير البروتينات الفلورية البرتقالية (mOrange و CoralHue Orange) باستخدام مرشحات الإثارة في منطقة 500 إلى 540 نانومتر ، إلى جانب مرآة ثنائية اللون لها طول موجي مقطوع يبلغ حوالي 550 نانومترًا ومرشحات انبعاث ممر النطاق تتميز بأطوال موجية تتراوح بين 560 و 600 نانومتر. العديد من مجموعات مرشحات الإثارة الخضراء القياسية تناسب المتطلبات بشكل فضفاض ، ولكن يجب تصميم معلمات المرشح المتخصصة من أجل التصوير الأمثل لفلوروفور معين في هذه الفئة. يمكن عادةً تصوير البروتينات الفلورية الحمراء ذات الطول الموجي الأطول (mCherry و HcRed1 و mRaspberry و mPlum) باستخدام تركيبات مرشح الإثارة الصفراء. على سبيل المثال ، نيكون Y-2E / C. مجموعة ، التي تحتوي على مرشح إثارة ممر النطاق من 540 إلى 580 نانومتر ، ومرآة ثنائية اللون بطول موجة مقطوع يبلغ 595 نانومترًا ، ومرشح انبعاث ممر النطاق يلتقط فوتونات بين 600 و 660 نانومتر ، يمكن استخدامها للعديد من هذه المجسات الحمراء. يتم تقديم مجموعات المرشحات المخصصة من قبل مصنعي المجهر والمرشحات.

في الفحص المجهري متحد البؤر المسح بالليزر ، يقتصر اختيار أطوال موجات الإثارة على نطاق ضيق من خطوط الليزر المتاحة لكل أداة. المجاهر النموذجية ، مثل Nikon A1 HD25 / A1R HD25 ، مجهزة بأشعة الليزر التي تمتد فوق البنفسجي (405 و 440 نانومتر) ، والأزرق (457 ، و 477 ، و 488 نانومتر) ، والأخضر (514 و 543 نانومتر) ، والأصفر البرتقالي (568 و 594 نانومتر) ، والمناطق الطيفية الحمراء (633 و 647 نانومتر). يمكن استخدام أطوال موجات الإثارة هذه بشكل فعال لإثارة معظم البروتينات الفلورية المدرجة في الجدول 1حسب توفر المرايا ثنائية اللون ومرشحات الانبعاث المناسبة. يمكن أيضًا استخدام مجاهر Multiphoton لتصوير معظم مشتقات البروتين الفلوريسنت الشائعة في الحجم المكاني المقيد الذي يميز هذه الأدوات.

الجدول 1 - معلمات تركيبة فلتر البروتين الفلوريسنت

بروتين
(اختصار)
الإثارة
الليزر
(نانومتر)
الإثارة
منقي
CWL / BW (نانومتر)
ثنائي اللون
مرآة
قطع على (نانومتر)
حاجز
منقي
CWL / BW (نانومتر)
نسبيا
سطوع
(٪ من EGFP)
GFP (بالوزن)ارجون (488)450/50480 ليرة لبنانية510/5048
البروتينات الفلورية الخضراء
EGFPارجون (488)470/40495 ليرة لبنانية515/30100
زمردارجون (488)470/40495 ليرة لبنانية515/30116
أعظمي جرينارجون (488)470/40495 ليرة لبنانية520/30121
كوبجفبارجون (488)470/40490 ليرة لبنانية510/30125
أكجفبارجون (488)470/40490 ليرة لبنانية510/3082
ZsGreenارجون (488)470/30495 ليرة لبنانية520/40117
البروتينات الفلورية الزرقاء
EBFPديود (405)375/50405 ليرة لبنانية445/5027
الياقوتديود (405)400/50460 ليرة لبنانية515/5055
T- الياقوتديود (405)400/50460 ليرة لبنانية515/5079
بروتينات فلورية سماوية
AmCyan1ارجون (457)440/40470 ليرة لبنانية500/4031
ECFPديود (440)435/40460 ليرة لبنانية495/5039
سيرولينديود (440)435/40460 ليرة لبنانية500/5079
CoralHue سماويارجون (488)450/50480 ليرة لبنانية505/3573
البروتينات الفلورية الصفراء
EYFPارجون (514)490/40515 ليرة لبنانية540/30151
PhiYFPارجون (514)500/45525 ليرة لبنانية555/40155
السترينارجون (514)500/25515 ليرة لبنانية545/40174
كوكب الزهرةارجون (514)495/35515 ليرة لبنانية545/40156
ZsYellow1هي-ني (543)500/45525 ليرة لبنانية555/4025
البروتينات الفلورية البرتقالية والحمراء
كورال هوى أورانجهي-ني (543)525/40550 ليرة لبنانية580/4092
م البرتقالهي-ني (543)525/40550 ليرة لبنانية585/50146
DSRedهي-ني (543)540/45570 ليرة لبنانية600/50176
DSRed2هي-ني (543)540/50570 ليرة لبنانية600/4072
DsRed- اكسبريسهي-ني (543)540/45570 ليرة لبنانية600/5058
m اليوسفيKr-Ar (568)545/40570 ليرة لبنانية600/4034
م الفراولةKr-Ar (568)550/50580 ليرة لبنانية615/5078
AsRed2Kr-Ar (568)540/40575 ليرة لبنانية620/608
mRFP1هي-ني (594)560/55590 ليرة لبنانية630/6037
مشيريهي-ني (594)560/55590 ليرة لبنانية630/6047
هكريد 1هي-ني (594)560/60595 ليرة لبنانية630/501
أم التوتهي-ني (594)570/60605 ليرة لبنانية645/6038
HcRed-Tandemهي-ني (594)570/70610 ليرة لبنانية650/6019
mPlumهي-ني (594)570/60605 ليرة لبنانية650/6012
البروتينات الفلورية الضوئية (N) = Native (P) = Photoconverted
PA-GFP (N)ديود (405)400/60465 ليرة لبنانية530/508
PA-GFP (P)ارجون (488)480/40505 ليرة لبنانية535/4041
PS-CFP (N)ديود (405)395/50430 ليرة لبنانية470/6016
PS-CFP (P)ارجون (488)470/50500 ليرة لبنانية530/4015
PS-CFP2 (N)ديود (405)395/50430 ليرة لبنانية470/6026
PS-CFP2 (ف)ارجون (488)470/50500 ليرة لبنانية530/4032
كايدي (ن)ارجون (488)485/40510 ليرة لبنانية535/30259
كايدي (ف)Kr-Ar (568)540/50570 ليرة لبنانية590/3059
mEosFP (N)ارجون (488)490/30510 ليرة لبنانية535/30128
mEosFP (P)Kr-Ar (568)540/50570 ليرة لبنانية600/4068
Kindling (N / P)Kr-Ar (568)560/50590 ليرة لبنانية625/5012
درونبا (ف)ارجون (488)485/30505 ليرة لبنانية530/30240

المقدمة في الجدول 1 عبارة عن مجموعة من الخصائص المعروضة بواسطة العديد من متغيرات البروتين الفلوري الأكثر شيوعًا والأكثر فائدة. إلى جانب الاسم الشائع و / أو الاختصار لكل بروتين فلورسنت ، يتم سرد خط الطول الموجي لليزر الأمثل ، بالإضافة إلى نقاط البداية المقترحة للإثارة وعرض النطاق الترددي لمرشح الانبعاث (وأطوال الموجات المركزية). يشتمل الجدول أيضًا على السطوع النسبي ومعلمات المرآة ثنائية الألوان الموصى بها. تم اشتقاق قيم السطوع المحسوبة من ناتج معامل الانقراض المولي والعائد الكمي ، مقسومًا على قيمة EGFP. تم إنشاء هذه القائمة من مصادر الأدبيات العلمية والتجارية ولا يُقصد منها أن تكون شاملة ، ولكنها تمثل بدلاً من ذلك مشتقات البروتين الفلورية التي حظيت باهتمام كبير في الأدبيات وقد تثبت قيمتها في الجهود البحثية.

الكاشفات المفضلة عادة للفحص المجهري الكمي هي جهاز مضاعف ضوئي وجهاز مقرن شحنة مبرد (اتفاقية مكافحة التصحر) أنظمة الكاميرات. نظرًا لأن المضاعفات الضوئية ليست أجهزة تصوير ، يجب إجراء المسح النقطي (كما هو مستخدم في الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر) عبر العينة لبناء صورة نقطة تلو الأخرى. بدلاً من ذلك ، تحتوي مستشعرات الصور CCD على مصفوفات من الثنائيات الضوئية التي تنتج صورًا ثنائية الأبعاد محدودة الحجم فقط بعدد عناصر الصمام الثنائي الفردية. بصرف النظر عن اعتبارات الإشارة إلى الضوضاء ، فإن أهم جانب في نظام الكاشف هو الخطية والإزاحة. كل من المضاعفات الضوئية ومصفوفات CCD خطية للغاية وأنظمة الكاميرا ذات النهاية الأعلى تتيح ضبط الإزاحة (غالبًا ما يطلق عليها المستوى الأسود) ، كما تفعل جميع تكوينات المضاعف الضوئي. في الممارسة العملية ، يجب تعديل الإزاحة لقراءة الصفر عندما يكون انبعاث التألق غائبًا من العينة. إذا كان هناك إزاحة غير صفرية في النظام ، فلن يكون من الممكن الحصول على اختلافات كمية بين الصور.

في مجاهر المسح بالليزر المتحد البؤر ، عادةً ما تظهر المضاعفات الضوئية نطاقًا ديناميكيًا أقل (8 بت أو 256 مستوى رمادي) وكفاءة الكشف (15 إلى 30 بالمائة) عند مقارنتها بنظام كاميرا CCD مبرد. على الرغم من أنه من المرغوب فيه زيادة كفاءة الكشف ، إلا أن النطاق الديناميكي 8 بت لا يمثل مشكلة عادةً لأنه يتم جمع أقل من 255 فوتونًا لكل بكسل لكل عملية مسح (حتى بالنسبة للعينات الملطخة جيدًا). ومع ذلك ، فإن الخطية الممتازة لاستجابة المضاعف الضوئي ، جنبًا إلى جنب مع خصائص رفض الخلفية المقترنة بتوافر الليزر المناسب تجعل المجهر متحد البؤر خيارًا ممتازًا للتصوير الكمي للبروتينات الفلورية. يعد الفحص المجهري Multiphoton ، الذي يزيل التلف الضوئي بعيدًا عن المستوى البؤري ، ويتجنب الانحرافات اللونية ، ويوفر قياسات ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ، أيضًا أداة مفيدة جدًا لتصوير البروتينات الفلورية.

المعلمة الأكثر أهمية لتحديد فائدة التصوير الكمي هي نسبة الإشارة إلى الضوضاء (المختصرة S / N). في مجاهر التألق التجارية الحديثة ، تُشتق هذه القيمة عمومًا من ضوضاء اللقطة ، والتي تُعرَّف على أنها الجذر التربيعي لعدد الفوتونات التي يجمعها الكاشف. قد يتم إدخال العديد من الأخطاء المنهجية في نظام الكشف ، ولكنها بشكل عام صغيرة مقارنة بضوضاء اللقطة لأجهزة CCD والمضاعفات الضوئية. على سبيل المثال ، إذا قام الكاشف بجمع 100 فوتون لكل بكسل ، فمن المتوقع أن تكون الضوضاء 10 (الجذر التربيعي لـ 100) ، أو 10 بالمائة من الإشارة. وبالمثل ، بالنسبة للإشارة التي تبلغ 10000 فوتون لكل بكسل ، فإن الضوضاء (100) تمثل 1 بالمائة فقط من الإشارة. تعكس هذه الأمثلة مستويات الإشارة النموذجية في الفحص المجهري الفلوري ، وعادة ما تكون الأخطاء التي يتم إدخالها في إلكترونيات الكشف أقل و 1 بالمائة. للظهور الأول ، قد يبدو واضحًا أن أعلى مستوى للإشارة إلى الضوضاء هو الأكثر تفضيلًا ، ولكن في الواقع ، فإن عوامل مثل التبييض الضوئي ، والتشبع بالفلوروفور ، وعدد الفلوروفور في العينة ، والدقة المكانية تحد من الإشارة التي يمكن الحصول عليها- نسبة الضوضاء.

في معظم الحالات ، توجد نسبة متساوية بين ملصق البروتين الفلوري والبروتين المستهدف الخلوي الذي يتم دمجه فيه. لذلك ، يمكن حساب تركيز جزيئات الفلورسنت في الخلية من إجمالي التألق الخلوي باستخدام تركيزات معروفة من البروتين الفلوري المؤتلف كمعيار مرجعي. عادة ما يتم استخدام بروتين الفلوريسنت الأخضر المحسن لهذا الغرض بسبب ثباته الضوئي وسطوعه. لحساب تركيزات EGFP داخل الخلايا ، يمكن تضمين الكميات المعروفة للعلامة في ألواح بولي أكريلاميد وتصويرها جنبًا إلى جنب مع الخلايا التي تعبر عن بنيات الاندماج. تم أيضًا تطوير معايير مرجعية لحساب كثافة البروتينات المرتبطة بالغشاء من خلال ربط كميات دقيقة من EGFP الموسومة بالهيستيدين بالخرز المطلي. نظرًا لاستخدام البروتينات الفلورية بشكل متزايد لتسمية الجزيئات في الكائنات الحية بأكملها باستخدام منهجية الضربة القاضية ، سيصبح التحليل الكمي لتعبير البروتين تقنية مفيدة بشكل متزايد.

