معلومة

هل تمتد المحاور العصبية حول وصلات كهذه؟

هل تمتد المحاور العصبية حول وصلات كهذه؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كنت أتساءل عما إذا كانت المحاور تتصل أحيانًا بهذا الشكل:

لاحظ أنني لا أشير إلى المواقف التي يكون فيها مسار تلك الشبكة منحنيًا وتكون الخلية العصبية الثالثة / الرابعة قريبة تمامًا من الخلية العصبية الأولى مثل الثانية ، فأنا أتحدث عن المواقف التي تكون فيها الخلية العصبية الثالثة / الرابعة جسديًا 2-3x بعيدًا عن العصبون الأول عن العصبون الثاني أو أكثر. هذا وثيق الصلة بالمحاكاة العصبية.


ما هي الضمانات المحوار؟ (مع الصور)

تحتوي معظم الخلايا العصبية على العديد من الإسقاطات أو العمليات التي تنبت من جسم الخلية ، أو سوما ، تسمى "الخلايا العصبية". تحتوي الخلايا العصبية على العديد من العمليات ، معظمها عبارة عن تشعبات ، ولكن معظم الخلايا العصبية لها أيضًا عملية واحدة فريدة تسمى المحور العصبي. التشعبات هي العمليات التي تستقبل إشارات من الإسقاطات الوافدة للخلايا الأخرى ، بينما المحاور هي العصبونات الإسقاطية ، وترسل إشارات إلى الخلايا الأخرى ، حتى في المناطق البعيدة من الدماغ أو النخاع الشوكي. تنقسم المحاور ويمكن أن ترسل فرعًا إلى سوما الخلية الخاصة بها. تُعرف هذه الإسقاطات باسم "الضمانات المحورية".

بينما تحتوي الخلية العصبية على محور عصبي واحد فقط ، فمن الشائع أن تتشعب هذه العملية المفردة عند نقاط متعددة بطولها. يحتوي المحوار على إسقاط رئيسي ، وهو الموقع الطرفي ، الذي يحدد مكان "المشاريع" للخلية ، ولها فروع. أحد الفروع التي تتشعب من المحور الرئيسي هو الضمانات المحورية ، وهي تعود إلى الخلية نفسها.

في نهاية المحاور العصبية توجد "نبتات" تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا الأخرى ، غالبًا على العمليات التغصنية لتلك الخلايا المستقبلة. هناك أيضًا نقاط الاشتباك العصبي التي تتشكل على طول المحور العصبي. في حالات العمليات النخاعية ، تتشكل المشابك فقط عند فواصل الميالين التي تسمى "عقد رانفييه".

غالبًا ما ترتبط الضمانات المحورية بآليات التغذية الراجعة التي تساعد الخلية على تنظيم نمط إطلاق النار الخاص بها. نظرًا لأن هذه الضمانات ستعود نحو الخلية التي يتصل بها المحور العصبي ، فيمكنها بسهولة تكوين نقاط الاشتباك العصبي مع الخلية نفسها ، أو الخلايا الأخرى المجاورة. في حالة الخلايا الهرمية ، غالبًا ما تكون الخلايا المثيرة - خلايا تكامل المعلومات الشائعة في دماغ الثدييات - قريبة من الخلايا العصبية الداخلية المثبطة. نظرًا لأن الضمانات المحورية يمكن أن تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع هذه الخلايا العصبية المثبطة القريبة ، فإنها تعمل كنظام تنظيم. تثير الخلايا الاستثارة الخلايا المثبطة القريبة التي تمنعها من إطلاق النار في كثير من الأحيان.

تتشعب الضمانات المحورية من مقاطع المحوار الأولية في المناطق غير المبطنة. هذا منطقي لأن الميالين يعمل كغطاء عصبي عندما ترسل خلية قليلة التغصن عملية بشكل متكرر حول عملية محور عصبي لخلية أخرى. ومع ذلك ، فإن عملية oligodendrocytic واحدة ستواجه صعوبة في الالتفاف حول ثلاثة أجزاء متصلة في نقطة واحدة ، وهو ما يحدث عندما تشكل مقاطع المحوار فروعًا.

يعتقد بعض العلماء أن هذا النوع من الضمانات هو آلية حفظ خلوية أكثر من آلية مصممة لتشفير أنماط إطلاق النار وتنظيم معلومات الإشارات من خلال المسارات العصبية. وذلك لأن بعض الخلايا الاستثارة معرضة لخطر استجابة السمية مع الكثير من النشاط. إذا تم إطلاق خلية استثارة وحفز الضمانات الجانبية المحوار نفس الخلية مرة أخرى ، فسيحدث شلال إطلاق يتكاثر ذاتيًا ، مما يتسبب في ظاهرة تُعرف باسم "سمية الإثارة".


المواد والأساليب

تنقية خلايا NG2 + من النخاع الشوكي البالغ.

استخدمنا بروتوكول عزل جديدًا (باي وآخرون ، 2013) للحصول على خلايا NG2 + عالية النقاء من الفئران البالغة (& # x0003e8 أسابيع) C57BL / 6J. بعد تشريح الحبل الشوكي ، تمت إزالة الأوعية الدموية السطحية وفصل الأنسجة مع التربسين و EDTA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم نسج الأنسجة المهضومة عند 800 & # x000d7 ز لمدة 5 دقائق ، تغسل ثلاث مرات ، ثم توضع على تدرج بيركول (GE Healthcare ، كتالوج # 17-0891-02). تم طرد التدرج لمدة 30 دقيقة عند 2000 دورة في الدقيقة. تم جمع الأجزاء الخلوية وغسلها وتعليقها في 1 مل من وسط DMEM / F12 يحتوي على 10 ٪ من مصل بقري جنيني. تم طلاء الخلايا في دورق مقاس 75 سم 2 مطلي بـ PLL ونمت عند 37 & # x000b0C في 5 ٪ CO2 لمدة 4 أسابيع ، ثم مرت لتطهير. بعد المرور ، كانت 99٪ من الخلايا عبارة عن + NG2 ، & # x0003c5٪ تعبر عن GFAP ، ولم يكن هناك تعبير يمكن اكتشافه لعلامات oligodendrocyte الناضجة ، مثل CNP أو MBP. عبّرت معظم الخلايا (84٪) عن مستقبل PDGF & # x003b1 ، وهو علامة غالبًا ما ترتبط بالخلايا السليفة قليلة التغصن. أعربت غالبية الخلايا (99 ٪) عن علامات النسب قليلة التغصن A2B5 و Olig2 و O4 (في المقاطع اللاحقة).

زراعة الخلايا العصبية DRG.

تم حصاد الخلايا العصبية DRG كما هو موصوف سابقًا (Tom et al. ، 2004b). باختصار ، تمت إزالة DRGs من فئران Sprague Dawley البالغة (Zivic-Miller Laboratories Harlan). بعد تقليم الجذور المركزية والمحيطية ، تم تحضين DRGs في محلول كولاجيناز II (200 وحدة / مل Worthington Biochemicals) و dispase II (2.5 U / ml Roche) في HBSS. تم غسل DRGs المهضوم في HBSS-CMF وسحنه برفق ثلاث مرات ، متبوعًا بالطرد المركزي منخفض السرعة. تم تعليق الخلايا العصبية المنفصلة في وسائط Neurobasal A المكملة بـ B-27 و GlutaMAX والبنسلين & # x02013streptomycin (Invitrogen) للعد.

أطول مقايسة ثمرة نيريت.

كانت الأغطية مغطاة بالبولي- l -lysine (PLL 0.1 mg / ml Sigma-Aldrich) طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة ، ثم غسلها بـ ddH20. تم غسل Coverslips في laminin (5 & # x003bcg / ml Invitrogen) في HBSS-CMF وحضنت (37 & # x000b0C) لمدة ساعتين قبل طلاء الخلايا. بالنسبة لتجارب الخلية أحادية الطبقة NG2 + ، تم طلاء الخلايا الدبقية في الحبل الشوكي للفأر البالغ NG2 + بكثافة (60000 خلية / بقعة) لمدة 24 ساعة. عولجت الخلايا باستخدام chondroitinase ABC (ch'ase 0.1 U / ml في محلول Seikagaku الملحي) لمدة 4 ساعات قبل إضافة الخلايا العصبية المنفصلة DRG (1500 & # x020132000 الخلايا العصبية / ساترة) إلى الثقافة. تمت إضافة DRGs ، جنبًا إلى جنب مع ch'ase في وسط جديد ، والسماح لها بالنمو لمدة 24 ساعة. بالنسبة لأغطية نمو اللامينين ، تم غسل الأغطية المطلية بـ PLL في 1 & # x003bcg / ml أو 5 & # x003bcg / ml laminin في CMF واحتضانها عند 37 & # x000b0C. بعد ساعتين من الحضانة ، تمت إضافة الخلايا العصبية DRG المنفصلة إلى الثقافة. سمح بالنمو لمدة 24 ساعة ، ثم تم إصلاح الثقافات بنسبة 4 ٪ بارافورمالدهيد وملطخة لـ NG2 (كواشف أبحاث Millipore Bioscience) و & # x003b2-III-tubulin (Sigma). بالنسبة لدراسات النمو ، تم قياس أطول نورت لكل خلية عصبية تنمو على طبقة أحادية كاملة من خلايا NG2 + باستخدام برنامج MetaMorph.

مقايسة انحباس.

كانت الأغطية مغطاة بـ PLL ثم بالنيتروسليلوز. تم بعد ذلك غسل الأغطية في اللامينين لتشكيل ركائز بتركيزات مختلفة [0 & # x003bcg / ml ، 1 & # x003bcg / ml ، أو 5 & # x003bcg / ml في Ca 2+ / Mg 2+-free HBSS (HBSS-CMF ) BTI] لمدة 2+ ساعة عند 37 & # x000b0C. تم طلاء خلايا NG2 + في الحبل الشوكي للفأر البالغ على الأغطية بكثافة 15000 خلية / ساترة. تم وضع الأغطية في الحاضنة (37 & # x000b0C). بعد أربع وعشرين ساعة من تصفيح خلايا NG2 + ، تمت إضافة الخلايا العصبية DRG المنفصلة إلى الثقافة (2000 خلية / ساترة). بعد 24 ساعة إضافية ، تم إصلاح المزارع لمدة 30 دقيقة مع 4٪ بارافورمالدهيد ، وغسلها ، وسدها في 5٪ مصل ماعز طبيعي. تم تلوين الخلايا الثابتة لـ NG2 و # x003b2-III-tubulin و DAPI. تم تصوير كل خلية عصبية بها جسم خلوي يبدأ على خلية NG2 + مع ثمرة نوريت وقياسها عن طريق حساب عدد الخلايا العصبية القادرة على تمديد العمليات خارج سطح الخلية NG2 +. لفحص دور NG2 و CSPGs الأخرى في الفخ ، تمت إضافة chondroitinase في الوسائط (0.1 U / ml) في وقت طلاء الخلية NG2 + ، ثم مرة أخرى في الوسائط في وقت إضافة الخلايا العصبية DRG. بالنسبة لدراسات 5 د ، تم استبدال الوسائط و ch'ase يوميًا.

فحوصات الشريط.

تم إجراء تجارب الفحص الشريطي وفقًا لبروتوكول معدل من Kn & # x000f6ll et al. ، 2007. تم طلاء الأغطية في PLL طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، ثم غسلها بـ ddH2تم تجفيف الأغطية بالكامل ووضع كل غطاء في وسط طبق بتري كبير. تم وضع المصفوفة الشريطية (معهد كارلسروه للتكنولوجيا ، ألمانيا) في وسط الغطاء ، مما يضمن أن الممرات بأكملها كانت على الغطاء. يتكون الحل A من laminin (1 & # x003bcg / ml ، 5 & # x003bcg / ml ، أو 10 & # x003bcg / ml Invitrogen) -aggrecan (50 & # x003bcg / ml أو 100 & # x003bcg / ml Sigma-Aldrich) خليط أو laminin (2 & # x003bcg / ml) -NG2 (7 & # x003bcg / ml هدية من Joel Levine ، Stony Brook University ، Stony Brook ، NY) خليط (مصنوع من BSA مترافق مع 488 في CMF). تم وضع مائة وخمسين ميكرولتر من المحلول A على قناة المدخل واستنشاقها برفق عبر الممرات باستخدام ماصة زجاجية ملتهبة ، مع الحرص على عدم استنشاق المحلول بالكامل حتى تظل الممرات مغطاة بالركيزة. ثم تم وضع الأغطية في الحاضنة لمدة 30 دقيقة. تمت إزالة المحلول من المصفوفة واستبداله بـ 2٪ من مساحة سطح الجسم. بعد 10 دقائق إضافية من الحضانة عند 37 & # x000b0C ، تمت إزالة BSA من الأغطية ، جنبًا إلى جنب مع المصفوفة. تم وضع الأغطية في صفيحة 24 بئراً ، حيث تم غسلها في 400 & # x003bcl من المحلول B [لامينين منخفض (1 & # x003bcg / مل) أو فبرونيكتين (5 & # x003bcg / مل) ، مع BSA في CMF] و حضنت في 37 & # x000b0C لمدة 30 دقيقة. ثم تمت إزالة المحلول B من الآبار واستبداله بـ 2٪ BSA لمدة 10 دقائق أخرى من الحضانة عند 37 & # x000b0C. لإزالة سلاسل GAG للبروتيوغليكان ، تمت إضافة chondroitinase (0.1 وحدة / مل في محلول ملحي) إلى ساترة 4 + ساعة قبل طلاء الخلايا العصبية DRG. ثم تمت إضافة الخلايا العصبية المنفصلة DRG إلى الأغطية بكثافة 2000 خلية / ساترة. سمح بالنمو لمدة 48 ساعة ثم تم إصلاح الثقافات بنسبة 4٪ PFA. تم تحصين بعض الأغطية من أجل laminin (Sigma) و CS56 (Sigma) و fibronectin (BD Biosciences) لضمان وجود هذه المكونات. تم تلوين جميع الأغطية باستخدام & # x003b2-III-tubulin لتصور الخلايا العصبية. تم تصوير جميع الخلايا العصبية التي نمت ضعف طول أجسامها الخلوية. تم تحليل الخلايا العصبية ذات الأجسام الخلوية التي تبدأ في الممر الأخضر لمعرفة ما إذا كانت قد امتدت العمليات إلى الممر الأسود أم لا والعكس صحيح.

كيمياء الخلايا المناعية.

تم حظر جميع الثقافات في مصل الماعز الطبيعي بنسبة 5٪. تم تحضين جميع الأجسام المضادة طوال الليل عند 4 & # x000b0 درجة مئوية. تشمل الأجسام المضادة الأولية المستخدمة ما يلي: مضاد NG2 (ميليبور) ، مضاد لـ GFAP (دقيق) ، مضاد للفيمنتين (سيغما) ، مضاد SV2 (بنك الورم الهجين للدراسات التنموية) ، مضاد لـ PSD-95 (أبكام) ، مضاد- SNAP-25 (Sigma) ومضاد الفبرونيكتين (BD Biosciences) ومضاد اللامينين (Sigma) و DAPI (Sigma) ومضاد Olig2 (Millipore) ومضاد A2B5 ومضاد O4 (هدايا سخية من مختبر روبرت ميلر ، جامعة كيس ويسترن ريزيرف ، كليفلاند ، أوهايو). تبع ذلك الأجسام المضادة الثانوية المناسبة ، Alexa Fluor 350 أو 488 أو 594 أو 633 أو 647.

التحديد الكمي لعدد المشابك في المختبر بين محاور DRG وخلايا NG2.

تم قياس شدة البكسل باستخدام برنامج ImageJ لدراسات التوحيد. تم استخدام طرق مشابهة لتلك التي وصفها إيبوليتو وإيروغلو ، 2010 لتحديد نقاط الاشتباك العصبي. تم التقاط جميع الصور بنفس الإعدادات على مجهر زايس LSM510 متحد البؤر. تم تحديد مجال الاهتمام حول جسم الخلية ، ضعف قطر جسم الخلية. باستخدام محلل النقاط وتحديد عتبة 50 ، تم حساب عدد النقاط.

فحص الحويصلة المشبكية.

تم طلاء الأطباق بالبولي- l -lysine طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، وشطفها ، وطليها في 1 & # x003bcg / ml laminin في CMF لمدة ساعتين عند 37 & # x000b0 درجة مئوية. تمت إزالة Laminin وتم طلاء خلايا NG2 + بكثافة لتشكيل طبقة أحادية (40.000 خلية في وسط 40 & # x003bcl DMEM-F12 لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة) ، ثم تمت إضافة 3 مل من DMEM-F12 إلى الأطباق وحضنت الأطباق بين عشية وضحاها. تمت إضافة الخلايا العصبية DRG بعد 24 ساعة. تم تحضين الأطباق لمدة 5 أيام ، وتم تغيير الوسائط في اليوم الثالث للحفاظ على الثقافات. في اليوم الخامس من الزراعة ، تمت إزالة الوسائط ومحلول عالي البوتاسيوم (5.37 م م بوكل ، 125 م م كلوريد الصوديوم ، 24 م م ناهكو)3) تحتوي على صبغة FM (FM1 & # x0201343 Invitrogen) تمت إضافتها إلى الثقافة لمدة 3 دقائق. تمت إضافة محلول منخفض الكالسيوم 2+ (0.5 م م) إلى الطبق ، متبوعًا على الفور بإضافة ADVACEP-7 (Sigma) لمدة 5 دقائق لإخماد تألق الخلفية. تمت إزالة المحاليل وتم إجراء غسيل إضافي باستخدام Ca 2+ منخفض لمدة 10 دقائق. تم تصوير الفلورة على مجهر لايكا DMI6000 (AF). ثم تمت إزالة المحلول وإضافة K + بدون صبغة لمدة 3 دقائق. تم تصوير الفلورة مرة أخرى. تم استخدام برنامج ImageJ لتحديد الخطوط العريضة للخلايا العصبية بالكامل ومقارنة شدة البكسل داخل الخلية العصبية قبل وبعد التحفيز باستخدام صبغة أو بدونها.

محللة الخلية لطخة ويسترن.

نمت خلايا NG2 + إلى التقاء على أطباق زراعة الخلايا المعالجة مسبقًا بـ 1 & # x000d7 PLL لمدة 48 ساعة. بالنسبة للخلايا التي تم معالجتها مسبقًا بـ ch'ase ، تمت إضافة الإنزيم (0.1 U) إلى الوسائط ساعة واحدة قبل إضافة المخزن المؤقت RIPA. تم غسل الخلايا باستخدام PBS المثلج وحضنتها على الجليد باستخدام محلول RIPA (Thermo Scientific) وكوكتيل مثبط البروتياز 1: 500 (Abcam) لمدة دقيقة واحدة. تم استخدام كاشطات الخلايا المعقمة لكشط الخلايا من طبق زراعة الخلايا. تم بعد ذلك تدوير الخلايا المعلقة في المخزن المؤقت RIPA لمدة 30 دقيقة عند 4 & # x000b0C ولفها عند 14.1 rcf لمدة 20 دقيقة. تم حفظ المادة الطافية من كل مجموعة وتم اختبار تركيز البروتين باستخدام مجموعة BCA (Thermo Scientific).

لطخة غربية.