اختيار أهداف التصوير بالبروتين الفلوري

على الرغم من أنه قد يكون أهم اعتبار عند تصميم بروتوكولات لتجربة التصوير ، غالبًا ما يتم إعطاء أقل قدر من التفكير في اختيار الأهداف. تعتبر المعلمات الموضوعية ذات أهمية قصوى في تحديد الدقة المكانية المتاحة وكمية الضوء المجمعة لحساس الصورة. بشكل عام ، يتم تحديد الأهداف من خلال ثلاثة معايير رئيسية: الفتحة العددية ، والتكبير ، ودرجة التصحيح البصري. أقل عامل مهم هو التكبير على الرغم من الاعتقاد السائد بعكس ذلك. يحدد التكبير فقط حجم الكائن الذي سيظهر في العدسة أو الكاشف ، ولكنه لا يلعب دورًا في الدقة (أصغر التفاصيل التي يمكن ملاحظتها بوضوح) أو السطوع (مقدار إشارة التألق التي سيتم جمعها) للصورة.

الشكل 4 - تأثيرات الفتحة العددية الموضوعية في التصوير الفلوري

الدقة والسطوع هما من وظائف الفتحة العددية ، وهي أهم معيار لاختيار الهدف. تحدد الفتحة العددية مقدار الضوء الذي سيدخل العدسة الأمامية الموضوعية ، لذلك يجب اختيار أعلى فتحة عددية ممكنة للتصوير الكمي لبروتينات الفلورسنت. المبدأ العام وراء جمع الصور (من أي شكل) بسيط: مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، تزداد جودة الصورة أيضًا. هذا المفهوم مهم بشكل خاص لجمع الصور باستخدام نظام الفحص المجهري المتحد البؤر بالليزر ، حيث يكون عدد الفوتونات التي تم جمعها صغيرًا جدًا (عادةً عدد قليل فقط لكل بكسل). لذلك ، فإن الاختيار الدقيق للهدف المناسب مفيد بشكل خاص عند تحسين استراتيجيات جمع الفوتون. لاحظ أن السطوع الكلي للصورة يتناسب مع القوة الرابعة للفتحة العددية الموضوعية مقسومة على مربع التكبير.

يتضح في الشكل 4 مثال على مبدأ أهمية الفتحة العددية فيما يتعلق بالدقة وسطوع الصورة. العينة عبارة عن مزرعة لخلايا ساركوما عظمية بشرية ملتصقة (U2OS الخط) المنقولة باستخدام ترميز ناقل بلازميد لبروتين الفلورسنت الأخضر المحسن المنصهر في تسلسل النوكليوتيدات المستهدفة للميتوكوندريا من الوحدة الفرعية الثامنة من أوكسيديز السيتوكروم البشري. عند نسخ وترجمة البلازميد في مضيفات الثدييات المنقولة ، تكون إشارة توطين الميتوكوندريا مسؤولة عن نقل وتوزيع البروتين الفلوري الوهمي عبر شبكة الميتوكوندريا الخلوية. يمكن تصور الميتوكوندريا الأنبوبية في وقت لاحق باستخدام الفحص المجهري مضان.

في الشكل 4، تم تصوير نفس مجال الرؤية باستخدام أهداف لها نفس التصحيح البصري (مخطط فلوريت) وفتحة عددية (1.3) ، ولكن مع تكبير يتراوح من 40x إلى 100x. على الرغم من أن عدد وحدات البكسل وظروف الكاشف المستخدمة في جمع الصور للشكل 4 كانت متطابقة ، فإن الميتوكوندريا تكون أكثر سطوعًا عند تصويرها من خلال هدف 40x (الشكل 4 (أ)). في المقابل ، فإن أهداف التكبير الأعلى 60x و 100x (الشكل 4 (ب) و 4 (ج)، على التوالي) تنتج صورًا أغمق تدريجيًا ، مع كون الصورة 100x غير قابلة للتمييز تقريبًا. لا يزال من الممكن استخدام هذا الهدف لتصوير العينة ، ولكن يجب زيادة كسب الكاشف بشكل كبير ، مما يؤدي إلى تدهور نسبة الإشارة إلى الضوضاء وصورة أدنى بشكل عام. لاحظ أن قوة حل الأهداف (الشكل 4 (د) إلى 4 (و)) قابل للمقارنة بسبب قيم الفتحة العددية المتطابقة.

أحد المفاهيم الأساسية التي يجب استخلاصها من البيانات الموجودة في الشكل 4 هو تجنب التكبير المفرط عند اختيار أهداف لتصوير البروتينات الفلورية (وغيرها من الفلوروفورات ، لهذه المسألة). ما عليك سوى زيادة التكبير الرقمي (التكبير / التصغير) أثناء جمع الصور على مجهر متحد البؤر باستخدام نتائج الهدف 40x في صورة تعادل حجم العدسة 100x (الشكل 4 (د) و 4 (و)). دقة كلا الهدفين هي نفسها لأن لديهم قيم فتحة عددية متطابقة. لا ينبغي أن تؤخذ الحجة المتعلقة بعدم الأهمية النسبية للتكبير للإشارة إلى أن استخدام أهداف 60x أو 100x ليس مفيدًا. في الواقع ، غالبًا ما يكون اختيار هدف تكبير عالٍ ضروريًا عند تصوير أجسام صغيرة جدًا ، مثل البيروكسيسومات أو الحبيبات الإفرازية ، باستخدام مجهر واسع المجال. نظرًا لأن حجم الصورة بالنسبة لحجم الكاشف يلعب دورًا مهمًا في تحديد تردد أخذ العينات المكانية ، يتم تحديد التكبير الأمثل بواسطة معلمات نظام الكاميرا الرقمية (حجم بكسل CCD وعامل التكبير المتوسط). وبالتالي ، فإن أفضل اختيار للهدف يعتمد عادة على التكوين البصري للأجهزة بالإضافة إلى المتطلبات المحددة لتجربة معينة.

يجب مراعاة استخدام الأهداف المصححة بدرجة عالية (أحادية اللون) بعناية وتجنبها إن أمكن. تتطلب التصحيحات البصرية النموذجية المدرجة في أهداف الانحراف اللوني وتسطيح المجال عناصر عدسة إضافية مع زيادة درجة التصحيح (على سبيل المثال ، من الفلوريت إلى أحادي اللون). مع كل عدسة إضافية ، ينخفض ​​النقل الكلي للضوء عبر الهدف ، مما يحد من كمية الإشارة القادرة على الوصول إلى الكاشف. على الرغم من أن العدسات المصححة بدرجة عالية مطلوبة للتطبيقات المتخصصة ، مثل التصوير متعدد الألوان ، إلا أنه سيكون من الصعب الحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (وبالتالي صورة ذات جودة استثنائية) ، خاصة عند تصوير بعض البروتينات الفلورية الباهتة ، مثل HcRed أو ECFP. باختصار ، هدف الفلوريت 40x (فتحة عددية 1.3) هو الأفضل لتصوير العينات التي تحتوي على بروتين فلورسنت واحد ، ولكن للتجارب متعددة الألوان (اثنان أو أكثر من بروتينات الفلورسنت) ، فإن هدف أحادي اللون ضروري لتصحيح اللون.

تصوير متعدد الألوان ببروتينات الفلورسنت

السبب الرئيسي وراء تطوير لوحة ألوان كاملة من البروتينات الفلورية هو تتبع حدثين خلويين أو أكثر في وقت واحد. بالنظر إلى العدد المتزايد باستمرار من متغيرات البروتين الفلوري المتاحة حاليًا (انظر الجدول 1) ، قد لا تكون عمليات الاقتران المثلى واضحة. غالبًا ما تتطلب الملامح الطيفية للإثارة والانبعاثات التي تظهرها البروتينات الفلورية ومتغيراتها الوراثية ذات الألوان المتغيرة اعتبارات متخصصة عند تصميم تجارب تصوير الخلايا الحية باستخدام اثنين أو أكثر من هذه المجسات الفريدة في وقت واحد. مصدر القلق الأساسي هو القطع الأثرية المحتملة للنزيف (في الواقع ، انتشار التألق من مسبار واحد إلى القناة التي تم تكوينها لمسبار ثان) الناتج عن درجة كبيرة من التداخل الطيفي الذي يظهر عادة بواسطة تركيبات بروتين الفلورسنت.

نزيف من خلال (يشار إليه غالبًا باسم عبور أو الحديث المتبادل) يمكن أن يحدث أثناء الإثارة وانبعاث بروتينات الفلورسنت المختلفة. عند فحص خصائص مجسات الفلورسنت ، يحدث النزف باتجاه الطرف الأزرق من الطيف (أطوال موجية أقصر) ، بينما تكون القطعة الأثرية أكثر وضوحًا عند الأطوال الموجية الأطول (النهاية الحمراء) للانبعاث. على سبيل المثال ، غالبًا ما يمكن اكتشاف البروتين الفلوري الأخضر من خلال مرشحات الانبعاث الحمراء ، ولكن لا يتم تصوير البروتين الفلوري الأحمر عمومًا باستخدام مرشح أخضر. لهذا السبب ، يجب أن يتابع التصوير متعدد الألوان للبروتينات الفلورية بأطول مسبار انبعاث ذو طول موجي تم تصويره أولاً ، باستخدام أطوال موجات الإثارة التي لا تعبر إلى مسبار الطول الموجي الأقصر. على سبيل المثال ، لتصوير EYFP و EGFP في نفس الخلية باستخدام ليزر الأرجون أيون ، سيتم جمع إشارة EYFP أولاً باستخدام الخط الطيفي 514 نانومتر ، والذي يتجاوز ملف امتصاص EGFP ، والانبعاثات التي تم جمعها باستخدام 530- 550 نانومتر مرشح النطاق الترددي. عرض النطاق الترددي لمرشح الانبعاث ليس حرجًا بشكل خاص لأن EYFP فقط هو المتحمس. يتم تصوير EGFP باستخدام مسح ثانٍ من خط ليزر الأرجون أيون 477 نانومتر مع مرشح انبعاث نطاق ضيق للغاية من 490 إلى 500 نانومتر. يجب وضع هذا المرشح بشكل صحيح لاستبعاد مضان EYFP والسماح بالتقاط إشارة محددة من EGFP (مهمة شاقة إلى حد ما). على الرغم من أن ذروة ليزر الأرجون أيون 488 نانومتر أقرب إلى الحد الأقصى للإثارة لـ EGFP ، إلا أنه قريب جدًا من منطقة ممر مرشح الانبعاث ، مما يؤدي إلى احتمال حدوث تداخل من ضوء الليزر المنعكس مع جمع الصور.

الشكل 5 - تصوير متعدد الألوان بالبروتينات الفلورية

من النقاط المهمة التي يجب مراعاتها عند تصوير اثنين أو أكثر من البروتينات الفلورية أن التصوير متعدد الألوان باستخدام المرشحات يتطلب اهتمامًا دقيقًا من أجل التحكم في النزيف من انبعاث الفلورسينت في قنوات غير مقصودة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن التقييد الكبير لعرض نطاق المرشح يحدث على حساب الإشارة إلى الضوضاء (لأن عرض نطاق المجموعة مقيد بشدة) والاستبانة الزمنية بسبب استراتيجيات التجميع المنفصلة المطلوبة. ثانيًا ، عادةً ما تكون التصميمات البصرية المتخصصة ، غالبًا ما تكون خاصة بالتجربة ، مطلوبة لتحقيق ظروف التصوير المثلى. على سبيل المثال ، مجموعات المرشح المتخصصة اللازمة لجمع متغيرات البروتين الفلوري الأخضر في وجود المشتقات الصفراء ليست شائعة في المجاهر متحد البؤر القياسية. مع استمرار تزايد عدد وتغيرات المظهر الطيفي للبروتينات الفلورية ، ستزداد الحاجة إلى مجموعات مرشح محددة وفقًا لذلك.

يتضح في الشكل 5 هي سلسلة من الصور الملتقطة في خطوط الخلايا المنقولة في وقت واحد مع اثنين أو أكثر من البروتينات الفلورية المدمجة مع أهداف التوطين الخلوية الفرعية. قدمت خلايا هيلا في الشكل 5 (أ) تم تصنيفها باستخدام EYFP (النواة) ، ECFP (Golgi) ، و DsRed2FP (الميتوكوندريا) ، ثلاثة تحقيقات مفصولة بوضوح عن طريق مجموعات مرشح مضان واسع النطاق المستخدمة في التقاط الصورة (Nikon CFP ، YFP HYQ ، و Cy3 HYQ). الخلايا الطلائية للكلى الأبوسوم (نعم الخط) المنقولة بواسطة EGFP (tubulin) ، ECFP (النواة) ، و DsRed2FP (الميتوكوندريا) وتم تصويره باستخدام تركيبات المرشحات القياسية واردة في الشكل 5 (ب). وبالمثل ، فإن خلايا الكلى الأرانب (RK-13 في الخط الشكل 5 (ج) تم نقل العدوى باستخدام EYFP (الشبكة الإندوبلازمية) و ECFP (بيروكسيسومات) وتم تصويرها باستخدام مجموعات مرشحات Nikon CFP و YFP HYQ. خلايا نمس الماء الأفريقي (APM) خلايا موضحة في الشكل 5 (د) تم نقل العدوى باستخدام EGFP (tubulin) و DsRed2FP (النواة) ، وخلايا الساركوما العظمية البشرية (U2OS خط الشكل 5 (هـ)) مع نفس المسبار النووي مع ECFP (الميتوكوندريا). أخيرًا ، خلايا الكلى الهامستر الصغيرة (BHK تم نقل خط الخلية) الواردة في الشكل 5 (و) باستخدام EGFP (بيروكسيسومات) و DsRed2FP (الميتوكوندريا). كل الصور واردة في الشكل 5 تم التقاطها باستخدام مجهر واسع المجال ومجموعات فلاتر نيكون المحسّنة لبروتينات الفلورسنت المناسبة.

على الرغم من أن ألمع فئات البروتين الفلوريسنت هي الأخضر والأصفر (انظر الجدول 1) ، يتم فصل الحدود القصوى الطيفية الخاصة بهم بمتوسط ​​20 إلى 25 نانومتر فقط. من الممكن إجراء تجارب متعددة الألوان باستخدام بروتينات الفلورسنت الخضراء والصفراء المقترنة ، ولكن النزيف بين مجموعات المرشح يصبح مشكلة كبيرة. نتيجة لذلك ، لا يتم استخدام تركيبات الأخضر والأصفر معًا في كثير من الأحيان. واحدة من أكثر مجموعات المجسات المزدوجة شيوعًا هي بروتينات الفلورسنت السماوي والأصفر (ECFP و EYFP ، انظر الشكل 5). على الرغم من أن ECFP ليس أكثر سطوعًا من EBFP ، إلا أن استخدامه يقدم ميزتين في أن ECFP متحمس بكفاءة مع خط 457 نانومتر من ليزر الأرجون أيون ، ولا يتعدى المسبار ضوئيًا بسهولة (كما هو موضح في الشكل 2).

يمكن أن يؤدي الجمع بين مشتقات DsRed مع البروتينات الفلورية الخضراء أو الصفراء إلى إنشاء اقتران مفيد من المجسات مع أطياف الانبعاث التي يمكن فصلها بسهولة. ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر في اختيار متغيرات DsRed بسبب الاختلافات في معدلات النضج. علاوة على ذلك ، لأن DsRed ومشتقاته تشكل رباعي الأبعاد ملزمًا في الجسم الحي، فإنها قد تنتج تأثيرات غير مقصودة على بيولوجيا نظام البروتين قيد التحقيق (مثل التجميع أو التوطين في عضيات أخرى غير تلك المقصودة). لا توجد قاعدة عامة فعالة متاحة للتنبؤ بما إذا كانت مشتقات DsRed ستعمل كعلامة اندماج ، وبعض البروتينات قد تتسامح مع قلة القلة بينما لا يتحمل البعض الآخر. للوسم الثلاثي باستخدام البروتينات الفلورية فقط (الشكلان 5 (أ) و 5 (ب)) مزيج من اللون السماوي والأصفر (أو الأخضر) و DsRed يقدم حلاً ممتازًا.

هناك العديد من الحلول الوسط التي يجب مراعاتها عند استخدام اثنين أو أكثر من البروتينات الفلورية في سياق تصوير الخلايا الحية. على سبيل المثال ، يتباطأ معدل الحصول على البيانات مع إضافة كل لون بسبب متطلبات ظروف جمع الصور المختلفة. تصبح معالجة النزف الفلوري أكثر تعقيدًا ، خاصةً لأن الملامح الطيفية للانبعاثات للبروتينات الفلورية تميل إلى أن تكون واسعة جدًا (وغالبًا ما تكون متداخلة). بالإضافة إلى ذلك ، لأن البروتينات الفلورية الشائعة تختلف في السطوع النسبي (الجدول 1) ، قد يتطلب كل لون أوقات تكامل إشارة مختلفة. بروتينات الفلورسنت السماوي والأزرق قاتمة تمامًا وقد تتطلب فترات تجميع أطول تشبع البروتينات الفلورية الخضراء والصفراء الأكثر إشراقًا. لذلك ، من المهم موازنة معلمات التجربة (في الواقع ، التجميع السريع مقابل الفصل الأمثل) مع اختيار البروتينات الفلورية. على سبيل المثال ، يعد الجمع بين EYFP و DsRedFP خيارًا جيدًا لالتقاط الصور بسرعة وكفاءة ، لأن هذه البروتينات الفلورية يمكن أن تشترك في إعداد إثارة واحد ، في حين أن استخدام ECFP مع EYFP يمكن أن يوفر درجة أعلى من الفصل الطيفي.

التصوير الضوئي للبروتينات الفلورية

عند تصميم التجارب باستخدام بروتينات الفلوريسنت الضوئية ، يجب مراعاة العديد من الجوانب المهمة فيما يتعلق بتصوير الخلايا الحية ، وتكوين المجهر ، وبناء المتجهات ، واختيار البروتينات من أجل تحسين معلمات الحصول على الصورة. تُستخدم هذه المجسات الفريدة بشكل أساسي لمراقبة العمليات الديناميكية في الخلايا الحية ، والتي تتطلب غالبًا الحفاظ على ثقافة الخلية في حالة صحية على مرحلة المجهر لفترات طويلة من الزمن. تتوفر مجموعة متنوعة من غرف التصوير المُسخنة المتخصصة المُصنَّعة كإدراج على المسرح تجاريًا لصيانة الخلايا على المدى الطويل على المجهر ، ولكن يجب على المحقق أيضًا مراعاة العديد من المتطلبات الإضافية الأساسية ، مثل مصدر ثاني أكسيد الكربون ، ومرفقات مجهر محكمة الضوء ، والاهتزاز عزل. باختصار ، يجب تحديد الشروط التجريبية اللازمة لتصوير الخلايا الحية بنجاح لفترات طويلة بعناية قبل الشروع في تجارب مع بروتينات التمييز البصري.

يمكن تصوير العديد من بروتينات الفلورسنت الضوئية المضيئة بنجاح باستخدام تقنيات الفحص المجهري التقليدية ذات المجال الواسع ، ولكن يجب إجراء التحقيقات الكمية الجادة التي تتضمن منهجية التبييض الضوئي والتنشيط الضوئي في كثير من الأحيان على مجهر متحد البؤر أو متعدد الفوتون مجهز بأنظمة ليزر متخصصة. على وجه التحديد ، تتطلب كل من PA-GFP و PS-CFP و Kaede و EosFP و Dronpa إضاءة قريبة من الأشعة فوق البنفسجية أو البنفسجي للتنشيط الضوئي أو التحويل الضوئي ، ولكن مصادر الطول الموجي الأطول (الإثارة الزرقاء والخضراء) ضرورية لتصوير البروتينات. لذلك ، يجب أن تكون المجاهر متحد البؤر مجهزة بأشعة ليزر فوق بنفسجية أو بنفسجية ، بالإضافة إلى ليزر ضوئي مرئي ينبعث منه خطوط طيفية زرقاء وخضراء.

التكوين الليزري الحالي الأكثر شيوعًا لأدوات التمييز الضوئية هو الصمام الثنائي 405 نانومتر ، والأرجون-أيون 488 نانومتر ، والهيليوم النيون 543 نانومتر ، على الرغم من الأرجون عالي الطاقة فوق البنفسجي ، والحالة الصلبة التي يضخها الصمام الثنائي ، والهيليوم والكادميوم قد يعمل الليزر أيضًا في التنشيط الضوئي (مع الأخذ في الاعتبار الآثار المحتملة لتلف الخلايا مع التشعيع فوق البنفسجي). تشمل أشعة الليزر التصويرية المفيدة الأخرى عدة نماذج جديدة للديود والهيليوم والنيون وأنظمة كريبتون-أرجون متعددة الأطياف. يجب أن يتم تكوين أدوات Multiphoton بشكل مثالي باستخدام ليزر Ti: Sapphire ذو النطاق العريض الذي يتميز بإخراج قابل للضبط في نطاق الطول الموجي بين 750 و 1100 نانومتر.

الشكل 6 - تحويل ضوئي لـ PS-CFP2 وبروتين اندماج الأكتين

يتضح في الشكل 6 هو التحويل الضوئي لمنتج انصهار البروتين الفلوري PS-CFP2 مع الإنسان بيتا-الاكتين باستخدام ليزر ديود 405 نانومتر للتصوير والتحويل ، وكذلك خط طيفي الأرجون أيون 488 نانومتر لتصوير وتتبع البروتين المحول ضوئيًا. تم استخدام ناقل بلازميد بناء الانصهار لتعدية الأبوسوم الكلوي (نعم الخط) الخلايا الظهارية في غرفة التصوير بالخلية الحية للتعبير عن الأكتين الخيطي المسمى. الشكل 6 (أ) يُظهر خلية واحدة قبل التحويل الضوئي ، يتم تصويرها باستخدام ليزر الصمام الثنائي. تم رسم منطقة اهتمام حول جزء كبير من شبكة الهيكل الخلوي للأكتين (الشكل 6 (ب) مربع أحمر) ، ثم يضيء عند 405 نانومتر بقوة ليزر 40 بالمائة. عند التصوير باستخدام كل من ليزر الدايود وليزر الأرجون أيون (الشكل 6 (ب)) ، يكون بروتين الانصهار PS-CFP2 المحول ضوئيًا مرئيًا بوضوح في التألق الأخضر ، على عكس المسبار غير المحول (الأزرق). بعد 10 دقائق (الشكل 6 (ج)) ، بدأ الأكتين المحول ضوئيًا في الاندماج في خيوط خارج منطقة الاهتمام ، وفي 30 دقيقة (الشكل 6 (د)) يتم تمييز جزء كبير من شبكة الهيكل الخلوي باستخدام أداة التمييز الضوئية.

يتم تحديد مناطق معينة للإضاءة أثناء التحويل الضوئي والتنشيط الضوئي بكفاءة أكبر تحت سيطرة مرشح ضبط الصوت البصري (AOTF) ، والذي يمكن استخدامه بشكل ملائم لتحديد التحديدات الدائرية أو البيضاوية أو المستطيلة أو اليدوية الحرة لتشعيع عينة. يعمل AOTF أيضًا على ضبط مستويات طاقة الليزر لتعديل الكثافة في العينة ، وهو قادر على مسح العينات بالتتابع باستخدام تقنية تُعرف باسم تبديل القنوات عالي السرعة أو تعدد المسارات. يتيح هذا النهج الإثارة المتسلسلة وجمع الانبعاثات من العديد من مجسات الفلورسنت لتجنب القطع الأثرية التي تمر عبر النزيف وفصل أطياف الانبعاث بشكل أكثر دقة.

يمثل تحديد مناطق الاهتمام بالفحص المجهري واسع المجال تحديًا أكبر. غالبًا ما تكون المجاهر على مستوى البحث مجهزة بفتحة متغيرة يمكن تعديلها لإلقاء الضوء على مناطق مختارة في العينة ، على الرغم من دقة أقل بكثير من نظام AOTF المجهر متحد البؤر. يجب أيضًا تكوين أدوات Widefield باستخدام مجموعات مرشح مضان متخصصة من أجل تصوير العديد من بروتينات أداة التمييز الضوئية. نسبيًا ، تعد أدوات (كنفوكل) ومتعددة الفوتونات أكثر ملاءمة للتحليل الكمي للديناميات الخلوية باستخدام تقنيات التحويل الضوئي والتنشيط الضوئي مقارنة بالمجاهر ذات المجال العريض ، وبالتالي يجب أن تكون الخيار الأول لهذه التطبيقات.

يعد توليد مستويات إشارة مضان عالية بدرجة كافية للحصول على الصورة المثلى أيضًا عاملاً مهمًا يجب مراعاته عند استخدام أدوات التظليل الضوئية. في هذا الصدد ، يمكن استخدام معامل الانقراض المولي للامتصاص وقيم العائد الكمومي الفلوري لأنواع البروتين الأصلية والمحول ضوئيًا كمقياس لتحديد مستويات السطوع النسبية. على سبيل المثال ، يمتلك كل من Kaede و mEosFP ملفات تعريف عرض نطاق طيفية مماثلة في المناطق الخضراء (الأصلية) والأحمر (المحول ضوئيًا) من طيف الضوء المرئي. ومع ذلك ، فإن الشكل الأخضر الأصلي لـ Kaede يحتوي على ما يقرب من ضعف كثافة انبعاث الفلورة أو مستوى سطوع mEosFP الأخضر بسبب ارتفاع معامل الانقراض والعائد الكمي. لذلك ، قبل التحويل الضوئي ، تكون نسبة إشارة إلى ضوضاء التصوير في Kaede أعلى بكثير من نسبة mEosFP. بعد التحويل الضوئي ، يتميز كلا البروتينين بمستويات سطوع متشابهة (انظر الجدول 1) وإنتاج صور قابلة للمقارنة.

من بين بروتينات التمييز البصري المتوفرة حاليًا ، Dronpa و Kaede و mEosFP هي الأكثر سطوعًا ، تليها PA-GFP ، والتي تشبه في مستوى السطوع الأنواع المحولة ضوئيًا من Kaede ، ولكنها أقل بكثير من البروتين الأصلي. إن متغير PS-CFP2 المتوفر تجارياً يبلغ نصف سطوعه مثل Kaede ، في حين أن بروتينات التألق و PS-CFP ، في كل من الأشكال الأصلية والمحوّلة ضوئيًا ، هي إلى حد بعيد الأكثر خفوتًا من أدوات التظليل الضوئية ، حيث تنتج حوالي 25 بالمائة فقط من مستوى السطوع المعروض بواسطة Kaede المحول ضوئيًا (الجدول 1). تُظهر أدوات التمييز الأخيرة نسب إشارة إلى ضوضاء أقل بشكل ملحوظ أثناء التصوير ، وهو عامل يجب مراعاته عند التخطيط لتحقيقات الأهداف البيولوجية ذات مستويات الوفرة المنخفضة أو التي تتطلب سرعات تصوير عالية.