تم تغيير طبيعة محللات NG2 باستخدام & # x003b2-mercaptoethanol عند 80 & # x000b0C لمدة 10 دقائق. تم تشغيل عشرة ميكروغرامات من البروتين على 7.5٪ TGX gel (Bio-Rad) لمدة 1.5 ساعة عند 125 فولت. حدث النقل طوال الليل عند 12 فولت على أغشية PVDF. تم حظر أغشية PVDF (Thermo Scientific Super Blocker) لمدة ساعة واحدة تهتز في درجة حرارة الغرفة وحضنت عند 4 & # x000b0C طوال الليل باستخدام جسم مضاد NG2 (NG2 Millipore). تم بعد ذلك غسل الغشاء بـ 1 & # x000d7 PBS و 0.1٪ توين 20 ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما عند درجة حرارة الغرفة أثناء الرج. تمت إضافة الجسم المضاد HRP المضاد للأرنب (كواشف Millipore Bioscience Research) لمدة ساعتين ، يهتز عند درجة حرارة الغرفة. ثم تم استخدام Thermo Scientific ECL لتطوير اللطخة. ثم تم غسل البقع في PBS-Tween 20 وحضنتها على شاكر مداري في Thermo Scientific Restore Stripping Buffer لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة متبوعة بثلاث غسلات باستخدام PBS-Tween 20 لمدة 15 دقيقة لكل منهما. تم بعد ذلك حظر البقع باستخدام Thermo Scientific Blocking Buffer لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري قبل الحضانة باستخدام الجسم المضاد الأولي المضاد 2B6 (تخفيف Seikagaku 1: 1000) طوال الليل عند 4 & # x000b0C. قبل التطوير باستخدام ركيزة النشاف الغربية ECL ، تم تحضين البقع بجسم مضاد ثانوي مترافق مع HRP لدرجة حرارة غرفة 2 قبعة بعد ثلاث غسلات لمدة 15 دقيقة باستخدام PBS-Tween 20.

ثقافة الخلايا العصبية القشرية ومقايسة فخ.

تم طلاء Coverslips بـ PLL ثم استحم في ركائز laminin بتركيزات مختلفة (0 & # x003bcg / ml ، 1 & # x003bcg / ml ، أو 5 & # x003bcg / ml) لمدة ساعتين عند 37 & # x000b0C. تم طلاء خلايا الحبل الشوكي للفأر البالغ NG2 + على الأغطية بكثافة 10000 خلية / ساترة وحضنت عند 37 & # x000b0C لمدة 24 ساعة. تم تشريح قشور كاملة من الفئران BALBC / B6 / 129S التي يبلغ عمرها من 0 إلى 4 أيام (مختبر جاكسون) في حمام من HBSS و kynurenate وحضنت في محلول يحتوي على Papain و kynurenate و cysteine ​​لمدة 30 دقيقة عند 37 & # x000b0 درجة مئوية . ثم تم غسل الخلايا العصبية في HBSS-CMF ، وسحنها ، وتصفيتها. بعد طرد مركزي قصير السرعة ، تم تعليق الخلايا العصبية المنفصلة في وسائط Neurobasal A التي تحتوي على مكمل B-27 ، GlutaMAX ، والبنسلين & # x02013streptomycin (Invitrogen) وطليها على ساترة بتركيز 2000 خلية لكل ساترة. تمت معالجة Coverslips بعامل مضاد للانقسام (5 & # x02032fluoro-2 & # x02032-deoxy-uridine / uridine) في وقت طلاء الخلايا العصبية وأضيف chondroitinase ABC في الوسائط (0.1 U / ml Seikagaku) ​​عند الإشارة. تم تحضين Coverslips لمدة 24 ساعة قبل التثبيت مع 4 ٪ بارافورمالدهيد ومناعة.

سحق العمود الظهري ، آفة التكييف المزدوجة ، ووضع العلامات المحوار.

تم إجراء جميع العمليات الجراحية وفقًا لإجراءات وبروتوكولات مركز الموارد الحيوانية بجامعة كيس ويسترن ريزيرف. أعطيت فئران Sprague Dawley البالغة (250 & # x02013300 جم) إصابة سحق العمود الظهري كما هو موضح سابقًا (Horn et al. ، 2008). باختصار ، بينما تم تخدير الحيوانات باستخدام غاز الأيزوفلورين المستنشق (2 ٪ في الأكسجين) وتحت تقنية التعقيم ، تم إجراء استئصال الصفيحة الفقرية T1 لفضح الجانب الظهري للجزء C8. تم إدخال أسنان ملقط المجوهرات Dumont # 3 من خلال ثقب في الجافية بمسافة 1.5 مم وعمق 1 مم. ثم تم سحق الحبل ثلاث مرات لمدة 10 ثوانٍ في كل مرة لإحداث الآفة. تم وضع فيلم جل فوق موقع الإصابة وتم خياطة طبقات العضلات بخياطة 4-0 من النايلون. تم استخدام دبابيس جراحية لإغلاق الجلد ، وفي ذلك الوقت تلقت الحيوانات Marcaine (1.0 مجم / كجم) تحت الجلد والبوبرينورفين (0.1 مجم / كجم) في العضل. باستخدام 3000 ميغاواط Dextran-Texas Red (Invitrogen) ، تم تمييز المحاور العصبية من خلال العصب الوركي الأيمن 2 د قبل قتل الحيوان. قُتلت الحيوانات في 7 أيام أو 14 يومًا أو 21 يومًا أو 28 يومًا (ن = 6 / مجموعة). ثم تم استخدام الأنسجة إما للكيمياء المناعية أو المجهر الإلكتروني. بالنسبة لدراسات الآفة المزدوجة التكييف ، تم إجراء عملية سحق العمود الظهري (DCC) ، كما هو مذكور أعلاه ، وبعد الإصابة مباشرة ، تعرض العصب الوركي الأيمن وسحقه. بعد أسبوع واحد ، تم إعادة كشف العصب الوركي الأيمن وسحقه للمرة الثانية ، بالقرب من سحق العصب السابق بمقدار 1 ملم. بعد أسبوعين (3 أسابيع إجمالاً) ، تم تصنيف الحيوانات وترطيبها وتقطيعها كما هو موضح أعلاه.

نظرًا لانخفاض تلطيخ NG2 بمرور الوقت ، أجرينا دراسات بالتوازي على الفئران التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز تحت محفز NG2. تم الحصول عليها من الدكتور دوايت بيرجلز (قسم علم الأعصاب ، جامعة جونز هوبكنز ، بالتيمور ، دكتوراه في الطب). تم إجراء تجارب الضربة القاضية NG2 على فئران NG2 التي تم الحصول عليها من الدكتور ويليام ستالكوب (معهد سانفورد-بورنهام للبحوث الطبية ، لا جولا ، كاليفورنيا). بالنسبة لهذه التجارب ، تم إجراء DCC في T12 وقتلت الحيوانات بعد 14 يومًا أو 28 يومًا.

في تجارب التكييف المزدوج ، تمت مقارنة تعبير SV2 نوعياً. تم فحص أنسجة من خمسة فئران مختلفة بحثًا عن تلطيخ SV2 المرئي في ألياف تحمل علامات ديكستران وجدت منقاريًا للآفة مقارنةً بتلك التي بقيت داخل الآفة أو الذيلية.

المناعية.

تم تروية الحيوانات بنسبة 4٪ PFA. تم تثبيت الحبل لاحقًا في 4٪ PFA طوال الليل ، متبوعًا بغمره في 30٪ سكروز طوال الليل. تم تجميد الأنسجة في وسائط تثبيت OCT وتم تقسيمها على ناظم ناظم إلى 20 & # x003bcm مقاطع طولية. كانت الأقسام ملطخة بمضاد GFAP (شركة كيميائية وعلمية دقيقة) ، مضاد SV2 (بنك ورم هجين للدراسات التنموية) ، مضاد PSD-95 (Abcam) ، مضاد لـ SNAP-25 (Sigma) ، مضاد للفيمنتين (Sigma) ، أو anti-NG2 (Millipore) ، أو anti-fibronectin (BD Biosciences) ، متبوعًا إما Alexa Fluor 405 ، 488 ، أو 633. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM510.

التحديد الكمي للنهايات الضمور عند ملامستها لخلايا NG2 +.

تم استخدام الأنسجة من أربعة فئران. تم تدريب الحيوانات 7 أيام بعد الإصابة كما هو موضح أعلاه. ضتم الحصول على صور مكدس باستخدام مجهر متحد البؤر زايس LSM510. تم حساب عدد كرات النهاية المسمى Dextran-Texas Red الملامسة لخلية NG2 + ومقارنتها مع العدد الإجمالي للكرات الطرفية التي تمت ملاحظتها.

المجهر الإلكتروني.

لتحليل TEM ، تم زرع الخلايا في فيلم تضمين ACLAR معقم (علوم المجهر الإلكتروني) ، والذي تم تقطيعه إلى قطع ذات حجم مناسب لتناسب لوحة 24 بئر. تم طلاء خلايا NG2 + البالغة على 1 & # x003bcg / ml laminin بتركيز 40000 خلية لكل ساترة. بعد أربع وعشرين ساعة تمت إضافة DRGs (3500 لكل قسيمة) إلى ساترة وتم وضع الثقافات في 37 & # x000b0C ، 10 ٪ CO2 الحاضنة وسمح لها بالوصول إلى التقاء & # x0223c80٪. بعد أن وصلت الخلايا إلى هذا المستوى من التقاء (إما 3 أيام أو 5 أيام في زراعة المحاصيل) ، تم غمر صفائح ACLAR مع الخلايا المرتبطة بها في مثبت. كان المثبت الأولي 2.5 ٪ جلوتارالدهيد في محلول كاكوديلات 0.1 متر ، ودرجة الحموضة 7.3. تم تثبيت العينة لاحقًا في رابع أكسيد الأوزميوم المخفض بنسبة 1 ٪ (كارنوفسكي ، 1971). بعد نقعها في أسيتات اليورانيل المحمض (Tandler ، 1990) ، تم تجفيف العينة في الإيثانول ، وتمريرها عبر أكسيد البروبيلين ، وتم دمجها في Poly / Bed. تم تلطيخ الأجزاء الرقيقة أولاً بأسيتات اليورانيل المحمض في 50٪ ميثانول (Tandler ، 1990) ، ثم بصبغة الرصاص الثلاثية لـ Sato كما تم تعديلها بواسطة Hanaichi et al. (1986). تم فحص هذه الأقسام في المجهر الإلكتروني JEOL 1200 EX.