الاستنتاجات

تمكّن بطارية البروتينات الفلورية وأدوات التصوير المتوفرة حاليًا عالم الأحياء الخلوي من مراقبة ديناميكيات البروتين في الخلايا الحية بسهولة ، والاستمرار في تقديم رؤى جديدة عديدة حول سلوك البروتينات والعضيات والخلايا. وبذلك ، تكون هذه المجسات الرائعة إيذانا ببدء حقبة جديدة من بيولوجيا الخلية حيث يمكن استخدام تقنيات الحالة المستقرة والفحص المجهري الحركي لفك رموز مسارات وآليات العمليات البيولوجية. إلى جانب التقدم السريع الذي تم إحرازه في تطوير أنظمة مجهر تصوير الخلايا الحية ، بما في ذلك مستوى الضوء المنخفض للإلكترون الذي يضاعف كاميرات CCD ، وأدوات متحد البؤر القرصية ، ومجاهر المسح الشقي ، تم إعداد المسرح لتصوير البروتينات الفلورية وأضواء الضوء على كامل المرئي والمناطق الطيفية القريبة من الأشعة تحت الحمراء بدقة قريبة من الوقت الحقيقي.

المؤلفون المساهمون

ديفيد دبليو بيستون - قسم الفسيولوجيا الجزيئية والفيزياء الحيوية ، جامعة فاندربيلت ، ناشفيل ، تينيسي ، 37232.

جورج اتش باترسون و جينيفر ليبينكوت شوارتز - فرع بيولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي ، المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، ماريلاند ، 20892.

ناثان س و مايكل دبليو ديفيدسون - مختبر المجال المغناطيسي الوطني العالي ، 1800 East Paul Dirac Dr. ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي ، فلوريدا ، 32310.

منتجات نيكون ذات الصلة

مكعبات الفلورسنت الفلورية

تقدم نيكون مجموعة كبيرة من مكعبات مرشح التألق بكفاءة عالية في اكتساب الفلورة لدعم تصوير مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات الفلورية والبروتينات الفلورية.

مصادر الاضاءة

توفر نيكون مصادر ضوء لمجموعة واسعة من احتياجات التصوير ، بدءًا من الأنظمة المحورية للتنظير المجسم إلى أجهزة الإضاءة القائمة على LED لتطبيقات epi-fluorescence ووحدات الليزر القوية لتطبيقات التصوير المتقدمة. تتضمن العديد من حلول الإضاءة لدينا تطبيقات فريدة ويمكن تشغيلها للتحكم عالي السرعة.


البروتين الفلوري الأخضر (GFP)


يعد البروتين الفلوري الأخضر (GFP) علامة بيولوجية متعددة الاستخدامات لرصد العمليات الفسيولوجية ، وتصور توطين البروتين ، واكتشاف التعبير الجيني في الجسم الحي. يمكن إثارة GFP بواسطة خط الليزر 488 نانومتر ويتم اكتشافه على النحو الأمثل عند 510 نانومتر.

نحن نقدم سلسلة من تركيبات الانصهار GFP Invitrogen CellLight لببتيدات الإشارة أو بروتينات بنية الخلية مع emGFP لاستهداف دقيق ومحدد للهياكل دون الخلوية ، بما في ذلك الهيكل الخلوي والميتوكوندريا والمقصورات الإفرازية.

لاستكمال هذه الأدوات ، نقدم أيضًا الأجسام المضادة لـ GFP وتقارنات الأجسام المضادة لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما في ذلك التصوير والنشاف الغربي وقياس التدفق الخلوي. جميع الأجسام المضادة المضادة لـ GFP مناسبة للكشف عن متغيرات GFP الأصلية ومتغيرات GFP وبروتينات الانصهار CellLight.


مناقشة

على الرغم من أكثر من عقد من هندسة GFP الموجهة نحو تطوير FPs ذات الخصائص الضوئية المتنوعة ، فإن فهم العوامل التي تعدل "السطوع" لا يزال غير مؤكد.نظرًا لدرجة السطوع العالية بشكل ملحوظ المرتبطة بـ bfloGFPa1 ودرجة السطوع المنخفضة بشكل غير متوقع لابن عمه التطوري ، bfloGFPc1 ، قمنا بدراسة بنية الدقة الذرية لكلا البروتينين بهدف إنشاء أساس هيكلي لهذا الاختلاف المفاجئ في سطوع GFP داخل كائن واحد ، و cephalochordate أمفيوكسوس.

في هذه الدراسة ، نتناول الأساس الهيكلي للسطوع في GFPs من خلال مقارنة بنيتين متناقضتين من GFP من أمفيوكسوس (bfloGFPs) مع هيكل مجدافيات GFP ذات الصلة التطورية (copGFP). ظهرت آليتان منطقيتان لضبط السطوع والتيسير الكمي من هذا التحليل المقارن. على وجه التحديد ، تتعلق الآليات بالصلابة المطابقة الشديدة للكروموفور في السطوع بشكل استثنائي أمفيوكسوس GFP و bfloGFPa1 وتغييره في بيئة الرابطة الهيدروجينية المحيطة بشق الكروموفور الهيدروكسيل الفينولي.

يرتبط QE بشكل إيجابي مع زيادة صلابة الكروموفور وفي GFPs ، يتم توفير هذه الصلابة من خلال الهيكل الوقائي برميل 13. يبدو بالفعل أن انبعاث الفلورة الأكثر إشراقًا يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالصلابة المعززة للكروموفور المغلف ، عن طريق منع تبديد طاقة الحالة المثارة من خلال أزمرة البقايا المجاورة أثناء الحالة المثارة 14،46،47. يمكن أيضًا أن تقلل الصلابة المحسّنة للكروموفور ، والتي يتم دمجها مع إمالة طفيفة في bfloGFPa1 الساطع ، من عدم الانتماء إلى البقايا ، والذي يُعرف بزيادة التيسير الكمي في GFP 11 ، 48 ، 49. هذا مدعوم أيضًا من الدراسات التي أجريت على GFP Padron الفوتوكرومية حيث يرتبط الانتقال الضوئي بين الحالات الفلورية وغير الفلورية بمزيج من إمالة وتواء الحلقتين اللونيين بالنسبة لبعضهما البعض 50. تأخذ هذه العملية أماكن دون التأثير على مستوية في حد ذاته، مما يشير إلى أن التيسير الكمي عالي التألق لا يرتبط بالضرورة بحلقات الكروموفور المستوية 50. هذا يمكن أن يفسر حقيقة أن bfloGFPa1 لديه أقصى قدر من QE بينما لديه أيضًا 6.8 درجة فرق متحد المستوى بين الحلقات chromophoric. يبدو أن الحد الأقصى للتسهيل الكمي في bfloGFPa1 مرتبط بدلاً من ذلك بمجموعة من العوامل الأخرى المتعلقة بالإمالة الطفيفة بمقدار 10 درجات لحامل اللون عند دفعه في جيبه (لم يتم اكتشاف التواء) ، و / أو حرية الاهتزاز للحلقات ، مثل موضح من خلال تحليل العامل B (انظر القسم أدناه). المقارنة مع الحد الأقصى للتسهيلات الكمية الأخرى محدودة: البروتين الفلوري الأخضر (VFP) من المرجان Cyphastrea microphthalma هو GFP الأصلي الآخر الوحيد الذي تم الإبلاغ عنه حتى الآن بنسبة 100 ٪ QE 38 ، على الرغم من سطوع أقل من bfloGFPa1 بسبب معامل الانقراض المنخفض ، حيث يبلغ 107000 متر مكعب 1 سم −1 38 مقارنة بـ 120،900 مترًا 1 سم −1 لـ bfloGFPa1. لا تتوفر حاليًا بيانات علم البلورات من VFP لمعالجة أوجه التشابه أو الاختلافات مع السمات الهيكلية لـ bfloGFPa1.

عامل الإزاحة الذري البلوري (أو العامل B) هو مقياس جزئي لهذه الصلابة ، يستخدم كبديل مستوى المرونة الناتج عن الطاقة الحرارية. وبالتالي فإن العامل B يعتمد على الدقة وعند مقارنة الهياكل التي تم حلها بنفس الدقة البلورية ، فكلما انخفضت عوامل B لمجموعة معينة من الذرات ، كان الهيكل المرتبط أكثر صلابة. قمنا بفحص PDB لهياكل GFP التي تم تنقيحها بدقة مماثلة مثل bfloGFPa1 ووجدنا 15 منها (الجدول S2) تمت دراستها أيضًا في مكان آخر 51. قمنا بعد ذلك بتحليل متوسط ​​عامل درجة الحرارة للذرات التي تشتمل على الكروموفورات لهذه GFPs ووجدنا أن العامل B يتراوح بين 9.5 × 2 (2CD1) و 21.1 × 2 (2DUG) (الجدول S2). يتم الإبلاغ عن جميع هذه الأشكال من GFP باستخدام QE على غرار نموذج GFP الأصلي وبالتالي أقل بكثير من 100 ٪ ، مما يعزز ملاحظة أنه كلما انخفض العامل B ، زادت الصلابة وزاد التيسير الكمي. في الواقع ، بالمقارنة ، يحمل 100٪ QE bfloGFPa1 متوسط ​​عامل B منخفضًا نسبيًا يبلغ 8.7 Å 2 للذرات التي تتكون منها الكروموفور ، مما يشير إلى أن حامل اللون مقيد بشدة في جيب chromophore في bfloGFPa1. لوحظ هذا الاتجاه في الواقع على وجه التحديد عند ، أو حول ، chromophore في حد ذاته لأن تحليلات العامل B حول البقايا 60 كانت حوالي 40 2 لـ bfloGFPc1 (بمعنى أنه يشير بوضوح إلى منطقة مرونة عالية) ، بينما تكون & lt10 2 لـ bfloGFPa1. يشير عامل B المنخفض لـ bfloGFPa1 بوضوح إلى أن الكروموفور ومحيطه يتمتعان بمرونة هيكلية محدودة (ومن ثم صلابة عالية) ، وهو أمر معروف على نطاق واسع في الأدبيات أنه يرتبط بتيسير كمية أكبر (على سبيل المثال ، 29 ، 46 ، 52).

إذا كان من الواضح أن العامل B يلعب دورًا مهمًا في قيادة التيسير الكمي في GFP ، فمن المحتمل أيضًا أنه ليس العامل الوحيد وقد يتعين على العديد من العوامل العمل في تآزر للوصول إلى أقصى قدر من التيسير الكمي. يمكن الإشارة إلى ذلك على سبيل المثال بواسطة متحولة 3CB9 المحتوية على الجليسين ، والتي تتوافق مع GFP الحساس للاختزال مع إدخال حمض أميني إضافي ، في هذه الحالة أرجينين 51. في هذا المتحولة ، تم الإبلاغ عن أن QE منخفض على الرغم من انخفاض عامل B بشكل خاص عند 6.2 Å 2 ، مما يدل على صلابة عالية للكروموفور وبالتالي ارتفاع التيسير الكمي. يشير هذا إلى أن هناك عاملًا آخر يؤثر على التيسير الكمي ، والذي يمكن أن يكون جيب الكروموفور. في الواقع ، نعتقد أن الصلابة التوافقية لـ chromophore bfloGFPa1 قد تكون جزئيًا نتيجة الحجم الأصغر لجيب chromophore الخاص به بالنسبة إلى ابن عمه الباهت للغاية bfloGFPc1. ومع ذلك ، فإن حجم جيب chromophore bfloGFPa1 أصغر بنسبة 65 ٪ تقريبًا من نفس الجيب المحسوب للهيكل البلوري للأشعة السينية الثابت لـ eGFP ومكافئًا تقريبًا لتلك الموجودة في GFP ذات الصلة التطورية ، أي copGFP ، ومع ذلك كلاهما GFPs هي 5-10 مرات باهتة من bfloGFPa1. تشير هذه الملاحظة إلى أن حجم جيب chromophore وحده لا يمكن أن يكون العامل الوحيد الذي يعدل التيسير الكمي والسطوع في النهاية. من المحتمل أن يساهم حجم الجيب المقيد في الحفاظ على حامل اللون في شكل متوتر عالي الطاقة ، مما يساهم في زيادة كفاءة نقل الفوتون والتألق ، مع زيادة حماية الكروموفور من عوامل التبريد 53،54.

من خلال مقارنات هياكل GFP التي تمتلك خصائص طيفية متفاوتة على نطاق واسع ولكنها معزولة عن نفس الكائن الحي ، تمكنا من تحديد الميزات الهيكلية الأخرى غير الواضحة من محاذاة التسلسل وحدها والتي من المحتمل أن تساهم في تعديل التيسير الكمي والسطوع في FPs المطورة بشكل طبيعي. في ال أمفيوكسوس تم توضيح هياكل GFP ووصفها هنا ، من الواضح أن حزم chromophore مقابل Pro ، Pro 55 ، التي تفترض حالات مطابقة العمود الفقري متميزة في كل GFP في GFP شديد السطوع ، bfloGFPa1 ، رابطة الببتيد ، Ile 54 - Pro 55 ، تتبنى اتجاه رابطة الدول المستقلة بينما نفس الببتيد ، Ile 54 - Pro 55 يتبنى اتجاهًا عابرًا في bfloGFPc1 الخافت جدًا. تعمل مطابقة العمود الفقري المتباينة هذه على تغيير مواضع الجزء الحلزوني المغلف بالكروموفور ، مما يؤدي إلى تكوين رابطة هيدروجينية واحدة بين نيتروجين إيميدازولينون وأكسجين الكربونيل الأساسي لـ Pro 55 في bfloGFPc1. من المتوقع أن يؤدي مثل هذا التغيير في أنماط الترابط الهيدروجيني للبرميل مع حامل اللون إلى تغيير (تغييرات) في كفاءات انبعاث الكروموفور وسطوع التألق الناتج 12.

مجموعة إضافية من التغييرات في بيئات chromophore عند مقارنة مراكز bfloGFPa1 و bfloGFPc1 حول الحالة الدوارة للكروموفور المتصل بـ Trp 157. في bfloGFPa1 ، يعطل هذا الدوران الرابطة الهيدروجينية بين NH إندولي لـ Trp 157 وجزء الهيدروكسيل لـ Tyr 159 الذي يحدث في bfloGFPc1. ينتج عن هذا التشوه الهيكلي أن جزء فينيل من Trp 157 متاخمًا للطرف الفينولي لحامل اللون ، مما يزيد من الكراهية للماء لبيئة chromophore bfloGFPa1 مقارنة ببيئة bfloGFPc1. يبدو أن هذا الدوران مستقر من خلال التفاعل من الحافة إلى الوجه بين الشقوق العطرية لـ Trp 157 و Tyr 159. بدون بنية ثلاثية الأبعاد محددة تجريبياً ، يمكن أن يكون هذا النوع من تفاعل الطبقة الثانية تحديًا لتحديده بشكل لا لبس فيه.

حاليًا ، تركز الهندسة الوراثية لـ GFPs أكثر فأكثر على تحسين QEs ولكنها لا تزال تمثل تحديًا مستمرًا مقارنة بتعديل الخصائص البيوكيميائية و / أو الخصائص الحيوية لـ FPs 3،13،55. لذلك ، قد يمثل bfloGFPa1 بديلًا محسنًا تطوريًا GFP يمكن من خلاله متابعة التطور الموجه للمعلمات المرغوبة الأخرى ، بما في ذلك حالة قليلة القسيمات ، وتحمل أكبر للأس الهيدروجيني الحمضي ، ومقاومة أفضل للتبييض ، وسرعة طي ونضج كروموفور ، ومعامل انقراض كبير وإثارة واسعة و الانبعاثات الأطياف. نظرًا لكفاءتها الكمية المثالية ، ومجموعة pKa الفلورية الواسعة ومعدلات الطي والنضج اللونية السريعة نسبيًا ، أمفيوكسوس يبدو أن bfloGFPa1 مرشح مثالي للتطبيقات والجهود الهندسية المستقبلية. لقد تحقق هذا بالفعل من خلال استخدام bfloGFPa1 في الاختبارات الحيوية حيث كان زيادة السطوع والاستقرار الكيميائي الحيوي عاملين أساسيين في توفير إشارة غير متوفرة بطريقة أخرى باستخدام FPs التقليدية 56،57. بالإضافة إلى ذلك ، فإن GFP من Branchiostoma lanceolatum، أنواع الأمفيوكسوس من أوروبا ، متاحة الآن تجاريًا (تحت اسم lanGFP) وتظهر حوالي 4 أضعاف السطوع مقارنة بـ eGFP 58 ، وبالتالي يمكن مقارنتها بـ bfloGFPa1. يشير هذا بقوة إلى أن amphioxus GFPs تحمل بالفعل وعودًا جذابة للاستخدام في المستقبل في نطاق واسع من التطبيقات أكثر من المتاح حاليًا.

استخدمنا التقنيات التقليدية لإحداث الطفرات في المخلفات الحرجة في محاولة أولى لإثبات دور المخلفات الرئيسية من جيب الكروموفور المرتبطة بدرجة سطوع عالية مقابل منخفضة أو كفاءة كمومية. أجرينا بدائل الأحماض الأمينية الموجهة للموقع على bfloGFPa1 بناءً على الاختلافات مع bfloGFPc1 و copGFP. تم إنشاء طفرات bfloGFP باستخدام طريقة QuikChange (Stratagene ، سان دييغو ، كاليفورنيا) القائمة على PCR. تم التعبير عن الإنزيمات الطافرة وتنقيتها كما هو موضح في هذه الدراسة من أجل bfloGFP من النوع البري. بالإضافة إلى عناصر تحكم wtGFP ، أكملنا خمس طفرات فردية مختلفة تم اختيارها لتوفير مزيد من الفهم للعلاقة بين GFPs المتنوعة داخل amphioxus 34. حاولنا بعد ذلك إجراء تحليل مقارن طيفي وكيميائي حيوي على المسوخات الخمسة باستخدام نفس البروتوكولات البروتينية والطيفية تمامًا المستخدمة في bfloGFPa1. كانت الطفرات P55H و C139S (P55 و C139 كلاهما فريد من نوعه لـ GFPa1) ، F155L و Y62H (F155 و Y62 شائعان في GFPa1 و copGFP ويساهمان في تغليف chromophore) و R195A (مشترك في جميع GFPs ومسؤول عن الترابط الهيدروجين في تجويف الكروموفور). تتضمن هذه الطفرات بالتالي بقايا ذات دور مهم في توفير الاستقرار النشط لحامل اللون (الشكل 4).

تم التعبير عن طفرات bfloGFP الخمسة بنجاح وعرضها مضانًا قويًا ، باستثناء C139S و F155L و R195A التي أظهرت كثافة مضان أقل نسبيًا ، ولكن دائمًا مع طيف مشابه لطيف bfloGFPa1. كان طيف الامتصاص قابلاً للقياس أيضًا لكل متحولة وظل متشابهًا بين جميع bfloGFPs ، مع إظهار قيم أكبر نسبيًا لـ F155L. ومع ذلك ، لا يمكن إجراء توصيف كيميائي حيوي وطيفي كامل ومفصل للطفرات لأن جميع المسوخات كانت غير مستقرة ، وتترسب باستمرار من المحلول ، والذي لم يتم ملاحظته بخلاف ذلك للتحكم في wtGFP ، أو عند الحفاظ عليه في الظلام. وبالتالي ، فإن تحديد تركيز البروتين الدقيق اللازم لحساب معامل الانقراض ، لإجراء تجارب كيميائية حيوية ولتفسير القياسات الطيفية من طفرات bfloGFPa1 لم يكن ممكنًا باستخدام البروتوكولات الحالية. ومع ذلك ، تشير هذه البيانات إلى أن الطفرات الخمس التي أجريناها في جيب حامل اللون لا يبدو أنها تؤثر نوعيًا على الخصائص الطيفية لـ bfloGFPs ، بينما تشير بوضوح إلى أن كل من البقايا المستبدلة (المقترحة لكل منها لها وظيفة حاسمة في جيب chromophore) يلعب دور رئيسي في المساهمة في الاستقرار النشط للبروتين بأكمله.

يحتوي Amphioxus على 16 bfloGFPs منظمة في ستة أقسام 34 ، كل منها يظهر بدائل مختلفة لواحد (أو أكثر) من البقايا التي قمنا بتحويرها تجريبياً في هذه الدراسة. وبالتالي ، فإن التواجد المشترك للعديد من GFPs المختلفة في كائن حي واحد يشير إلى أن عدم التوازن في الطاقة بسبب استبدال البقايا المذكورة هنا يجب تعويضه في النظام الطبيعي ببدائل إضافية في مناطق أخرى من البروتين ، من أجل توفير استقرار البروتين . من الواضح أن هذا سيناريو محتمل بالنظر إلى أن هوية تسلسل البروتين بين الكتل تختلف من 49 إلى 65 ٪ 34 وأن FPs بشكل عام يبدو أن لها مناطق متميزة (منطقة الكروموفور المركزية المحفوظة نسبيًا مقابل المناطق المتغيرة N و C) ذات التباعد. التطور والوظائف الجزيئية المختلفة 59. في هذه المرحلة ، تبدو الهندسة الوراثية لـ bfloGFPa1 جذابة ، ولكنها تتطلب فحص البدائل الترادفية و / أو البروتوكولات البديلة من أجل الحفاظ على استقرار البروتين في المحلول 12 ، 13. سيكون إجراء طفرات للمخلفات بخلاف تلك الخمسة المعروضة هنا أمرًا أساسيًا في الدراسات الهندسية المستقبلية ، لا سيما بالنظر إلى أن الطفرات التي تؤدي إلى ألوان أخرى من التألق تختلف عن تلك التي اختبرناها 9 ، مما يعطي الاحتمال للحفاظ على الكفاءة الكمية القصوى لـ bfloGFPa1 الهندسي مع أطياف انبعاث مختلفة.


نتائج ومناقشة

تنبؤات سطوع البروتين الفلوري

قبل إجراء القياسات في الجسم الحي ، قمنا بعمل تنبؤات كمية حول البروتينات الفلورية التي من المتوقع أن تكون أكثر سطوعًا. قمنا بحساب السطوع المتوقع لكل بروتين فلورسنت بواسطة منتج العائد الكمي ومعامل الانقراض كما ورد في الأدبيات (الشكل 1 أ يانغ وآخرون.، 1996 شانير وآخرون.، 2004 ، 2008 ، 2013 Nguyen and Daugherty ، 2005 Shcherbo وآخرون.، 2009 لام وآخرون.، 2012 لي وآخرون.، 2013). نظرًا لأن ظروف التصوير مثل الطول الموجي للإثارة ومجموعات مرشح الانبعاث المستخدمة تؤثر على السطوع المرصود لبروتين الفلورسنت ، فقد سعينا إلى استخدام هذه القيم لعمل تنبؤات أكثر فائدة لسطوع البروتين الفلوري للمقارنة المباشرة مع نتائجنا.

الشكل 1: السطوع المتوقع للبروتينات الفلورية والتألق الذاتي للجنين. (أ) تم الإبلاغ عن السطوع لبروتينات الفلورسنت في ذروة أطوال موجات الإثارة. (ب) السطوع المتوقع لمقارنات البروتين الفلوري التي أجريت في الشكل 2. أطوال موجات الإثارة والانبعاثات في الأعلى. (ج) تألق ذاتي الجنين. الخطوط هي متوسطات أجنة متعددة ، والنقاط الصغيرة هي أجنة فردية تم الحصول عليها باستخدام كاشف طيفي. تمثل النقاط الكبيرة بيانات تألق ذاتي متحد البؤر لقرص الغزل.

لتسهيل التقييم البصري والكمي لأطياف البروتين الفلوريسنت مع خطوط الليزر المحددة ومجموعات المرشحات التي نستخدمها نحن والآخرون ، قمنا بتطوير أداة قائمة على Microsoft Excel بسيطة وقابلة للتخصيص نسميها Spectrum Viewer (ملف إضافي S1). باستخدام هذه الأداة ، قمنا بحساب السطوع المتوقع لكل بروتين فلوري من خلال دمج جزء ذروة انبعاث البروتين الفلوري تحت مرشح الانبعاث وضربه في العائد الكمي (الشكل 1 ب). استخدمنا بعد ذلك عارض الطيف لرسم أطياف الامتصاص والانبعاث الطبيعية للبروتينات الفلورية في مقارناتنا مع الطول الموجي للإثارة ومجموعات مرشح الانبعاث التي استخدمناها للتصوير (الشكل 2 ، A-D ، العمود الثالث). يتوفر عارض الطيف كملف إضافي S1.

الشكل 2: سطوع البروتين الفلوري في الجسم الحي. (أ - د) إلى اليسار ، يتم تركيب الأجنة جنبًا إلى جنب وتصويرها في نفس الظروف المستخدمة في القياس الكمي. المركز الكمي لكل مقارنة. تمثل كل نقطة بيانات جنينًا واحدًا. تشير الأشرطة السوداء إلى الوسط و 95٪ CIs. على اليمين ، الإثارة (أعلى) وأطياف الانبعاث (أسفل) لبروتينات الفلورسنت المقارنة. يشار إلى الطول الموجي للإضاءة (مثل ، الخط الأزرق) ومجموعات المرشحات المستخدمة للكشف (Em. ، تظليل رمادي).

قياس C. ايليجانس تألق ذاتي للجنين بأطوال موجية مختلفة

نظرًا لأن الجينات المحورة الفلورية أحادية النسخة تنتج أحيانًا إشارة مضان ضعيفة في الجسم الحي ، فقد قمنا بتقييم كمي لمستويات التألق الذاتي الذاتية لـ C. ايليجانس الأجنة. قمنا بقياس التألق الذاتي باستخدام طريقتين مختلفتين. في إحدى الحالات ، استخدمنا كاشفًا طيفيًا لقياس التألق الذاتي عند أطوال موجات انبعاث مختلفة. في الجانب الآخر ، استخدمنا مجهرًا متحد البؤر للقرص الدوار مع أشعة الليزر القياسية ومجموعات المرشحات وكاميرا جهاز اقتران الشحنات المضاعفة للإلكترون (EM-CCD). كانت نتائج كلتا التجربتين متسقة (الشكل 1 ج) ومن المرجح أن تكون متشابهة في أنظمة التصوير الأخرى المماثلة. وجدنا أن التألق الذاتي هو الأبرز تحت الإثارة 488 نانومتر عبر مجموعة واسعة من أطوال موجات الانبعاث (الشكل 1C). وهكذا ، عندما يتم التعبير عنها عند مستويات منخفضة ، فإن البروتينات الفلورية المُثارة بضوء 488 نانومتر ، بما في ذلك GFP ، سيكون لها ضوضاء خلفية كبيرة في C. ايليجانس الأجنة. كان لدى الأجنة خلفية أقل تألقًا ذاتيًا مع إثارة 514 نانومتر (الشكل 1C). يشير هذا إلى أنه عند تصوير البروتينات بمستويات منخفضة في الأجنة ، قد تكون الإثارة 514 نانومتر والبروتينات الفلورية الصفراء مثل mNeonGreen و mYPet أفضل من GFP وإضاءة 488 نانومتر. وجدنا أن التألق الذاتي يكون أقل باستخدام إثارة 405 و 442 نانومتر ، لكننا نتجنب بشكل عام التصوير الحي في هذه الأطوال الموجية بسبب زيادة السمية الضوئية.