تحليل احصائي.

أجريت جميع التجارب في ثلاث نسخ وتكررت مرتين على الأقل. المحقق كان أعمى قبل تحليل البيانات. تم تحليل البيانات من قبل الطالب ر الاختبار ، الاختبار ذو النسبتين ، أو ANOVA ثنائي الاتجاه مع Tukey آخر مخصص اختبار باستخدام برنامج Minitab 15 ، أو باستخدام اختبار Kruskal & # x02013Wallis متبوعًا بـ Mann & # x02013Whitney يو اختبار مع SPSS ، حسب الاقتضاء. يتم تقديم جميع البيانات على أنها متوسط ​​& # x000b1 SEM. اعتبرت الاختلافات ذات دلالة إحصائية عند ص كانت القيمة & # x0003c0.05.


1 إجابة 1

أ: لا تحتوي كل الخلايا العصبية على العديد من التشعبات القصيرة ومحور عصبي طويل واحد. في الواقع ، معظمهم ليس لديهم هذا الشكل. لا تحتوي الخلايا الحبيبية المخيخية ، وهي الخلايا العصبية الأكثر عددًا في الدماغ (يبلغ متوسط ​​عددها الإجمالي حوالي 50 مليارًا ، مما يعني أنها تشكل حوالي 3/4 من الخلايا العصبية في الدماغ) [المرجع 1،2،3] ، هذا الشكل. لديهم محور عصبي يتفرع إلى ألياف متوازية طويلة كما هو موضح في الرسم البياني أدناه (معدل من الشكل في المرجع 2). تختلف أشكال الخلايا العصبية بشكل كبير. هذا لأن الخلايا العصبية قد طورت هياكلها لتناسب وظائفها:

يمكننا أن نتعلم الكثير حول ما تفعله الخلايا العصبية من خلال النظر إلى مورفولوجياها (أي الشكل). على سبيل المثال ، من المحتمل أن تدمج الخلايا العصبية ذات التشعبات المتفرعة الكبيرة المعلومات من عدد كبير من المدخلات ، في حين أن العصبون الذي يحتوي على تشعبات هذا الفرع القريب من سوما ، ولكنه لا يمتد بعيدًا ، ربما يقوم فقط بدمج المعلومات منه بالقرب من الجيران. نفس الشيء مع المحاور ، تحتوي الخلايا العصبية الإسقاطية على محاور طويلة تسمح لها بالتواصل مع الخلايا العصبية في مناطق الدماغ البعيدة ، في حين أن العصبون الداخلي المحلي سيكون محوارًا قصيرًا يتفرع محليًا فقط ، مما يسمح له بالتحدث إلى الخلايا القريبة. تحتوي بعض الخلايا في الجهاز العصبي المحيطي على محاور تخرج مباشرة من التشعبات ، مما يسمح لها بنقل المعلومات بكفاءة من واحدة إلى أخرى. [المرجع 4] (الشكل أدناه مأخوذ أيضًا من المرجع 4)

لذلك ، طورت الخلايا العصبية أشكالها المختلفة للقيام بوظائفها. أعتقد أن ما إذا كان الشكل الوحيد لهذه الأشكال ، كما هو مذكور في هذا الموضوع ، أو العديد من هذه الأشكال أو جميعها صحيحة أو خاطئة بالنسبة لنا لاستخدامها في نمذجة الشبكات العصبية ، لا يمكن الإجابة عليه الآن. لكني أعتقد أننا يجب أن نحاول الدراسة والتعلم منهم لأنه أفضل نموذج لدينا. تذكر أن هذه الخلايا العصبية بأشكالها ووصلاتها المختلفة تنجح في خلق واحدة من أروع الظواهر في هذا الكون: عقلنا الواعي.

ريتشارد هـ. ماسلاند. نوع الخلية العصبية. علم الأحياء الحالي. 2004 المجلد 14 رقم 3: R497-R500.

ماسلاند RH. النظر في جامعة نيورونز براون. علم الأعصاب في العمل: فهم أدمغتنا ونظامنا العصبي.


النتائج

الرواد الطوليون للجهاز العصبي المركزي

تم إطلاق الوصلات الطولية بين القطاعات في الجهاز العصبي المركزي الذبابة من قبل أربعة عصبونات داخلية ، pCC ، MP1 ، dMP2 و vMP2 (الشكل 1 أ) (جاكوبس وجودمان ، 1989a جاكوبس وجودمان ، 1989b Lin et al. ، 1995 Hidalgo and Brand ، 1997). يولد dMP2 و vMP2 في منتصف كل عقدة قطعية ("قسيم عصبي") ، ويبدأان في تمديد محاور خلال المرحلة 12. ينمو محور dMP2 للخلف وينمو vMP2 من الأمام ، متجهًا نحو محاور vMP2 و dMP2 الرائدة من الجزء التالي. في نفس الوقت ، يرسل pcc محور عصبي أماميًا بالاشتراك مع vMP2 ، بينما يلتف محور MP1 حول dMP2 ويمتد إلى الخلف بالاشتراك معه. يؤسس لقاء الرواد من القطاعات المتتالية أول اتصال بين القطاعات في وقت مبكر من المرحلة 13. الوظائف الرائدة لهذه المحاور الأربعة زائدة عن الحاجة إلى حد كبير حيث يجب استئصالها جميعًا لإنتاج عيب شديد في العصب الناضج (Lin et al. ، 1995 Hidalgo and براند ، 1997). أدناه ، سنركز على dMP2 و vMP2.

مطلوب شق لتشكيل اتصالات طولية في الجهاز العصبي المركزي

أدت إزالة الشق في منتصف الطريق خلال عملية التطور الجنيني ، باستخدام طفرة حساسة لدرجة الحرارة ، إلى منع تكوين مسارات محاور طولية ناضجة (الشكل 1 ب ، ج) (جينيجر وآخرون ، 1993 جينيجر ، 1998). كشف فحص الأجنة في المرحلة المبكرة 13 أن الشق النمط الظاهري واضح في المراحل الأولى من ريادة هذه المسالك. في الأجنة ذات درجة الحرارة المتغيرة ، نمت محاور dMP2 و vMP2 في الاتجاه المناسب ، لكنها توقفت ، وفشلت في الاتصال حتى في المرحلة المتأخرة 13 (الشكل 1D-F). تعتمد تعبيرية هذا النمط الظاهري على توقيت تغير درجة الحرارة (Crowner et al. ، 2003). قمنا بتعديل الظروف لإعطاء تعبيرية متواضعة للغاية (13 ± 1.1٪ من الوصلات النصفية المبكرة مفقودة) لتقليل عيوب الجهاز العصبي المركزي غير ذات الصلة. لا يرجع الفشل في إنشاء اتصالات بين القطاعات إلى تحول هويات vMP2 و dMP2 ، كما يتضح من اتجاه نمو المحوار والتلطيخ للعلامة الجزيئية التي تم تخطيها (Spana and Doe ، 1996) (البيانات غير معروضة). كما لوحظ توقف الرواد الطوليين في دلتا ts (الشكل 1G).

Notch مطلوب للنمو وتوجيه الرواد الطوليين. (أ) تنشئ أربع خلايا عصبية رائدة اتصالات بين القطاعات في ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي: pCC و MP1 و dMP2 و vMP2. يتم عرض اثنين من الخلايا العصبية والمنطقة بين القطاعات. تشير الخطوط المتقطعة باللونين الأخضر والأبيض إلى محاذاة المخطط مع صورة مجهرية في ب. الأمامي في الأعلى. (ب,ج) الزخرفة المحورية في الحبل العصبي الجنيني الناضج. من النوع البري (WT B) أو الشق ts تم نقل الأجنة (C) إلى 32 درجة مئوية قبل أن تمتد المحاور الرائدة ، ونمت إلى المرحلة 15/16 ، وثابتة وملطخة بـ mAb BP102. تشير الأسهم في C إلى الفجوات بين الأجزاء المجاورة في المتحولة مقارنة بالنوع البري (رؤوس الأسهم في B). القوس يشير إلى قسيم عصبي واحد. (د,ه,جي) الزخرفة المحورية في وقت مبكر من الجهاز العصبي المركزي. وزن (د) ، الشق ts (E) أو دلتا ts تم نقل الأجنة (G) إلى 32 درجة مئوية ثم تم تثبيتها في منتصف المرحلة 13 وتلطيخها بـ mAb 22C10 للكشف عن محاور رائدة. تشير الأسهم الصفراء إلى الروابط الطولية المفقودة في المسوخ مقارنة بالنوع البري (رأس السهم في D). تبرز الأسهم البيضاء أقماع نمو dMP2 و vMP2 المتوقفة في الشق ts . (F) الخلايا العصبية dMP2 و vMP2 بتنسيق الشق ts . مرحلة منتصف 13 الشق ts الجنين معربا عن mCD8-GFP في dMP2 و vMP2 تحت السيطرة GAL4-15J2 تم تحضيره كما هو موصوف لـ D و E وتصور باستخدام مضاد GFP. تشير الأسهم إلى أقماع نمو MP2 المتوقفة. خصلات من الإسقاطات من مخروط نمو vMP2 المتوقف محاطة بدائرة. (ح) مرحلة مبكرة من النوع البري 13 تحمل جنينًا أ لاكز مراسل لنشاط إشارات Notch [ه (سب) مδ-لاكز] ، المسمى بمضاد β-galactosidase (β-gal أحمر) و mAb22C10 (أخضر). تبرز الأسهم قرب أقماع النمو الرائدة من الخلايا ذات إشارات الشق النشطة (lacZ + ). (أنا,ي) المرحلة 13 تحمل الأجنة ه (سب) مδ-لاكز مراسل ، مُسمى بـ anti-β-gal (أحمر) وعلامات للواجهة الدبقية ، anti-Prospero (I ، أخضر) أو anti-Repo (J ، أزرق). تبرز الدوائر مجموعات الخلايا الموجبة β-gal. (ك) الشق ts تم تحضير الأجنة التي تحمل الجينات المحورة المشار إليها كما هو موصوف لـ D و E وتم تحديد كمية الاتصالات بين القطاعات التي فشلت في تشكيلها بحلول منتصف المرحلة المتأخرة 13. كل الانحرافات عن الشق ts ذات دلالة إحصائية (ص& lt0.05 أنوفا). الخط العمودي الرفيع على الشق عروض شريط sem لم ينتج عن أي من الجينات المحورة عيوبًا سائدة في خلفية من النوع البري في ظل هذه الظروف (& lt2٪ من الأجزاء النصفية).