توليد نسخة مفردة من الجينات المعدلة وراثيا

للمقارنة المباشرة بين البروتينات الفلورية في الجسم الحي ، استخدمنا CRIPSR / Cas-9 لتوليد سلالات قادمة من نسخة مفردة من الجينات المتحولة تعبر عن بروتينات الفلورسنت المتميزة. كانت التركيبات المستخدمة لإنشاء هذه السلالات متطابقة باستثناء تسلسل البروتين الفلوري المشفر في كل حالة ، وتم إدخال كل جين متحور في نفس الموضع في C. ايليجانس الجينوم (الشكل 2 انظر المواد والأساليب). لقد أكدنا الضربات من خلال ملاحظة نمط توطين التألق المتوقع في غشاء البلازما ، وأكدنا أن الضربات كانت نسخة واحدة عن طريق التنميط الجيني PCR وتسلسلها (الشكل التكميلي S1B).

سطوع البروتين الفلوري في الجسم الحي

لتقييم سطوع هذه المجموعة من الجينات المحورة للبروتين الفلوريسنت في الجسم الحي ، قمنا بالتصوير على مراحل C. ايليجانس يتم تثبيت الأجنة جنبًا إلى جنب في بعض الحالات لإجراء مقارنات مباشرة ، عن طريق الفحص المجهري للقرص الدوار (كنفوكل). قمنا أولاً بمقارنة GFP و mNG من خلال قياس التألق من الأجنة المضاءة بإثارة 488 نانومتر.على الرغم من أنه كان من المتوقع أن يكون mNG أكثر إشراقًا من GFP استنادًا إلى البيانات المختبرية (الشكل 1 و A و B) ، وجدنا أن إشارة GFP كانت تقريبًا ضعف سطوع إشارة mNG في الجسم الحي (الشكل 2 أ). تختلف القيم المتوسطة في كل مقارنة اختلافًا كبيرًا (ص & lt 0.05) باستثناء ما تم تحديده بـ ns (لا يختلف اختلافًا كبيرًا عن طريق Student ر اختبار مع تصحيح ويلش) ، وجميع قيم الأهمية (ص القيم) في الشكل التكميلي S2B.

مع إضاءة 514 نانومتر ، كان mYPet أيضًا أكثر إشراقًا من mNG (الشكل 2 ب). على الرغم من أن حساباتنا توقعت أن يكون mYPet تقريبًا ضعف سطوع mNG (الشكل 1 ب) ، فقد لاحظنا أن mYPet يبلغ حوالي أربعة أضعاف سطوع mNG في المتوسط ​​(الشكل 2 ب). تشير البيانات من مقارنات mNG مع GFP و mYpet إلى أن mNG ليس ساطعًا في الجسم الحي كما توقعنا بناءً على معامل الانقراض المنشور والعائد الكمي (Shaner وآخرون.، 2013 الأشكال 1B و 2 ، A و B).

بعد ذلك قمنا بفحص سطوع أربعة بروتينات فلورية حمراء (TagRFP-T و mRuby2 و mCherry و mKate2). أجرينا تجارب مع مجموعتين مختلفتين من مرشحات الانبعاث ، 561LP و 630 / 75BP ، والتي تتوافق جيدًا مع بعض أو كل هذه البروتينات الفلورية الحمراء. مرشح الانبعاث 561LP هو الأمثل لأنه يجمع غالبية ذروة الانبعاثات لكل بروتين الفلورسنت (الشكل 2C). مرشح ممر النطاق ، مثل 630 / 75BP ، هو أقل مثالية (قارن العمود الأيمن ، الشكل 2 ، C و D) ، على الرغم من أنه قد يكون مفيدًا لتقليل التداخل الطيفي للتصوير ثنائي أو ثلاثة ألوان.

باستخدام الإضاءة 561 نانومتر ، قمنا بقياس سطوع البروتينات الفلورية الحمراء الأربعة. وجدنا أن TagRFP-T كان الأكثر سطوعًا باستخدام مجموعة مرشح 561LP (الشكل 2C). باستخدام مجموعة التصفية 630 / 75BP ، كان متوسط ​​شدة التألق من TagRFP-T لا يمكن تمييزه عن ذلك من mCherry (الشكل 2D). تتوافق هذه النتائج مع طيف الانبعاث ذو التحول البرتقالي لـ TagRFP-T ومع تنبؤاتنا المحسوبة لهذه البروتينات الفلورية (الأشكال 1B و 2 و C و D). كان mRuby2 ، الذي كان من المتوقع أن يكون ألمع البروتينات الفلورية الحمراء الأربعة (الشكل 1 ب) ، الأقل سطوعًا بغض النظر عن مجموعة مرشح الانبعاث التي استخدمناها (الشكل 2 و C و D). مجتمعة ، تكشف هذه البيانات عن سطوع البروتين الفلوري في الجسم الحي الذي لا يتطابق دائمًا مع التنبؤات التي تم إجراؤها باستخدام المعلمات المقاسة في المختبر.

التباين في سطوع البروتين الفلوري بين الجينات المحورة أحادية النسخ

نظرًا لأننا توقعنا أن يكون mNG أكثر سطوعًا بمقدار 1.8 مرة من GFP ، فقد فوجئنا بأن أجنة GFP كانت أكثر إشراقًا من أجنة mNG (الشكلان 1B و 2A). إسكات Germline في C. ايليجانس يمكن أن يكون لها تأثيرات غير متجانسة على بعض الجينات المحورة أحادية النسخة (شيراياما وآخرون.، 2012). وبالتالي ، يمكن التعبير عن الجينات المحورة للبروتين الفلوري والتي تكون متطابقة من جميع النواحي الأخرى على مستويات مختلفة ، مما يتسبب في تناقضات بين السطوع المتوقع والملاحظ. للسؤال عما إذا كانت الاختلافات في وفرة البروتين الفلوري يمكن أن تفسر الاختلافات في شدة التألق التي لاحظناها ، قمنا بتحليل مستويات البروتين في كل من سلالاتنا المعدلة وراثيًا أحادية النسخة بواسطة لطخة غربية (الشكل التكميلي S1). لاحظنا ما يقرب من ضعف مستويات مكس 5-دفع GFP :: بروتين PH مقارنة مع mNG :: بروتين PH (الشكل التكميلي S1C مقترن ر اختبار، ص = 0.0408) ، والذي قد يكون ناتجًا عن إسكات جزئي للجينات المحورة أو تنظيم ما بعد النسخ لهذه الجينات المحورة.

لمزيد من التحقيق في التناقض بين تنبؤاتنا وملاحظاتنا ، قمنا بمقارنة مجموعة ثانية من سلالات GFP متطابقة و mNG أحادية النسخ المعدلة وراثيًا. تم دمج هذه البروتينات الفلورية في الطرف C لجين هيستون (صاحب 58). كما هو متوقع ، كان الأسفار الناتج ألمع في النوى (الشكل 3 أ). للتحكم في تأثيرات توقيت دورة الخلية على وفرة بروتين الهيستون ، قمنا بترتيب الأجنة في غضون 3 دقائق من بعضها البعض. قمنا بقياس شدة التألق في نواة خلية جنينية واحدة (خلية EMS) في كل جنين ووجدنا أن متوسط ​​شدة التألق للأجنة المعبرة عن GFP والأجنة هيستون mNG لم تكن مختلفة بشكل كبير (الشكل 3 أ). على الرغم من أننا وجدنا في مقارنتنا الأولية للجينات المحورة الغشائية أن الأجنة التي تعبر عن GFP كانت أكثر إشراقًا من تلك التي تعبر عن mNG (الشكل 2 أ) ، تشير كلا النتيجتين إلى أنه في وقت مبكر C. ايليجانس الأجنة ، mNG ليست مشرقة مقارنة مع GFP ، كما هو متوقع (الشكل 1B).

الشكل 3: مقارنات بين GFP و mNeonGreen في السلالات المعدلة وراثيًا أحادية النسخة وكقلبات في الجينات الذاتية. (أ - ج) تمثل كل نقطة بيانات جنينًا واحدًا أو أشرطة سوداء حيوانية تمثل المتوسط ​​ومجال الموثوقية 95٪. (أ) الأجنة معربا عن اندماج البروتين هيستون - الفلورسنت. تم قياس شدة الإسفار لنواة خلية EMS (رؤوس الأسهم البيضاء). (ب) الديدان البالغة التي تعبر عن اندماج البروتين الفلوري في البلعوم (رؤوس سهام بيضاء). الإدخال هو صورة مدينة دبي للإنترنت للديدان. (ج) جيكس -3 الضربة القاضية ، (د) الراب -1 الضربة القاضية ، و (هـ) nmy-2 تم تصوير أجنة من النوع البري والبرية باستخدام إضاءة 488 و 514 نانومتر. الخطوط المتقطعة تحدد الخطوط العريضة للأجنة غير المرئية في ظل ظروف التصوير المحددة.

لأن مستويات البروتين في C. ايليجانس يمكن أن يتأثر السلالة الجرثومية والجنين المبكر بآليات الإسكات (شيراياما وآخرون.، 2012) ، قارنا GFP و mNG في ملف C. ايليجانس الأنسجة التي لم يتم الإبلاغ عنها لإظهار الصمت. لقد استبدلنا مروج السلالة الجرثومية في تركيبات قالب إصلاح GFP و mNG :: PH الأصلية بامتداد ميو 2 المروج ، الذي يدفع التعبير في البلعوم (Okkema وآخرون.، 1993) ، وتولّدت الضربات المحورة لنسخة واحدة في نفس الموضع الجيني المستخدم لمقارنتنا الأولية. قمنا بتصوير الديدان على مراحل و GFP و mNG مضان ووجدنا مرة أخرى عدم وجود فرق كبير بين متوسط ​​شدة GFP و mNG (الشكل 3 ب). تتوافق هذه البيانات مع النتائج التي توصلنا إليها في الأجنة المبكرة وتتسق مع احتمال أن تلعب العوامل خارج إسكات السلالة الجرثومية دورًا أيضًا في تحديد التألق الملحوظ من الجينات المحورة من نسخة واحدة.

مقارنة البروتينات الفلورية الخضراء كعلامات داخلية

شرعنا بعد ذلك في مقارنة GFP و mNG اللذين تم إدخالهما في الجينات الموجودة في مواقعها الداخلية. اخترنا ثلاثة مواضع جينومية توجد لها بالفعل طرق N-terminal MNG -جيكس -3, الراب -1, و nmy-2 (ديكنسون وآخرون., 2015)وقمنا بإنشاء ضربات GFP متطابقة في تلك المواقع بنفس الطريقة المستخدمة لإنشاء سلالات mNG الأصلية. قمنا بتصوير الأجنة من السلالات المزدوجة جنبًا إلى جنب في نفس المرحلة التنموية كما في مقارناتنا السابقة (الشكل 3 ، C –E). باستخدام إضاءة 488 نانومتر ، لم نجد توافقًا في الآراء في مقارناتنا: كان mNG :: GEX-3 أكثر إشراقًا من GFP: كان GEX-3 mNG و GFP :: RAP-1 ساطعًا بنفس القدر وكان GFP :: NMY-2 أكثر إشراقًا من mNG :: NMY-2 (الشكل 3 ، C – E).

نظرًا لأن التألق الذاتي للجنين في الخلفية يكون أعلى عند إضاءة 488 نانومتر (الشكل 1C) ، قمنا أيضًا بتصوير هذه الأجنة باستخدام إضاءة 514 نانومتر. يكون التألق الذاتي للخلفية أكثر انتشارًا عندما تكون مستويات إشارة البروتين الفلوري منخفضة. لذلك كنا مهتمين أكثر ، في هذه المقارنة ، بـ جيكس -3 أجنة تلقائية لأننا لاحظنا أن لديها أقل تعبير عن الجينات الثلاثة التي قمنا بتمييزها (الشكل 3 ، C –E). على الرغم من أننا لم نتمكن من مقارنة شدة التألق للأجنة المضاءة بـ 488- مقابل 514 نانومتر بسبب الاختلافات في إعداد الحصول على الصور (على سبيل المثال ، طاقة الليزر ، مجموعات المرشحات) ، لاحظنا أن mNG :: GEX-3 تم تصويره بـ 514 نانومتر أعطت الإضاءة نوعيًا أفضل النتائج في ظل ظروف التصوير هذه (الشكل 3 ج). تُظهر الأجنة من النوع البري في كل صورة مستوى الخلفية الفلورية الذاتية التي ساهمت في ظل ظروف التصوير المحددة.

الثبات الضوئي للبروتينات الفلورية في الجسم الحي

يحدد سطوع البروتين الفلوري ، جنبًا إلى جنب مع معدل التبييض الضوئي ، مدى فائدة البروتين الفلوري للتصوير بفاصل زمني (Shaner وآخرون.، 2005 Shaner، 2014 Davidson and Campbell، 2009). لاختبار معدل التبييض الضوئي للبروتينات الفلورية المستخدمة في المقارنة الأولية في الشكل 2 ، قمنا بتصوير الأجنة بمرور الوقت تحت الإضاءة المستمرة (الشكل 4 ، أ - ج). تم تطبيع شدة الإسفار إلى السطوع الأولي المقاس لكل جنين ، وتم رسم المتوسطات لكل سلالة بمرور الوقت (الشكل 4 ، أ - ج ، يسار). كان كل منحنى تبيض ضوئي مناسبًا للانحلال الأسي أحادي الطور ، وتم حساب نصف العمر (الشكل التكميلي S3B). لتقدير ميزانية الفوتون (Lee وآخرون.، 2013) ، أو مقدار الإشارة المنبعثة من كل بروتين فلوري بمرور الوقت ، قمنا بدمج كثافة التألق المقاسة لكل جنين حتى 50٪ من شدتها الأولية (الشكل 4 ، أ-ج ، يمين).

الشكل 4: الثبات الضوئي للبروتين الفلوري في الجسم الحي. (أ - ج) تم قياس شدة الإسفار في الأجنة بمرور الوقت. تتم مقارنة ملف التبييض الضوئي وميزانية الفوتون لانصهار البروتين الفلوري المرتبط بالغشاء. تمثل كل نقطة بيانات جنينًا واحدًا ، وتمثل الأشرطة السوداء المتوسط ​​و 95٪ CIs.

عرض GFP و mNG فترات نصف عمر مماثلة لتبييض الصور ، مع كون mNG أكثر ثباتًا للضوء (الشكل 4 أ والشكل التكميلي S3B). ومع ذلك ، لأن أجنة GFP أكثر إشراقًا ، في المتوسط ​​، كانت الكثافة المتكاملة ، أو ميزانية الفوتون ، لأجنة GFP أعلى قليلاً من تلك الخاصة بـ mNG (الشكل 4 أ). لوحظ أن mYPet هو photobleach أسرع بكثير من mNG ، كما هو متوقع (الشكل التكميلي S3B Shaner وآخرون.، 2013). نظرًا لأن mYPet أكثر إشراقًا من mNG ، فإن ميزانيته للفوتون أقل قليلاً من ميزانية mNG (الشكل 4 ب). من بين البروتينات الفلورية الحمراء التي اختبرناها ، كان mKate2 أبطأ متوسط ​​معدل التبييض الضوئي ونفس ميزانية الفوتون مثل mCherry (الشكل 4C). يشير ملف التبييض الضوئي لـ mKate2 إلى أنه يعرض إشعالًا (تنشيط ضوئي) في الإطارات القليلة الأولى من الإضاءة (الشكل 3C والشكل التكميلي S3). لم يتم الإبلاغ عن التنشيط الضوئي في التوصيف الأولي لـ mKate2 ولكن تمت ملاحظته لبروتين سلائفه ، mKate (Shcherbo وآخرون.، 2009). نستنتج أن mRuby2 و mYPet أظهروا ثباتًا ضوئيًا ضعيفًا نسبيًا في الجسم الحي وأن GFP و mNG و mKate2 كانوا الأكثر ثباتًا للضوء.

ملخص وتوصيات

تشير نتائجنا إلى توصيات محددة لاستخدام البروتينات الفلورية في التجارب المجراة في C. ايليجانس الأجنة ، وتشكل خط أساس للمقارنات في أنظمة أخرى في الجسم الحي. بشكل عام ، لاحظنا سطوعًا أقل من المتوقع لـ mNG. في بعض المقارنات ، كان أداء GFP و mNG متشابهًا (الشكلان 2 أ و 3) ، ولكن من المدهش أنه في بعض التجارب ، كان كل منهما أكثر إشراقًا من الآخر. كان GFP أكثر إشراقًا من mNG في جين متحور وراثي معبر عنه بمستويات عالية وفي nmy-2 علامة داخلية (الشكلان 2 أ و 3 هـ). ومع ذلك ، كان mNG أكثر إشراقًا من GFP في التعبير الأضعف جيكس -3 علامة داخلية (الشكل 3 ج). تشير هذه النتائج إلى أن GFP و mNG قد يكون كل منهما مثاليًا في سياقات مختلفة وأنه قد يلزم إجراء اختبار لتحديد أفضل بروتين الفلوريسنت الأخضر لتجربة معينة. كان mYPet أكثر إشراقًا من mNG ، لكن معدله العالي من التبييض الضوئي يجعله خيارًا غير جذاب للتصوير طويل المدى (الشكلان 2 ب و 4 ب). تمت مقارنة البروتينات الفلورية الحمراء الأربعة التي اختبرناها فقط في ظل مجموعة واحدة من الظروف ، وهو ما يمثل قيودًا على هذه الدراسة. ومع ذلك ، كان أداء TagRFP-T و mCherry و mKate2 مشابهًا من حيث السطوع ، وكان mKate2 يتمتع بديناميكيات التبييض الضوئي الفائقة في الجسم الحي (الأشكال 2 و C و D و 4 C).

قياساتنا للتألق الذاتي في وقت مبكر C. ايليجانس تسليط الضوء على قيمة أخذ مثل هذه القياسات قبل تصميم تجارب التصوير في الجسم الحي. ل C. ايليجانس أعطت الأجنة ، باستخدام إضاءة 488 نانومتر ، خلفية أعلى من التصوير باستخدام إضاءة 514 نانومتر (الشكل 1C). لذلك ، بالنسبة للجينات ذات مستويات التعبير المنخفضة ، يمكن تحقيق نسب إشارة إلى ضوضاء أفضل باستخدام بروتين فلوري أصفر ومثير مع إضاءة 514 نانومتر بدلاً من بروتين الفلورسنت الأخضر وإضاءة 488 نانومتر (الشكل 3 ج). بسبب التبييض الضوئي السريع الذي لاحظناه لـ mYPet (الشكل 4 ب) ، سنختار mNG لتمييز البروتينات المعبر عنها بمستويات أقل في C. ايليجانس الأجنة لتصوير الخلايا الحية على المدى الطويل. على الرغم من أن هذه القياسات مفيدة للنظر في البروتينات الفلورية التي يجب استخدامها في الجسم الحي ، بسبب التباين في حساسية الكاشف وتشتت الضوء المنبعث بأطوال موجية مختلفة ، إلا أنها قد لا تعكس خصائص الفلورسنت الفعلية لـ C. ايليجانس الأجنة.

لاحظنا العديد من الاختلافات بين تنبؤاتنا وقياساتنا في الجسم الحي لسطوع البروتين الفلوري ، وعلى الأخص بالنسبة لـ mNeonGreen و mRuby2 (الشكلان 1B و 2). توضح هذه النتائج قيمة المقارنات المباشرة في الجسم الحي لاختيار البروتينات الفلورية لاستخدامها في الجسم الحي. نظرًا لأننا قمنا بقياس أداء البروتين الفلوري وجهاً لوجه ، في الجسم الحي ، فإننا نتوقع أن الاختلافات في السطوع التي لاحظناها كانت بسبب مزيج من الاختلافات الجوهرية في سطوع البروتين الفلوري والتأثيرات التراكمية لأي آليات تنظيمية (على مستوى الرنا المرسال أو البروتين) في النظام البيولوجي الذي استخدمناه. تشير الحالات التي تم فيها انتهاك توقعاتنا الكمية المستندة إلى الخصائص الجوهرية لبروتينات الفلورسنت إلى أن الآليات التنظيمية الأخرى هي بالفعل عامل في تحديد أداء البروتين الفلوري.

على الرغم من أن تحديد المتغيرات بخلاف السطوع الجوهري التي قد تؤثر على سطوع البروتين الفلوري في الجسم الحي خارج نطاق هذا العمل ، إلا أن هناك مجموعة متنوعة من الاحتمالات المثيرة للاهتمام التي يجب مراعاتها. أحد الاحتمالات هو أن الاختلافات في تسلسل الترميز في البروتينات الفلورية تؤدي إلى إسكات تفاضلي للجينات المحورة التي قارناها. إسكات Germline في C. ايليجانس ثبت أن لها تأثيرات غير متجانسة على بعض الجينات المحورة من نسخة واحدة (شيراياما وآخرون.، 2012). وبالتالي ، يمكن التعبير عن الجينات المحورة للبروتين الفلوري والتي تكون متطابقة من جميع النواحي الأخرى على مستويات مختلفة ، مما يتسبب في تناقضات بين السطوع المتوقع والملاحظ. من المحتمل أن تختلف أي تأثيرات للإسكات على التعبير والسطوع المرصود في أنظمة النماذج المختلفة. الاحتمال الآخر هو أن البروتينات الفلورية تنضج وتتحلل بمعدلات مختلفة في الجسم الحي عنها في المختبر (Iizuka وآخرون.، 2011 هيبيش وآخرون.، 2013). يمكن أن تؤثر درجة الحرارة على أداء البروتينات الفلورية المصممة للتعبير في أنظمة الثدييات (37 درجة مئوية) ، مثل C. ايليجانس يتم الاحتفاظ بها وتصويرها بالقرب من درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية).

يعد تحديد الآليات الخلوية والعضوية الكامنة وراء الأداء المحدد للسياق للبروتينات الفلورية أمرًا مهمًا لفهم كيف يمكن أن تكون النتائج الشاملة في أي نظام واحد. في الوقت الحاضر ، من غير المعروف مدى قابلية تطبيق النتائج المحددة لهذه الدراسة في الأنظمة النموذجية بعد ذلك C. ايليجانس. لم تكن البروتينات الفلورية التي وجدنا أنها مثالية هي نفسها الموجودة في مقارنة شاملة في الجسم الحي لبروتينات الفلورسنت في الخميرة (Lee وآخرون.، 2013) ، مما يشير إلى بعض الإمكانات لقواعد خاصة بالكائن للتحكم في أداء البروتين الفلوري في الجسم الحي. هناك حاجة لدراسات مستقبلية في أنظمة متنوعة للكشف عما إذا كانت هناك أفضل مجموعة من البروتينات الفلورية على مستوى العالم. استخدمنا مجهرًا متحد البؤر للقرص الدوار لمقارناتنا. ومع ذلك ، فإن الاختلافات في مصدر الإضاءة وأجهزة الكشف المستخدمة في تقنيات الفحص المجهري للضوء المختلفة (على سبيل المثال ، المجال الواسع ، ومضان الانعكاس الداخلي الكلي ، والورقة الضوئية) قد تغير الأداء المرصود لبروتينات الفلورسنت في تجارب التصوير الحي.

تقدم هذه الدراسة معلومات ذات قيمة عملية حول البروتينات الفلورية التي يجب استخدامها في التجارب في الجسم الحي ، بالإضافة إلى أداة يستخدمها الباحثون لتقييم أطياف البروتينات الفلورية المختلفة بالنسبة إلى موارد التصوير الخاصة بهم. النتائج قابلة للتطبيق بشكل خاص للتجارب في C. ايليجانس وتقترح قيمة إجراء تجارب مماثلة في أنظمة نموذجية أخرى ، بالإضافة إلى تقديم بروتينات فلورية مرشحة جيدة للاختبار.


الاستنتاجات

إن معرفة الآليات التي تسمح للمستقلبات والجزيئات الكبيرة بالتحرك عبر الخلية لأداء العمليات البيوكيميائية أو التنظيمية غير مكتملة في الوقت الحالي. ستكون الأساليب القائمة على GFP مفيدة لمعرفة المزيد عن وظيفة التقسيم وكيفية تحقيق التنظيم. من خلال مشاريع الجينوم واسعة النطاق ، سيتم قريبًا التنبؤ بكل تسلسلات البروتينات الموجودة في الخلايا النباتية للعديد من الأنواع من تسلسل الحمض النووي. يمكن تحديد موقع (مواقع) هذه البروتينات بواسطة طرق اندماج GFP. يمكن فحص تفاعلات اثنين من البروتينات بواسطة طرق GFP / FRET. يمكن تتبع حركة البروتينات داخل الخلية والنبات. سيسهل وضع العلامات على المقصورة باستخدام GFP تحليل حجم وشكل وعدد الأجزاء المختلفة وقد كشف بالفعل عن ميزات غير معروفة سابقًا لمورفولوجيا المقصورة والتفاعل مع الأجزاء الأخرى. يمكن استخدام مستشعرات GFP لتحديد التدرجات في الأيونات وتركيز المعادن ، ودرجة الحموضة والجهد ، أو لاكتشاف نشاط إنزيمات معينة. يمكن أن تكشف FRAP و FLIP و FCS عن وجود اتصال بين الأجزاء ومعدلات حركة الجزيئات داخل المقصورات أو بينها. كل هذه البيانات ستولد صورة أكثر اكتمالاً عن التنظيم الوظيفي للخلية النباتية.


أعمدة فقرية فارغة لانصهار البروتينات الفلورية (منظمة حسب اللون)

لكل طاولة:

  • يتم سرد الإثارة والانبعاثات القصوى في نانومتر.
  • السطوع هو نتاج معامل الفسخ والعائد الكمي مقسومًا على 1000.
  • pKa هو الرقم الهيدروجيني الذي تكون عنده كثافة التألق 50٪ من قيمته القصوى.
  • النضج هو الوقت المناسب للحصول على الفلورة نصف القيمة القصوى.
  • يصف الهيكل الحالة الأحادية أو القلة للبروتين. العديد من FPs عبارة عن مونومرات بتركيز منخفض ولكنها عرضة للثنائي بتركيز عالٍ ، لذلك لوحظ هذا هنا. البروتينات المشتقة من GFP والتي تحتوي على طفرة A206K أحادية اللون في جميع التركيزات ، لذلك يتم ملاحظة هذه الطفرة عند وجودها.
  • لمزيد من المعلومات حول خصائص العديد من هذه البروتينات ، انظر:
      ، طرق الطبيعة 2016 يوليو 13 (7): 557-62. : قاعدة بيانات لمستخدمي البروتينات الفلورية التي أنشأتها Talley Lambert في كلية الطب بجامعة هارفارد
  • المزيد من المراجع أدناه
  • اقفز إلى:

    أزرق / الأشعة فوق البنفسجية

      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - التعبير الفيروسي للثدييات. - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - التعبير البكتيري - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات
      - التعبير الجرثومي
      - التعبير الجرثومي
      - التعبير البكتيري - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري

    لون أخضر

      - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير العدسي للثدييات - التعبير عن الحشرات - الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - سمك الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - تعبير الخميرة - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات (SGFP2 الخالي من السيستين)
      - تعبير الثدييات (هذا ناقل ثنائي الاتجاه وليس ناقل بروتين اندماج) - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الخميرة
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - التعبير الجرثومي
      - تعبير الثدييات

    أصفر

      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
    • pKT0090 - تعبير الخميرة
    • mVenus-pBAD - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الخميرة - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - التعبير البكتيري - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - التعبير البكتيري - تعبير الثدييات

    البرتقالي

      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - التعبير البكتيري - الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - التعبير الجرثومي
      - تعبير الثدييات - تعبير الخميرة - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات
      - التعبير الجرثومي
      - تعبير الثدييات - تعبير الخميرة - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - التعبير الجرثومي
      - تعبير الثدييات - التعبير الفيروسي للثدييات
      - تعبير الثدييات - التعبير العدسي للثدييات - الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - الزرد / Xenopus / C.elegans / قنفذ البحر - التعبير البكتيري - تعبير الخميرة
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات

    بعيد الاحمر

      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - التعبير الجرثومي
      - التعبير الجرثومي
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات. - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات. - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - تعبير الخميرة
      - تعبير الثدييات

    قريب من الأشعة تحت الحمراء

      - تعبير الثدييات. - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات. - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات. - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري

    تحول ستوكس الطويل

      - خميرة التعبير
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - التعبير البكتيري - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الخميرة - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري - تعبير الثدييات

    قابل للتنشيط ضوئيًا (على سبيل المثال ، إيقاف تشغيل)

    أطوال موجات الإثارة والانبعاث بعد التنشيط.