Notch مطلوب للنمو وتوجيه الرواد الطوليين. (أ) تنشئ أربع خلايا عصبية رائدة اتصالات بين القطاعات في ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي: pCC و MP1 و dMP2 و vMP2. يتم عرض اثنين من الخلايا العصبية والمنطقة بين القطاعات. تشير الخطوط المتقطعة باللونين الأخضر والأبيض إلى محاذاة المخطط مع صورة مجهرية في ب. الأمامي في الأعلى. (ب,ج) الزخرفة المحورية في الحبل العصبي الجنيني الناضج. من النوع البري (WT B) أو الشق ts تم نقل الأجنة (C) إلى 32 درجة مئوية قبل أن تمتد المحاور الرائدة ، ونمت إلى المرحلة 15/16 ، وثابتة وملطخة بـ mAb BP102. تشير الأسهم في C إلى الفجوات بين الأجزاء المجاورة في المتحولة مقارنة بالنوع البري (رؤوس الأسهم في B). القوس يشير إلى قسيم عصبي واحد. (د,ه,جي) الزخرفة المحورية في وقت مبكر من الجهاز العصبي المركزي. وزن (د) ، الشق ts (E) أو دلتا ts تم نقل الأجنة (G) إلى 32 درجة مئوية ثم تم إصلاحها في منتصف المرحلة 13 وتم تلطيخها بـ mAb 22C10 للكشف عن محاور رائدة. تشير الأسهم الصفراء إلى الروابط الطولية المفقودة في المسوخ مقارنة بالنوع البري (رأس السهم في D). تبرز الأسهم البيضاء أقماع نمو dMP2 و vMP2 المتوقفة في الشق ts . (F) الخلايا العصبية dMP2 و vMP2 بتنسيق الشق ts . مرحلة منتصف 13 الشق ts الجنين معربا عن mCD8-GFP في dMP2 و vMP2 تحت السيطرة GAL4-15J2 تم تحضيره كما هو موصوف لـ D و E وتصور باستخدام مضاد GFP. تشير الأسهم إلى أقماع نمو MP2 المتوقفة. خصلات من الإسقاطات من مخروط نمو vMP2 المتوقف محاطة بدائرة. (ح) مرحلة مبكرة من النوع البري 13 تحمل جنينًا أ لاكز مراسل لنشاط إشارات Notch [ه (سب) مδ-لاكز] ، المسمى بمضاد β-galactosidase (β-gal أحمر) و mAb22C10 (أخضر). تبرز الأسهم قرب أقماع النمو الرائدة من الخلايا ذات إشارات الشق النشطة (lacZ + ). (أنا,ي) المرحلة 13 تحمل الأجنة ه (سب) مδ-لاكز مراسل ، مُسمى بـ anti-β-gal (أحمر) وعلامات للواجهة الدبقية ، anti-Prospero (I ، أخضر) أو anti-Repo (J ، أزرق). تبرز الدوائر مجموعات الخلايا الموجبة β-gal. (ك) الشق ts تم تحضير الأجنة التي تحمل الجينات المحورة المشار إليها كما هو موصوف لـ D و E وتم تحديد كمية الاتصالات بين القطاعات التي فشلت في تشكيلها بحلول منتصف المرحلة المتأخرة 13. كل الانحرافات عن الشق ts ذات دلالة إحصائية (ص& lt0.05 أنوفا). الخط العمودي الرفيع على الشق عروض شريط sem لم ينتج عن أي من الجينات المحورة عيوبًا سائدة في خلفية من النوع البري في ظل هذه الظروف (& lt2٪ من الأجزاء النصفية).

للتأكد من مكان تنشيط Notch في هذه المرحلة في النوع البري ، قمنا بفحص مراسل نسخي لنشاط Notch ، ه (سب) مδ-لاكز (Cooper and Bray ، 1999) ، ووجدوا تعبير β-galactosidase في مجموعة فرعية من السطح البيني الدبقي. تصطف هذه الخلايا الدبقية على المسار الذي ستتبعه المحاور الطولية الرائدة المتقدمة وكانت موجودة عندما كانت تلك المحاور تنمو (الشكل 1 ح) (جاكوبس وغودمان ، 1989 أ هيدالغو وبوث ، 2000). تم تحديد خلايا β-galactosidase + على أنها خلايا دبقية على أساس الموقع والتشكل (الشكل 1H) ، ومن خلال وضع العلامات المشتركة لـ Prospero و Repo (الشكل 1I ، J). أبرز تعبير β-galactosidase موجود في الخلايا الدبقية داخل الخلايا العصبية (Griffiths and Hidalgo ، 2004) ، ولكن في هذه المرحلة كان هناك أيضًا تعبير في الواجهة الدبقية بين الخلايا العصبية ، على طول مسار محور عصبي افتراضي (الشكل 1H ، الأسهم).

كان تنشيط الشق في الواجهة الدبقية مفاجئًا لأن التعبير عن الشق في الخلايا العصبية يقمع المرحلة المتأخرة من النمط الظاهري للجهاز العصبي المركزي من الشق ts (جينيجر ، 1998 لو جال وآخرون ، 2008). Remarkably, we now found we could efficiently rescue the early axon phenotype of Notch ts by expressing Notch either just in the glia [repo-GAL4 (all glia): 72% rescue htl-GAL4 (interface glia): 92% rescue] or just in the dMP2 and vMP2 pioneers (15J2-GAL4: 85% rescue ص<0.01 in all cases ر-test) (Fig. 1K). We verified that in wild type Notch is expressed in interface glia and in both dMP2 and vMP2 (data not shown). We also verified that Notch activity in both cell types is physiologically relevant using loss-of-function experiments (Fig. 1K): RNAi against الشق in interface glia significantly enhanced the Notch ts phenotype (2.5-fold ص<0.005), and cell-autonomous reduction of functional Notch in dMP2 and vMP2 by cis-inhibition (Sprinzak et al., 2010) using expression of Delta lacking its intracellular domain (Itoh et al., 2003) enhanced the Notch ts phenotype by 92% (ص& lt0.05). RNAi was not effective on the relevant timescale in dMP2 and vMP2 using 15J2-GAL4.

How can Notch rescue the growth of longitudinal pioneer axons both autonomously, acting in the pioneers, and non-autonomously, acting in the glia? We will first dissect the action of Notch in glia, and then turn to the Notch mechanism in pioneers.

Glial development in Notch ts

Notch becomes activated in interface glia by contact en passant with the axons of Delta-expressing commissural interneurons (Thomas and van Meyel, 2007). Interface glia were contacted by Delta + axons and displayed activated Notch signaling by early stage 13, in time to modulate growth of longitudinal pioneers (Fig. 2A). Moreover, expression in the glia of a Notch derivative lacking the ligand-binding domain could not rescue longitudinal axons (21% of intersegment connections were absent in Notch ts repo-GAL4UAS-Notch Δ EGF(10-12) versus 13% for Notch ts , consistent with previous evidence showing a mild dominant-negative effect of this transgene) (Le Gall et al., 2008).

ByM6A__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt="Interface glia recruit a cap of Frazzled+ neuronal processes. The CNS of stage 13 Drosophila embryos was analyzed by immunofluorescence. Embryos in E-G and J are very early stage 13, other panels are mid-stage 13. (A) Stage 13 embryos bearing E(spl)mδ-lacZ reporter, labeled with anti-β-gal (red) and anti-Delta (green). A z-projection is shown in A. White arrowheads indicate Delta-positive axons coursing medially from lateral neurons. Anterior is to the right. AL shows a longitudinal cross-section at the position of the yellow triangles. AT shows a transverse cross-section at the position of the orange triangles. Thin white arrows indicate Delta-positive axons (green) as they contact Notch signaling-positive glia (red). (B) Wild-type (WT) or Notchts embryos were temperature-shifted, fixed and labeled with anti-Repo. Each white bracket indicates one segment. White arrow indicates midline. Wild-type and Notchts embryos each have approximately ten Repo+ interface glia per hemisegment. A few non-interface glia are also visible in this section. (C) Wild-type or Notchts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Htl. (D) Wild-type or Notchts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Prospero. Five to six Pros+ cells are visible in each segment in wild type and in Notchts (bracket). Only one focal plane is shown so not all Pros+ cells are visible in all segments. (E-E″″) Wild-type embryo expressing mCD8-GFP in interface glia, under the control of htl-GAL4, labeled with anti-GFP (green), anti-Frazzled (red) and mAb 22C10 (blue). E shows the overlay of all channels. E′-E″″ are higher magnification views of the boxed region. Thin white arrows indicate the growth cones of dMP2 and vMP2. Glia (GFP, green) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E′. Anti-Frazzled (red) is shown in E″. Anti-Frazzled (red) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E‴. E″″ is the overlay of all markers. Yellow arrows highlight the gap between the vMP2 growth cone and the glial cell. Note close apposition of dMP2 and vMP2 growth cones with Frazzled. (F) Three-dimensional rendering of an image stack of an embryo prepared as described for E. vMP2 growth cone (mAb 22C10, cyan) migrates through a bed of Frazzled+ processes (red) that separate it from the associated interface glia (GFP green). Image has been inverted to put glia beneath axon. (G-G″″) Wild-type embryo labeled with anti-Frazzled (green), anti-HRP (red) and mAb BP102 (blue). G shows overlay of all channels. A single optical section is shown (

Interface glia recruit a cap of Frazzled + neuronal processes. The CNS of stage 13 ذبابة الفاكهة embryos was analyzed by immunofluorescence. Embryos in E-G and J are very early stage 13, other panels are mid-stage 13. (أ) Stage 13 embryos bearing E(spl)mδ-لاكز reporter, labeled with anti-β-gal (red) and anti-Delta (green). أ ض-projection is shown in A. White arrowheads indicate Delta-positive axons coursing medially from lateral neurons. Anterior is to the right. أإل shows a longitudinal cross-section at the position of the yellow triangles. أتي shows a transverse cross-section at the position of the orange triangles. Thin white arrows indicate Delta-positive axons (green) as they contact Notch signaling-positive glia (red). (ب) Wild-type (WT) or Notch ts embryos were temperature-shifted, fixed and labeled with anti-Repo. Each white bracket indicates one segment. White arrow indicates midline. Wild-type and Notch ts embryos each have approximately ten Repo + interface glia per hemisegment. A few non-interface glia are also visible in this section. (ج) Wild-type or Notch ts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Htl. (د) Wild-type or Notch ts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Prospero. Five to six Pros + cells are visible in each segment in wild type and in Notch ts (bracket). Only one focal plane is shown so not all Pros + cells are visible in all segments. (E-E″″) Wild-type embryo expressing mCD8-GFP in interface glia, under the control of htl-GAL4, labeled with anti-GFP (green), anti-Frazzled (red) and mAb 22C10 (blue). E shows the overlay of all channels. E′-E″″ are higher magnification views of the boxed region. Thin white arrows indicate the growth cones of dMP2 and vMP2. Glia (GFP, green) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E′. Anti-Frazzled (red) is shown in E″. Anti-Frazzled (red) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E‴. E″″ is the overlay of all markers. Yellow arrows highlight the gap between the vMP2 growth cone and the glial cell. Note close apposition of dMP2 and vMP2 growth cones with Frazzled. (F) Three-dimensional rendering of an image stack of an embryo prepared as described for E. vMP2 growth cone (mAb 22C10, cyan) migrates through a bed of Frazzled + processes (red) that separate it from the associated interface glia (GFP green). Image has been inverted to put glia beneath axon. (G-G″″) Wild-type embryo labeled with anti-Frazzled (green), anti-HRP (red) and mAb BP102 (blue). G shows overlay of all channels. A single optical section is shown (

0.7 μm). G′-G″″ show higher magnification views of the boxed region. G′ shows the overlay of channels G″-G″″ show separate channels as indicated. (H-I) An embryo expressing mCD8-GFP in interface glia (htl-GAL4), labeled with anti-GFP (green) and anti-Frazzled (red). H is a ض-projection. Arrows highlight the correspondence of glial position and Frazzled. H′ is a magnified view of the region indicated in H. I shows a three-dimensional rendering of H, viewed obliquely. Frazzled is ventral to the glia (arrows). (J-J″) ض-projection of an early stage 13 wild-type embryo expressing mCD8-GFP in interface glia (GAL4-605), labeled with anti-GFP (green) and anti-Frazzled (blue). Frazzled + cap is beginning to fill-in between successive segments (asterisks). J shows the overlay of channels. Arrows indicate an intersegmental region in which Frazzled is not yet detected but a glial cell is already present. J′ shows GFP signal in glia and J″ shows anti-Frazzled staining. At early stage 13 GAL4-605 is expressed primarily in interface glia later it will also be in some neurons.

Notch ts embryos had the normal number of interface glia, as assayed with anti-Repo (Fig. 2B). Moreover, the position and morphology of those glia appeared largely normal, and they expressed Htl and (where appropriate) Prospero (Fig. 2C,D). Thus, failure of overall glial development does not underlie the الشق axonal phenotype.


Neural activity promotes brain plasticity through myelin growth, study finds

ستيف فيش

Michelle Monje is senior author of a paper that found neuronal activity causes changes in myelin, cells that insulate nerve fibers and make them more efficient.The brain is a wonderfully flexible and adaptive learning tool. For decades, researchers have known that this flexibility, called plasticity, comes from selective strengthening of well-used synapses — the connections between nerve cells.

Now, researchers at the Stanford University School of Medicine have demonstrated that brain plasticity also comes from another mechanism: activity-dependent changes in the cells that insulate neural fibers and make them more efficient. These cells form a specialized type of insulation called myelin.

“Myelin plasticity is a fascinating concept that may help to explain how the brain adapts in response to experience or training,” said Michelle Monje, MD, PhD, assistant professor of neurology and neurological sciences.

The researchers’ findings are described in a paper published online April 10 in Science Express.

“The findings illustrate a form of neural plasticity based in myelin, and future work on the molecular mechanisms responsible may ultimately shed light on a broad range of neurological and psychiatric diseases,” said Monje, senior author of the paper. The lead authors of the study are Stanford postdoctoral scholar Erin Gibson, PhD, and graduate student David Purger.

Sending neural impulses quickly down a long nerve fiber requires insulation with myelin, which is formed by a cell called an oligodendrocyte that wraps itself around a neuron. Even small changes in the structure of this insulating sheath, such as changes in its thickness, can dramatically affect the speed of neural-impulse conduction. Demyelinating disorders, such as multiple sclerosis, attack these cells and degrade nerve transmission, especially over long distances.

Myelin-insulated nerve fibers make up the “white matter” of the brain, the vast tracts that connect one information-processing area of the brain to another. “If you think of the brain’s infrastructure as a city, the white matter is like the roads, highways and freeways that connect one place to another,” Monje said.

In the study, Monje and her colleagues showed that nerve activity prompts oligodendrocyte precursor cell proliferation and differentiation into myelin-forming oligodendrocytes. Neuronal activity also causes an increase in the thickness of the myelin sheaths within the active neural circuit, making signal transmission along the neural fiber more efficient. It’s much like a system for improving traffic flow along roadways that are heavily used, Monje said. And as with a transportation system, improving the routes that are most productive makes the whole system more efficient.

In recent years, researchers have seen clues that nerve cell activity could promote the growth of myelin insulation. There have been studies that showed a correlation between experience and myelin dynamics, and studies of isolated cells in a dish suggesting a relationship between neuronal activity and myelination. But there has been no way to show that neuronal activity directly causes myelin changes in an intact brain. “You can’t really implant an electrode in the brain to answer this question because the resulting injury changes the behavior of the cells,” Monje said.

The solution was a relatively new and radical technique called optogenetics. Scientists insert genes for a light-sensitive ion channel into a specific group of neurons. Those neurons can be made to fire when exposed to particular wavelengths of light. In the study, Monje and her colleagues used mice with light-sensitive ion channels in an area of their brains that controls movement. The scientists could then turn on and off certain movement behaviors in the mice by turning on and off the light. Because the light diffuses from a source placed at the surface of the brain down to the neurons being studied, there was no need to insert a probe directly next to the neurons, which would have created an injury.

By directly stimulating the neurons with light, the researchers were able to show it was the activation of the neurons that prompted the myelin-forming cells to respond.

Further research could reveal exactly how activity promotes oligodendrocyte-precursor-cell proliferation and maturation, as well as dynamic changes in myelin. Such a molecular understanding could help researchers develop therapeutic strategies that promote myelin repair in diseases in which myelin is degraded, such as multiple sclerosis, the leukodystrophies and spinal cord injury.

“Conversely, when growth of these cells is dysregulated, how does that contribute to disease?” Monje said. One particular area of interest for her is a childhood brain cancer called diffuse intrinsic pontine glioma. The cancer, which usually strikes children between 5 and 9 years old and is inevitably fatal, occurs when the brain myelination that normally takes place as kids become more physically coordinated goes awry, and the brain cells grow out of control.

Other Stanford co-authors of the paper are Hannes Vogel, MD, professor of pathology and of pediatrics Ben Barres, MD, PhD, professor and chair of neurobiology, as well as professor of developmental biology and of neurology and neurological sciences postdoctoral scholar Bradley Zuchero, PhD graduate students Christopher Mount, Grant Lin, Lauren Wood and Gregor Bieri and undergraduate students Andrea Goldstein, Sarah Miller and Ingrid Inema.

This research was funded by the National Institutes of Health (K08NS070926 and R01EY10257) the California Institute for Regenerative Medicine Alex’s Lemonade Stand Foundation the McKenna Claire Foundation The Cure Starts Now the Lyla Nsouli Foundation the Dylan Jewett, Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, Wayland Villars and Jennifer Kranz Memorial Funds the Ludwig Foundation the Stanford Medical Scientist Training Program the Stanford Institute for Neuro-Innovation and Translational Neurosciences the Lucile Packard Foundation for Children’s Health Stanford’s Clinical and Translational Science Award (UL1RR025744) the Howard Hughes Medical Institute Fellowship of the Life Sciences Research Foundation the Bezos Family Foundation the Child Health Research Institute at Stanford and the Anne T. and Robert M. Bass Endowed Faculty Scholarship.


Notch Signaling

Ryoichiro Kageyama , . Toshiyuki Ohtsuka , in Current Topics in Developmental Biology , 2010

2.1 Hes7 oscillations by negative feedback

Somites are segmental axial structures of vertebrate embryos that give rise to vertebral column, ribs, skeletal muscles, and subcutaneous tissues. A bilateral pair of somites forms periodically at the anterior ends of the presomitic mesoderm (PSM), located at the caudal part of embryos ( Fig. 10.2A ). During this process, mesenchymal cells of the PSM are transformed into the epithelial sheet (mesenchymal–epithelial transition) at each somite border, which segments a block of somitic cells from the PSM (segmentation). A bilateral pair of somites is formed once every 2 h in mice, every 90 min in chick, and every 30 min in zebrafish. Thus, the segmentation period differs from species to species. In addition, the period becomes longer at lower temperatures ( Jiang وآخرون., 2000 ), indicating that it is also temperature dependent. However, within each species, the period length remains precise during development, so that the number of somites is used to identify the embryonic stages. The biological clock that regulates this periodic segmentation is called the segmentation clock ( Pourquié, 2003 ) its molecular mechanisms have been analyzed intensively in zebrafish, chick, and mice ( Dequéant and Pourquié, 2008 Mara and Holley, 2007 ).