      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري - تعبير الخميرة - تعبير الخميرة - تعبير الخميرة - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - التعبير الجرثومي
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات. - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات. - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات. - التعبير البكتيري

    قابل للتحويل ضوئيًا (مثل الأخضر إلى الأحمر)

      - تعبير دودة
      - التعبير الجرثومي - الخميرة
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - تعبير الخميرة
      - تعبير الثدييات. - التعبير البكتيري

    الصور قابلة للتحويل (على سبيل المثال ، إيقاف تشغيل إلى إيقاف تشغيل)

      - التعبير الجرثومي
      - التعبير الجرثومي
      - التعبير الجرثومي
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات

    الموقتات الفلورية

      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري
      - تعبير الثدييات - تعبير الثدييات - التعبير البكتيري

    الملخص

    البروتين الفلوري الأخضر (GFP) - nanobody هو سلسلة واحدة V.حتم تطوير مجال الجسم المضاد H مع نشاط ارتباط محدد ضد GFP ويظهر كأداة قوية للعزل والهندسة الخلوية لانصهار البروتينات الفلورية في العديد من مجالات البحث البيولوجي المختلفة. باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية والقياس الحراري للمعايرة الحرارية ، نحدد التفاصيل الجزيئية لـ GFP: تكوين معقد GFP-nanobody وشرح أساس التقارب العالي وفي نفس الوقت الخصوصية العالية لربط البروتين. على الرغم من أن GFP-nanobody يمكن أن يربط أيضًا YFP ، إلا أنه لا يمكنه ربط CFP ذي الصلة أو البروتينات الفلورية الأخرى من سلسلة mFruit. يختلف CFP عن GFP فقط داخل الكروموفور المركزي وفي موضع واحد من الأحماض الأمينية السطحية ، والذي يقع في واجهة الربط. باستخدام هذه المعلومات ، قمنا بتصميم متغير CFP (I146N) قادر أيضًا على ربط GFP-nanobody بتقارب عالٍ ، وبالتالي توسيع مجموعة أدوات تحقيقات الفلورسنت المشفرة وراثيًا والتي يمكن عزلها باستخدام GFP-nanobody.


    اختيار البروتين الفلوري

    منذ أن تم استنساخ جين البروتين الفلوري الأخضر الأصلي (GFP) في عام 1992 1 ، كان هناك انفجار في مجموعة متنوعة من البروتينات الفلورية (FPs) المتاحة. يمكن دمجها في بروتين في الخلايا أو الحيوانات المعدلة وراثيًا ، أو اقترانها بجسم مضاد ، أو حتى استخدامها كركيزة في التفاعلات الأنزيمية.

    قبل اختيار بروتين فلوري لأي من هذه التطبيقات ، هناك عدد من الاعتبارات الرئيسية التي يجب وضعها في الاعتبار.

    جرب كلاهما إذا كان من الممكن أن تكون بروتينات الاندماج الطرفي C أفضل بشكل عام. تأكيد التوطين بجسم مضاد.

    تأكد من أن لديك ليزر صحيح للإثارة ، وأن قمم الانبعاث لا تتداخل.

    حدد FP الأكثر سطوعًا والذي يلبي أيضًا متطلباتك التجريبية.

    حدد نضجًا قصيرًا للأحداث السريعة / الحساسة للوقت.

    اختر FP مع ثبات ضوئي عالي للتجارب ذات المدة الطويلة.

    تأكد من تحسين درجة الحموضة ودرجة الحرارة والأكسجين لـ FP الخاص بك.

    تحقق من أن تسلسل كودون FP محسن / مناسب لأنواعك - خاصة عند استخدام البلازميدات الأقدم.

    بشكل عام ، حاول استخدام FP أحادي.

    لعرض خصائص بعض بروتينات الفلورسنت الأكثر شيوعًا ، ألق نظرة على بطاقة المرجع السريع الخاصة بنا.

    C مقابل N: أي محطة؟

    سواء اخترت دمج FP الخاص بك في الطرف C أو N للبروتين الذي يهمك يعتمد إلى حد كبير على البروتين نفسه: كيف يتم طيه وما إذا كانت المحطة التي تختارها لها متطلبات وظيفية أم لا. على سبيل المثال ، إذا كان الطرف C مطويًا داخل البروتين ، فمن غير المرجح أن تتلقى أي إشارة FP أو إذا كان البروتين الخاص بك مشقوقًا بعد التحويل في الطرف الذي تم دمج FP الخاص بك به ، فسيتم إزالة FP الخاص بك من البروتين الخاص بك من اهتمام.

    إذا كانت لديك الموارد أو كانت تجربتك جديدة ، فقد يكون من الأفضل استنساخ كل من التركيبات ذات العلامات الطرفية C و N لتحديد الخيار الأفضل. وجدت إحدى المجموعات البحثية أن المزيد من بروتينات الاندماج الطرفي C تتمركز في الحيز الخلوي المقصود أكثر من بروتينات الاندماج ذات العلامات الطرفية N 2. ومع ذلك ، من المهم التأكيد على أنه في حين تميل البروتينات ذات العلامات الطرفية C إلى التوطين والتصرف كما هو متوقع ، إلا أنه ليس من الممكن دائمًا التنبؤ بذلك.

    يجب تأكيد توطين بروتين الاندماج باستخدام جسم مضاد ضد البروتين الأصلي. يمكن استخدام التألق المناعي للتحقق من أن بروتين الاندماج يتمركز بشكل صحيح في اللطخة المناعية سيساعد في تأكيد أن بروتين الاندماج هو الحجم الصحيح ويتم التعبير عنه بالمستويات المتوقعة ويمكن أن يساعد الترسيب المناعي المشترك في تقييم كيفية تفاعل بروتين الاندماج مع الركائز المعروفة 3.

    الإثارة والانبعاث والسطوع

    إذا كنت تخطط لاستخدام FPs متعددة ، فمن المهم اختيار FPs ذات قمم انبعاث مميزة - بالإضافة إلى قمم الإثارة التي يمكنك استهدافها باستخدام الليزر المتاح لديك. إذا تداخلت ذروات الانبعاثات ، فسيكون من الصعب ، أو ربما من المستحيل ، التمييز بينها.

    أنت تريد عادةً ألمع FP ضمن الأطياف المتاحة لديك من أجل تحقيق إشارة واضحة والتغلب على أي تألق محتمل في الخلفية. قيم السطوع هي نتاج معامل انقراض البروتين والعائد الكمي. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تفسير الرقم الناتج ، وبالتالي فإن سطوع FP بالنسبة إلى FP محدد جيدًا مثل EGFP ، هو مقياس بديل شائع.

    النضج والتبييض

    يحدد النضج المدة التي يستغرقها FP لينطوي بشكل صحيح ، ويشكل حامل اللون ، ويبدأ في التألق. بالنسبة للأحداث الحساسة للوقت في الخلايا الحية ، يمكن أن يكون وقت النضج القصير مهمًا. على سبيل المثال ، يمكن طي Superfolder GFP (sfGFP) في أقل من 10 دقائق ، بينما يمكن أن يستغرق mOrange2 أكثر من أربع ساعات.

    التبييض هو مقياس للثبات الضوئي ، أي كم من الوقت بعد الإثارة يفقد حامل اللون قدرته على إصدار الضوء. إذا كنت تخطط لإجراء تجارب طويلة الفاصل الزمني ، ففكر في FP مع ثبات ضوئي عالي. يتمتع T-sapphire بعمر نصفي للتبييض (t½ الوقت لمعدل انبعاث أولي من x فوتون / ثانية ينخفض ​​إلى النصف) يبلغ 25 ثانية ، لكن EGFP أكثر استقرارًا ، مع تبييض t½ 174 ثانية 4.

    الظروف البيئية

    مثل معظم البروتينات ، تتأثر FPs بمستويات الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة والأكسجين. اعتمادًا على البيئة التي تخطط لاستخدام FP الخاص بك فيها ، قد تحتاج إما إلى تعديل الظروف قليلاً أو تحديد FP أكثر ملاءمة.

    يمكن أن يؤثر الرقم الهيدروجيني على الإثارة وقمم الانبعاث ، كما أن غالبية FPs حساسة للحمض. يمكن لبعض FPs تغيير كثافة الفلورسنت عند تغيرات الأس الهيدروجيني (مثل pHTomato). تعد قيمة pKa مؤشرًا جيدًا على حساسية الأس الهيدروجيني: فهي تُظهر الرقم الهيدروجيني الذي يكون نصف حوامل الكروموفور فيه متألقًا.

    تؤثر كل من درجة الحرارة ومستويات الأكسجين على أوقات النضج: تميل ظروف نقص الأكسجين إلى تأخير أوقات النضج ، كما تفعل درجات الحرارة خارج النطاق الأمثل لـ FP (على سبيل المثال ، تم تحسين EGFP للعمل عند 37 درجة مئوية). ومع ذلك ، فإن FPs الأحدث مثل UnaG ، وهو GFP معزول عن ثعبان الماء العذب الياباني (أنغيلا جابونيكا) ، يتألق حتى عندما تكون مستويات الأكسجين منخفضة 5.

    تحسين كودون

    نظرًا لأن معظم FPs مشتق من قنديل البحر أو البروتينات المرجانية - بدلاً من شيء مثل خلايا وأنسجة الثدييات التي من المحتمل أن تستخدمها فيها - يمكن أن يكون هناك اختلاف بين الأنواع في أكواد الأحماض الأمينية المستخدمة. هذا يمكن أن يؤدي إلى ضعف التعبير FP وبالتالي إشارة منخفضة.

    لحسن الحظ ، تم تحسين العديد من الإصدارات الأحدث من FPs لتعكس تفضيلات خلايا الثدييات. في GFP على سبيل المثال ، قام Jürgen Haas وزملاؤه بتحسين الإشارة 40-120 مرة عن طريق تعديل تسلسل كود GFP 6.

    إذا كنت تستخدم بلازميدًا قديمًا لتوليد بروتينات الاندماج ، فقد لا يحتوي على تسلسل FP معدل. تحقق لمعرفة ما إذا تم تعديل تسلسل FP الخاص بك للاستخدام في أنواع معينة.

    قلة القلة

    من المهم تحديد ما إذا كان FP الخاص بك هو مونومر أم ثنائي (عادةً ما يتم الإشارة إلى المونومرات بالحرف "m" الذي يسبق اسم البروتين ، على سبيل المثال mCherry) ، وما إذا كان هذا يؤثر على تجربتك أم لا. كان العديد من FPs في وقت مبكر عرضة لتشكيل أوليغومرات ، ويمكن أن تؤثر عملية oligomerization على الوظيفة البيولوجية لبروتين الاندماج. EGFP ، على سبيل المثال ، هو مونومر يمكن أن يشكل ثنائيات عند استخدامه بتركيزات عالية بما يكفي ، والتي يمكن أن تشوه العضيات تحت الخلوية 7 أو تعطل التجارب مثل FRET 8.

    يوصى حقًا بـ FPs أحادية اللون في الغالبية العظمى من الحالات.

    لمزيد من المعلومات حول FPs ، تفضل بزيارة صفحة GFP الخاصة بنا.

    1. Prasher ، D.C ، Eckenrode ، V. K. ، Ward ، W. W. ، Prendergast ، F.G & amp Cormier ، M. J. الجين 111, 229–233 (1992).

    2. Palmer، E. & amp Freeman، T. التحقيق في استخدام بروتينات الانصهار C- و N-terminal GFP لدراسات التوطين تحت الخلوية باستخدام المصفوفات الدقيقة للترنس العكسي. شركات Funct. علم الجينوم 5, 342–353 (2004).

    3. Snapp، E.L. البروتينات الفلورية: دليل مستخدم بيولوجي الخلية. اتجاهات خلية بيول. 19, 649–655 (2009).

    4. Shaner، N.C، Steinbach، P. A. & amp Tsien، R. Y. دليل لاختيار البروتينات الفلورية. نات. أساليب 2, 905–909 (2005).

    5. Kumagai، A. وآخرون. بروتين فلوري يحفز البيليروبين من عضلة ثعبان البحر. زنزانة 153, 1602–1611 (2013).

    6. Haas، J.، Park، E.-C. & amp Seed ، B. قيود استخدام Codon في التعبير عن بروتين سكري مغلف HIV-1. بالعملة. بيول. 6, 315–324 (1996).

    7. سناب ، إ. وآخرون. تكوين صهاريج ER مكدسة عن طريق تفاعلات البروتين منخفضة التقارب. J. خلية بيول. 163, 257–269 (2003).

    8. Zacharias، D.A، Violin، J.D، Newton، A.C & amp Tsien، R. Y. علم 296, 913–6 (2002).


    شاهد الفيديو: Раскрытие памяти прошлых жизней с помощью Телепата 640 (يونيو 2022).