Figure 10.2 . Hes7 oscillations in the PSM during somite segmentation. (A) The anterior ends of the PSM are segmented every 2 h in mouse embryos, forming a bilateral pair of somites (asterisk). Hes7 gene transcription is initiated in the posterior end of the PSM (phase I) and is propagated into the anterior region (phase II), stopping near the anterior end (phase III). Hes7 gene transcription and Hes7 protein expression occur in a mutually exclusive manner in all three phases, indicating that Hes7 gene transcription is repressed by Hes7 protein. (B) Dynamic Hes7 expression is caused by oscillation in individual cells [indicated by a dot in (A)]. Hes7 gene transcription and Hes7 protein expression oscillate in an antiphase manner. (See Color Insert.)

In mouse embryos, both Hes1 و Hes7 are expressed dynamically in the PSM ( Bessho وآخرون., 2001a Jouve وآخرون. ، 2000). The expression cycle is initiated in the posterior tip of the PSM and is propagated toward the anterior, ending near the anterior boundary of the PSM, after which segmentation of one bilateral pair of somites occurs ( Fig. 10.2A ). This dynamic expression of Hes1 and Hes7 is caused by synchronized oscillation in PSM cells ( Fig. 10.2B ). Of these two genes, Hes7 is functionally more important than Hes1 for somite segmentation: somites fail to segment and thus are severely fused in the absence of Hes7 but not in the absence of Hes1 ( Bessho وآخرون., 2001b ). Interestingly, sustained expression of Hes7 also leads to severe somite fusion, suggesting that the oscillating expression of Hes7 is the key for maintaining periodic somite segmentation ( Niwa وآخرون., 2007 ).

What is the mechanism producing Hes7 oscillations? In the PSM, Hes7 gene transcription and translation are mutually exclusive ( Fig. 10.2A,B ), and in the absence of a functional Hes7 protein, the Hes7 gene is continuously transcribed in the PSM ( Bessho وآخرون. ، 2003). تفعيل Hes7 promoter induces synthesis of Hes7 mRNA which is then translated to generate Hes7 protein Hes7 protein levels reach a peak within about 1 h. Hes7 protein binds to the multiple N box sequences located in the Hes7 promoter, repressing its own expression ( Fig. 10.3 ). This repression leads to disappearance of Hes7 mRNA, and then the Hes7 proteins disappear within an hour by the ubiquitin–proteasome-mediated degradation. The disappearance of Hes7 protein relieves autorepression, allowing Hes7 transcription to restart. As a result, Hes7 expression oscillates with a period of about 2 h. Thus, the negative regulation of Hes7 expression by Hes7 protein forms a negative feedback loop that is critical for maintaining oscillations.

Figure 10.3 . Hes7 oscillations are regulated by negative feedback and rapid degradation of gene products. تفعيل Hes7 promoter induces synthesis of both Hes7 mRNA and Hes7 protein. Hes7 protein then binds to multiple N box sequences of Hes7 promoter and represses its own expression. This repression leads to disappearance of Hes7 mRNA and Hes7 protein because they are extremely unstable. Hes7 protein is polyubiquitinated and degraded by proteasome. Disappearance of Hes7 protein relieves negative autoregulation, allowing the next round of expression. As a result, Hes7 expression oscillates in the PSM.


Olfactory ensheathing cells: Biology in neural development and regeneration

Olfactory ensheathing cells (OECs) constitute a unique population of glia that accompany and ensheath the primary olfactory axons. They are thought to be critical for spontaneous growth of olfactory axons within the developing and adult olfactory nervous system, and have recently emerged as potential candidates for cell-mediated repair of neural injuries. Here, based on the current research, we give an overview of the biology of OECs in neural development and regeneration. This review starts with a detailed description of the cellular and molecular biological properties of OECs. Their functions in olfactory neurogenesis, olfactory axonal growth and olfactory bulb formation are sequently discussed. We also describe therapeutic applications of OECs for the treatment of a variety of neural lesions, including spinal cord injury, stroke, degenerative diseases, and PNS injuries. Finally, we address issues that may foster a better understanding of OECs in neural development and regeneration.

Research highlights

▶ Olfactory ensheathing cells (OECs) constitute a unique population of glia that accompany and ensheath the primary olfactory axons. ▶ They are thought to be critical for growth of olfactory axons within the developing and adult olfactory nervous system, and have recently emerged as potential candidates for cell-mediated repair of neural injuries. ▶ In this article we review current knowledge of OEC biology, including their molecular and cellular properties, and their role in olfactory development. ▶ We also describe therapeutic applications of OECs for a variety of neural lesions. ▶ This review, we think, may foster a better understanding of OECs biology in neural development and regeneration.


How are Interactions Between Neural Cells Established and Maintained?

The human embryo is a collection of clusters of non-specific cells, which then develop into the tissues of the adult human. In particular immature, non-specific neuroblasts must be differentiated into the highly specialised cells of the nervous system, each with a unique structure, function and synaptic interactions (Whatson 2004).

The whole function of the nervous system relies on the synaptic and other interactions between neural cells being developed appropriately and maintained throughout life. This account covers the initial development of specific neural cells from immature precursor stem cells and also the methods by which the growing specialised neurons grow along the correct routes to form their interactions with other cells, both neuronal and non neuronal.

Establishing neural cells from stem cells

Progenitor or stem cells are non-specific immature cells that are able to differentiate and form specialised cells in the adult organism. There are relatively few types of neural stem cells, with the potential to differentiate into many different types of specialised neural cells, depending on specific, localised requirements. Multipotent (able to form many types of daughter cells) neural stem cells were first identified in the early 1990s (Imitola et al. 2004) and subsequent research has focussed on specific examples of these immature progenitor cells.

Neural stem cells can give rise both to different types of mature cell, as a result of asymmetric cell division, as well as identical daughter cells via simple symmetric cell replication (Gage 2000). The exact form of the adult cell is controlled by the location of progenitors during differentiation, as well as by diffusible factors acting from a more distant site, usually the final location to which the differentiated cells will migrate.

Signalling molecules influence the differentiation of neural stem cells. For instance valproic acid (VPA) actively suppresses glial differentiation, instead encouraging the development of adult neurons, via upregulation of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor (Hsieh, Gage 2004).

The mesenchymal stem cell (MSC) is derived from bone marrow and able to self regenerate and differentiate into several different types of cells in vivo (Kondo et al. 2005). MSCs are able to form both neuronal and glial cells the difference relating to the presence or absence or voltage gated ion channels indicative of the potential to develop into a full neuronal cell. Furthermore the presence of specific signalling molecules in the cell milieu can influence the development of specific types of neuronal cells. One such example involves the sonic hedgehog and retinoic acid signalling molecules, which have been shown to cause MSCs to define neurons adapted for the peripheral nervous system (Kondo et al. 2005). It is believed that this guidance of development occurs via the promotion of specific transcription factors appropriate to the adult neuronal cells. The diffusible signalling molecules would switch on the transcription factors.

A growing axon has an area of active tissue on the tip, known as the growth cone (Whatson 2004). It is the interactions between the growth cone and the surrounding structures and chemicals that govern the route along which the axon grows. Chemotactic guidance is the name given to guidance derived from close physical contact between the growth cone and structures it comes into contact with. For instance, physical obstacles such as bones or cartilage may prevent the axon from continuing along a specific route. Instead the filopodia (thin membrane extensions) would literally feel around for a route that the axonal growth could take.In the case of growth of the axons of the optic nerve, the growth of retinal neurites is influenced by the presence of laminin and fibronectin. Axons interact with these extracellular matrix components differently according to their origin with some adhering more strongly to laminin, with others showing greater allegiance to fibronectin (Whatson 2004). Hence some retinal neurites cross the optic chiasm whilst others do not.

Chemotactic guidance does not, however, operate in isolation, instead being linked to the presence of chemical signalling molecules, many of which are similar to those affecting the initial stem cell differentiation.

The idea that the gradient of chemical substances secreted by a target cell might be responsible for the ability of growth cones to find their way to a target cell was initially proposed by Ramon y Cajal more than a century ago (Ming et al. 2002). These chemotropic (literally movement in response to a chemical factor) factors are present in the extracellular matrix and act to either attract or repel the growth cone, along a chemical gradient. One example is netrin-1, which causes isolated xenopus spinal neurones to turn towards the greater concentration. However too high a concentration of netrin-1 (eg 5ng/ml-1 compared to 5 (g/ml-1) appears to desensitise the neurones, which no longer exhibit turning on a gradient (Ming et al. 2002). Netrin-1 (also known as unc-6) is also required by the worm C-elegans in order for differentiating neuroblasts to migrate along the dorsoventral axis the final direction determined by interactions between the neuroblasts and specific receptors (Hatten 2002).

Crossing the midline a detailed example

In the fruit fly drosophila the genes roundabout (deficient mutant – robo), commissureless (deficient mutant – comm) and slit (deficient mutant – sli) work together to influence axonal growth across the CNS midline (Kidd, Bland & Goodman 1999). Axons may cross the midline and become commissural or remain ipsilateral as longitudinal axons. Figure 1 below illustrates the effect that removal of each of the 3 chemotropic factors has on the appearance of longitudinal and commissural axons within the CNS axon scaffold, described as follows:

Wild type (all genes thus chemotropic factors intact) shows neat crossing of the midline, resulting in 2 commissures per segment and balanced commissural and longitudinal axons.

comm – no axons cross the midline, all remain longitudinal.

sli – axons enter the midline but then continue as longitudinal axons, within the midline.

robo – axons cross and recross the midline resulting in excessive commissural axons and very few longitudinal axons.

The authors concluded that slit acted as a short range repellent of axons with respect to the midline, thus was a chemotropic factor (Kidd, Bland & Goodman 1999). Subsequent research has shown that robo is actually repelled from the midline in response to slit, which has been found to be a large protein expressed by midline glia (Kraut, Zinn 2004).

Neuronal and Glial cell interactions

Much recent research into the methods by which developing neurons form interactions with other neural cells as well as the glial support cells, has come from study of insects such as drosophila.

Glia are crucial in the correct development of the developing eye disc in insects. The diffusible factors decapentaplegic and hedgehog both strongly influence glial proliferation, with decapentaplegic also having a role in glial motility. Glia motility is particularly crucial as axons will extend and grow in the correct direction in response to diffusible factors but will not enter the optic stalk without the chemotactic guidance of glia (Oland, Tolbert 2003).

Maintaining the connections in the adult nervous system

It has recently become apparent that, as a neuron matures, it’s responsiveness to signalling molecules such as netrin-1 changes (Salinas 2003). There is logic to this, as a maturing axon would expect to receive specific guidance cues to establish connections with other cells whereas a mature axon would not seek to continue to migrate towards the cells, rather wishing to maintain accurate connections. As there is a need to replace dead cells throughout life it would not be appropriate to completely switch off signalling molecules such as netrin-1, as every new axon would need to migrate towards the correct connections, but would then benefit from becoming effectively immune to the signalling capabilities of netrin-1 as there would be no need for further migration.

The importance of accurate migration from the stem cell germinal site to the area of axon-target interaction relates to the need for accurate synaptic connections in the adult nervous system. Organisms with a more simplistic nervous system have a low extent of migration, whilst the vertebrate nervous system involves a high degree of migration (Hatten 2002). Thus the eventual nervous system depends heavily on the accuracy of the guidance provided by both the signalling molecules and the chemotactic scaffold.

Whilst there is immense potential in understanding how stem cells develop, in terms of replicating this in order to replace damaged cells in the human adult thus far the research underlying the regulation of endogenous stem cells is in its infancy and mechanisms are poorly understood. Further, the method by which differentiated cells are able to accurately locate their target connections is also an area of current mystery.


المواد والأساليب

Zebrafish lines

Embryos and larvae were obtained by natural spawning from wild-type, Tg(الثعلب D3:GFP) [12, 30], Tg(flh:eGFP) Tg(foxD3:GFP) [12], Tg(h2afz-GFP) [31], or Tg(ET16:GFP) fish (a gift from Dr Vladimir Korzh). The ET16 enhancer trap line carries a Tol2-GFP insertion and labels a subset of habenular neurons [32, 33]. Embryos were reared and staged according to standard procedures [34] and occasionally 0.002% phenylthiourea was added to the fish water from 24 hpf to inhibit pigment formation.

Dye labeling

Carbocyanine dye labeling of habenular efferent axons was performed as described previously [16].

Laser ablation

Laser ablation of parapineal precursors was performed at 24–28 hpf in Tg(flh:eGFP) Tg(foxD3:GFP) transgenic embryos as described previously [12]. Larvae were subsequently examined by laser-scanning confocal microscopy at 3 or 4 dpf to determine if any parapineal cells remained. Larvae lacking all parapineal cells were classed as 'ablated' whereas those retaining one or more parapineal cell(s) were classed as 'failed ablated'.

Focal electroporation

The electroporation technique was adapted from [35] to enable the efficient transfer of DNA to single cells or small group of cells in embryonic zebrafish CNS. Embryos at 48–72 hpf were mounted in 2% low melting point agarose (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) and using a microsurgical blade, a small chamber of agarose was cut out to expose the dorsal diencephalons/mesencephalon. Micropipettes with a tip diameter of 1–2 μm were pulled on a P-87 micropipette puller (Sutter Instrument Company, CA, USA) using AlSi glass capillaries containing a filament. Micropipettes were filled with a solution containing purified plasmid DNA resuspended in H2O at a concentration of 1 μg/μl. For most habenular neuron electroporations we used pCS2-GAP43-GFP (a gift from Dr E Amaya). GFP synthesized from this construct is localized to the cell membrane by virtue of two amino-terminal palmitoylation signals from the GAP43 protein. To visualize presynaptic terminals, we used a 1:1 mixture of pCS2-GAL4 plasmid DNA (a gift from Dr Masahiko Hibi) and pCS2-Syp:GFP-DSR [17]. This latter construct encodes both cytoplasmic DsRed fluorescent protein and a Syp-GFP fusion protein, driven from separate UAS elements. For IPN electroporations we used pCS2-lyn-Cherry, which encodes a membrane-targetted Cherry fluorescent protein (a kind gift from Henry Roehl). Micropipettes were guided into either the L or R habenula or the IPN using an MX3000 Huxley-style micromanipulator (Soma Scientific Instruments, Irvine, CA, USA) under ×40 water-immersion DIC optics (Axioskop 2 FS microscope, Carl Zeiss). The following stimulation parameters were used: 1–2 s long trains of 2 ms square pulses at 200 Hz and a potential difference of 30 V. Trains were delivered 3–5 times with approximately 0.5 s interval between trains. Pulses were generated with a Grass SD9 stimulator (Grass-Telefactor, West Warwick, RI, USA). After electroporation, embryos were cut out from the agarose and returned to embryo medium.

Whole mount فى الموقع hybridization and immunostaining

فى الموقع hybridization, antibody staining and histological sectioning were performed according to standard methods [36]. For antibody stainings, mouse anti-acetylated tubulin (T6793 Sigma) and rabbit anti-GFP (TP401 Torrey Pines Biolabs, San Diego, CA, USA) were used at 1:1,000 dilutions and rabbit anti-DsRed (632496 ClonTech, Palo Alta, CA, USA) was used at 1:600.

Microscopy and image manipulation

Fluorescent labeling was imaged by confocal laser-scanning microscopy (Leica SP2) using ×40 and ×63 water-immersion objective lenses. ض-stacks were typically acquired at 1–2 μm intervals for epithalamic labeling and fluorescent dye-labeling of habenular axons or 0.5–1 μm intervals for imaging axonal arbors or IPN neurons labeled by electroporation. في بعض الحالات، ض-stacks were deconvolved using Huygen's Essential software (Scientific Volume Imaging, Hilversum, The Netherlands). Three-dimensional projections were generated from the stack of images using Volocity software (Improvision, Coventry, UK).

فى الموقع hybridization staining and plastic sections were photographed using a Jentopix C14 digital camera attached to a Nikon Eclipse E1000 compound microscope. For presentation, image manipulation was performed using Photoshop CS2 (Adobe) software.

Morphometric analyses

Radial distribution of neurites

To quantify the distribution of neurite branches from the center to periphery of each terminal arbor, we developed a method similar to Sholl analysis. Three-dimensional reconstructions of each arbor were orientated such that the base of the arbor lay on a flat plane and a two-dimensional image of the reconstruction, parallel to this plane, was used for further analysis. The incoming axon was cropped where it extended beyond the maximum width and length of the arbor. Next, the image was thresholded and the convex hull method was used to define the arbor perimeter (ImageJ software, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA Hull and Circle plug-in by A Karperien and TR Roy). Using custom-written MATLAB software (The MathWorks, Inc., Natick, MA, USA), a series of 10 equally spaced concentric shells were defined, centered upon the centroid of the convex hull (see Figure 3g, for example). The number of pixels (representing axon signal) in each shell was taken as a measure of axon density. This generated a plot of cumulative fraction of axon density versus radius, for each arbor. This method is resistant to differences in the absolute area covered by the arbor and the total axonal length. Because we analyzed two-dimensional images, our method will underestimate axon density where axon segments are aligned above or below one another. This occurs rarely for L-typical arbors but is more common at the perimeter of R-typical arbors. Thus, although our method detects a greater peripheral localization of axonal length in R-typical arbors, if anything this difference between the arbor sub-types is likely to have been underestimated.

To describe the distribution profiles for the different sub-types of arbor (L-typical, R-typical and Ab-L, Ab-R) non-linear regression was used to fit fourth order polynomial models to the raw data with the y-intersect constrained to zero (at 0% radius the cumulative fraction of axon density must be zero). To compare the curves for the different arbor sub-types, we used the AIC method [37, 38]. Briefly, we used the AIC method to compare two models an AICc score is computed for a 'global' model that treats all the data from two arbor sub-types as a single data set and for a second model with individual curves fit to each data set. A large difference in the AICc scores, ΔAICc, indicates there is a high probability of the model with the lower AICc score being correct. If this is the model with separate fits for the two arbor sub-types it follows that the sub-types can be considered distinct. In the Results text we report ΔAICc and the probability that the 'individual' model, with separate polynomial fits for the two arbor sub-types, is correct.

Width/length ratio

The maximum length (measured along the AP axis) and maximum width (measured perpendicular to the AP and DV axes) were measured (Volocity, Improvision). Width/Length ratios were compared using one-way ANOVA with Tukey's post-tests for pair-wise comparisons of arbor sub-types.

عمق

The depth over which each axon elaborated its terminal arbor was measured in YZ projections made using Volocity software. For L-typical arbors located in the dIPN, depth was measured parallel to the DV axis of the brain. Because the neuropil domain of the vIPN is inclined relative to the DV axis, accurate depth measurements for ventrally located R-typical, Ab-L and Ab-R arbors were made perpendicular to the plane of the vIPN neuropil domain. Depths were compared using one-way ANOVA with Tukey's post-tests for pair-wise comparisons of arbor sub-types.

Branching

The number of branch points was counted by hand in three-dimensional reconstructions of axonal arbors. Branch points giving rise to small filopodial extensions (less than 5 μm in length) were excluded from the analysis. Average numbers of branch points were compared by one-way ANOVA with Tukey's post-tests for pair-wise comparisons of arbor sub-types.

إحصائيات

All statistical comparisons, nonlinear regression and comparison of curves using the AIC method were performed using Prism 4 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).


شاهد الفيديو: مقدمة الجهاز العصبي (أغسطس 2022).